Name: 제자리에서 검색 및 핵 현미경 분석을 사용 하 여 금속 산화물 나노 입자의 단일 셀 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: 학습하세요 인간 세포 내 금속 산화물 나노입자의 제자리 검색 및 단일 세포 정량화 방법을. 원자 분광법과 핵 현미경 분석을 결합하여 나노입자 세포 흡수와 대사 반응을 정량적으로 연구합니다.

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우리 감사 Serge Borderes 감독 및 비디오의 편집. 프랑스 국립 연구 기관 연구 프로그램 TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01)을 지원합니다. CNRS와 통합 활동으로 유럽 공동체 "지원의 공공 및 산업 연구를 사용 하 여 이온 빔 기술 (정신)" EC 계약 n ° 227012에서 제공. 이 작품 EC 계약 번호 317169 마리 퀴리 작업-초기 교육 네트워크 (ITN) "통합 활동 지원 대학원 연구와 인턴쉽에 산업 및 교육 우수" (스프라이트, D1.3)로 지원 되어 있다. C'NANO 그랜드 Sud Ouest 및 지역 아키텐 연구 프로그램 TOX-나노 (n ° 20111201003)와 POPRA (n ° 14006636-034) 연구 프로그램을 지원합니다.

1. 샘플 홀더 준비
<ol><li>
샘플 홀더 설계 및 준비
	<ol>
<li>1 m m 두께 픽 프레임에 5mm x 5mm 스퀘어 드릴 여 샘플 홀더를 제조 한다.</li>
		<li>에탄올 70% (v/v)로 헹 궈 서 깨끗 하 고 살 균 판에 사용할 준비가 될 때까지 계속. 참고입니다. 세포 배양 및 세포 처리에 대 한 적절 한 샘플 홀더는 필요 합니다. 그것은 세포 배양, 체 외에서 관찰 광학 현미경 검사 법, 그리고 핵 현미경 분석 및 이미징에 대 한 설계 될 필요가 있다. 이 홀더는 슬쩍 프레임13의 이루어집니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플 홀더 준비<ol>
<li>클로 프롬의 100 ml에서 Formvar 분말의 1 mg를 용 해 하 여 Formvar 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>아니 배 선물을 금속 프레임에 폴 리카 보 네이트 호 일을 스트레칭.</li>
		<li>멸 균 팁을 사용 하 여 샘플 홀더 구멍 주위 Formvar 솔루션을 확산.</li>
		<li>섬세 하 게 샘플 홀더 뻗어 폴 리 카보 네이트 호 일 (5mm x 5mm 스퀘어)에 접착제를 내려 놔.</li>
		<li>각 복제에 대 한 하나의 샘플 홀더를 준비 하려면 이전 시퀀스를 반복 합니다. 참고입니다. 폴 리카 보 네이트 (PC) 영화는 생체, 충분히 두껍고 다른 프로토콜 및 분석 제약. 주의-클로 프롬은 독성이 있습니다. 흡입, 섭취를 피 하거나 피부 접촉. 항상 제대로 작동 화학 증기 두건 및 적절 한 필터를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플 홀더 살 균<ol>
<li>인큐베이터/교 반기를 사용 하 여 에탄올 70% (v/v), 180 rpm 및 +37 ° C 동요의 50 mL와 원뿔 플라스 크에 탑재 된 샘플 홀더를 놓습니다.</li>
		<li>홀더를 살 균 증류수에 여러 번 헹 구 십시오.</li>
		<li>공기 메 마른 조건에서 그들을 건조 하 고 각 면에 30 분 동안 자외선 (Biosafety 벤치, 클래스 II에서에서 살 균 램프)에 그들을 노출.</li>
		<li>사용할 준비가 될 때까지 무 균 12-잘 접시 (우물 당 1 개 견본 홀더)에서 샘플을 유지. 참고: 여러 샘플 홀더 살 균과 건조 12-잘 접시 몇 일 동안 parafilm으로 밀봉 상 온에서 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 적절 한 샘플 홀더 셀의 성장.
주의: 프로토콜은 biosafety 층 류 벤치 (종류 II) 오염 미생물 제외 하에 실시 해야 합니다. 장갑과 항생제 (예: 페니실린, 스)를 처리 합니다. (셀 라인, 유전자 변형 인간 세포 파생) 생물 학적 자료를 처리할 때 유용한 정보를 존중 합니다.
중요: 사용 세포 선 그들은 하지와 Mycoplasma감염을 확인 하 여야 한다.
<ol><li>매트릭스-roGFP 17,,1819 transfection 메서드를 사용 하 여 프로토콜 제조 업체에 의해 설립에 따라 베어링 플라스 미드와 U2OS 셀 라인 transfect.</li>
	<li>플라스 미드-휴대용 transfection를 확인 하는 바이오 센서 및 손실을 방지 하기 위해 플라스 미드를 선택 하 고 적절 한 문화 매체에 transfected 세포를 유지.</li>
	<li>형광 현미경 검사 법은 transfection 발생 했습니다 보장 형광의 표현과 관으로 미토 콘 드 리아 네트워크19의 표시를 확인 하 고 여 transfected 세포를 시각화. 일시 중지 포인트: 셀 몇 년 동안 액체 질소에 동결 될 수 있습니다.</li>
	<li>적절 한 매체에서 세포를 배양 하 여 transfected 세포 인구를 사용 하 여 하위 confluent 세포 인구를 얻기 위하여. 37 ° C, 5% (v/v) CO2 포화 물 분위기에서에서 세포 성장.</li>
	<li>씨와 같은 그들은 80% 합류에 정착의 하루는 농도에 세포. 일반적으로, µ L 당 500 세포의 농도 사용 될 수 있습니다. 0.25% Trypsin EDTA의 400 µ L를 사용 하 여 셀 (v/v)을 수확 하 고 37 ° c.에 3 분 동안 유지 문화 매체의 1 mL와 트립 신 작업을 중지 합니다. 230 x g와 + 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리 하 여 세포를 작은, 다음 상쾌한, 제거 하 고 신선한 문화 매체의 원하는 볼륨 추가. 참고. 프로토콜은 모든 세포 종류에 적용 하 고 시드 셀 수와 시간을 두 배로 하는 셀에 셀 크기에 따라 달라 집니다. 주의: 트립 신, 항생제, 및 혈 청 반복된 freeze-thaw 주기를 겪고 하지 마십시오. 살 균 보관. Aliquots로 재고 솔루션을 분할 하 고 −20 ° c.에서 그들을 멈추게합니다 만료 날짜까지에 aliquots를 저장 합니다. 신중 하 게는 트립 신을 완전히 제거 하려면 셀 펠 릿을 씻어. 잔여 trypsin의 지연 하 고 도금 효율 감소.</li>
	<li>셀을 계산 하 고 µ L 당 500 세포와 세포 현 탁 액을 얻기 위하여 37 ° C에서 유지 하는 신선한 완전 한 문화 매체와 희석을 수행 합니다. 참고: 세포 현 탁 액의 농도 40 µ L 드롭 접시 위해서는 세포 유형의 기능으로 적용할 수 있다.</li>
	<li>폴 리 카보 네이트 호 일의 중심에 40 µ L 드롭 접시 신중 하 게 포화 물 분위기에서 +37 ° C에서 2 h, 5% (v/v) CO2 에 대 한 샘플을 놓습니다. 중요 한: 샘플 인큐베이터에 배치 되 면 최대한 빠른 셀 첨부 파일 하나를 어떤 기계적인 운동을 제한 합니다. 셀 형식에 따라 최적의 platting 효율성을 위한 2 시간 이상 세포를 품 어 해야 할 수 있습니다. 체크 방울 증발 하지 않도록 포화 인큐베이터 분위기는 잘.</li>
	<li>세포는 광학 현미경을 사용 하 여 폴 리카 보 네이트 호 일에 잘 연결 되는지 확인 합니다. 부드럽게 신선한 완전 한 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 24 시간 동안 계속.</li>
</ol>3. 나노 준비 및 노출
참고: 형광 염료 수정 티 오2 NPs 했다 설계, 합성, 그리고 화학적 tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC)로 변경. 20 , 21 이 표면 개 질 나노 입자 감지, 추적 및 지역화에 제자리에 및 cellulo에 생활 및 고정 세포 또는 다세포 생물을 수 있습니다. 12 , 13 , 18
주의: 나노 소재 및 나노 치료와 함께 처리 되어야 합니다. 흡입, 섭취를 피 하거나 피부 접촉. 공기에서 보급을 방지 하기 위해, 나노 솔루션 (초순)에 유지 됩니다.
<ol><li>티 오2 초순에 NPs의 1 mg.mL− 1 의 현 탁 액을 준비 합니다. 티 오2 NPs RT에서 강렬한 1 분 쥡니다 펄스를 사용 하 여 분산 (750 W, 20 kHz, 진폭: 30%)는 초음파 발생기와 전용된 원뿔 현미경을 사용 하 여.</li>
	<li>4 µg.cm−2 (최종 농도)의 노출 중단을 얻기 위해 티 오2 NPs에서 문화 매체에서 원하는 농도 희석. 적절 한 양의 셀에 중간 포함 NPs와 매체를 장착 하 고 티 오2 NPs의 추가 없이 마찬가지로 컨트롤 셀 티 오2 NPs 준비의 균질 배급에 대 한 부드럽게 혼합.</li>
	<li>37 ° C, 5% (v/v) CO2 와 포화 물 분위기에서 24 h에 대 한 세포 인구를 품 어.</li>
</ol>4. paraformaldehyde 기정 그리고 형광 현미경
<ol><li>인산 염 버퍼 (PBS, pH 7.4)에 버퍼 paraformaldehyde 솔루션 (PFA, 4 %w / v)의 새로운 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>100 ml PBS의 PFA 가루 4g을 디졸브. 증기 두건에서 자석 및 자석 교 반기를 사용 하 여 교 반 하면서 65 ° C에 솔루션을 열. 해결 될 때까지 한 번에 1 M NaOH 한 방울을 추가 하 여 pH를 증가. 실내 온도에 해결책을 냉각 하 고 pH 7.4에 조정. 즉시 갓된 솔루션을 사용 하 여 또는 + 4 ° C에서 유지 하 고 빛 으로부터 보호. 참고: 그러나 더 나은 품질의 고정 및 고정된 샘플의 장기 보존을 보장 하는 PFA의 임기 응 변의 준비 미리 만든된 PFA 솔루션을 사용할 수 있습니다. 주의: PFA는 독성; 흡입, 섭취를 피 하거나 피부 접촉. 항상 제대로 작동 화학 증기 두건 및 적절 한 필터를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>일단, 보육 시간 경과, 포함 된 티 오2 NPs 린스 한번 신선한 문화 매체와 함께 한 번 PBS (2 mL)는 세포 인구 세포 배양 매체를 제거 합니다. PBS를 제거, 신속 하 게 신선 하 고 차가운 PFA (4 %w / v, + 4 ° C)의 약 수와 린스.<ol>
<li>PFA (2 mL, 4 %w / v, + 4 ° C)를 추가 합니다. 실 온에서 15 분을 품 어.</li>
		<li>제거는 PFA, 동요에서 PBS (2 mL, 3 시간, 5 분)와 셀 린스. 일시 중지 포인트: 이러한 화학적 샘플 고정 형광 이미징 (단계 5로 이동) 후 "급락-동결" 절차에 사용할 수 있습니다 또는 형광 이미징 (4.3 단계로 이동)에 사용.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hoechst33342 PBS에서 10 분 셀 잠복기와 핵을 얼룩. 500의 최종 농도에 사용 되는 Hoescht33342 nM. 부 화 후 솔루션을 제거 하 고 PBS로 씻어. 주의: Hoechst33342 셀 permeant 이며 독성이 있을 수 있습니다. 직접 접촉을 방지 하 고 장갑을 준비 하는 동안 Hoechst33342를 사용 하 여 사용. 중요: Hoechst33342 솔루션 얼룩은 갓 준비 하 고 메 마른 조건에서 유지.</li>
	<li>프로세스 현장 및 형광 현미경 검사 법 (그림 1)를 사용 하 여 단일 셀 이미징에 대 한 샘플 고정.</li>
</ol>5. "식이 어" 고정 및 탈수
<ol><li>액체 질소에 냉각 하 여 알루미늄 전송 접시를 준비 합니다. 저장소 상자에 접시 액체 질소로 채워진 고 차가운 질소 증기에 액체 위에 접시 표면 유지. 참고: 어떤 금속 격판덮개의 전송 접시를 만들 수 있습니다 (여기서, 우리가 알루미늄을 사용)는 액체 질소 온도, 냉각 수 고 그 동결 건조 시료 챔버를 입력할 수 있습니다. 중요 한: 상자 지켜져야 한다 폐쇄 가능한 한 많이 찬 격판덮개 표면에 수증기 공 술 서를 방지 하기 위하여. 샘플 준비 하는 동안에 저장 된 액체 질소에 의해 포함 되지 않습니다 한다.</li>
	<li>세포 배양에 한 번 헹 구 고 두 번 더, 짧게, 살 균과 초순 물의 얻을 제거 나머지 extracellular 소금의 흔적. 중요 한: 미디어는 갓 준비 하 고 메 마른 조건에서 유지를 확인 합니다. 사용 되기 전에 37 ° C에서 모든 미디어를 열. 린스는 아주 짧은 (몇 초) 하며 샘플에 액체의 초과 제거 가능한 한 빨리.</li>
	<li>식이-동결 세포-150 ° c 액체 질소 냉장 2-methylbutane 30 s 및 장소 중에서 알루미늄에 그들 격판덮개 전송. 다른 모든 샘플의 준비 하는 동안 여기 샘플을 저장 합니다. 샘플 모든 cryofixed 때, 모든-에-한 번 전송 접시 동결 건조 기에 배치 하 여 전송 합니다. 중요 한: 전반적인 cryofixation 프로세스 구조 수정 전송 상자에 임시로 저장 하는 샘플에 표시를 방지 하기 위해 20 분 이상 지속 하지.</li>
	<li>다음 시퀀스를 사용 하 여 샘플을 freeze-dry: 1) 낮은 압력과 낮은 온도에서 12 ~ 24 h (-99 ° C, 10-3 mbar)에 대 한 기본 건조 수행 후 2) 판 온도를 증가 적어도 24 h에 대 한 보조 건조 단계 수행 + 40 ° C (+ 40 ° C, 10-3 mbar) 압력 낮은 유지 하는 동안. 주의: 액체 질소는 매우 추운 이며 접촉 시 심한 동상 또는 눈 손상 될 수 있습니다. 전송에 대 한 적응된 벤치 최고 컨테이너를 사용 하 고 (극저온 장갑, 눈과 얼굴 보호) 안전 장비를 착용. 주의: 2 Methylbutane는 매우 가연성. 공기의 유해한 오염 + 20 ° c.에이 물질의 증발에 오히려 신속 하 게 도달 될 수 있다 흡입, 섭취를 피 하거나 피부 접촉. 사용 하 여 호흡과 눈 보호 및 보호 장갑. 항상 제대로 작동 화학 연기 후드를 사용 하 여. + 4 ° c.에 저장 될 수 있습니다. 중요 한: "급락-동결" 세션 2-Methylbutane 온도 모니터링 하는 적절 한 온도계 (-150 ° C)를 사용 합니다. 2-methylbutane 액체 단계에서 유지 되어야 한다. 주변 분위기에 cryofixed 샘플을 전송 하는 것은 온도 증가 또는 샘플 표면에 집 광 수증기 세포 손상을 발생할 수 있습니다. 따라서, 전송 한다 합리적으로 가능한 한 빨리 (30 s) 일시 중지 포인트: Cryofixation, 후 샘플 (먼지와 습기 로부터 보호) 살 균과 건조 조건에서 몇 일 동안 실내 온도에 저장 수 있습니다. 신중 하 게 좋은 집게와 샘플을 처리 하 고 parafilm으로 밀봉 살 균 12-잘 접시에 그들을 배치. 건조 시키는 건조 한 분위기를 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>6. 핵 현미경 분석
참고: 핵 현미경 분석 실시 되었다 보완 이온 빔 분석 기법 입자 유도 된 x 선 방출 (µ-를 사용 하 여 AIFIRA (응용 프로그램 Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions en 지구의 아키텐)의 microbeam 라인에 PIXE) 및 스캐닝 전송 이온 현미경 검사 법 (μ-STIM). 시설 제공 빛 이온 빔 백만 전자 볼트 에너지 범위에 3.5 MV 입자 가속기를 기반으로 합니다. 22 , 23
일시 중지 포인트: AIFIRA 제안 된 실험의 과학적 평가 후 국내 및 국제 팀에 대 한 액세스를 제공 하는 보르도의 대학에 의해 접대 하는 이온 빔 시설입니다.
<ol><li>양면 테이프를 사용 하 여 apertured 접시에 슬쩍 시료 홀더를 탑재 합니다.</li>
	<li>수직 빔 방향에 수직인 평면에서 샘플을 지 원하는 접시를 놓습니다.</li>
	<li>분석 챔버를 닫고 분석 챔버를 진공.</li>
	<li>스캔 전송 이온 현미경 검사 법 (μ-STIM) 참고: STIM 사용 됩니다 세포 질량, 에너지 손실의 변환 후 셀의 영역 밀도 지도 기록 에너지 손실은 이다 (µg.cm-2에서 표현) 샘플 면 적당 밀도에 비례 하는 사실을 활용.<ol>
<li>2 MeV의 헬륨 (그+) microbeam를 사용 하 여 약 300의 초점면에 크기와 프로브로 nm 직경에서 및 낮은 유창 (2000 ions.s-1). 평면 실리콘 검출기 (PIPS 검출기, 25 m m2, 5.4 MeV @ 11 keV 에너지 분해능), 전송 된 이온의 측정 에너지 빔 축에 샘플 뒤에 배치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>입자 유도 x 선 방출 (µ-PIXE) 및 러더포드 Backscattering 분석 (µ-RBS). 참고: µ Pixe 및 µ-RBS 분석 공간 배급 및 서브 마이크로미터 해상도와 화학 성분의 정량화를 제공합니다.<ol>
<li>8 시간 4에서 STIM와 약 100 x 100 µ m2에 의해 발견 하는 관심의 동일한 셀에 1 µ m 및 스캔의 직경까지 집중 1.5 MeV 양성자 (H+) microbeam (50-150 pA)를 사용 합니다.</li>
		<li>원자는 고해상도 Si(Li) 고체 검출기 (145 eV 에너지 분해능, @Mn-Kα)에 의해 (나 보다 더 무거운) 샘플에 들어오는 광속 축에서 45 °에 위치에서 방출 된 유도 x 선 광자를 수집 합니다. 검색 된 광자 에너지를 사용 하 여 미터 (요소 예: Z) 및 x 선 강도 요소 농도 결정의 성격을 파악.</li>
		<li>실리콘 검출기-135 °에 다시 흩어져 양자를 동시에 수집 (부분적으로 고갈된 검출기, 25 m m2, 11 케빈 5.4 MeV @ FWHM) 들어오는 입자의 총 수를 측정 하 고 x 선 강도 정상화를. 중요 한: 원자 농도 정량화에 대 한 인증된 교정 표준 컬렉션 x 선 검출기 응답을 보정 하기 위해 사용 됩니다. 참고 자료는 6.3 µ m 두께 Mylar 포 일에 원자 박막의 모음. 20.2 0.6 (Li, K 선)에서 x 선 에너지 범위 방출 케빈 (Rh, K 선).</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 데이터 분석
<ol><li>ImageJ를 위한 IBA J 플러그인을 사용 하 여 화학 원소 지도 재구성 합니다. 24 참고: ImageJ 위한 플러그인의 형태로 전용된 소프트웨어 원시 핵 현미경 분석 데이터를 처리 하도록 개발 되었습니다. 원시 데이터 연대기 순서로 빔 위치와 함께 기록 됩니다 세포와 상호 작용 입자 빔에서에서 발생 하는 이벤트의 목록에 해당 합니다.<ol>
<li>IBA J 플러그인을 사용 하 여 정렬 유형에 따라 이벤트: 이온 에너지 (STIM) 전송, backscattered 이온 에너지 (RBS) 또는 x 선 광자 에너지 (PIXE). 그런 다음 별도로 각 유형의 데이터를 처리 합니다.</li>
		<li>STIM 지도 밀도 계산</li>
		<li>평균 x 선 광자 에너지 스펙트럼을 계산 하 고 요소 공간 분포를 검색 하려면 관심 있는 에너지 창 각 화학 원소에 대 한 정의.</li>
		<li>관심 (ROI) (예: 개별 셀, 조밀한 구조, 집계, 등등.) 영역을 정의 하 고 해당 x 선 스펙트럼을 계산.</li>
	</ol>
</li>
	<li>입사 입자25의 총 수를 계산 하려면 해당 RBS 스펙트럼을 분석 합니다.</li>
	<li>26 Gupix 소프트웨어 사용 하 여 각 ROI에 대 한 요소 농도 결정 하는 x 선 스펙트럼에 맞게. 참고: 방법에 대 한 탐지 (LOD)의 일반적인 제한 요소 (LOD는 Z와 감소)의 원자 번호에 따라 건조 질량 범위 1 ~ 10 µg.g-1 에.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

우리는 subcellular 수준에서 특히 다른 이미징 기술로 가능한 유용한 정보를 제공 하는 방법을 설명 합니다. 이미징 능력, 더불어 핵 현미경 분석 또한 생물 학적 샘플의 구성에서 입력 하는 화학 성분의 정량화의 가능성을 제공 합니다. 현재 작업에서 우리 인간의 세포 인구를 공부 하 고 티 오2 NPs에 노출 하는 단일 셀에 따라 관심의 선택한 영역의 분석으로 집중. 다른 기술을 조합 원소 화학 성분에 형태학 상 세포 이미징 및 정확한 정량적 데이터를 제공합니다.
성공적으로 적용 하려면 핵 현미경 분석, 존중 하는 잠재적인 함정을 피하기 위해 다음 사항을 필수입니다. 첫째, 열 대권 외의의 및 생화학의 무결성을 유지 하기 위해 셀 고정을 위한 극저온 프로토콜을 사용 하는 것이 필수적입니다. 둘째, 그것은 또한 아래 20 µ m 두께 얇은 샘플 분석을 수행 하는 필수입니다. 필요한 경우, cryofixed 샘플의 단면을 수행할 수 수 있습니다. 샘플은 절대...

세포질 항상성 이해 컨트롤, 동화 작용, 및 다른 성분 (이온, 금속, 세 무기 화합물)의 세포내 지역화에 의해 결정 됩니다. 이러한 구성 요소 추적의 형태로 자주 하지만 그럼에도 불구 하 고 시스템 생리학에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 정상 및 병리학/스트레스 상황에서 세포 생화학의 연구 세포 대사 메커니즘에 대 한 전반적인 이해 향한 키 단계입니다. 따라서, 세포내 화학 나타났는데, 구조적 조직 및 그들의 관련된 대사 기능 조사를 사용 하는 이미징 및 분석 기술의 개발이 필요한 됩니다. 아주 몇 가지 방법이 제자리에 정량의 한 조각이 주어진된 샘플의 전반적인 화학 본질에 관한 정보를 제공할 수 있습니다. 벌크 형태로 샘플을 분석 하는 방법 외에도 현장에서 분석 고려 생물 학적 샘플 자신의 완전에 질량과 구조 정보, 그로 인하여 그들의 구성 화학 물질 (미 량 원소와 이온) 보존을 잃지 않고, 단백질입니다. 또한, 지속적으로 개발 하는 nanosciences, 향상 된 이미징 및 세포 규모 환경 모니터링에 대 한 분석 방법 됩니다 관찰 하 고 계량 나노 개체 동작 및 상호 작용 하는 데 필요한. 1
나노 (NPs) 전시 범위 1와 100 nm에 최소한 하나의 얼굴 차원으로 정의 되었습니다. 2 그들의 특정 물리 화학적 특성 때문에 NPs는 광범위 하 게 업계에서 사용. NPs는 nanomedicine 및 바이오 응용 프로그램에서 채택 된다. 3 , 4 NPs의 수많은 물리 화학적 특성에도 불구 하 고 인간의 건강 및 환경에 불리 한 영향의 몇 가지 위험을 생성할 수 있습니다 그들은. 이러한 위험 다양 한 농도 수준에서 장기간 및 반복 노출에 의해 유도 될 수 있다 그리고 이것은 아직 명확 하 게 설립 되지. 5 , 6 , 7 , 8 특히, 셀과 연결 된 세포질 응답 내부 NPs의 운명은, 날짜, 완전히 설명. 이것은 탐지를 허용 하는 방법의 부족 및 정량화는 단일 셀에 내 면된 NPs의 일부입니다. 9
나노 입자의 셀룰러 복용량 microscopies, 질량 분석 (MS), 추정 하는 데 사용 하는 고전 분석 도구 유도 결합 플라즈마 (ICP-MS) MS10,11 및 액체 크로마토그래피 석사 (LC-석사), 하지만 그들은 단지 제공 거시적인 규모에서 유용한 정보입니다. 그들 중 누구도 subcellular NPs 콘텐츠 분류 방법의 사용 없이 NPs 배급의 정확한 평가 제공할 수 있습니다. 복용량 응답의 체계적인 평가 불가능 따라서 이러한 방법으로, 반대로 핵 현미경 분석12,13, 싱크 로트 론 x-선 형광 현미경14 같은 원자 분광학에 기반으로 하는 방법 , 그리고 2 차 이온 질량 분석 (SIMS). 15 , 16 그들은 형광 현미경을 사용 하 여 만든 관측을 보완, NPs 형광 분자와 함께 표시 될 수 없습니다 및 따라서 그들의 네이티브 국가에서 공부 하는 경우에 특히 이러한 방법은 특히 흥미 있다. 어느 정도까지, NPs는 fluorophores, 함께 융합 하는 경우에 (i) 정량화 남아 어려운 NP 당 태그 수준 알려져 있기 때문에 (ii) NP 표면 화학 수정 세포의 분포를 수정할 수 있습니다.
이 문서에서는, 우리가 이미징 형태학 및 주, 부, 생물학 견본의 원소 구성에 핵 현미경 기술의 조합에 따라 방법에 집중 하 고 농도 추적.
원자력 현미경 분석 특히 생물학 조직에 화학 성분의 측정에 적합을 증명 한다. 빔 측면 해상도 (0.3 ~ 1 μ m) 및 화학 원소 검출에서 감도 (1 ~ 10 µg.g-1 건조 질량)는 세포 수준에서 연구 하는 데 적합 하다. 원자력 현미경 기법 샘플에 존재 원자와 상호 작용 하는 (일반적으로 MeV 에너지에서 실행 되는) 이온 빔 후 방출 입자 검출 (광자, 전자, 이온)를 기반으로 합니다. 셀에 발생 하는 상호 작용은 주로: 1) 여기/이온화 원자 원자를 기본 상태로; 반환 후 광자의 방출 다음의 그리고 2) 그들의 에너지와 방향을 선도 하는 들어오는 입자의 확산. 상호 작용에 관련 된 원자의 방출된 입자 에너지 allowsthe 식별 측정. 요소의 매핑을 수행 하 이온 microbeam는 반복 검색 샘플 표면에 종종 100 µ m2 여러 셀을 포함 하 여 약 100의 지역. 내보낸된 입자 감지 하 고 그들의 에너지는 각 광속 위치에 대 한 기록. 빔 위치에 따라 입자의 정렬, 데이터 처리의 목표는 이러한 입자의 방출에 대 한 책임 구조를 따라서 식별. 여기, 우리는 정확 하 게 형광 현미경 검사 법 및 핵 현미경 분석 검색으로 생활 NP 상호 작용의 결과 조사 하기 위하여 세포질과 세포 하위 스케일에서 exogenous NPs를 계량에 따라 접근을 설명 시스템입니다. 우리는 특히 제자리에 정량화 subcellular 수준에서 이산화 티타늄 나노 (티 오2 NPs)의 관점에서이 방법으로 제공 하는 기회에 집중 한다.

<table><tbody><tr><td><강한>세포 배양</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>U2OS</td><td>ATCC, LGC 표준</td><td>ATCC HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>중간 MCCOY 5A w/o L-글루타민</td><td>Dominique DUTSCHER</td><td>L0211-500</td><td></td></tr><tr><td>FBS 500 mL</td><td>Dominique DUTSCHER</td><td>500105U</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; L-글루타민 200 mM, 100 mL&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin,&nbsp; 20 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10092772</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25% (v/v)&nbsp; 500 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11570626</td><td></td></tr><tr><td>Viromer Red</td><td>Lipocalyx</td><td>VR-01LB-01</td><td></td></tr><tr><td>Matrix-roGFP Plasmid</td><td>AddGene</td><td>#49437</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>H3570</td><td>취급 주의</td></tr><tr><td>NPs preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TiO2 P25 AEROXIDE</td><td>Degussa/Evonik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T3163</td><td>Surface modification of NPs</td></tr><tr><td>Sample preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리카보네이트 호일</td><td>Goodfellow</td><td>CT301020</td><td></td></tr><tr><td>폴리에테르 에테르 케톤 지원 (PEEK)</td><td>Matechplast</td><td>A-239-4047</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, ACS 절대</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>02860-6x1L</td><td></td></tr><tr><td>클로르포름, 무수, 99%</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>372978-1L&nbsp;</td><td>주의: 독성</td></tr><tr><td>Formvar 100 g</td><td>한천 과학</td><td>AGR1201</td><td>유해합니다. 10 &micro의 농도에서 사용하십시오. 클로로포름</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>시그마 알드리치</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td><강한>샘플 고정</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>분말, 95% 파라포름알데히드</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>158127-500G</td><td>주의 독성. PBS</td></tr><tr><td>PBS(pH 7.4, Ca2+ 및 Mg2+ 제외)</td>에서 4% 용액으로 사용<td>ThermoFisher Scientific</td><td>11503387</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>93443</td><td>유해한</td></tr><tr><td><강한>시료 동결 고정</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td>공기 액체 sante</td><td></td><td>유해한</td></tr><tr><td>메틸부탄 >=99%</td><td>SIGMA-ALDRICH&</td><td>nbsp; M32631-1L</td><td>주의 독성</td></tr><tr><td>알루미늄 전사판</td><td>집에서 만든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>증류수 및 탈이온수</td><td>집에서 만든</td><td></td><td>Barnstead Smart2Pure</td></tr><tr><td>시스템 Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barnstead Smart2Pure</td><td>ThermoFisher를 사용하여 제작됨 과학</td><td>50129870</td><td></td></tr><tr><td>생물안전 벤치, 클래스 II</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MSC-Advantage</td><td></td></tr><tr><td>TC20 자동 세포 카운터</td><td>Biorad</td><td>145-0102SP</td><td></td></tr><tr><td>세는 슬라이드 2 웰</td><td>Biorad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>PIPS 검출기, 25 mm2, 12 keV 에너지 해상도 @5.5 MeV</td><td>캔버라&nbsp;</td><td>PD25-12-100AM</td><td></td></tr><tr><td>고해상도 Si(Li) 고체 검출기, 145-eV에너지 분해능, @Mn-K&alpha;</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Everhart-Thornley 유형 2차 전자 검출기(SED)&nbsp;</td><td>Orsay Physics</td><td>1-SED</td><td></td></tr><tr><td>XRF 교정 표준 나트륨 또는 염소(NaCl</td><td>마이크로물질</td><td>34381</td><td></td></tr><tr><td>XRF 교정 표준) 마그네슘(MgF2</td><td>마이크로물질</td><td>34382</td><td></td></tr>) <tr><td>XRF 교정 표준 알루미늄(알루미늄 금속</td><td>마이크로물질</td><td>34383</td><td></td></tr><tr><td>XRF 캘리브레이션 표준 실리콘(SiO</td><td>마이크로물질</td><td>34384</td><td></td></tr>)<tr><td>XRF 교정 표준 황(CuSx</td><td>마이크로물질</td>) <td>34385</td><td></td></tr><tr><td>XRF 교정 표준 칼슘(CaF2</td><td>마이크로물질</td><td>34387</td><td></td></tr><tr><td>XRF 교정 표준) 티타늄(Ti 금속</td><td>마이크로물질</td><td>34388</td><td></td></tr><tr><td>XRF 교정 표준) 철 금속</td><td>마이크로물질</td><td>34389</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator 750W</td><td>음향 재료</td><td>11743619</td><td></td></tr><tr><td>3MM 마이크로 프로브</td><td>Bioblock scientific</td><td>220-05</td><td></td></tr><tr><td>진공 내 동결 건조기</td><td>Elexience</td><td>EK3147</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경 Zeiss AxioObserver Z1</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>431006-9901</td><td></td></tr><tr><td>전동 스테이지 xy</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>432031-9902</td><td></td></tr><tr><td>EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 대물</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>420351-9910</td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>420781-9910</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss filterset 02</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>488002-9901</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss filterset 38HE</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>489038-9901</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss filterset 31</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>000000-1031-350</td><td></td></tr><tr><td>화학 흄 후드</td><td>Erlab</td><td>Captair SD321</td><td></td></tr><tr><td>입자 가속기</td><td>HVEE</td><td>singletron</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>미국 국립 보건원</td><td>ImageJ 1.51</td><td></td></tr><tr><td>SimNRA 소프트웨어</td><td>Max-Planck-Institut f&uuml; r Plasmaphysik, 독일</td><td>SIMNRA 6.06</td><td></td></tr><tr><td>Gupix 소프트웨어</td><td>Guelph university, 캐나다</td><td>GUPIXWIN 2.2.4</td><td></td></tr></tbody></table>

제자리에서 검색 및 핵 현미경 분석을 사용 하 여 금속 산화물 나노 입자의 단일 셀 정량화

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

화학 원소 영상 기반 마이크로 분석 기법 지역화 및 세포 수준에서 화학 성분의 정량화를 활성화 합니다. 그들은 생활 시스템의 특성에 대 한 새로운 가능성을 제공 하 고 특히 탐지, 지역화 및 생물 표본 및 환경 모두에서 금속 산화물 나노 입자의 존재를 측정에 적합. 사실, 이러한 기술을 모든 (i) (1에서 최대 건조 질량의 10 µg.g-1 ), (ii) 마이크로미터 범위 공간 해상도, 및 (iii) 여러 요소 검색 관련 요구 사항을 충족. 이러한 특성을 감안할 때, microbeam 화학 원소 영상 수 있습니다 강력 하 게 보완 일상적인 이미징 기술을 같은 광학 및 형광 현미경 검사 법. 이 프로토콜에는 경작된 한 세포 (U2OS) 이산화 티타늄 나노 입자에 노출에 핵 현미경 분석을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 셀 성장 해야 한다 고 핵 현미경 분석 단계와 광학 현미경에 사용 되는 특별히 설계 된 샘플 홀더에서 직접 노출. 샘플의 식이 동결 극저온 고정 세포 조직과 화학 원소 분포를 유지합니다. 샘플에 동시 핵 현미경 분석 (스캐닝 전송 이온 현미경, 러더퍼드 backscattering 분석 및 입자 유도 된 x 선 방출) 세포 밀도의 지역 분포에 대 한 정보를 제공 합니다. 화학 요소 뿐만 아니라 나노 입자의 휴대 전화 콘텐츠. 생물학, 특히 Nanotoxicology 및 나노 입자와 생물 학적 샘플 사이의 상호 작용의 우리의 이해를 심화 해야 합니다는 Nanomedicine 신흥 컨텍스트 내에서 이러한 분석 도구에 대 한 필요성이 있다. 특히, 핵 현미경 분석 이라는 것을 나노 입자를 필요로 하지 않습니다, 나노 나타났는데 그들의 표면 상태에 상관 없이 세포 인구에서 개별 셀 수준까지 가늠할 수 있습니다.

세포 배양 및 붙일 레이블된 티 오의 형광 이미징 2 NPs
우리는 샘플 홀더를 복합 분석 뿐만 아니라 세포 배양, 세포 처리에 맞게 설계 되었습니다. 특히, 중요 한 홀더 음 핵 현미경 분석 및 이미징으로 일상적인 광학 현미경을 허용 했다. 이 샘플 홀더 픽 프레임에 2 µ m 두께 폴 리카 보 네이트 호 일을 기반으로 합니다. 셀은 폴 리카 보 네이트, 몇 일 동안 메 마른 문화 조건에 직접 성장 하 고 NPs 노출 등 다른 실험 설정에 대 한 사용.
Fluorophores (TRITC)와 화학 표면 수정 paraformaldehyde 형광 현...

우리 화학 요소 존재 원래의 인간 세포에 그들의 생체 외에서 정량화의 검출을 위한 절차를 설명합니다. 메서드는 모든 셀 종류에 적합 하 고는 금속 산화물 나노 입자 노출 체 외에서 다음 단일 셀에 정량적 화학 분석에 특히 유용.

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

나노입자는 독특한 물리화학적 특성으로 인해 산업 및 의료 분야에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 그러나 나노입자에 장기간 노출됨에 따른 인체 건강에 대한 우려는 여전히 남아 있습니다. 이러한 위험성은 세포 내 나노입자의 거동과 나노입자에 의한 세포의 대사 반응을 연구함으로써 정량화할 수 있습니다.이는 단일 세포 내로 유입된 나노입자를 검출하고 정량화할 수 있는 방법이 부족하기 때문인 측면이 있습니다. 현미경 검사 및 질량 분석법을 포함한 수많은 분석 도구를 사용하여 나노입자의 세포 섭취량을 추정할 수 있지만, 이러한 방법들은 미세 수준에서 질적인 정보만을 제공합니다. 반면, 원자 분광법 기반의 in situ 방법은 시료 준비 과정에서 발생하는 이미징 아티팩트의 양을 줄일 수 있으며, 나노입자를 직접 관찰할 수 있게 합니다.이를 활용하기 위해, 나노입자를 천연 상태 또는 형광 표지와 함께 베드 상에서 연구할 수 있는 상관관계 분석법을 제시합니다. 여기서는 형광 현미경법과 핵 마이크로프로브 분석의 결합을 기반으로 한 방법을 설명합니다. 이 방법은 세포 밀도, 화학 원소의 공간적 분포 및 세포당 나노입자의 양에 대한 이미지를 제공합니다.시연으로서, 형광 현미경과 핵 미세프로브 분석을 모두 사용하여 24시간 동안 이산화티타늄 나노입자에 노출된 세포를 연구하겠습니다. 이 프로토콜을 위해서는 폴리머 PEEK로 제작된 맞춤형 샘플 홀더가 필요합니다. 이는 세포 배양 및 인비트로(in vitro) 관찰에 적합해야 합니다.홀더를 2 µm 두께의 폴리카보네이트 호일로 덮습니다. 폴리카보네이트 호일은 얇은 Formvar 용액 층을 이용해 PEEK 디시에 접착합니다. 장착이 완료되면 시료 홀더를 멸균해야 합니다.필요할 때까지 멸균된 12-웰 플레이트의 각 웰에 하나씩 멸균된 샘플 홀더 여러 개를 보관할 수 있습니다. matrix row GFP 플라스미드가 형질전환된 세포는 형광 현미경으로 확인하여 형질전환이 성공적으로 이루어졌는지와 형광 단백질이 발현되는지 확인합니다. 트립신으로 세포를 수확하고, 37°C에서 3분 동안 배양합니다.신선한 배양액을 첨가하여 트립신 반응을 중단시킵니다. 4°C에서 1200 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 상층액을 제거하고 적절한 양의 신선한 배양액을 첨가합니다.세포 수를 측정하고, 온도가 조절된 신선한 완전 배양 배지를 사용하여 희석하여 마이크로리터당 500개의 세포가 포함된 세포 현탁액을 준비합니다. 폴리카보네이트 포일 중앙에 40 µL의 액적을 도말합니다. 샘플을 세포 배양기에 조심스럽게 넣고 2시간 동안 배양합니다.신선한 배양액 2 mL를 조심스럽게 첨가하고 24시간 동안 방치합니다. 체외에서 나노입자를 검출, 추적 및 국소화하기 위해 흔히 사용되는 형광체로 설계, 합성 및 접합된 형광 수정 이산화티타늄 나노입자가 준비되었습니다. 이 단계를 위해 1 mg/mL 농도의 초순수 내 이산화티타늄 나노입자 현탁액이 미리 준비되어 있어야 합니다.실온에서 1분 동안 강한 초음파 처리를 반복하여 나노입자를 분산시킵니다. 나노입자를 적절한 배양액에 희석하여 cm²당 4µg의 노출 현탁액을 준비합니다. 기존의 세포 배양액을 이 새로운 나노입자 함유 배양액으로 교체하고, 나노입자가 균일하게 분포되도록 부드럽게 혼합합니다.이산화 티타늄 나노입자를 첨가하지 않고 동일한 방식으로 대조군 세포 세트를 준비합니다. 세포군을 24시간 동안 배양합니다. 파라포름알데히드를 사용하여 이 샘플들을 고정한 후, 형광 현미경을 이용한 인시튜(in situ) 및 단일 세포 이미지 분석을 위해 처리할 수 있습니다.반면, 저온 물리적 고정법은 세포의 초미세 구조와 생화학적 무결성을 보존합니다. 급속 냉동 고정법은 밀리초 단위로 세포 활동을 빠르게 중단시키며 고정 화합물의 사용을 피할 수 있습니다. 세포를 저온 고정하기 위해 다음과 같은 과정을 수행합니다.알루미늄 전송 플레이트를 액체 질소로 냉각하여 준비합니다. 플레이트 표면이 액체 위에 놓여 차가운 질소 증기 속에 유지되도록 액체 질소가 채워진 상자에 플레이트를 보관하십시오. 충분한 양의 2-methylbutane을 150 °C까지 냉각합니다.배양액이 담긴 50 mL Falcon 튜브 1개와 초순수가 담긴 Falcon 튜브 2개를 준비합니다. 샘플을 동결하기 전 건조시킬 수 있도록 흡수성 종이를 가까이에 둡니다. 배양액에 남아 있는 과잉 염을 제거하기 위해 세포를 배양액으로 한 번, 그 다음 멸균된 초순수로 두 번 더 헹굽니다.흡수지에 샘플을 빠르게 말립니다. 냉각된 2-methylbutane에 세포를 30초 동안 급속 동결(plunge-freeze)시킨 후, 냉각된 알루미늄 전송 플레이트에 배치합니다. 차가운 플레이트 표면에 수증기가 응결되는 것을 방지하기 위해 박스를 최대한 닫은 상태로 유지하는 것이 매우 중요합니다.모든 샘플을 동결시킨 후, 수분을 승화시키기 위해 다음과 같은 방법으로 동결 건조를 수행합니다. 먼저, 저압 및 저온 상태에서 12~24시간 동안 1차 건조를 수행합니다. 그다음, 저압 상태를 유지하면서 플레이트 온도를 40 °C까지 올려 최소 24시간 동안 2차 건조 단계를 수행합니다.냉동 고정 후, 샘플은 먼지와 습기로부터 보호된 멸균 및 건조 상태의 상온에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다. 핵 마이크로프로브 분석은 프랑스 보르도의 Ifera 시설에서 수행되었습니다. 3.5 megavolt singletron 입자 가속기는 megaelectron volt 에너지 범위의 경이온 빔을 제공합니다.상보적인 이온 빔 분석 기술을 이용하여 마이크로프로브 빔라인에서 화학 원소 이미징을 수행하였습니다. 사용된 기술로는 micro-PIXE(입자 유도 X선 방출), STIM(주사 투과 이온 현미경) 및 micro-RBS(러더퍼드 후방 산란 분광법)가 있습니다. 시료를 분석 챔버 내부에 배치하고, 다양한 이온 빔 분석을 수행하기 위해 진공 상태에서 서로 다른 입자로 조사하였습니다.STIM은 서로 다른 밀도를 가진 세포 영역을 통과하며 손실되는 에너지 입자를 기반으로 세포의 공중 밀도 맵(aerial density maps)을 기록하는 데 사용됩니다. Micro-PIXE 및 micro-RBS 분석은 단일 세포 수준에서 화학 원소의 공간적 분포와 정량 분석을 제공합니다. 1.5 megaelectron volt 양성자 마이크로빔을 약 1 micrometer의 직경으로 집중시켜 STIM으로 식별된 관심 세포들에 걸쳐 스캔합니다.나트륨부터 티타늄까지 시료에 존재하는 원자에서 방출되는 X-선을 통해 원소 농도를 결정할 수 있습니다. X-선 강도를 정규화하는 데 필요한 입사 입자의 총 수를 측정하기 위해 후방 산란된 양성자를 수집합니다. X-선 검출기의 응답을 교정하여 원소 농도를 정량화하기 위해서는 인증된 교정 표준물질을 확보하는 것이 매우 중요합니다.이온 빔 데이터를 분석하기 위해, 저희는 ImageJ용 새로운 플러그인을 개발했습니다. 먼저, STIM 밀도 맵을 계산했습니다. 주사 투과 철 현미경 이미지의 대비는 국소적인 밀도 차이로 인해 발생하며, 이를 통해 핵 및 세포질과 같은 세포 구조를 검출할 수 있습니다.여러 개의 맵을 동시에 처리할 수 있습니다. 각 맵은 입사 입자로부터 전달된 평균 에너지를 나타냅니다. 데이터 분석의 두 번째 단계는 개별 세포 스펙트럼을 계산하는 것입니다.입자 유도 X선 방출 분석을 통해 시료의 화학적 조성과 화학 원소의 원소 맵을 모두 얻을 수 있습니다. 화학 원소 맵은 기록 당시의 빔 위치에 따라 광자를 분류하고 특정 원소를 중심으로 하는 에너지 창을 선택하여 계산합니다. 맵은 일반적으로 빔 위치에서 검출된 이벤트 수를 나타내며 정량적 데이터를 포함합니다.선택한 각 원소에 대해 화학 지도 스택을 산출합니다. 인(phosphorus)에 대한 PIXE 데이터를 사용하여 각 세포의 관심 영역을 찾습니다. 그런 다음 각 세포의 관심 영역에 걸쳐 개별 스펙트럼을 합산하여 각 전체 세포에 해당하는 스펙트럼을 산출합니다.여기서 전용 PIXE 및 IBS 분석 소프트웨어를 사용하여 각 세포 내 화학적 함량에 대한 정량적 데이터를 추출할 수 있습니다. 여기서는 파라포름알데히드 고정 후 세포의 형광 이미지를 보여줍니다. 위쪽 행은 이산화티타늄 나노입자에 노출되지 않은 세포를 나타내며, 아래쪽 행은 노출된 세포를 나타냅니다.청색 채널은 세포핵을, 녹색 채널은 미토콘드리아를, 적색 채널은 티타늄을 나타냅니다. 대조군에서는 이산화티타늄이 존재하지 않음이 명확히 확인됩니다. 오른쪽의 병합 채널을 통해 나노입자가 오직 세포질에서만 발견되며 미토콘드리아에서는 배제되었음을 알 수 있습니다.하지만 이 방법에는 나노입자 농도에 대한 정량적 정보가 부족합니다. 핵 미세분석법(Nuclear microprobe analysis)을 통해 이를 제공할 수 있을 것으로 기대됩니다. 이 이미지들은 모두 다양한 미세분석 기술을 사용하여 촬영되었습니다.다시 한번 설명하자면, 윗줄은 대조군 세포를, 아랫줄은 티타늄 나노입자가 포함된 세포를 보여줍니다. 가장 왼쪽 이미지는 저온 고정된 세포의 밀도를 STIM으로 측정한 결과입니다. 이어지는 세 개의 패널은 PIXE를 통해 얻은 세포 내 칼륨, 인, 티타늄의 함량을 보여줍니다.마찬가지로, 대조군과 세포핵 모두에서 티타늄은 관찰되지 않았습니다. 티타늄의 흡수량을 세포별로 정량화하기 위해, 가장 오른쪽 패널에 표시된 세포 경계를 기준으로 관심 영역(ROI)을 설정하고 해당 영역의 원소 함량을 측정하였습니다. 이러한 PIXE 측정 결과를 바탕으로, 대조군과 노출군 집단의 단일 세포 수준에서의 원소 함량 분포를 그래프로 나타내었습니다.대조군 집단은 흰색으로, 노출군 집단은 노란색으로 표시되었습니다. 여기에 나타난 티타늄의 중앙 함량은 4 µg/cm²의 노출 용량에 비해 상당히 낮습니다. 티타늄 흡수 범위는 0.2 µg/cm²에서 최대 1.8 µg/cm²까지 집단 전반에 걸쳐 큰 변동을 보입니다.우리는 또한 나노입자에 노출된 시료에서 칼륨 및 칼슘과 같은 유리 세포 내 이온의 증가를 관찰했으며, 이는 이산화티타늄 나노입자의 존재로 인해 세포 항상성에 변화가 유도되었음을 시사합니다. 핵 마이크로프로브 분석은 세포 소기관 수준에서 유용한 정보를 제공하며 생물학적 시료를 구성하는 화학 원소의 정량을 가능하게 합니다. 이러한 기술들은 많은 장점을 제공합니다.첫째, 화학적 고정이 필요 없는 시료 준비 과정입니다. 둘째, 추가적인 관심 영역에 초점을 맞추어 더 넓은 영역을 연구할 수 있는 가능성입니다. 셋째, g당 수 µg의 민감도로 화학 원소를 정량화할 수 있다는 점입니다.넷째로, 핵, 인 및 세포질과 같은 세포 구획의 식별입니다. 단일 세포 내 나노입자의 내재화를 연구할 때 이러한 구획을 정확하게 결정하는 것은 정량적 나노입자 독성학에 있어 필수적입니다. 본 연구 사례에서 보여주듯, 개별 세포 내의 나노입자를 관찰하고 정량화하는 능력은 금속 산화물 나노입자와 같은 내인성 및 외인성 화학 원소의 가치 축적을 더 잘 이해할 수 있게 해줍니다.본 프로토콜은 살아있는 세포와 나노입자의 상호작용에 관한 향후 연구에서 핵 마이크로프로브 분석의 적합성을 강조합니다. 이러한 정량적 접근 방식은 검출, 식별, 국소화 및 정량화 측면에서 나노입자의 영향을 제공하며, 천연 및 화학적 수정 나노입자 모두에 대해 단일 세포 수준에서의 정보를 제공합니다.

in-situ-detection-single-cell-quantification-metal-oxide

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

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소수 종, 광원, 산소 공실 및 기타 포인트/라인/평면도 결함으로부터 정보를 안정적으로 추출하는 사고 전자 빔 흔들림 조건하에서 전자 채널링 현상을 활용하여 불순물 및 화학 상태의 사이트 점유율을 추정하기 위한 정량적 미세 분석 방법의 일반적인 개요를 제공합니다.

전자 채널링 강화 마이크로 분석에 의한 결정재료의 기능적 도팬츠/점 결함의 정량적 원자사이트 분석

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제자리에서 검색 및 핵 현미경 분석을 사용 하 여 금속 산화물 나노 입자의 단일 셀 정량화

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