Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

Membrane Structural and Functional Biology Group에 오신 것을 환영합니다. 제 이름은 Martin Caffery입니다. 우리 연구의 초점은 첫 번째 슬라이드에 표시된 개략도인 생물학적 막이며, 존재할 때 세포와 세포 내 소기관을 둘러싸고 있는 막은 분자적으로 얇은 구조로, 가로질러 두 개의 지질 분자에 불과하고 단백질이 박혀 있습니다.

우리는 지질과 단백질 모두에 적용되는 구조와 기능에 관심이 있습니다. 그러나 이 JO 시리즈의 목적을 위해 저는 막 단백질에 초점을 맞추겠습니다. 우리는 두 가지 이유로 이러한 막 단백질이 분자 수준에서 어떻게 기능하는지 이해하려고 합니다.

첫째, 무언가가 어떻게 작동하는지 아는 데서 오는 지적 만족감이 있습니다. 둘째, 자전거나 자동차와 마찬가지로 작동 방식을 알면 오작동 시 고칠 수 있습니다. 약물 설계는 이러한 유형의 작업의 명백한 결과입니다.

막 단백질이 분자 수준에서 어떻게 작용하는지 알아내기 위해 우리가 취하는 접근 방식은 결정학적 구조를 결정하는 것입니다. 이것은 모든 원자 또는 적어도 단백질을 구성하는 모든 수소가 아닌 원자의 위치를 3차원 공간으로 설정하는 것을 포함합니다. 이를 위해 우리가 사용하는 방법을 줄여서 고분자 X선 결정학 MX라고 합니다.

여기서 우리는 단백질의 분획 품질 결정에서 MX를 사용하여 구조를 결정한 막 단백질의 예를 볼 수 있습니다. 상상할 수 있듯이, 그림과 같이 고분자 결정학을 사용하여 구조화된 결정과 관련된 많은 단계가 있습니다. 여기. 일반적으로 여기에는 멤브레인 단백질 표적을 식별한 다음 생산, 정제 및 결정화가 포함됩니다.

회절 측정은 가정 또는 싱크로트론 X-ray 소스를 사용하여 결정에서 수행됩니다. 회절 데이터가 처리되어 전자 밀도 맵이 생성되고, 이 맵에는 분자 모델이 장착됩니다. 이 모델은 정제되면 단백질의 작용 메커니즘을 탐색하고 구조 기반 약물 설계에 사용할 수 있습니다.

이 기사의 JO의 초점은 소위 메소 방법으로 지질 메조 상을 사용하여 막 단백질의 분획 품질 결정을 생산하는 방법을 보여주는 것입니다. 이 방법과 그 범위에 대한 최근 검토는 참고 문헌 1에서 확인할 수 있습니다. 여기에서 따를 단계별 프로토콜은 말단 메조막 단백질 결정화 시험과 관련된 단계와 필요한 시간을 요약한 순서도를 참조하여 설명되어 있습니다.

이 비디오에서는 빨간색 파선으로 묶인 단계를 다룹니다. 수동 모드에서 메조 결정화에서 수행해야 하는 항목이 여기에 표시됩니다. 그들은 숙주 매아제를 창조하기 위한 순화된 막 단백질 지질의 집중된 해결책을 포함하며, 지질을 더 명백하게 하기 위해 보통 모노 올레를 포함합니다.

이 비디오에서는 적색 염료 침전제 용액, 정제된 수도관 페팅 장치 및 일회용 팁, 다양한 가스 밀폐 해밀턴 주사기가 도핑되었으며, 일부는 탈착식 바늘이 있으며, 단백질 용액과 지질을 혼합하여 미즈를 생성하는 데 사용되는 좁은 보어 커플러가 있습니다. Hamilton 유리 현미경의 리피터 디스펜서는 슬라이드와 커버 슬립을 제공합니다. 우물 생성 핀셋, 부서진 얼음 티슈, 계산기 및 가장 중요한 모든 실험실 노트북을 위한 이상적으로 사일로화된 천공 양면 스페이서 테이프.

다음 절차는 유리 샌드위치 결정화 플레이트를 준비하는 데 사용됩니다. 로딩을 위해 사일로화된 현미경 슬라이드를 벤치에 놓습니다. 구멍이 뚫린 양면 스틱 스페이서 테이프 스트립의 한쪽 표면에서 보호지 덮개를 제거합니다.

테이프의 끈적한 면이 아래로 향하게 하여 슬라이드 압력의 표면과 접촉하도록 합니다. 테이프를 슬라이드에 밀봉합니다. 브레이어 또는 롤러를 사용하여 테이프와 롤러 사이에 알루미늄 호일을 배치하여 우물 바닥을 보호할 수 있습니다.

테이프에서 두 번째 종이 덮개를 제거하여 위쪽의 끈적한 표면을 노출시킵니다. 이 절차는 적재 준비가 된 유리판을 생성하고 적재가 완료되는 즉시 후속 천장을 생성합니다. 개별 사일로화된 덮개는 우물의 빠르고 효율적인 천장을 위해 플레이트에 근접하여 미끄러집니다.

지질을 섭씨 45도의 온도 조절 블록에 3분 동안 넣어 용융시킵니다. 사용되는 지질은 일반적으로 모노 랜드입니다. 이 비디오에서는 지질이 녹는 동안 가시성을 위해 지질에 빨간색 염료가 추가되었습니다.

사용할 100마이크로리터 가스 밀폐 Hamilton 주사기 2개를 준비합니다.지질 단백질 혼합 단계에서 단백질 용액을 포함할 주사기에서 테프론 모피 오일을 제거합니다. 지질을 담을 주사기를 그 옆에 놓습니다. 이 경우 fal은 제자리에 남아 있습니다.

두 주사기 사이에 좁은 보어 커플러를 놓고 커플러를 지질 주사기 핑거에 연결합니다. 커플러를 주사기에 조이되 과도하게 조이지 마십시오. 지질 주사기의 배럴에서 플런저를 제거합니다.

지질이 용융되었는지 확인하십시오. 피펫을 30마이크로리터로 설정하고 30마이크로리터의 용융 지질 캡을 천천히 흡수합니다. 지질 바이알.

지질은 섭씨 영하 80도의 질소 또는 아르곤 아래에서 보관해야 합니다. 용융된 지질을 가능한 한 많이 주사기의 열린 끝으로 천천히 전달합니다. 에어 갭이 생기지 않도록 주의합니다.

플런저를 용융된 표범과 접촉하는 배럴에 놓고 주사기를 수직으로 잡고 플런저를 배럴 위로 천천히 전진시킵니다. 그림과 같이 갇힌 기포는 그 과정에서 부주의하게 상승하여 방출됩니다. 이제 배럴에 용융된 지질의 플러그가 있으며 그 부피를 정확하게 결정해야 합니다.

이것은 주사기 배럴의 표시를 읽음으로써 수행할 수 있습니다. 이 경우 부피는 23마이크로리터이며 이는 실험실 노트북에 기록됩니다. 커플러에서 뻗어 나온 바늘에 털을 밀어 넣습니다.

플런저를 사용하여 용융된 지질을 배럴 위로 밀어 넣고 천천히 부드럽게 커플러 코어의 바늘로 밀어 넣습니다. 바늘이 약간 과도하게 채워지면 열린 끝에서 지질이 뛰는 것을 볼 수 있습니다. 플런저를 약간 뒤로 젖히면 과도한 지질이 커플러 바늘 끝과 같은 높이가 될 때까지 커플러로 빼낼 수 있습니다.

이 경우 시린지 커플러 장치가 완전히 로드되어 단백질 시린지와 결합할 준비가 되었습니다. 해결책은 14, 10 분 동안 000 G, 4 섭씨 온도에 5 10 분에 큰 골재를 제거하기 위하여 회전되어야 한다. 결정화 시험을 설정하기 전에 얼음 양동이에서 단백질 용액을 꺼내 실온에서 평형을 이룹니다.

단백질의 부피를 계산하여 섭씨 20도의 올린에 대한 완전 수화 또는 이에 가까운 입방체상을 형성하는 데 사용할 용액을 계산합니다. 물을 사용한 완전한 수화는 상 다이어그램에서와 같이 40 중량 %에 가까운 물에서 발생합니다. 지질 주사기에 마이크로리터당 0.94mg의 밀도로 23개의 모노를 적재했다는 것을 기억하십시오.

이것은 지질의 21.6 밀리그램에 해당하며, 따라서 단백질 용액의 6 또는 14.4 밀리그램 또는 14.4 마이크로 리터로 나눈 21.6 곱하기 4는 단백질 용액의 필요한 부피를 차지하는 25 또는 50 마이크로 리터 해밀턴 주사기로 필요하며, 단백질 용액의 배럴에있는 플런저의 테프론 팁으로 용액을 옮깁니다. 기포가 생기지 않도록 주의하면서 바늘을 조심스럽게 빼내고 주사기의 단백질 용액의 부피를 측정합니다. 이전 단계에서 제공된 값과 일치해야 합니다.

지질이 적재된 주사기와 결합하기 위한 준비. 단백질 용액을 배럴 위로 조심스럽게 밀어 올려 끝이 열린 것과 같은 높이가 되도록 합니다. 이것은 배럴 종단 끝을 통해 아래를 내려다보면 관찰할 수 있습니다.

리핀 단백질 용액, 장전된 주사기는 이제 Mex가 이를 수행할 준비를 위해 결합할 준비가 되었으며, 단백질 주사기를 지질 주사기에 부착된 커플러의 열린 끝 부분에 나사로 고정합니다. 커플러를 통해 두 개의 주사기를 결합했습니다. 한 주사기의 지질에서 커플러를 통해 다른 주사기의 단백질 용액까지 연속적인 양의 액체가 존재해야 합니다.

혼합을 준비하기 위해 조립된 장치는 오른손에는 주사기, 왼손에는 주사기가 하나씩 있습니다. 토크는 커플러를 통해 두 배럴에 가해지며 양손의 손가락과 엄지 손가락을 사용하여 커플러의 고랑에 대한 씰이 조여도 손상되지 않도록 합니다. 이 단계에서 조립된 혼합 장치는 ALS를 손상시키고 조임 시 누출을 일으키

그것은 불가피한 시행 착오와 때때로 샘플의 손실에 대한 경험의 문제입니다. 따라서 혼합에 영향을 미치기 위해 귀중한 단백질 용액을 사용하기 시작하기 전에 시스템에 대한 느낌을 얻기 위해 지질 및 물 또는 완충 용액으로 연습하고, 엄지 손가락 또는 검지 손가락으로 조립된 혼합 장치의 단백질 측면에 있는 플런저를 한계까지 전진시켜 단백질 주사기에서 단백질 용액을 커플러를 통해 지질 주사기로 밀어 넣는 것이 좋습니다. 장치가 효과적으로 밀봉된 경우 이 작업은 지질 측에서 플런저의 동일하고 반대 움직임을 유발합니다.

지질 측의 플런저는 이제 지질 주사기의 내용물을 콜러를 통해 단백질 주사기로 다시 밀어 넣는 데 사용됩니다. 이 과정은 여러 번 반복됩니다. 때로는 균질한 미사 상을 생성하기 위해 100개 이상의 구절이 필요합니다.

혼합을 시작할 때 커플러를 통해 재료를 앞뒤로 이동하는 것이 고르지 않을 수 있으며 때때로 혼합에 영향을 미치기 위해 추가 힘이 필요합니다. 이것은 예상할 수 있는 일입니다. 초기 혼합은 일반적으로 샘플에서 균일하지 않은 흐림의 발달을 동반하며 다시 예상됩니다.

균질화가 진행됨에 따라. 플런저를 앞뒤로 움직이는 데 필요한 힘에 의해 감지되는 질감은 더 균일해지고 점성 입방체상의 특징이 되며, 나타나는 입방상의 시각적 외관도 마찬가지입니다. 조건이 적절하고 입방상이 형성되면 분산액이 주사기 배럴에서 광학적으로 투명하게 나타나야 합니다.

따라서 주사기 배럴의 표시는 배럴의 중간상을 통해 명확하게 읽을 수 있어야 합니다. 착색된 단백질의 경우, 메조상은 단백질의 색을 갖지만 광학적으로 투명합니다. 얼음 위에 주사기 믹서를 짧은 시간 동안 놓아 혼합하는 동안 샘플을 약간 냉각하면 균질화와 투명도 달성을 가속화할 수 있습니다.

그러나 샘플을 과도하게 사용하지 않는 것이 중요합니다.amp마찰 가열로 인해 샘플 온도가 상승할 수 있으므로 매우 격렬한 혼합을 피하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 이 시점에서 입방체 미사 상(cubic misa phase)이 형성되고 단백질이 지질 블레이(lipid blay)로 재구성됩니다. misa 상은 이제 결정화 플레이트의 개별 웰로 디스펜싱할 준비가 되었습니다.

그러나 먼저 메조 상을 반복 디스펜서에 장착된 10마이크로리터 Hamilton 주사기로 전환해야 합니다. 주사기를 디스펜서 얇음에 연결하여 이 프로세스를 시작합니다. 주사기에 큐빅 마이즈를 로드합니다.

주사기에서 바늘과 플런저를 제거합니다. 테프론 팔은 제자리에 두십시오. 작은 동전을 사용하여 디스펜서에서 고정 너트를 제거합니다.

래칫 암을 완전히 빼낸 상태에서. 플런저와 바늘이 없는 주사기를 디스펜서의 고정 링을 통해 삽입합니다. 주사기를 향하고 있는 고정 매듭 개스킷 쪽을 교체하고 주사기의 열린 끝 부분에 단단히 조입니다.

주사기가 고정 링의 중앙에 적절하게 배치되고 배럴이 래칫 암과 평행하게 정렬되도록 주의해야 합니다. 둘 다 I.These 두 가지 요구 사항에 의해 판단 될 수 있습니다.이 두 가지 요구 사항은 플런저가 자유롭게 작동하지 않고 압력을 통해 적재하는 동안 소스 주사기에 축적되어 누출이 발생할 수 있기 때문에 중요합니다. 그리퍼 너트를 사용하여 플런저를 그립 링에 통과시키고 나사를 몇 바퀴 풀고 플런저를 주사기의 열린 끝으로 안내합니다.

래칫 암을 완전히 누르고 플런저를 배럴 안으로 이동한 다음 배럴 내에서 자유롭게 이동하는지 확인합니다. 나사와 가이드 바가 느슨해지면 다시 조이고 플런저가 자유롭게 움직이는지 다시 확인하십시오. I 이제 디스펜싱 주사기를 적재할 준비가 되었습니다.

조립된 혼합 장치의 한쪽에 있는 플런저를 0마이크로리터 눈금 표시로 이동합니다. 메조상을 다른 주사기와 커플러로 전달합니다. 혼합 장치에서 UL이 있는 빈 주사기를 분리하고 10마이크로리터 디스펜싱 주사기의 나사산 종단에 부착된 커플러에 로드된 주사기를 즉시 연결합니다.

커플링이 수행되는 기밀성의 정도는 매우 중요합니다. 이미 언급했듯이 100 마이크로 리터 주사기의 플런저를 눌러 분배 주사기를 적재하여 메조상이 커플러를 통해 전달되도록합니다. 커플링이 팽팽하고 디스펜싱 시린지의 플런저가 풀리면 디스펜싱 시린지가 채워질 때 플런저가 로딩 플런저의 모션 방향으로 움직이기 시작해야 합니다.

디스펜싱 주사기에 커플러가 부착된 장전 주사기를 분리합니다. 짧고 끝이 평평한 바늘을 디스펜싱 주사기의 강철 종단에 고정하고 조심스럽게 제자리에 조입니다. 그립 링의 매듭을 조여 플런저를 래칫 암에 고정합니다.

매듭을 과도하게 조이지 않도록 주의해야 합니다. 이로 인해 플런저에 흠집이 생기고 변형되어 사용할 수 없게 될 수 있습니다. 클램핑된 상태에서 래칫 암에 제공되는 이동 범위는 1인치 이하로 제한되는 것이 중요합니다.

이 외에도 표시된 것처럼 플런저가 휘어지는 경향이 있어 배송이 실패할 수 있습니다. L은 래칫 드럼을 여러 번 눌러 배럴의 플런저를 전진시켜 바늘의 빈 공간을 채우고 바늘을 로드합니다. 이 단계는 바늘 끝에서 메사 상의 연속적인 끈이 나올 때까지 최대 10회까지 반복해야 합니다.

이제 바늘은 결정화 시험을 설정하는 데 사용할 준비가 되었으며, 즉시 시작해야 합니다. 결정화 시험을 설정하기 전에 단백질이 적재된 입방상을 너무 오랫동안 유지하는 것은 바람직하지 않습니다. 일부 단백질은 침전제가 추가되지 않으면 입방체에서 불안정하므로 다중 웰 결정화 플레이트를 놓고 로딩을 용이하게 하기 위해 벤치에서 몇 인치 위로 올려진 표면에 슬립을 덮습니다.

최적의 대비와 향상된 가시성은 표면이 약간 어두울 때 달성됩니다. 침전제 용액을 균질화하고 바이알의 뚜껑을 열었습니다. 한 손에 디스펜싱 주사기를 수직으로 잡고 침전제 디스펜싱 프로펠프를 1마이크로리터로 설정하고 다른 손을 사용하여 바늘 끝을 중앙과 웰 바닥 바로 위에 놓습니다.

제일. 반복 디스펜서의 디스펜에 있는 버튼을 눌러 유리 표면에 진흙 덩어리를 배출합니다. 덩어리 부피는 200 나노 리터입니다.

표준 리피터 디스펜서를 10마이크로리터 주사기와 함께 사용하는 경우 바늘 끝이 웰 바닥에서 수백 마이크로미터 이상 높아서는 안 됩니다.적절한 전달을 보장하기 위해 재현 가능한 전달이 쉽게 달성됩니다. 약간의 연습이 필요할 뿐입니다. 인접한 4개의 웰에 마이즈를 로드한 후 각 마이즈 볼루스 위에 1마이크로리터의 침전제 용액을 놓습니다.

특허당 2마이크로리터와 표준 일회용 팁을 가능한 한 빨리 사용하여 채워진 우물 위에 커버 슬립을 직각으로 놓아 균일하게 덮어 방수 밀봉을 수행합니다. 주걱을 사용하여 스페이서 테이프의 노출된 스틱 끈적한 표면과 접촉하는 커버 슬립에 압력을 가합니다. 플레이트의 모든 웰이 적재되고 밀봉될 때까지 미즈 및 침전제 디스펜싱 프로세스를 반복할 수 있습니다.

이제 플레이트를 검사하고 배양할 준비가 되었습니다. 추적을 위해 플레이트에 명확하게 레이블을 지정하십시오. 빛에 민감한 단백질은 일반적으로 배양실에 넣기 전에 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸서 처리합니다.

이러한 물질은 제거되어 차분하거나 적절한 색상의 빛으로 현미경으로 검사할 수 있습니다. 플레이트를 일반적으로 섭씨 20도 또는 그 정도의 온도 조절 챔버에 정기적으로 배치하십시오. 10배 또는 20배가 일치하는 편광 현미경을 사용하여 벽의 결정 성장을 검사합니다.

목적, 저자의 연구실에서 사용한 일정은 다음과 같습니다., 0 1 2 3 5 7 14 21 30 포스트 세트. 미즈 볼루스를 주의 깊게 검사합니다. 140미크론 두께의 샘플 내에서 초점 심도를 조정합니다.

검사는 정상 광선과 교차 교차 편광자 사이에서 수행되어야 하며, 정상 광으로 볼 때 입방체상에서 성장하는 무색 막 단백질 결정입니다. 이렇게 보입니다. 편광으로 볼 때 meso에서 자라는 무색 막 단백질 결정은 이렇거나 저렇게 보이고, 정상적인 빛으로 볼 때 meso에서 자라는 자연적인 색의 막 단백질은 이것 또는 저렇게 보입니다.

구조화된 측정의 전체 공정에서 다음 단계는 결정을 수확 및 극저온 냉각하고 결정에서 X선 회절을 기록 및 처리하는 것입니다. 이러한 항목은 이 시리즈의 별도 JoVE 문서에서 다룹니다.