Name: 제자리에서 검색 및 핵 현미경 분석을 사용 하 여 금속 산화물 나노 입자의 단일 셀 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: 학습하세요 인간 세포 내 금속 산화물 나노입자의 제자리 검색 및 단일 세포 정량화 방법을. 원자 분광법과 핵 현미경 분석을 결합하여 나노입자 세포 흡수와 대사 반응을 정량적으로 연구합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

우리 감사 Serge Borderes 감독 및 비디오의 편집. 프랑스 국립 연구 기관 연구 프로그램 TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01)을 지원합니다. CNRS와 통합 활동으로 유럽 공동체 "지원의 공공 및 산업 연구를 사용 하 여 이온 빔 기술 (정신)" EC 계약 n ° 227012에서 제공. 이 작품 EC 계약 번호 317169 마리 퀴리 작업-초기 교육 네트워크 (ITN) "통합 활동 지원 대학원 연구와 인턴쉽에 산업 및 교육 우수" (스프라이트, D1.3)로 지원 되어 있다. C'NANO 그랜드 Sud Ouest 및 지역 아키텐 연구 프로그램 TOX-나노 (n ° 20111201003)와 POPRA (n ° 14006636-034) 연구 프로그램을 지원합니다.

1. 샘플 홀더 준비
<ol><li>
샘플 홀더 설계 및 준비
	<ol>
<li>1 m m 두께 픽 프레임에 5mm x 5mm 스퀘어 드릴 여 샘플 홀더를 제조 한다.</li>
		<li>에탄올 70% (v/v)로 헹 궈 서 깨끗 하 고 살 균 판에 사용할 준비가 될 때까지 계속. 참고입니다. 세포 배양 및 세포 처리에 대 한 적절 한 샘플 홀더는 필요 합니다. 그것은 세포 배양, 체 외에서 관찰 광학 현미경 검사 법, 그리고 핵 현미경 분석 및 이미징에 대 한 설계 될 필요가 있다. 이 홀더는 슬쩍 프레임13의 이루어집니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플 홀더 준비<ol>
<li>클로 프롬의 100 ml에서 Formvar 분말의 1 mg를 용 해 하 여 Formvar 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>아니 배 선물을 금속 프레임에 폴 리카 보 네이트 호 일을 스트레칭.</li>
		<li>멸 균 팁을 사용 하 여 샘플 홀더 구멍 주위 Formvar 솔루션을 확산.</li>
		<li>섬세 하 게 샘플 홀더 뻗어 폴 리 카보 네이트 호 일 (5mm x 5mm 스퀘어)에 접착제를 내려 놔.</li>
		<li>각 복제에 대 한 하나의 샘플 홀더를 준비 하려면 이전 시퀀스를 반복 합니다. 참고입니다. 폴 리카 보 네이트 (PC) 영화는 생체, 충분히 두껍고 다른 프로토콜 및 분석 제약. 주의-클로 프롬은 독성이 있습니다. 흡입, 섭취를 피 하거나 피부 접촉. 항상 제대로 작동 화학 증기 두건 및 적절 한 필터를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플 홀더 살 균<ol>
<li>인큐베이터/교 반기를 사용 하 여 에탄올 70% (v/v), 180 rpm 및 +37 ° C 동요의 50 mL와 원뿔 플라스 크에 탑재 된 샘플 홀더를 놓습니다.</li>
		<li>홀더를 살 균 증류수에 여러 번 헹 구 십시오.</li>
		<li>공기 메 마른 조건에서 그들을 건조 하 고 각 면에 30 분 동안 자외선 (Biosafety 벤치, 클래스 II에서에서 살 균 램프)에 그들을 노출.</li>
		<li>사용할 준비가 될 때까지 무 균 12-잘 접시 (우물 당 1 개 견본 홀더)에서 샘플을 유지. 참고: 여러 샘플 홀더 살 균과 건조 12-잘 접시 몇 일 동안 parafilm으로 밀봉 상 온에서 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 적절 한 샘플 홀더 셀의 성장.
주의: 프로토콜은 biosafety 층 류 벤치 (종류 II) 오염 미생물 제외 하에 실시 해야 합니다. 장갑과 항생제 (예: 페니실린, 스)를 처리 합니다. (셀 라인, 유전자 변형 인간 세포 파생) 생물 학적 자료를 처리할 때 유용한 정보를 존중 합니다.
중요: 사용 세포 선 그들은 하지와 Mycoplasma감염을 확인 하 여야 한다.
<ol><li>매트릭스-roGFP 17,,1819 transfection 메서드를 사용 하 여 프로토콜 제조 업체에 의해 설립에 따라 베어링 플라스 미드와 U2OS 셀 라인 transfect.</li>
	<li>플라스 미드-휴대용 transfection를 확인 하는 바이오 센서 및 손실을 방지 하기 위해 플라스 미드를 선택 하 고 적절 한 문화 매체에 transfected 세포를 유지.</li>
	<li>형광 현미경 검사 법은 transfection 발생 했습니다 보장 형광의 표현과 관으로 미토 콘 드 리아 네트워크19의 표시를 확인 하 고 여 transfected 세포를 시각화. 일시 중지 포인트: 셀 몇 년 동안 액체 질소에 동결 될 수 있습니다.</li>
	<li>적절 한 매체에서 세포를 배양 하 여 transfected 세포 인구를 사용 하 여 하위 confluent 세포 인구를 얻기 위하여. 37 ° C, 5% (v/v) CO2 포화 물 분위기에서에서 세포 성장.</li>
	<li>씨와 같은 그들은 80% 합류에 정착의 하루는 농도에 세포. 일반적으로, µ L 당 500 세포의 농도 사용 될 수 있습니다. 0.25% Trypsin EDTA의 400 µ L를 사용 하 여 셀 (v/v)을 수확 하 고 37 ° c.에 3 분 동안 유지 문화 매체의 1 mL와 트립 신 작업을 중지 합니다. 230 x g와 + 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리 하 여 세포를 작은, 다음 상쾌한, 제거 하 고 신선한 문화 매체의 원하는 볼륨 추가. 참고. 프로토콜은 모든 세포 종류에 적용 하 고 시드 셀 수와 시간을 두 배로 하는 셀에 셀 크기에 따라 달라 집니다. 주의: 트립 신, 항생제, 및 혈 청 반복된 freeze-thaw 주기를 겪고 하지 마십시오. 살 균 보관. Aliquots로 재고 솔루션을 분할 하 고 −20 ° c.에서 그들을 멈추게합니다 만료 날짜까지에 aliquots를 저장 합니다. 신중 하 게는 트립 신을 완전히 제거 하려면 셀 펠 릿을 씻어. 잔여 trypsin의 지연 하 고 도금 효율 감소.</li>
	<li>셀을 계산 하 고 µ L 당 500 세포와 세포 현 탁 액을 얻기 위하여 37 ° C에서 유지 하는 신선한 완전 한 문화 매체와 희석을 수행 합니다. 참고: 세포 현 탁 액의 농도 40 µ L 드롭 접시 위해서는 세포 유형의 기능으로 적용할 수 있다.</li>
	<li>폴 리 카보 네이트 호 일의 중심에 40 µ L 드롭 접시 신중 하 게 포화 물 분위기에서 +37 ° C에서 2 h, 5% (v/v) CO2 에 대 한 샘플을 놓습니다. 중요 한: 샘플 인큐베이터에 배치 되 면 최대한 빠른 셀 첨부 파일 하나를 어떤 기계적인 운동을 제한 합니다. 셀 형식에 따라 최적의 platting 효율성을 위한 2 시간 이상 세포를 품 어 해야 할 수 있습니다. 체크 방울 증발 하지 않도록 포화 인큐베이터 분위기는 잘.</li>
	<li>세포는 광학 현미경을 사용 하 여 폴 리카 보 네이트 호 일에 잘 연결 되는지 확인 합니다. 부드럽게 신선한 완전 한 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 24 시간 동안 계속.</li>
</ol>3. 나노 준비 및 노출
참고: 형광 염료 수정 티 오2 NPs 했다 설계, 합성, 그리고 화학적 tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC)로 변경. 20 , 21 이 표면 개 질 나노 입자 감지, 추적 및 지역화에 제자리에 및 cellulo에 생활 및 고정 세포 또는 다세포 생물을 수 있습니다. 12 , 13 , 18
주의: 나노 소재 및 나노 치료와 함께 처리 되어야 합니다. 흡입, 섭취를 피 하거나 피부 접촉. 공기에서 보급을 방지 하기 위해, 나노 솔루션 (초순)에 유지 됩니다.
<ol><li>티 오2 초순에 NPs의 1 mg.mL− 1 의 현 탁 액을 준비 합니다. 티 오2 NPs RT에서 강렬한 1 분 쥡니다 펄스를 사용 하 여 분산 (750 W, 20 kHz, 진폭: 30%)는 초음파 발생기와 전용된 원뿔 현미경을 사용 하 여.</li>
	<li>4 µg.cm−2 (최종 농도)의 노출 중단을 얻기 위해 티 오2 NPs에서 문화 매체에서 원하는 농도 희석. 적절 한 양의 셀에 중간 포함 NPs와 매체를 장착 하 고 티 오2 NPs의 추가 없이 마찬가지로 컨트롤 셀 티 오2 NPs 준비의 균질 배급에 대 한 부드럽게 혼합.</li>
	<li>37 ° C, 5% (v/v) CO2 와 포화 물 분위기에서 24 h에 대 한 세포 인구를 품 어.</li>
</ol>4. paraformaldehyde 기정 그리고 형광 현미경
<ol><li>인산 염 버퍼 (PBS, pH 7.4)에 버퍼 paraformaldehyde 솔루션 (PFA, 4 %w / v)의 새로운 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>100 ml PBS의 PFA 가루 4g을 디졸브. 증기 두건에서 자석 및 자석 교 반기를 사용 하 여 교 반 하면서 65 ° C에 솔루션을 열. 해결 될 때까지 한 번에 1 M NaOH 한 방울을 추가 하 여 pH를 증가. 실내 온도에 해결책을 냉각 하 고 pH 7.4에 조정. 즉시 갓된 솔루션을 사용 하 여 또는 + 4 ° C에서 유지 하 고 빛 으로부터 보호. 참고: 그러나 더 나은 품질의 고정 및 고정된 샘플의 장기 보존을 보장 하는 PFA의 임기 응 변의 준비 미리 만든된 PFA 솔루션을 사용할 수 있습니다. 주의: PFA는 독성; 흡입, 섭취를 피 하거나 피부 접촉. 항상 제대로 작동 화학 증기 두건 및 적절 한 필터를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>일단, 보육 시간 경과, 포함 된 티 오2 NPs 린스 한번 신선한 문화 매체와 함께 한 번 PBS (2 mL)는 세포 인구 세포 배양 매체를 제거 합니다. PBS를 제거, 신속 하 게 신선 하 고 차가운 PFA (4 %w / v, + 4 ° C)의 약 수와 린스.<ol>
<li>PFA (2 mL, 4 %w / v, + 4 ° C)를 추가 합니다. 실 온에서 15 분을 품 어.</li>
		<li>제거는 PFA, 동요에서 PBS (2 mL, 3 시간, 5 분)와 셀 린스. 일시 중지 포인트: 이러한 화학적 샘플 고정 형광 이미징 (단계 5로 이동) 후 "급락-동결" 절차에 사용할 수 있습니다 또는 형광 이미징 (4.3 단계로 이동)에 사용.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hoechst33342 PBS에서 10 분 셀 잠복기와 핵을 얼룩. 500의 최종 농도에 사용 되는 Hoescht33342 nM. 부 화 후 솔루션을 제거 하 고 PBS로 씻어. 주의: Hoechst33342 셀 permeant 이며 독성이 있을 수 있습니다. 직접 접촉을 방지 하 고 장갑을 준비 하는 동안 Hoechst33342를 사용 하 여 사용. 중요: Hoechst33342 솔루션 얼룩은 갓 준비 하 고 메 마른 조건에서 유지.</li>
	<li>프로세스 현장 및 형광 현미경 검사 법 (그림 1)를 사용 하 여 단일 셀 이미징에 대 한 샘플 고정.</li>
</ol>5. "식이 어" 고정 및 탈수
<ol><li>액체 질소에 냉각 하 여 알루미늄 전송 접시를 준비 합니다. 저장소 상자에 접시 액체 질소로 채워진 고 차가운 질소 증기에 액체 위에 접시 표면 유지. 참고: 어떤 금속 격판덮개의 전송 접시를 만들 수 있습니다 (여기서, 우리가 알루미늄을 사용)는 액체 질소 온도, 냉각 수 고 그 동결 건조 시료 챔버를 입력할 수 있습니다. 중요 한: 상자 지켜져야 한다 폐쇄 가능한 한 많이 찬 격판덮개 표면에 수증기 공 술 서를 방지 하기 위하여. 샘플 준비 하는 동안에 저장 된 액체 질소에 의해 포함 되지 않습니다 한다.</li>
	<li>세포 배양에 한 번 헹 구 고 두 번 더, 짧게, 살 균과 초순 물의 얻을 제거 나머지 extracellular 소금의 흔적. 중요 한: 미디어는 갓 준비 하 고 메 마른 조건에서 유지를 확인 합니다. 사용 되기 전에 37 ° C에서 모든 미디어를 열. 린스는 아주 짧은 (몇 초) 하며 샘플에 액체의 초과 제거 가능한 한 빨리.</li>
	<li>식이-동결 세포-150 ° c 액체 질소 냉장 2-methylbutane 30 s 및 장소 중에서 알루미늄에 그들 격판덮개 전송. 다른 모든 샘플의 준비 하는 동안 여기 샘플을 저장 합니다. 샘플 모든 cryofixed 때, 모든-에-한 번 전송 접시 동결 건조 기에 배치 하 여 전송 합니다. 중요 한: 전반적인 cryofixation 프로세스 구조 수정 전송 상자에 임시로 저장 하는 샘플에 표시를 방지 하기 위해 20 분 이상 지속 하지.</li>
	<li>다음 시퀀스를 사용 하 여 샘플을 freeze-dry: 1) 낮은 압력과 낮은 온도에서 12 ~ 24 h (-99 ° C, 10-3 mbar)에 대 한 기본 건조 수행 후 2) 판 온도를 증가 적어도 24 h에 대 한 보조 건조 단계 수행 + 40 ° C (+ 40 ° C, 10-3 mbar) 압력 낮은 유지 하는 동안. 주의: 액체 질소는 매우 추운 이며 접촉 시 심한 동상 또는 눈 손상 될 수 있습니다. 전송에 대 한 적응된 벤치 최고 컨테이너를 사용 하 고 (극저온 장갑, 눈과 얼굴 보호) 안전 장비를 착용. 주의: 2 Methylbutane는 매우 가연성. 공기의 유해한 오염 + 20 ° c.에이 물질의 증발에 오히려 신속 하 게 도달 될 수 있다 흡입, 섭취를 피 하거나 피부 접촉. 사용 하 여 호흡과 눈 보호 및 보호 장갑. 항상 제대로 작동 화학 연기 후드를 사용 하 여. + 4 ° c.에 저장 될 수 있습니다. 중요 한: "급락-동결" 세션 2-Methylbutane 온도 모니터링 하는 적절 한 온도계 (-150 ° C)를 사용 합니다. 2-methylbutane 액체 단계에서 유지 되어야 한다. 주변 분위기에 cryofixed 샘플을 전송 하는 것은 온도 증가 또는 샘플 표면에 집 광 수증기 세포 손상을 발생할 수 있습니다. 따라서, 전송 한다 합리적으로 가능한 한 빨리 (30 s) 일시 중지 포인트: Cryofixation, 후 샘플 (먼지와 습기 로부터 보호) 살 균과 건조 조건에서 몇 일 동안 실내 온도에 저장 수 있습니다. 신중 하 게 좋은 집게와 샘플을 처리 하 고 parafilm으로 밀봉 살 균 12-잘 접시에 그들을 배치. 건조 시키는 건조 한 분위기를 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>6. 핵 현미경 분석
참고: 핵 현미경 분석 실시 되었다 보완 이온 빔 분석 기법 입자 유도 된 x 선 방출 (µ-를 사용 하 여 AIFIRA (응용 프로그램 Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions en 지구의 아키텐)의 microbeam 라인에 PIXE) 및 스캐닝 전송 이온 현미경 검사 법 (μ-STIM). 시설 제공 빛 이온 빔 백만 전자 볼트 에너지 범위에 3.5 MV 입자 가속기를 기반으로 합니다. 22 , 23
일시 중지 포인트: AIFIRA 제안 된 실험의 과학적 평가 후 국내 및 국제 팀에 대 한 액세스를 제공 하는 보르도의 대학에 의해 접대 하는 이온 빔 시설입니다.
<ol><li>양면 테이프를 사용 하 여 apertured 접시에 슬쩍 시료 홀더를 탑재 합니다.</li>
	<li>수직 빔 방향에 수직인 평면에서 샘플을 지 원하는 접시를 놓습니다.</li>
	<li>분석 챔버를 닫고 분석 챔버를 진공.</li>
	<li>스캔 전송 이온 현미경 검사 법 (μ-STIM) 참고: STIM 사용 됩니다 세포 질량, 에너지 손실의 변환 후 셀의 영역 밀도 지도 기록 에너지 손실은 이다 (µg.cm-2에서 표현) 샘플 면 적당 밀도에 비례 하는 사실을 활용.<ol>
<li>2 MeV의 헬륨 (그+) microbeam를 사용 하 여 약 300의 초점면에 크기와 프로브로 nm 직경에서 및 낮은 유창 (2000 ions.s-1). 평면 실리콘 검출기 (PIPS 검출기, 25 m m2, 5.4 MeV @ 11 keV 에너지 분해능), 전송 된 이온의 측정 에너지 빔 축에 샘플 뒤에 배치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>입자 유도 x 선 방출 (µ-PIXE) 및 러더포드 Backscattering 분석 (µ-RBS). 참고: µ Pixe 및 µ-RBS 분석 공간 배급 및 서브 마이크로미터 해상도와 화학 성분의 정량화를 제공합니다.<ol>
<li>8 시간 4에서 STIM와 약 100 x 100 µ m2에 의해 발견 하는 관심의 동일한 셀에 1 µ m 및 스캔의 직경까지 집중 1.5 MeV 양성자 (H+) microbeam (50-150 pA)를 사용 합니다.</li>
		<li>원자는 고해상도 Si(Li) 고체 검출기 (145 eV 에너지 분해능, @Mn-Kα)에 의해 (나 보다 더 무거운) 샘플에 들어오는 광속 축에서 45 °에 위치에서 방출 된 유도 x 선 광자를 수집 합니다. 검색 된 광자 에너지를 사용 하 여 미터 (요소 예: Z) 및 x 선 강도 요소 농도 결정의 성격을 파악.</li>
		<li>실리콘 검출기-135 °에 다시 흩어져 양자를 동시에 수집 (부분적으로 고갈된 검출기, 25 m m2, 11 케빈 5.4 MeV @ FWHM) 들어오는 입자의 총 수를 측정 하 고 x 선 강도 정상화를. 중요 한: 원자 농도 정량화에 대 한 인증된 교정 표준 컬렉션 x 선 검출기 응답을 보정 하기 위해 사용 됩니다. 참고 자료는 6.3 µ m 두께 Mylar 포 일에 원자 박막의 모음. 20.2 0.6 (Li, K 선)에서 x 선 에너지 범위 방출 케빈 (Rh, K 선).</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 데이터 분석
<ol><li>ImageJ를 위한 IBA J 플러그인을 사용 하 여 화학 원소 지도 재구성 합니다. 24 참고: ImageJ 위한 플러그인의 형태로 전용된 소프트웨어 원시 핵 현미경 분석 데이터를 처리 하도록 개발 되었습니다. 원시 데이터 연대기 순서로 빔 위치와 함께 기록 됩니다 세포와 상호 작용 입자 빔에서에서 발생 하는 이벤트의 목록에 해당 합니다.<ol>
<li>IBA J 플러그인을 사용 하 여 정렬 유형에 따라 이벤트: 이온 에너지 (STIM) 전송, backscattered 이온 에너지 (RBS) 또는 x 선 광자 에너지 (PIXE). 그런 다음 별도로 각 유형의 데이터를 처리 합니다.</li>
		<li>STIM 지도 밀도 계산</li>
		<li>평균 x 선 광자 에너지 스펙트럼을 계산 하 고 요소 공간 분포를 검색 하려면 관심 있는 에너지 창 각 화학 원소에 대 한 정의.</li>
		<li>관심 (ROI) (예: 개별 셀, 조밀한 구조, 집계, 등등.) 영역을 정의 하 고 해당 x 선 스펙트럼을 계산.</li>
	</ol>
</li>
	<li>입사 입자25의 총 수를 계산 하려면 해당 RBS 스펙트럼을 분석 합니다.</li>
	<li>26 Gupix 소프트웨어 사용 하 여 각 ROI에 대 한 요소 농도 결정 하는 x 선 스펙트럼에 맞게. 참고: 방법에 대 한 탐지 (LOD)의 일반적인 제한 요소 (LOD는 Z와 감소)의 원자 번호에 따라 건조 질량 범위 1 ~ 10 µg.g-1 에.</li>
</ol>

<ol><li>Krug, H. F., Wick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotoxicology%3A+An+Interdisciplinary+Challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).</li>
<li>Van Hove, M. A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0920586105008783">From surface science to nanotechnology.</a> Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).</li>
<li>Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. <a target="_blank" href="https://www.degruyter.com/view/j/ntrev.2013.2.issue-2/ntrev-2012-0080/ntrev-2012-0080.xml">Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches.</a> Nanotox. Rev. 2 (2), 125-169 (2013).</li>
<li>Oberdorster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+assessment+for+nanotechnology+and+nanomedicine%3A+concepts+of+nanotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Int.+Med%22%5BJournal%5D)">Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology.</a> J. Int. Med. , 89-105 (2009).</li>
<li>Savolainen, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925753510000767">Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety - A review.</a> Saf. Sci. 48 (8), 957-963 (2010).</li>
<li>Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+assessment+of+engineered+nanomaterials+and+nanotechnologies+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol%22%5BJournal%5D)">Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies - A review.</a> Toxicol. 269 (2-3), 92-104 (2010).</li>
<li>Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotoxicology+and+in+vitro+studies%3A+The+need+of+the+hour%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+.+Appl.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour.</a> Toxicol. . Appl. Pharm. 258 (2), 151-165 (2012).</li>
<li>Donaldson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+nanoparticles+paradox%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med%22%5BJournal%5D)">Resolving the nanoparticles paradox.</a> Future Med. 1 (2), 229-234 (2006).</li>
<li>Schaumann, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0048969714014739">Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts.</a> Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).</li>
<li>Olesik, J. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOlesik%2C+JW+%22Inductively+Coupled+Plasma+Mass+Spectrometers.+Treatise+on+Geochemistry%22">Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry</a>. , Elsevier Ltd. (2014).</li>
<li>Krystek, P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0026265X12000422">A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Microchem. J. 105 (November 2011), 39-43 (2012).</li>
<li>Le Trequesser, Q., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12154-015-0133-5">Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology.</a> J .Chem. Biol. 8 (4), 159-167 (2015).</li>
<li>Le Trequesser, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+in+situ+detection+and+quantification+of+metal+oxide+nanoparticles+using+multimodal+correlative+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy.</a> Anal. Chem. 86 (15), 7311-7319 (2014).</li>
<li>Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+Methods+for+Imaging+Metals+in+Biology%3A+From+Transition+Metal+Metabolism+to+Transition+Metal+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling.</a> Anal. Chem. 89 (1), 22-41 (2017).</li>
<li>Legin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/sc/c3sc53426j#!divAbstract">NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs.</a> Chem. Sci. 5, 3135(2014).</li>
<li>Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+and+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging and profiling of single cells.</a> J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).</li>
<li>Waypa, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+triggers+subcellular+compartmental+redox+signaling+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells.</a> Circ. Res. 106 (3), 526-535 (2010).</li>
<li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Dynamic+Redox+Changes+in+Mammalian+Cells+with+Green+Fluorescent+Protein+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li>
<li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Mitochondrial+Redox+Potential+with+Redox-sensitive+Green+Fluorescent+Protein+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li>
<li>Chen, X., Mao, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+dioxide+nanomaterials%3A+Synthesis%2C+properties%2C+modifications+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications.</a> Chem. Rev. 107 (7), 2891-2959 (2007).</li>
<li>Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21425910">Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity.</a> Nanotox. 5 (June), 125-139 (2011).</li>
<li>Sorieul, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168583X14002894">An ion beam facility for multidisciplinary research.</a> Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).</li>
<li>Barberet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168583X11002199">First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications.</a> Nucl Instr Meth Phys Res B. 269 (20), 2163-2167 (2011).</li>
<li>Devès, G., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168583X15000373">An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility.</a> Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).</li>
<li>Mayer, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMayer%2C+M+%22SIMNRA+User%27s+Guide%2C+Report+IPP+9%2F113%22">SIMNRA User's Guide, Report IPP 9/113</a>. , Max-Planck-Institut für Plasmaphysik. Garching, Germany. (1997).</li>
<li>Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168583X10006452">The Guelph PIXE software package IV.</a> Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).</li>
<li>Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+Dioxide+Nanoparticles+Induce+Endoplasmic+Reticulum+Stress-Mediated+Autophagic+Cell+Death+via+Mitochondria-+Associated+Endoplasmic+Reticulum+Membrane+Disruption+in+Normal+Lung+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells.</a> PLoS ONE. , 1-17 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

우리는 subcellular 수준에서 특히 다른 이미징 기술로 가능한 유용한 정보를 제공 하는 방법을 설명 합니다. 이미징 능력, 더불어 핵 현미경 분석 또한 생물 학적 샘플의 구성에서 입력 하는 화학 성분의 정량화의 가능성을 제공 합니다. 현재 작업에서 우리 인간의 세포 인구를 공부 하 고 티 오2 NPs에 노출 하는 단일 셀에 따라 관심의 선택한 영역의 분석으로 집중. 다른 기술을 조합 원소 화학 성분에 형태학 상 세포 이미징 및 정확한 정량적 데이터를 제공합니다.
성공적으로 적용 하려면 핵 현미경 분석, 존중 하는 잠재적인 함정을 피하기 위해 다음 사항을 필수입니다. 첫째, 열 대권 외의의 및 생화학의 무결성을 유지 하기 위해 셀 고정을 위한 극저온 프로토콜을 사용 하는 것이 필수적입니다. 둘째, 그것은 또한 아래 20 µ m 두께 얇은 샘플 분석을 수행 하는 필수입니다. 필요한 경우, cryofixed 샘플의 단면을 수행할 수 수 있습니다. 샘플은 절대...

세포질 항상성 이해 컨트롤, 동화 작용, 및 다른 성분 (이온, 금속, 세 무기 화합물)의 세포내 지역화에 의해 결정 됩니다. 이러한 구성 요소 추적의 형태로 자주 하지만 그럼에도 불구 하 고 시스템 생리학에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 정상 및 병리학/스트레스 상황에서 세포 생화학의 연구 세포 대사 메커니즘에 대 한 전반적인 이해 향한 키 단계입니다. 따라서, 세포내 화학 나타났는데, 구조적 조직 및 그들의 관련된 대사 기능 조사를 사용 하는 이미징 및 분석 기술의 개발이 필요한 됩니다. 아주 몇 가지 방법이 제자리에 정량의 한 조각이 주어진된 샘플의 전반적인 화학 본질에 관한 정보를 제공할 수 있습니다. 벌크 형태로 샘플을 분석 하는 방법 외에도 현장에서 분석 고려 생물 학적 샘플 자신의 완전에 질량과 구조 정보, 그로 인하여 그들의 구성 화학 물질 (미 량 원소와 이온) 보존을 잃지 않고, 단백질입니다. 또한, 지속적으로 개발 하는 nanosciences, 향상 된 이미징 및 세포 규모 환경 모니터링에 대 한 분석 방법 됩니다 관찰 하 고 계량 나노 개체 동작 및 상호 작용 하는 데 필요한. 1
나노 (NPs) 전시 범위 1와 100 nm에 최소한 하나의 얼굴 차원으로 정의 되었습니다. 2 그들의 특정 물리 화학적 특성 때문에 NPs는 광범위 하 게 업계에서 사용. NPs는 nanomedicine 및 바이오 응용 프로그램에서 채택 된다. 3 , 4 NPs의 수많은 물리 화학적 특성에도 불구 하 고 인간의 건강 및 환경에 불리 한 영향의 몇 가지 위험을 생성할 수 있습니다 그들은. 이러한 위험 다양 한 농도 수준에서 장기간 및 반복 노출에 의해 유도 될 수 있다 그리고 이것은 아직 명확 하 게 설립 되지. 5 , 6 , 7 , 8 특히, 셀과 연결 된 세포질 응답 내부 NPs의 운명은, 날짜, 완전히 설명. 이것은 탐지를 허용 하는 방법의 부족 및 정량화는 단일 셀에 내 면된 NPs의 일부입니다. 9
나노 입자의 셀룰러 복용량 microscopies, 질량 분석 (MS), 추정 하는 데 사용 하는 고전 분석 도구 유도 결합 플라즈마 (ICP-MS) MS10,11 및 액체 크로마토그래피 석사 (LC-석사), 하지만 그들은 단지 제공 거시적인 규모에서 유용한 정보입니다. 그들 중 누구도 subcellular NPs 콘텐츠 분류 방법의 사용 없이 NPs 배급의 정확한 평가 제공할 수 있습니다. 복용량 응답의 체계적인 평가 불가능 따라서 이러한 방법으로, 반대로 핵 현미경 분석12,13, 싱크 로트 론 x-선 형광 현미경14 같은 원자 분광학에 기반으로 하는 방법 , 그리고 2 차 이온 질량 분석 (SIMS). 15 , 16 그들은 형광 현미경을 사용 하 여 만든 관측을 보완, NPs 형광 분자와 함께 표시 될 수 없습니다 및 따라서 그들의 네이티브 국가에서 공부 하는 경우에 특히 이러한 방법은 특히 흥미 있다. 어느 정도까지, NPs는 fluorophores, 함께 융합 하는 경우에 (i) 정량화 남아 어려운 NP 당 태그 수준 알려져 있기 때문에 (ii) NP 표면 화학 수정 세포의 분포를 수정할 수 있습니다.
이 문서에서는, 우리가 이미징 형태학 및 주, 부, 생물학 견본의 원소 구성에 핵 현미경 기술의 조합에 따라 방법에 집중 하 고 농도 추적.
원자력 현미경 분석 특히 생물학 조직에 화학 성분의 측정에 적합을 증명 한다. 빔 측면 해상도 (0.3 ~ 1 μ m) 및 화학 원소 검출에서 감도 (1 ~ 10 µg.g-1 건조 질량)는 세포 수준에서 연구 하는 데 적합 하다. 원자력 현미경 기법 샘플에 존재 원자와 상호 작용 하는 (일반적으로 MeV 에너지에서 실행 되는) 이온 빔 후 방출 입자 검출 (광자, 전자, 이온)를 기반으로 합니다. 셀에 발생 하는 상호 작용은 주로: 1) 여기/이온화 원자 원자를 기본 상태로; 반환 후 광자의 방출 다음의 그리고 2) 그들의 에너지와 방향을 선도 하는 들어오는 입자의 확산. 상호 작용에 관련 된 원자의 방출된 입자 에너지 allowsthe 식별 측정. 요소의 매핑을 수행 하 이온 microbeam는 반복 검색 샘플 표면에 종종 100 µ m2 여러 셀을 포함 하 여 약 100의 지역. 내보낸된 입자 감지 하 고 그들의 에너지는 각 광속 위치에 대 한 기록. 빔 위치에 따라 입자의 정렬, 데이터 처리의 목표는 이러한 입자의 방출에 대 한 책임 구조를 따라서 식별. 여기, 우리는 정확 하 게 형광 현미경 검사 법 및 핵 현미경 분석 검색으로 생활 NP 상호 작용의 결과 조사 하기 위하여 세포질과 세포 하위 스케일에서 exogenous NPs를 계량에 따라 접근을 설명 시스템입니다. 우리는 특히 제자리에 정량화 subcellular 수준에서 이산화 티타늄 나노 (티 오2 NPs)의 관점에서이 방법으로 제공 하는 기회에 집중 한다.

<table><tbody><tr><td><강한>세포 배양</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>U2OS</td><td>ATCC, LGC 표준</td><td>ATCC HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>중간 MCCOY 5A w/o L-글루타민</td><td>Dominique DUTSCHER</td><td>L0211-500</td><td></td></tr><tr><td>FBS 500 mL</td><td>Dominique DUTSCHER</td><td>500105U</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; L-글루타민 200 mM, 100 mL&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin,&nbsp; 20 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10092772</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25% (v/v)&nbsp; 500 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11570626</td><td></td></tr><tr><td>Viromer Red</td><td>Lipocalyx</td><td>VR-01LB-01</td><td></td></tr><tr><td>Matrix-roGFP Plasmid</td><td>AddGene</td><td>#49437</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>H3570</td><td>취급 주의</td></tr><tr><td>NPs preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TiO2 P25 AEROXIDE</td><td>Degussa/Evonik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T3163</td><td>Surface modification of NPs</td></tr><tr><td>Sample preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리카보네이트 호일</td><td>Goodfellow</td><td>CT301020</td><td></td></tr><tr><td>폴리에테르 에테르 케톤 지원 (PEEK)</td><td>Matechplast</td><td>A-239-4047</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, ACS 절대</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>02860-6x1L</td><td></td></tr><tr><td>클로르포름, 무수, 99%</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>372978-1L&nbsp;</td><td>주의: 독성</td></tr><tr><td>Formvar 100 g</td><td>한천 과학</td><td>AGR1201</td><td>유해합니다. 10 &micro의 농도에서 사용하십시오. 클로로포름</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>시그마 알드리치</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td><강한>샘플 고정</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>분말, 95% 파라포름알데히드</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>158127-500G</td><td>주의 독성. PBS</td></tr><tr><td>PBS(pH 7.4, Ca2+ 및 Mg2+ 제외)</td>에서 4% 용액으로 사용<td>ThermoFisher Scientific</td><td>11503387</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>93443</td><td>유해한</td></tr><tr><td><강한>시료 동결 고정</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td>공기 액체 sante</td><td></td><td>유해한</td></tr><tr><td>메틸부탄 >=99%</td><td>SIGMA-ALDRICH&</td><td>nbsp; M32631-1L</td><td>주의 독성</td></tr><tr><td>알루미늄 전사판</td><td>집에서 만든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>증류수 및 탈이온수</td><td>집에서 만든</td><td></td><td>Barnstead Smart2Pure</td></tr><tr><td>시스템 Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barnstead Smart2Pure</td><td>ThermoFisher를 사용하여 제작됨 과학</td><td>50129870</td><td></td></tr><tr><td>생물안전 벤치, 클래스 II</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MSC-Advantage</td><td></td></tr><tr><td>TC20 자동 세포 카운터</td><td>Biorad</td><td>145-0102SP</td><td></td></tr><tr><td>세는 슬라이드 2 웰</td><td>Biorad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>PIPS 검출기, 25 mm2, 12 keV 에너지 해상도 @5.5 MeV</td><td>캔버라&nbsp;</td><td>PD25-12-100AM</td><td></td></tr><tr><td>고해상도 Si(Li) 고체 검출기, 145-eV에너지 분해능, @Mn-K&alpha;</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Everhart-Thornley 유형 2차 전자 검출기(SED)&nbsp;</td><td>Orsay Physics</td><td>1-SED</td><td></td></tr><tr><td>XRF 교정 표준 나트륨 또는 염소(NaCl</td><td>마이크로물질</td><td>34381</td><td></td></tr><tr><td>XRF 교정 표준) 마그네슘(MgF2</td><td>마이크로물질</td><td>34382</td><td></td></tr>) <tr><td>XRF 교정 표준 알루미늄(알루미늄 금속</td><td>마이크로물질</td><td>34383</td><td></td></tr><tr><td>XRF 캘리브레이션 표준 실리콘(SiO</td><td>마이크로물질</td><td>34384</td><td></td></tr>)<tr><td>XRF 교정 표준 황(CuSx</td><td>마이크로물질</td>) <td>34385</td><td></td></tr><tr><td>XRF 교정 표준 칼슘(CaF2</td><td>마이크로물질</td><td>34387</td><td></td></tr><tr><td>XRF 교정 표준) 티타늄(Ti 금속</td><td>마이크로물질</td><td>34388</td><td></td></tr><tr><td>XRF 교정 표준) 철 금속</td><td>마이크로물질</td><td>34389</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator 750W</td><td>음향 재료</td><td>11743619</td><td></td></tr><tr><td>3MM 마이크로 프로브</td><td>Bioblock scientific</td><td>220-05</td><td></td></tr><tr><td>진공 내 동결 건조기</td><td>Elexience</td><td>EK3147</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경 Zeiss AxioObserver Z1</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>431006-9901</td><td></td></tr><tr><td>전동 스테이지 xy</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>432031-9902</td><td></td></tr><tr><td>EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 대물</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>420351-9910</td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>420781-9910</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss filterset 02</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>488002-9901</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss filterset 38HE</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>489038-9901</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss filterset 31</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>000000-1031-350</td><td></td></tr><tr><td>화학 흄 후드</td><td>Erlab</td><td>Captair SD321</td><td></td></tr><tr><td>입자 가속기</td><td>HVEE</td><td>singletron</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>미국 국립 보건원</td><td>ImageJ 1.51</td><td></td></tr><tr><td>SimNRA 소프트웨어</td><td>Max-Planck-Institut f&uuml; r Plasmaphysik, 독일</td><td>SIMNRA 6.06</td><td></td></tr><tr><td>Gupix 소프트웨어</td><td>Guelph university, 캐나다</td><td>GUPIXWIN 2.2.4</td><td></td></tr></tbody></table>

제자리에서 검색 및 핵 현미경 분석을 사용 하 여 금속 산화물 나노 입자의 단일 셀 정량화

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

화학 원소 영상 기반 마이크로 분석 기법 지역화 및 세포 수준에서 화학 성분의 정량화를 활성화 합니다. 그들은 생활 시스템의 특성에 대 한 새로운 가능성을 제공 하 고 특히 탐지, 지역화 및 생물 표본 및 환경 모두에서 금속 산화물 나노 입자의 존재를 측정에 적합. 사실, 이러한 기술을 모든 (i) (1에서 최대 건조 질량의 10 µg.g-1 ), (ii) 마이크로미터 범위 공간 해상도, 및 (iii) 여러 요소 검색 관련 요구 사항을 충족. 이러한 특성을 감안할 때, microbeam 화학 원소 영상 수 있습니다 강력 하 게 보완 일상적인 이미징 기술을 같은 광학 및 형광 현미경 검사 법. 이 프로토콜에는 경작된 한 세포 (U2OS) 이산화 티타늄 나노 입자에 노출에 핵 현미경 분석을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 셀 성장 해야 한다 고 핵 현미경 분석 단계와 광학 현미경에 사용 되는 특별히 설계 된 샘플 홀더에서 직접 노출. 샘플의 식이 동결 극저온 고정 세포 조직과 화학 원소 분포를 유지합니다. 샘플에 동시 핵 현미경 분석 (스캐닝 전송 이온 현미경, 러더퍼드 backscattering 분석 및 입자 유도 된 x 선 방출) 세포 밀도의 지역 분포에 대 한 정보를 제공 합니다. 화학 요소 뿐만 아니라 나노 입자의 휴대 전화 콘텐츠. 생물학, 특히 Nanotoxicology 및 나노 입자와 생물 학적 샘플 사이의 상호 작용의 우리의 이해를 심화 해야 합니다는 Nanomedicine 신흥 컨텍스트 내에서 이러한 분석 도구에 대 한 필요성이 있다. 특히, 핵 현미경 분석 이라는 것을 나노 입자를 필요로 하지 않습니다, 나노 나타났는데 그들의 표면 상태에 상관 없이 세포 인구에서 개별 셀 수준까지 가늠할 수 있습니다.

세포 배양 및 붙일 레이블된 티 오의 형광 이미징 2 NPs
우리는 샘플 홀더를 복합 분석 뿐만 아니라 세포 배양, 세포 처리에 맞게 설계 되었습니다. 특히, 중요 한 홀더 음 핵 현미경 분석 및 이미징으로 일상적인 광학 현미경을 허용 했다. 이 샘플 홀더 픽 프레임에 2 µ m 두께 폴 리카 보 네이트 호 일을 기반으로 합니다. 셀은 폴 리카 보 네이트, 몇 일 동안 메 마른 문화 조건에 직접 성장 하 고 NPs 노출 등 다른 실험 설정에 대 한 사용.
Fluorophores (TRITC)와 화학 표면 수정 paraformaldehyde 형광 현...

우리 화학 요소 존재 원래의 인간 세포에 그들의 생체 외에서 정량화의 검출을 위한 절차를 설명합니다. 메서드는 모든 셀 종류에 적합 하 고는 금속 산화물 나노 입자 노출 체 외에서 다음 단일 셀에 정량적 화학 분석에 특히 유용.

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

나노입자는 독특한 물리화학적 특성으로 인해 산업 및 의료 분야에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 그러나 나노입자에 장기간 노출됨에 따른 인체 건강에 대한 우려는 여전히 남아 있습니다. 이러한 위험성은 세포 내 나노입자의 거동과 나노입자에 의한 세포의 대사 반응을 연구함으로써 정량화할 수 있습니다.이는 단일 세포 내로 유입된 나노입자를 검출하고 정량화할 수 있는 방법이 부족하기 때문인 측면이 있습니다. 현미경 검사 및 질량 분석법을 포함한 수많은 분석 도구를 사용하여 나노입자의 세포 섭취량을 추정할 수 있지만, 이러한 방법들은 미세 수준에서 질적인 정보만을 제공합니다. 반면, 원자 분광법 기반의 in situ 방법은 시료 준비 과정에서 발생하는 이미징 아티팩트의 양을 줄일 수 있으며, 나노입자를 직접 관찰할 수 있게 합니다.이를 활용하기 위해, 나노입자를 천연 상태 또는 형광 표지와 함께 베드 상에서 연구할 수 있는 상관관계 분석법을 제시합니다. 여기서는 형광 현미경법과 핵 마이크로프로브 분석의 결합을 기반으로 한 방법을 설명합니다. 이 방법은 세포 밀도, 화학 원소의 공간적 분포 및 세포당 나노입자의 양에 대한 이미지를 제공합니다.시연으로서, 형광 현미경과 핵 미세프로브 분석을 모두 사용하여 24시간 동안 이산화티타늄 나노입자에 노출된 세포를 연구하겠습니다. 이 프로토콜을 위해서는 폴리머 PEEK로 제작된 맞춤형 샘플 홀더가 필요합니다. 이는 세포 배양 및 인비트로(in vitro) 관찰에 적합해야 합니다.홀더를 2 µm 두께의 폴리카보네이트 호일로 덮습니다. 폴리카보네이트 호일은 얇은 Formvar 용액 층을 이용해 PEEK 디시에 접착합니다. 장착이 완료되면 시료 홀더를 멸균해야 합니다.필요할 때까지 멸균된 12-웰 플레이트의 각 웰에 하나씩 멸균된 샘플 홀더 여러 개를 보관할 수 있습니다. matrix row GFP 플라스미드가 형질전환된 세포는 형광 현미경으로 확인하여 형질전환이 성공적으로 이루어졌는지와 형광 단백질이 발현되는지 확인합니다. 트립신으로 세포를 수확하고, 37°C에서 3분 동안 배양합니다.신선한 배양액을 첨가하여 트립신 반응을 중단시킵니다. 4°C에서 1200 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 상층액을 제거하고 적절한 양의 신선한 배양액을 첨가합니다.세포 수를 측정하고, 온도가 조절된 신선한 완전 배양 배지를 사용하여 희석하여 마이크로리터당 500개의 세포가 포함된

in-situ-detection-single-cell-quantification-metal-oxide

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

얇은 기관 및 종양 조직에서 수행 레이저 유도 분석 분광법을 성공적으로 하나님 기반의 나노 입자에서 발행 자연 요소와 인위적으로 주입 가돌리늄 (하나님을) 발견되었습니다. 화학 원소의 이미지는 100 μm의 양적 서브 밀리미터 감도의 해상도에 도달했습니다. 표준 광학 현미경과 설치의 적합성은 같은 생체 조직의 여러 이미지를 제공하기 위해 잠재력을 강조한다.

레이저 유도 내역 분광학 : 장기 조직에 나노 입자의 매핑 및 정량을위한 새로운 접근

전자 분광 이미징은 나노미터 해상도로 핵산과 단백질을 이미지화하고 구별할 수 있습니다. 이 시스템은 투과 전자 현미경 샘플에서 태그가 지정된 단백질을 특이적으로 라벨링할 수 있는 miniSOG 시스템과 결합할 수 있습니다. 이중 가닥 파단 복구 초점을 예로 들어 이러한 기술의 사용을 설명합니다.

전자 분광 이미징과 결합 miniSOG 태그 DNA 복구 단백질의 시각화 (ESI)

때문에 팔라듐, 금, 코발트의 중요성과 광범위한 사용   첨단 기술 장비 금속은, 자신의 회수 및 재활용은 중요한 산업 문제를 구성한다. 본원에 기재된 금속 회수 시스템은 간단하고, 저비용 도시 내에서 이러한 금속의 유효 검출, 제거 및 복구를위한 수단이다.

감지 및 팔라듐의 복구, 도시 광산에서 금과 코발트 금속은 나노 수레 바퀴 모양의 기공 지정 소설 센서 / 흡착제를 사용하여

향상된 암시야 현미경 및 스펙트럼 매핑을 통한 초분광 이미징을 통해 기존 방법보다 향상된 속도와 정확도로 조직학적 샘플에서 나노 단위 물질의 스크리닝, 위치 파악 및 식별이 가능합니다. 이 논문의 목표는 조직학적 샘플에서 금속 산화물 나노 입자의 암시야 이미징 및 초분광 매핑 방법을 제공하는 것입니다.

향상된 암시 야 현미경 및 초 분광 매핑하여 조직 학적 샘플에서 금속 산화물 나노 입자의 식별

전기적 보조 변형 (EAD)에 대한 전기 및 열 영향을 분리하는 것은 거시적 인 샘플을 사용하여 매우 어렵습니다. 금속 샘플 마이크로 및 나노 구조와 함께 커스텀 테스트 절차가 개발되어이 샘플에서 주울 가열 및 전위 전개없이 형성에인가 된 전류의 영향을 평가했습니다.

에 대한 소설 방법<em&gt; 현장에서</em&gt; 나노 크기 시편의 전자 기계적 특성 분석

이 문서는 소설 금속 분말의 생산에 사용 하는 방법론에 중점을 두고 대량 nanocrystalline 금속의 처리에 육군 연구소에서 지속적인 노력에 대 한 간략 한 개요를 제공 합니다.

미국 육군 연구소에서 대량 Nanocrystalline 금속 처리

이 작품에서는, nanoprobe 기반 바이오 센 싱의 신호 향상을 위한 프로토콜 제공 됩니다. 프로토콜은 금은, 실리 카 또는 산화 철 나노 입자의 구성 된 기존 nanoprobes의 표면에 chloroauric 산의 감소를 기반으로 합니다.

에 라 골드 나노 입자 합성에 의해 급속 한 Nanoprobe 신호 향상

여기서, 우리는 생물학적 나노기공 기반 전자 플랫폼을 사용하여 단일 분자 한계에서 이산 금속 산소 클러스터, 폴리옥소메탈레이트(POMs)를 검출하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 이러한 분자의 연구에 사용되는 전통적인 분석 화학 도구에 대한 보완적인 접근법을 제공합니다.

단일 금속 나노 입자의 고분해능 물리적 특성화

여기에 제시된 것은 싱크로트론 극저온 X선 나노프로브를 사용한 X선 형광 이미징 이전에 실리콘 질화물 멤브레인 및 플런지 동결에 대한 세포 배양 프로토콜이다. 실온 나노 분석만 이 제공되면, 동결된 시료는 더욱 동결건조될 수 있다. 이들은 세포내 원소 조성물에 대한 정보를 얻기 위한 중요한 단계이다.

싱크로트론 X선 형광 나노 분석을 위한 실리콘 질화물 멤브레인의 세포 배양 및 저온 준비

산화철 나노입자는 비수성 솔 젤 시술을 통해 합성되고 음이온 짧은 분자 또는 폴리머로 코팅된다. 인간 줄기 세포 내부의 자기 나노 입자의 통합 및 생체 변환을 모니터링하기 위한 자기 측정의 사용은 진동 시료 자력계(VSM)를 사용하여 입증된다.

자기 측정을 사용하여 화학적으로 합성된 산화철 나노 입자의 세포 통합 및 후속 생분해를 모니터링합니다.

소수 종, 광원, 산소 공실 및 기타 포인트/라인/평면도 결함으로부터 정보를 안정적으로 추출하는 사고 전자 빔 흔들림 조건하에서 전자 채널링 현상을 활용하여 불순물 및 화학 상태의 사이트 점유율을 추정하기 위한 정량적 미세 분석 방법의 일반적인 개요를 제공합니다.

전자 채널링 강화 마이크로 분석에 의한 결정재료의 기능적 도팬츠/점 결함의 정량적 원자사이트 분석

학습하세요 인간 세포 내 금속 산화물 나노입자의 제자리 검색 및 단일 세포 정량화 방법을. 원자 분광법과 핵 현미경 분석을 결합하여 나노입자 세포 흡수와 대사 반응을 정량적으로 연구합니다.

제자리에서 검색 및 핵 현미경 분석을 사용 하 여 금속 산화물 나노 입자의 단일 셀 정량화

더 많은 동영상 탐색