제자리에서 검색 및 핵 현미경 분석을 사용 하 여 금속 산화물 나노 입자의 단일 셀 정량화

나노 입자는 고유한 물리화학적 특성으로 인해 산업 및 의학 분야에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 그러나 장기간 나노 입자 노출과 관련된 인체 건강에 대한 우려는 지속되고 있습니다. 이러한 위험은 세포 내부의 나노 입자의 거동과 나노 입자에 대한 세포의 유도 대사 반응을 연구하여 정량화할 수 있습니다.

이는 부분적으로 sincle cell에서 내부화된 나노 입자를 검출하고 정량화할 수 있는 방법이 부족하기 때문입니다. 현미경 및 질량 분석법을 포함한 수많은 분석 도구를 사용하여 나노 입자의 세포 흡수를 추정할 수 있지만 이는 미시적 수준에서만 정성적 정보를 제공합니다. 반대로, 원자 분광법을 기반으로 하는 현장 방법은 샘플 준비에서 발생하는 이미징 아티팩트의 양을 줄이고 나노 입자를 직접 관찰할 수 있습니다.

이를 활용하기 위해 우리는 형광 태그가 있는 기본 상태 또는 실험실 침대에서 나노 입자를 연구할 수 있는 상관 관계 접근 방식을 제시합니다. 여기에서는 형광 현미경 검사와 핵 마이크로 프로브 분석의 조합을 기반으로 하는 방법을 설명합니다. 이것은 세포 밀도, 화학 원소 특수 분포 및 세포당 나노 입자의 양에 대한 이미지를 제공합니다.

실증으로, 우리는 형광 현미경과 핵 마이크로 프로브 분석을 사용하여 24 시간 동안 이산화 티타늄 나노 입자에 노출 된 세포를 연구합니다. 이 프로토콜의 경우 폴리머 PEEK로 만든 맞춤형 샘플 홀더가 필요합니다. 세포 배양 및 체외 관찰에 적합해야 합니다.

홀더를 2미크론 두께의 폴리카보네이트 호일로 덮습니다. 폴리카보네이트 호일은 Formvar 용액의 얇은 층으로 PEEK 접시에 접착됩니다. 장착한 후에는 시료 홀더를 멸균해야 합니다.

여러 개의 멸균 시료 홀더는 웰당 하나씩 사용에 필요할 때까지 멸균 12웰 플레이트에 보관할 수 있습니다. matrix row GFP plasmid로 transfection된 세포는 형광 현미경으로 검사하여 transfection이 성공적으로 이루어졌는지, 그리고 형광 단백질을 발현하는지 확인합니다. 트립신으로 세포를 채취하고 섭씨 37도에서 3분 동안 배양합니다.

신선한 배양 배지를 추가하여 트립신 작용을 중지합니다. 섭씨 4도에서 분당 1200회전으로 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 제거하고 적절한 양의 신선한 배양 배지를 첨가하십시오.

세포를 계수하고 신선하고 온도 조절된 완전한 배양 배지로 희석을 수행하여 마이크로리터당 500개의 세포 현탁액을 얻습니다. 폴리카보네이트 호일 중앙에 40마이크로리터 방울을 접시에 담습니다. 검체를 세포 배양기에 2시간 동안 조심스럽게 넣습니다.

신선한 배양 배지 2ml를 부드럽게 넣고 24시간 동안 그대로 둡니다. 형광 이변형 산화티타늄 나노 입자는 in vitro에서 나노 입자를 검출, 추적 및 국소화하기 위해 일반적으로 사용되는 형광단으로 설계, 합성 및 접목되었습니다. 이 단계를 위해 밀리리터당 1밀리그램 농도의 초순수에서 이산화티타늄 나노입자 현탁액을 이미 준비했어야 합니다.

실온에서 1분 길이의 강렬한 초음파 처리 펄스를 사용하여 나노 입자를 분산시킵니다. 나노 입자를 적절한 배양 배지에 희석하여 평방 센티미터당 4마이크로그램의 노출 현탁액을 얻습니다. 이전 세포 배양 배지를 이 새로운 나노입자 함유 배지로 전환하고 부드럽게 혼합하여 균일한 나노입자 분포를 달성합니다.

이산화티타늄 나노입자를 추가하지 않고 동일한 방식으로 대조군 세포 세트를 준비합니다. 세포 집단을 24시간 동안 배양합니다. 파라포름알데히드를 사용하여 이러한 샘플을 고정하고 형광 현미경을 사용하여 현장 및 단일 세포 이미징을 위해 처리할 수 있습니다.

그러나 극저온 물리적 고정은 세포 미세 구조와 생화학적 무결성을 보존합니다. 급락, 동결 고정은 밀리초 내에 세포 활동을 빠르게 중지하고 고정 화합물 사용을 피합니다. 세포를 극저온으로 고정하기 위해 다음을 수행합니다.

알루미늄 전사판을 액체 질소로 냉각하여 준비합니다. 액체 질소로 채워진 상자에 플레이트를 보관하고 플레이트 표면을 차가운 질소 증기에서 액체 위로 유지합니다. 충분한 양의 2-메틸부탄을 섭씨 150도까지 냉각합니다.

배양 배지로 50ml Falcon 1마리와 초순수로 Falcons 2개를 준비합니다. 샘플을 얼리기 전에 건조시키기 위해 흡수지가 근처에 있는지 확인하십시오. 배양 배지에서 세포를 한 번 헹구고 멸균 초순수에서 두 번 더 헹구어 배양 배지에 남아 있는 과도한 염을 제거합니다.

흡수성 종이에서 샘플을 빠르게 건조시킵니다. 식힌 2-메틸부탄에 세포를 30초 동안 급히 얼린 후 냉각된 알루미늄 전사판에 올려 놓습니다. 냉각판 표면에 수증기가 응결되는 것을 방지하기 위해 상자를 가능한 한 닫은 상태로 유지하는 것이 중요합니다.

모든 샘플을 동결한 후 다음 방법으로 동결 건조를 수행하여 물을 승화시킵니다. 먼저 저압 및 저온에서 12-24시간 동안 1차 건조를 수행합니다. 다음으로, 압력을 낮게 유지하고 플레이트 온도를 섭씨 40도로 상승시킨 상태에서 최소 24시간 동안 2차 건조 단계를 수행합니다.

동결 고정 후 샘플은 먼지와 습기로부터 보호되는 멸균 및 건조 상태에서 며칠 동안 실온에서 보관할 수 있습니다. 핵 마이크로프로브 분석은 프랑스 보르도에 있는 Ifera 시설에서 수행되었습니다. 3.5 메가볼트 싱글트론 입자 가속기는 메가전자 볼트 에너지 범위의 광 이온 빔을 전달합니다.

화학 원소 이미징은 상보적 이온 빔 분석 기술을 사용하여 마이크로프로브 빔라인에서 수행되었습니다. micro-PIXE, 입자 유도 X선 방출, STIM, 주사 투과 이온 현미경 및 micro-RBS, rutherford 후방 산란 분광법을 통해 사용되는 기술. 샘플은 분석 챔버 내부에 배치되고 다양한 이온 빔 분석을 수행하기 위해 진공 상태에서 다른 입자로 조사됩니다.

STIM은 밀도가 다른 세포 영역을 통과하는 에너지 입자를 기반으로 세포의 공중 밀도 지도를 기록하는 데 사용됩니다. Micro-PIXE 및 micro-RBS 분석은 단일 세포 수준에서 화학 원소의 공간 분포 및 정량화를 제공합니다. 1.5 메가 전자 볼트 양성자 마이크로 빔은 약 1 마이크로 미터의 직경까지 집중되고 STIM에 의해 식별되는 관심 세포를 가로 질러 스캔됩니다.

나트륨에서 티타늄에 이르기까지 샘플에 존재하는 원자에서 방출되는 X선을 통해 원소 농도를 측정할 수 있습니다. X선 강도를 정규화하는 데 필요한 들어오는 입자의 총 수를 측정하기 위해 후방 산란 양성자를 수집합니다. X선 검출기 반응을 보정하기 위해 원소 농도의 정량화를 위한 인증된 보정 표준을 보유하는 것이 중요합니다.

이온 빔 데이터를 분석하기 위해 ImageJ용 새 플러그인을 개발했습니다. 먼저 STIM 밀도 맵을 계산했습니다. 투과 철 현미경 이미지를 스캔할 때 대비는 밀도의 지역적 차이에 기인하며 핵 및 세포질과 같은 세포 구조를 검출할 수 있습니다.

한 번에 여러 맵을 처리할 수 있습니다. 각 맵은 들어오는 입자에서 전달되는 매체 에너지에 해당합니다. 데이터 분석의 두 번째 단계는 개별 세포 스펙트럼을 계산하는 것으로 구성됩니다.

입자 유도 X선 방출 분석은 샘플의 화학적 조성과 화학 원소의 원소 맵을 모두 생성합니다. 화학 원소 맵은 기록 시점의 빔 위치에 따라 광자를 정렬하고 특정 원소를 중심으로 하는 에너지 창을 선택한 후 계산됩니다. 맵은 일반적으로 빔 위치에서 감지된 이벤트의 수를 나타내며 정량적 데이터를 포함합니다.

선택한 각 원소에 대해 하나씩 화학 맵 스택이 계산됩니다. 각 세포에 대한 관심 영역은 인에 대한 PIXE 데이터를 사용하여 찾을 수 있습니다. 그런 다음 각 전체 세포에 해당하는 스펙트럼은 각 세포의 관심 영역에 걸쳐 개별 스펙트럼을 합산하여 계산됩니다.

여기에서 전용 PIXE 및 IBS 분석 소프트웨어를 사용하여 각 세포의 화학적 풍부도에 대한 정량적 데이터를 추출할 수 있습니다. 여기에서는 파라포름알데히드 고정 후 세포의 형광 이미지를 보여줍니다. 맨 윗줄은 이산화티타늄 나노입자에 노출되지 않은 세포를 보여주고 맨 아래 줄은 노출된 세포를 보여줍니다.

파란색 채널은 세포핵, 녹색 채널은 미토콘드리아, 빨간색 채널은 티타늄을 나타냅니다. 제어 장치에 이산화 티타늄이 존재하지 않는다는 것을 분명히 알 수 있습니다. 오른쪽의 병합된 채널에서 나노 입자는 세포질에서만 발견되고 미토콘드리아에서는 제외되는 것을 볼 수 있습니다.

그러나 이 방법에는 나노 입자 농도에 대한 정량적 정보가 부족합니다. 핵 마이크로프로브 분석은 이를 제공할 수 있기를 희망할 수 있습니다. 이 이미지는 모두 다양한 마이크로프로브 분석 기술을 사용하여 촬영되었습니다.

다시 말하지만, 맨 위 줄에는 대조 세포가 표시되고 맨 아래 줄에는 티타늄 나노 입자가 포함된 세포가 표시됩니다. 가장 왼쪽 이미지는 극저온으로 고정된 세포의 밀도에 대한 STIM 측정값을 보여줍니다. 다음 3개의 패널은 PIXE에 의해 얻어진 세포에 존재하는 칼륨, 인 및 티타늄의 풍부함을 보여줍니다.

다시 말하지만, 티타늄은 대조군이나 세포핵에 침투하지 않습니다. 세포 단위로 티타늄의 흡수를 정량화하기 위해 가장 오른쪽 패널에 표시된 세포 경계를 기반으로 관심 영역을 정의하고 이러한 영역의 원소 풍부도를 측정합니다. 이러한 PIXE 측정에서 우리는 대조군과 노출된 집단에 대한 단일 세포 수준에서 원소 풍부도의 분포를 표시했습니다.

대조군 모집단은 흰색으로 표시되고, 노출된 모집단은 노란색으로 표시됩니다. 여기에 존재하는 티타늄의 중간 함량은 평방 센티미터당 4마이크로그램의 노출 선량에 비해 상당히 낮습니다. 티타늄 흡수 범위는 제곱센티미터당 0.2마이크로그램에서 제곱센티미터당 1.8마이크로그램까지 인구 전반에 걸쳐 큰 차이를 보여줍니다.

우리는 또한 나노 입자에 노출된 샘플에서 칼륨 및 칼슘과 같은 유리 세포 내 이온의 증가를 발견했으며, 이는 이산화티타늄 나노 입자의 존재에 의해 유도된 세포 항상성의 변화를 시사합니다. 핵 마이크로프로브 분석은 세포 내 수준에서 유용한 정보를 제공할 수 있으며 생물학적 샘플을 구성하는 화학 원소의 정량화를 제공할 수 있습니다. 이러한 기술은 많은 이점을 제공합니다.

첫째, 화학적 고정이 필요하지 않은 시료 준비. 둘째, 추가 관심 영역에 집중할 수 있는 능력으로 더 넓은 영역을 연구할 수 있는 가능성입니다. 셋째, 그램당 몇 마이크로그램의 감도를 가진 화학 원소의 정량화.

넷째, 핵(nucleus), 핵소질(nucleolus), 세포질(cytoplasm)과 같은 세포 구획의 식별. 단일 세포에서 나노 입자의 내재화를 연구할 때 이들에 대한 정확한 측정은 정량적 나노 입자 독성학에 필수적입니다. 여기에서 연구된 사례에서 볼 수 있듯이 개별 세포 내에서 나노 입자를 관찰하고 정량화할 수 있는 능력을 통해 금속 산화물 나노 입자와 같은 내인성 및 외인성 화학 원소의 가치 축적을 더 잘 이해할 수 있습니다.

이 프로토콜은 살아있는 세포와의 나노 입자 상호 작용에 대한 향후 연구를 위한 핵 마이크로프로브 분석의 적합성을 강조합니다. 정량적 접근 방식은 검출, 식별, 국소화 및 정량화 측면에서 이러한 나노 입자의 영향에 대한 정보와 네이티브 및 화학적 변형 나노 입자 모두에 대한 단일 세포 수준에 대한 정보를 제공합니다.