다목적 미세 유체 칩의 직렬 결정학에 의한 효소의 결정화 및 구조적 결정: 기질 복합체

안녕하세요, 스트라스부르의 분자 및 세포 생물학 연구소에서 RNA의 실험실 아키텍처 및 반응성에 오신 것을 환영합니다. 잘 절개하는 결정은 어떤 결정학 연구에서든 중요한 단계입니다. 이 비디오에서는 생체 분자의 결정을 성장하고 시투 X 선 회절에 의해 3D 구조를 결정하기 위해 새로운 미세 유체 도구의 사용을 시연할 것입니다.

ChipX라는 미세 유체 장치는 몇 가지 장점을 제공합니다. 그것은 역확산 방법에 의해 결정화 자산을 소형화하고 용이하게하도록 설계되었습니다. 그것의 설정은 간단하고 표준 실험실 재료로 수행.

또한 연쇄 X선 결정예촬영으로 칩에서 자란 결정의 직접적인 특성화에 최적화되어 있습니다. ChipX는 결정 처리 및 저온 냉각 단계를 제거하고 현장에서 실온에서 분석되는 결정의 본질적인 품질을 보존합니다. ChipX는 현미경 슬라이드의 형식을 가지고, 7.5 에 의해 2.5 센티미터.

80 x 18 마이크로미터의 섹션과 4센티미터의 길이를 가진 결정화 챔버로 사용되는 8개의 미세 유체 채널을 포함하고 있습니다. 왼쪽입구는 저수지까지 8개의 채널을 채울 생체 분자 용액의 수동 주입을 허용합니다. 결정화 솔루션은 오른쪽에 있는 이러한 저장소에 증착됩니다.

결정화는 카운터 확산이라는 현상에 의해 유발됩니다. 결정화 제는 생체 분자 용액으로 확산되고 농도와 슈퍼 포화 그라데이션을 생성합니다. 채널을 따라 라벨과 보스트는 결정을 보다 쉽게 찾을 수 있도록 도와줍니다.

칩을 설정하려면 밀리리터당 5~10밀리그램의 일반적인 농도로 생체 분자 용액의 5~6개의 마이크로리터가 필요합니다. 마이크로리터 파라핀 오일 1개, 저수지당 결정화 용액 5개, 접착 테이프. ChipX의 로딩은 마이크로 파이프및 표준 팁으로 수동으로 수행됩니다.

이 예제에서는 주입 공정의 더 나은 시각화를 위해 파란색 샘플 솔루션이 사용됩니다. 누출을 방지하기 위해 팁은 칩에 수직으로 샘플 입구에 삽입됩니다. 파라핀 오일의 마이크로리터 1개는 샘플 이후에 적재되어 채널을 서로 분리합니다.

그런 다음 샘플 입구는 테이프로 밀봉됩니다. 8개의 저수지는 결정화 제용제 용액 5마이크로리터로 개별적으로 로드됩니다. 이렇게 하려면 파이펫 팁은 약 45도 각도로 채널 끝 부분에 배치됩니다.

이것은 시료와 결정화제 사이 기포의 형성을 방지합니다. 저수지는 스크리닝 또는 최적화를 위해 다양한 완충제, 폴리머 또는 염, 예를 들어 세테라를 포함하는 칵테일로 채워질 수 있습니다. 저장소는 테이프로 밀봉됩니다.

여기에서 설명했듯이 칩을 설정하는 것은 쉬우며 몇 분 밖에 걸리지 않습니다. ChipX에서는, 결정화는 카운터 확산에 의해 생깁니다. 저수지에 증착된 결정화제는 생체 분자를 포함하는 채널로 확산됩니다.

이것은 결정화를 트리거할 수 있는 농도및 슈퍼 포화의 그라데이션을 만듭니다. 이들은 채널 안쪽에 얻어진 효소의 결정의 보기입니다. 그(것)들은 80 x 80 마이크로미터의 단면이 있는 채널을 채우기 위하여 성장할 수 있습니다.

결정은 UV 빛 아래 트립토판 잔류물의 자연적인 형광을 사용하여 형광 현미경 검사법에 의해 ChipX에서 쉽게 검출될 수 있거나, 또는 형광 표지 단백질을 사용하여 여기에 도시된 바와 같이. 이 섹션에서는 스위스 의 필라그린스 스위스 광원에서 수행된 Chris 전신 분석을 보여줍니다. 칩은 추가 장비 나 특별한주의없이 싱크로트론에 수행 할 수 있습니다.

스위스 광원 의 홀에 들어가봅시다. 전자는 중앙 고리에서 순환하고 다른 빔라인에서 악용된 엑스레이를 포함하여 광범위한 전자파를 생성합니다. 이 비디오는 매크로 분자 결정촬영전용 빔라인인 X06에서 녹화되었습니다.

프로토콜은 하나의 싱크로트론 시설에서 다른 스트로트로로 변경될 수 있지만 전체 원칙은 동일하게 유지됩니다. ChipX는 3D 인쇄 홀더에 장착됩니다. 이 홀더는 표준 곤니오미터의 자석에 부착됩니다.

직렬 분석은 칩에서 자란 일련의 결정에서 일관된 수집 데이터를 수집합니다. 칩 채널을 따라 라벨과 보스트를 사용하여 결정 위치 목록이 설정됩니다. 연구원은 노란색 창에 의해 상징되는 엑스레이 빔에 있는 결정을 중심으로 칩을 이동합니다.

엑스레이 빔을 이용한 빠른 센터링 절차가 시작됩니다. 빔 정지가 제자리에 올라가고 검출기가 시료쪽으로 이동합니다. 그리드 스크리닝은 결정이 빔과 정렬되도록 수행됩니다.

동일한 절차는 칩을 30도 회전 한 후 반복됩니다. 두 번째 단계는 칩 재료가 관찰된 결정 위치에 대하여 회절 최대의 이동을 유도하는 시차 효과를 생성하기 때문에 중요합니다. 결정이 빔을 중심으로 하는 즉시 데이터 수집이 시작됩니다.

이 시퀀스는 실시간으로 데이터 수집을 보여 주어 있습니다. 칩이 30도 회전합니다. 한편, 해당 회절 이미지는 검출기에 의해 수집됩니다.

이 결정의 특성은 완료되었습니다. 칩은 채널의 다음 결정으로 변환되고 전체 절차가 반복됩니다. 이 분석은 크리스탈을 직접 취급하지 않고 실온에서 작동합니다.

그런 다음 일련의 결정에서 수집된 데이터를 병합하여 전자 밀도 맵을 계산하고 파란색으로 표시된 전자 밀도 맵을 계산하고 원자 모델을 빌드하는 데 사용되는 완전한 회절 데이터 집합을 얻습니다. 본 비디오에 기재된 절차는 tRNA 변형 효소의 구조적 특성화의 프레임에 적용되었다. 차가운 적응 박테리아, 플라노 코커스 할로크호필루스에서 CCA 추가 효소.

ChipX는 결정화제로 황화 암모늄의 존재에서 반대 확산에 의해 효소를 결정화하는 데 사용되었다. 20섭씨에서 며칠 간 잠복한 후, 피라미드형 결정이 채널을 따라 나타났습니다. 단백질의 형광 라벨링은 단백질 결정의 식별과 소금 결정에서의 차별을 촉진했습니다.

일련의 결정은 현장에서 실온에서 분석되었습니다. 이들의 회절 데이터는 합병되어 2.5 앙스트롬의 해상도로 APOE 효소의 결정 구조로 이어졌다. 또한, 칩 채널에서 환경의 확산은 결정을 축적하는 효소에 기판을 제공하기 위해 이용되었다.

본 경우, 싱크로트론 분석 이틀 전에 CTP 아날로그를 저수지 솔루션에 첨가하였다. 이것은 화합물이 확산하고 효소의 촉매 부위에 도달할 수 있었습니다. 2.3 앙스트롬의 해상도로 결정된 복합체의 결정 구조에서 볼 수 있듯이.

이 비디오에서 입증된 프로토콜은 일반적으로 적용 가능하며 다양한 생체 분자에서 테스트되었습니다. ChipX는 결정적 연구의 모든 단계를 통합하고 독특한 미세 유체 장치에서 결정 구조에 생체 의학 솔루션에서 갈 수 있습니다 실험실 칩 도구입니다. 이 비디오를 시청해 주셔서 감사합니다.

그리고 우리는 우리가 구체화하고 생체 분자에 의해 즐겨 찾기의 결정 구조를 결정하기 위해 ChipX를 사용하는 이점을 확신 바랍니다.