Name: 감염 된 조직에서 세균 유전자 규칙을 공부 하는 형광 기반 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 학습하세요 형광 기반 방법으로 감염된 동물 조직에서 Staphylococcus aureus의 공간적 유전자 발현 패턴과 세포 간 이질성을 분석하는 기술입니다. 이 방법은 새로운 항균 표적을 식별하는 데 활용됩니다.

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교류 cytometry 분석에 대 한 PsarAP1-tdTomato 퓨전, 그리고 카 렌 크레스 웰의 선물에 감사 알렉산더 Horswill 하 고. 우리는 또한 통계 분석에 대 한 조언을 Alyssa 킹을 감사합니다. 이 작품은 NIH 탐사/발달 연구 상 (그랜트 AI123708) 및 교직원 시작 자금 연료 부스터 부분에 투자 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 해석, 또는 게시에 대 한 작품을 제출 하도록 결정에 역할을 했다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 조지타운 대학에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 형광 기자 스트레인의 발생
<ol><li>게놈 통합 pRB4 벡터 순차적으로 EcoRI 및 SmaI 금지 효소로 소화. 제조 업체의 프로토콜을 따르고 25 ° C에서 1 µ g의 pRB4 사용 하 여 SmaI와 하룻밤 소화를 설정 하 고 37 ° C에서 1 시간에 대 한 두 번째 소화 EcoRI 반응 혼합물에 추가 하 여 진행. 20 분 동안 65 ° C에서 배양 하 여 효소 비활성화.</li>
	<li>PCR 증폭의 genomic DNA에서 (이 경우는 ~ 350 기본적인 쌍 DNA 파편 포함 하는 thermonuclease [nuc] 발기인 지역), 규제 지역 5' EcoRI 금지 사이트와 3' SmaI 제한 사이트. SmaI 인식 시퀀스 프레임에 있어야 변환 시작 codon로. 이 연구에서 PCR 뇌관 앞으로 oRB015와 제조 업체의 권장 사항에 따라 높은 충실도 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 수행 되었다 (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') 및 뇌관 oRB016 (역 5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). 어 닐 링 온도 53 ° c 이다. 제조업체의 지침에 따라 PCR 청소 키트를 사용 하 여 결과 조각 정화.</li>
	<li>EcoRI와 SmaI 단계 1.1에서에서 수행 결과 PCR 제품을 소화 하 고 소화 DNA 파편을 사용 하 여 T4 DNA 리가 제조업체에서 권장 하는 대로 통합 구조를 생성 pRB4의 동일한 사이트에 선. 대장균 으로 결 찰 혼합물을 소개 하 고 구문을 시퀀스를 확인 합니다.</li>
	<li>Electroporate S. 구 균 긴장 RN4220에 구조는 이전34를 설명합니다. 간단히, 1 µ g의 플라스 미드를 사용 하 여 전기 유능한 세포의 70 µ L로 (100 Ω, 25 µ F, 및 2.3 kV) B2 국물 (1% [w/v] 카 제인의 2.5% [w/v] 효 모 추출 물, 2.5% [w/v] NaCl, 0.1% [w/v] K2포4, 0.5% [w/v] 포도 당). 에 리스로 마이 신 (5 µ g mL-1)과 (X-여자; 80 µ g mL-1) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside 보충 tryptic 간장 agar (TSA) 허용 온도 (30 ° C)에 리스로 마이 신 저항 (Emr)을 선택 합니다. 결과 transformants는 플라스 미드로 인코딩된 β-galactosidase 활동으로 인해 블루. 참고: 임상 분리로 DNA의 이동 때문에 강한 제한 수정 장벽35매우 어렵습니다. 따라서, 그것은 부족 하 고 높은 변환 가능한 제한 때문에 S. 구 균 RN4220 퓨전 구문의 중간 받는 사람으로 사용 되었다.</li>
	<li>S. 구 균 USA300 스트레인 electroporation 또는 살 균 소 중재 변환36 을 사용 하 여 허용 온도에서 관심사의 플라스 미드를 전송 합니다. 간단히, Φ11 살 균 소 입자 5mm CaCl2 를 포함 하는 TSA 격판덮개를 사용 하 여 기증자 스트레인에 30 ° C에서 하룻밤 그리고 다음 0.45 μ M 셀 루 로스 아세테이트 주사기 필터를 통해 여과 하 여 소독을 전파 합니다. 그들r S. 구 균 긴장 락 transduce lysates 사용. 참고: 락 널리 임상 분리 이전 Em 민감한 의해 만들어진 TSB 매체 수 여 Emr 37,38네이티브 플라스 미드 pUSA03의 변형 치료에 직렬 통로 이다.</li>
	<li>앞에서 설명한32염색체에 두, 연속 동종 재결합 이벤트에 구조를 통합. recombinants 페니, 리스로 마이 신은 취약 음 (s), 및 더 이상 파랑의 페니-내성 (Cmr)에 TSA 격판덮개 5 μ g m l-1 를 포함 하는. 참고: 가능 하면 다시 생체 외에서 스트레인 통로39 및 온도 교대와 관련 된 돌연변이의 축적을 피하기 위하여 변환 페이지 중재를 통해 USA300로 표시 된 퓨전 소개.</li>
</ol>2. 동물 감염: 준비 Inoculum, 전신 감염, 및 조직 처리
<ol><li>
세균성 inoculum의 준비
	<ol>
<li>냉동된 글리세롤 재고에서 혈액 한 천 배지에서 격리에 대 한 관심의 S. 구 균 종자를 행진. 적혈구 (Rbc) lyse 그들의 능력에 기반 하는 hemolytic 고기 확인 16-24 h에 대 한 37 ° C에서 품 어와 양식 투명 영역 합니다.</li>
		<li>메 마른 유리관에 tryptic 간장 국물 (TSB)의 4 mL를 각 스트레인의 단일 식민지를 접종 하 여 숙박 문화를 시작 합니다. 약 70 ° 각도와 [RPM] 분당 70 회전 설정 튜브 롤러에서 16-24 h에 대 한 37 ° C에서 튜브를 회전 합니다.</li>
		<li>600에서 광학 밀도 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 하 여 단계 2.1.2에서에서 문화의 nm (OD600). 메 마른 매체를 사용 하 여 광학 참조 (빈)로. 0.05에서 25 ml의 멸 균 Tryptic 간장 국물 (TSB) 별도의 OD600 이 세포를 희석, 125 mL DeLong 플라스 크 (볼륨 비율 플라스 크 5:1) 및 (에 대 한 올바른 열 전달 문화), 물 목욕 문화를 품 어 280 RPM에서 진동 하 고 37 ° c.로 설정 참고:는 inoculum의 성장; 다양 한 방법으로 수행할 수 있습니다. 지 수 단계 성장 하는 셀에 대 한 한 가지 방법은 제공 됩니다. 어쨌든, 그것은 지속적으로 동일한 메서드를 사용 하 여 접종에 대 한 셀을 준비 하는 것이 중요입니다.</li>
		<li>세600 ~ 1, 다시 시작 세600 세포 지 수 단계를 달성 하 고 야간 보육 동안 축적 요인 지 수 단계 수준으로 감소 되었습니다 0.05의 신선한 매체에 셀 희석.</li>
		<li>실 온에서 10 분 동안 3000 x g 에서 centrifuging 여 지 수 단계 (OD600 ~0.6–0.8) 세포를 수확.</li>
		<li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.4) x 살 균 1의 해당 볼륨에 두 번 알 약을 씻으십시오.</li>
		<li>1 x 108 콜로 니 형성 단위 (CFUs) mL-1 의 농도를 1 x PBS (pH 7.4)에 셀을 일시 중지 하거나 원하는 적합 실험. 참고: 셀 크기와 모양의 스트레인-종속 변경 산란 속성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 세600 사이의 CFU mL-1 관심의 각 변형에 대 한 관계를 결정 하는 것이 중요 하다 고, 궁극적으로 감염 복용량입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
동물 및 세균 감염의 준비
	<ol>
<li>정화 다이어트 아 인-93에 7 일 동안 마우스를 적응. 다이어트는 표준 마우스 차 우40에 사용 되는 식물 기반 재료의 소비와 관련 된 조직 자동-형광을 줄이면서 적절 한 영양을 제공 하 공식화 했다. 참고: 여성 C57/BL6 마우스 (6-8 주 이전) 여기에, 사용 된다 그러나 마우스 긴장과 섹스 연구에 따라 달라 집니다.</li>
		<li>감염, 전에 미지근한 물으로 마우스 꼬리 혈관 같은데요.</li>
		<li>생산 조직의 감염을 꼬리 정 맥을 통해 세균 inoculum의 100 µ L를 주입 하 여 동물을 감염. Cytometry 수행 하는 경우 초기 inoculum의 약 수를 저장 (섹션 4 참조).</li>
		<li>동물을 매일 모니터링 하 고 검토 하 고 하나의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 모니터링 시스템을 사용 하 여 자신의 건강 상태를 평가.</li>
		<li>원하는 기간에 대 한 진행에 감염을 수 있습니다. 여기, 실험 종료 3 일 후 감염입니다. 참고: 이러한 조건 하에서 박테리아, 면역 세포5,41의 동심 층으로 둘러싸여 있고 섬유 소 예금의 포도 농 공동체 농에 의하여 이루어져 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수확 하는 기관 및 조직 처리
	<ol>
<li>CO2 흡입 및 보조 방법으로 자 궁 경부 전위에 의해 동물 안락사 고 검 시를 수행 합니다.</li>
		<li>신장 (오른쪽) 및 다른 중요 한 장기 (심장, 간, 폐, 비장)을 수확 하 고 10% [v] 버퍼링 말린을 포함 하는 15 mL 폴 리 프로필 렌 튜브로 전송. 이러한 장기 2.3.4 아래 단계를 계속 수행 하십시오.</li>
		<li>살 균 2 mL 충격 방지 튜브 2 m m 실리 카 구슬의 1 mL 균 1 x PBS (pH 7.4) ~ 500 µ L을 포함 하는 왼쪽된 신장 전송. 4.2 단계로이 기관으로 진행 합니다.</li>
		<li>2.3.2 부드러운 진동 또는 회전 24 시간 이상 하지만 이상의 48 시간 실 온에서 어둠 속에서 수정 단계에서 장기를 허용 합니다.</li>
		<li>매체를 동결 명확한 조직에 장기를 포함 하 고 저장-80 ° c.에 조직</li>
		<li>10 µ m 두께의 조각으로 cryostat, 조직 섹션을 사용 하 여.</li>
		<li>어둠 속에서 20 분에 대 한 사전 청소, 충전 유리 슬라이드에 섹션을 건조, 하드 설치 매체와 함께 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 얼룩을 적용 하 고 coverslip 적용. 하룻밤 실 온에 탑재 된 슬라이드를 치료 하 고 장기 저장을 위한 4 ° C에 전송.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 레이저 스캐닝 Confocal 현미경 검사 법 및 이미지 처리
<ol><li>사용 되 고 형광 기자에 대 한 적절 한 레이저를 사용 하 여 병 변을 찾을 수 마운트 슬라이드를 검사 합니다. 이 경우, 그린 (GFP), 레드 (tdTomato), 그리고 파랑 (DAPI) 형광 신호 사용 됩니다.</li>
	<li>개별 셀을 시각화에 대 한 적절 한 목표를 사용 하 여 이미지를 획득 (예를 들어, 일반적으로 20 x 또는 40 x 목표 사용 된다).</li>
	<li>
공초점 이미지의 형광 강도 측정 합니다.
	<ol>
<li>이미지 J에 confocal 이미지를 열고 제대로 병 변의 형광 신호를 시각화 하기 위해 밝기/대비를 조정 합니다.</li>
		<li>관심, 그리고 임계 처리 옵션을 사용 하 여 영역을 정의 필요에 따라 하위 및 상위 형광 한계를 설정.</li>
		<li>선택 하 여 중심을 정의 영역 → 평균 회색 값 → 중심 → 임계값 제한 제이 이미지에서 분석 탭</li>
		<li>중심 형광 강도 값을 추출 하거나 GFP와 tdTomato에 대 한 단위 지역 (의미 형광 강도, MFI) 당 주어진된 병 변에서 평균 형광 강도 측정 합니다. 여기, 1 µ m2 의 영역 사용 되었다. 참고: 멀게 두 번째 분석 샘플의 정체성 알려져 때 바이어스를 최소화 합니다.</li>
		<li>데이터를 플롯 하 고 각 비교에 대 한 적절 한 통계 분석을 수행.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 교류 Cytometry 분석
<ol><li>
(선택 사항) (2.2.3 단원)에서 감염의 날에는 inoculum의 융합 활동을 결정
	<ol>
<li>1 x 899 µ L를 살 균 PBS (pH 7.4) 100 µ L의 각 inoculum 추가 하 고 막 permeant 핵 산의 1 µ L 얼룩 ( 재료의 표참조). 컨트롤, 핵 산 얼룩 부족 샘플을 포함 해야 합니다.</li>
		<li>모든 샘플에 cytometry를 수행 합니다. 참고: 첫 실험에 대 한 사용 하 여 적절 한 전압을 결정 하는 관심의 융합에 대 한 벡터만 컨트롤을 포함 해야 유용 합니다. 긍정적이 고 부정적인 샘플 간의 구분이 분명 데이터 분석을 위해 필수적인 기자를 나타내는 이다 배경 신호 이상.</li>
		<li>세균성 인구를 식별 하려면 핵 산 얼룩 (y 축)을 사용 하 여 이벤트를 플롯 하 고 분산형 (x 축)를 전달 합니다.</li>
		<li>두 핵 산 얼룩 긍정적인 이벤트와 앞으로 분산형 ( S. 구 균에 대 한 0.5 ~ 2.0 µ m) 사이 따라 박테리아의 정확한 크기 포함 게이트를 그립니다. 참고: 이러한 매개 변수에서 명확 하 게 이벤트를 포함 하는 것이 중요으로이 인구를 식별할 때 엄격한 수.입니다 이 게이트는 다른 조건 하에서 부정적인 컨트롤에 대 한 모든 이벤트를 제외 해야 합니다. 이 연구에서는 약 70%는 세포 인구 만난 분석에서 이러한 요구 사항을.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
희생 후 조직 샘플의 분석:
	<ol>
<li>동물 안락사, 왼쪽된 신장 (2.3 단계 참조), 수확 및 비드 구타로 이동 관 포함 1 mL 균 PBS (pH 7.4) x 1 및 2 m m 붕 구슬의 250 µ L.</li>
		<li>세균성 세포 출시 조직 방해. 신장 세포를 방해 하는 균질 화기를 사용 합니다. 여기, 냉각 기간 주기 사이 젖은 얼음에 1 분으로 6800 rpm에서 3 개의 30 s 파열 난방 샘플을 최소화 하기 위해 사용 되었다.</li>
		<li>펠 릿 centrifuging 250 x g 탁상 microcentrifuge 3 분에 의해 더 큰 조직 파편 4 ° c.에 냉각 참고: 일반적으로, 셀 펠 렛 튜브와 상단에 떠 있는 파편의 층의 밑에 있다. 중간의 수성 층 세균 셀을 포함합니다.</li>
		<li>PBS의 989 µ L에서 핵 산 얼룩의 1 µ L을 포함 하는 깨끗 한 1.5 mL microcentrifuge 관으로 수성 층에서 10 µ L를 전송 (전체 용량 1 mL).</li>
		<li>동일한 데이터 수집 매개 변수를 사용 하 여 및 초기 inocula에 관해서는 게이팅 cytometry를 수행 합니다. 참고: 세균성 세포 수 샘플은 주로 조직 파편을 포함 하기 때문에 매우 낮은 것입니다. "라이브 게이트" 옵션 세포는 핵 산 얼룩 긍정적이 고 크기 문이 데이터 응용 프로그램에 로드 되 면 경우에 사용할 수 있습니다. 이 또한 대상 이벤트의 더 분석 하 고 파일 크기를 줄일 데 도움이 됩니다. 샘플 당 거의 1 백만 이벤트 계산 됩니다, 하지만 더 많은 이벤트 카운트는 감염의 심각도 및 조직 분석의 크기에 따라 필요할 수 있습니다.</li>
		<li>데이터 분석: 결정 각 fluorophore 섹션 4.1.4 결정 포함 게이트를 사용 하 여 주어진된 샘플에 대 한 형광 강도 (MFI)을 의미. 이벤트 카운트를 흐름 분석 소프트웨어에서 샘플을 정상화. 10000 카운트는 분석에서 일반적으로 충분 하다. 참고: 이후이 농 양 형성, 감염의 심각도에 따라 이벤트의이 수 보다는 더 적은 포함 하는 샘플을 찾아내는 것은 드물지 않다. 이 접근, 500-40, 000를 사용 하 여 이벤트는 일반적으로 감염 된 조직에서 발견 된다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

세균 감염 증은 항생제 내성 결정 요인46의 수집으로 인해 전세계 증가 건강 문제. 호스트 환경에 적응 성장과 감염 동안 생존을 위해 필수적 이다, 때문에 병원 체 적당을 증가 하는 유전자 식 프로그램을 대상으로 전략 therapeutically 유용한 증명할 수 있습니다. 하나는 이러한 프로그램이 SaeR/S 두 구성 요소 시스템 (TCS), 면역 회피47에 필수적인 역할을 이전 표시에 의해 통제 하는 유전자의 집합입니다. SaeR/S는 다양 한 요인, 특히 그 중 성구8,20와 관련 된에 의해 유도 된다. 감염, 동안 S. 구 균 중 성구 및 다른 식 세포는 감염2의 사이트에 보충 강한 염증 반응 elicits. 액 화 괴 사 및 섬유 소 증 착 따라 조직 손상<sup class...

박테리아는 차동 적응과 생존에 필요한 유전자를 표현 하 여 생리 적 조건 및 그들의 환경에의 영양 상태에 변경 변경에 응답 합니다. 예를 들어, 기회 주의 병원 체는 몸 표면에 상대적으로 낮은 밀도, 그리고 자주 무해 한 식민지. 그러나, 박테리아는 물리적, 화학적 장벽을 침투 하 고, 일단 그것은 호스트 면역 세포 카운터 방어와 제한 된 양분 가용성1맞설 까 해야 합니다. 예를 들어, 황색 포도상구균 인구의 약 1/3를 asymptomatically colonizes 하지만 치명적인 피부 및 연 조직 감염, 도왔습니다, 심장 내 막 염, 그리고 bacteremia2의 원인입니다. S. 구 균 병원 체로 서의 성공은 종종 대사 유연성 뿐만 아니라 혈 류를 탈출 하 고 주변 조직 에서에서 복제에 박테리아 수 있도록 표면에 연결 하 고 분 비 독성 요인의 특성을 사용합니다 3,,45. 호스트 죽음 포도 질병 때문 이며 진화 막다른 한계 전송 새 호스트6, 때문에 독성 요소 생산 하겠다는 신중 하 게 제어 해야 합니다.
밀도, 성장 단계, neutrophil 관련 요인, 및 독성 유전자가에 표현 되도록 양분 가용성 단백질 및 비 코딩 RNAs 응답 다양 한 환경 자극의 복잡 한 규제 네트워크, 세포 등에서 정확한 시간과 위치 호스트 조직7,8,9,10,11,,1213. 예를 들어, SaeR/S 두 구성 요소 시스템 (TCS) 조절 센서 키 (SaeS)와 응답 레 귤 레이 터 (SaeR)14를 통해 여러 독성 요인의 표현. SaeS는 호스트 신호 (예:, 인간 호 중구 펩 티 드 [HNPs] calprotectin)8,,1516응답에서 보존된 히스티딘 잔류물에 autophosphorylated입니다. Phosphoryl 그룹은 다음 aspartate 잔류물에 전송 SaeR, DNA 묶는 단백질으로 활성화 (SaeR ~ P)17. SaeR/S TCS fibronectin 의무적인 단백질 (FnBPs), coagulase14,18,,1920, leukocidins, 등 병 인에 기여 하는 20 개 이상의 유전자를 통제 한다. 대상 SaeR의 수준으로 유발 확률이 높은 친 화력과 낮은 선호도 유전자 대상으로 분류 될 수 있다 ~ P 상승의 신호21에 노출 되 면. SaeR/S 활동 Agr 쿼럼 감지 시스템 같은 유전자 발현의 다른 레 귤 레이 터, 독 소 단백질 (썩 음), 그리고 대체 시그마 요인 B (SigB)22,,2324의 진압에 의해 제어 됩니다.
nuc 황색 포도상구균 에 성폭력 종속 독성 유전자 이며 neutrophilic extracellular t비난 (그물)에서 탈출 한 동안 보급을 위한 필수적 이다 thermonuclease (Nuc)를 인코딩하는 감염25,26의 과정. Nuc 의 식은 강하게 직접 측 쇄 사슬 아미노산, GTP27, 존재 코디에 의해 하지 억압 이며 직접 포도 액세서리 레 귤 레이 터 단백질 사라28,29에 의해 억압 , 그의 활동이 산소 (산화 환 원 상태)와 산도30에 의해 좌우 된다. 성폭력 및 nuc 돌연변이 감염 마우스 모델에서 감쇠는, 그에 주어진 그들의 해당 활동26,31을 억제 하는 화학 개입 개발에 관심이 있다. 그럼에도 불구 하 고, 감염 시 그들의 규제에 관한 어떠한 정보도가 있다.
형광 기자 모니터링 하 고 단일 세포 수준에서 유전자 발현을 정량 사용 되었습니다. 여기, 우리는 S를 측정 하는 방법 제시. 감염 시 균 유전자 발현,와 결합 될 때 체 외 transcriptome 분석 및 자기 공명 영상 (MRI) 및 자기 공명 음 분광학 (MRS) 같은 강력한 이미징 기술을 계시 할 수 있다 어떻게 세균 생리학은 vivo 및 특정 틈새에서 영양소의 상대적 나타났는데에서 통제 된다. 메서드는 그러므로 유전 시스템과 어떤 세균성 병원 체에 적용할 수 있습니다.
게놈 통합 벡터의 개요입니다.
게놈 통합 벡터 pRB4 500 기본 쌍 각 동종 재결합을 촉진 하기 위하여 S. 구 균 USA300 SAUSA300_0087 pseudogene의 상류와 하류 지역에서 포함 되어 있습니다. pRB4는 리스로 마이 신 저항 카세트 (ermC)와 recombinants32의 블루/화이트 심사에 대 한 내 베타-galactosidase 유전자 bgaB 를 포함 하는 온도 민감한 pMAD 벡터 등뼈에서 파생 됩니다. 조작된 기자 구문 또한 들어 페니 저항 마커 (고양이) 게놈 통합 및 플라스 미드 제거 뿐만 아니라 관심 superfolder 녹색 규제 영역을 융합 EcoRI와 SmaI 사이트 후 선택 형광 성 단백질 (sGFP) (그림 1). 그것은 알려져 그 리보솜 바인딩 사이트 (RBS)의 기자의 활동에 영향을 하며 종종 경험적 최적화33. 따라서,는 RBS는 제공 되지. 여기, 네이티브 리보솜 바인딩 사이트는 유전자 발현의 좀 더 자연 스러운 패턴에 대 한 제공 하는 데 사용 됩니다 하지만 다른 사이트를 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>5% 양 혈액</td><td>Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)</td><td>A10</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td><td>ThermoScientific</td><td>R0402</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 Mice</td><td>Charles River</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0378</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>cryostat microtome</td><td>Thermo Scientific</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Culture, Cap</td><td>VWR International</td><td>2005-02512</td><td></td></tr><tr><td>D+2:25NA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>에리스로마이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5389</td><td></td></tr><tr><td>유량 분석기</td><td>Becton Dickinson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>유리 구슬</td><td>Sigma</td><td>Z273627</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep, 플라스미드</td><td>Promega</td><td>A1220</td><td></td></tr><tr><td>궤도 진탕 수조</td><td>New Brunswick Innova</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>PCR 정제</td><td>QIagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수 (PBS)</td><td>Cellgrow</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>Tecan</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 homogenizer</td><td>Bertin Laboratories</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>pUC57-Kan</td><td>GenScript (Piscataway, NJ)</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Taq DNA 중합효소</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>제한 효소</td><td>New 잉글랜드 바이오랩스(매사추세츠주 입스위치)</td><td>R0150S(PvuI), R3136S(BamHI), R0144S(BglII), R3131S(NheI), R0101S(EcoRI), R0141S(SmaI).</td><td></td></tr><tr><td>역전사 효소</td><td>New England BioLabs</td><td>E6300L</td><td></td></tr><tr><td>Sanger Sequencing</td><td>Genewiz (Germantown, MD)</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sub Xero 투명 조직 냉동 매체</td><td>Mercedes Medical</td><td>MER5000</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>superloop</td><td>GE Lifesciences</td><td>18111382</td><td></td></tr><tr><td>주사기, 필터</td><td>VWR International</td><td>28145-481</td><td></td></tr><tr><td>Syto 40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11351</td><td>멤브레인 투과 핵산 염색</td></tr><tr><td>테트라사이클린</td><td>시그마-알드리치</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>트립틱 소이 국물</td><td>VWR</td><td>90000-376</td><td></td></tr><tr><td>UV 가시광선 분광 광도계</td><td>Beckman Coulter-DU350</td><td>NA</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td><td>을 사용한 Vectashield Antifade 마운팅 매체</td></tr></tbody></table>

감염 된 조직에서 세균 유전자 규칙을 공부 하는 형광 기반 방법

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

세균성 독성 유전자는 다른 환경 신호에 응답 하는 여러 요인에 의해 종종 transcriptional 수준에서 통제 된다. 몇 가지 요인을 행동 직접 독성 유전자; 다른 다운스트림 레 귤 레이 터의 식이나 레 귤 레이 터 활동에 영향을 주는 신호의 축적을 조정 하 여 병을 제어 합니다. 레 귤 레이 션 생체 외에 성장 하는 동안 광대 하 게 공부 하고있다, 동안 상대적으로 작은 유전자 발현은 감염 시 조정 하는 방법에 대 한 알려져 있다. 이러한 정보는 특정 유전자 제품은 치료 적 개입에 대 한 후보 때 중요 하다. Transcriptional 접근 같은 양적, 실시간 RT-PCR 및 RNA-Seq는 글로벌 수준에 유전자 발현 검사 하지만 호스트 RNA 및 샘플에 비해 세균 RNA의 낮은 풍부를 포함 하 여 많은 기술 문제에서 고통 하는 강력한 방법을 RNases에 의해 저하입니다. 평가 규칙 형광 기자를 사용 하 여 상대적으로 쉽게 하 고 독특한 스펙트럼 특성을 가진 형광 성 단백질으로 다중화 될 수 있다. 메서드는 복잡 한 3 차원 건축과 physiochemical 그라디언트 세균성 규제 네트워크에 영향을 주는 조직에서 유전자 발현의 단일 셀, spatiotemporal 분석 할 수 있습니다. 이러한 정보는 데이터 대량 인구 이상 평균 하는 때 손실 됩니다. 여기, 세균성 병원 체 제자리에서 유전자 발현을 측정 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 간단한 조직 처리 및 기자 단백질에서 형광의 직접 관찰을 기반으로 합니다. 우리는 포도 상 구 균 thermonuclease (nuc), 유전자 제품 면역 회피 및 전 비보, vivo에서 전체 독성은의 식을 검사 하 여이 시스템의 유틸리티를 보여 줍니다. 우리는 nuc gfp 신장 농 양 표현 하는 표시 완전히 면역 응답에와 함께 종사 하는 농에 nuc 발기인 활동의 명백한 공간 규정에 인해 이질적인 유전자 발현을 일부 공개. 까지의 유전자 시스템 어떤 박테리아와 감염 모델, 전 임상 연구 및 신약 개발에 대 한 귀중 한 정보를 제공 하는 메서드를 적용할 수 있습니다.

우리는 어떤 기자를 제공할 수 있는 pMAD32 에서 파생 된 플라스 미드를 개발 더블 크로스 오버 동종 재결합 (그림 1)에 의해 염색체에 퓨전 구문. 이 구조는 GFP 단백질 생산 배경 위에 형광 신호를 지 원하는 어떤 규제 지역의 정량 분석에 대 한 수 있습니다. 플라스 미드 암 피 실린 저항 (Apr) 유지 보수 및 대장균 에서 전파에 대 한 수 여 하 고에 리스로 마이 신 저항 (Emr)를 수 여 S. 구 균. 구조는 페니 저항 (rCm), 정교한 유전자 분석에 대 한 다양 한 돌연변이 체 긴장 사이 기자는 통합된 융합의 쉽게 전송 허용에 또한 수 여 S. 구 균.
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여기에 설명 된 세포 수준에서 동물의 조직에서 세균 유전자 발현을 분석 하기 위한 방법이입니다. 이 메서드는 감염 동안 조직 환경에 대 한 응답에서 세균성 인구 내에서 발생 하는 phenotypic 다양성을 공부에 대 한 리소스를 제공 합니다.

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

이 방법은 조직의 전체 인구에 걸쳐 평균 될 때 손실되는 조직 마이크로 환경을 호스트하는 생리적 적응을위한 세균성 유전자 발현 및 전략의 공간 패턴을 공개 할 수 있습니다. 이 기술로 잠재적이기적인 이질성은 항보성 또는 항균 화합물에 의해 표적으로 하는 새로운 세균성 통로 및 단백질을 확인할 때 고려되어야 한다는 것을 검출될 수 있습니다. 냉동 글리세롤 육수에서 혈액 천서 판에 대한 관심의 S.aureus 균주를 줄이고 적혈구를 lyse와 명확한 투명 영역을 형성하는 능력에 따라 자신의 용혈 표현형을 확인하기 위해 16 ~ 24 시간 동안 37 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하여 시작합니다.살균 대두 국물, 또는 TSB의 4 밀리리터에 각 변형의 각 변형을 접종하고 약 70도 각도에서 튜브 롤러에서 16 ~ 24 시간 동안 섭씨 37도에서 튜브를 회전약 70도 각도와 분당 70 회전. 다음날 아침 분광계의 배양600 나노미터 또는 OD 600의 광학 밀도를 측정하고 125 밀리리터 Delong 플라스크에서 5 대 1 플라스크대 부피 비율로 멸균 TSB의 25 밀리리터에서 0.05의 OD 600으로 세포를 희석시. 분당 280회전에서 37도의 섭씨 수조에서 배양물을 배양하고 기하급수적인 단계에서 세포를 수확한다.원심분리에 의해 세포를 펠렛하고 멸균 PBS의 동등한 부피로 세포를 두 번 세척한다. 그런 다음 신선한 PBS에서 세포를 수신자 동물로 후속 주입을 위해 밀리리터 농도당 밀리리터 농도당 8번째 식민지 형성 단위로 1배씩 재연한다. 적절한 실험 종점에서 신장, 심장, 간, 폐 및 비장을 15 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브로 수확하여 10% 완충된 포르말린 튜브를 실내 온도에서 24~48시간 배양하여 부드러운 흔들림이나 회전을 합니다.고정의 끝에서, 영하 80도에서 저장을위한 명확한 조직 동결 배지에 장기를 포함. 저온측정기를 사용하여 10마이크로미터 두께의 조직 섹션을 획득하고 DAPI로 보충된 단단한 장착 매체를 적용하기 전에 어둠 속에서 20 분 동안 미리 청소 된 충전 유리 슬라이드의 섹션을 건조시키십시오. 그런 다음 덮개 전표를 적용하고 하룻밤 동안 실온에서 슬라이드를 치료한 후 샘플을 섭씨 4도에서 장기 보관으로 옮깁니다.샘플 내병변을 식별하려면 레이저 스캐닝 공초점 현미경의 단계에 슬라이드를 배치하고 개별 세포를 시각화하여 병변의 이미지를 획득하는 적절한 목표를 사용합니다. 공초점 이미지 내에서 형광 강도를 측정하려면 ImageJ에서 이미지를 열고 밝기와 대비를 조정하여 병변의 형광 신호를 적절하게 시각화합니다. 다각형 선택 도구를 사용하여 관심 영역을 정의하고 ImageJ의 편집 탭 에서 ROI 관리자에 ROI를 추가합니다.편집을 선택한 다음 선택한 다음 마지막으로 관리자에 추가합니다. 다음으로 ROI의 이름을 변경하여 각 이미지에 레이블을 지정합니다. 센트로이드를 정의하려면 분석 탭을 열고 영역, 평균 회색 값, 센트로이드 및 임계값으로 제한을 선택합니다.원중형형광 강도 값을 추출하거나 단위 영역당 주어진 병변에서 평균 형광 강도를 측정한다. 이는 임계값 을 사용하여 필요에 따라 하부 및 상부 형광 제한을 설정함으로써 달성 될 수 있습니다. 데이터를 Excel 파일로 내보내고 주변 및 코어에 대한 단위 영역당 평균 형광 강도를 나타내는 열을 준비합니다.주변 및 코어의 단위 영역당 평균 형광 강도를 계산하려면 임계값의 상한 및 하한을 수동으로 정의합니다. 황색포도상구균 열핵증 GFP 융합 형광은 기자 융합을 운반하지 않는 세포보다 융합 유전자를 운반하는 세포에서 평균 거의 9배 더 높다. 마찬가지로, 탠덤 디메릭 토마토 융합 형광은 null 리포터 제어보다 약 6배 높다.리포터 활동의 패턴은 조직 균질화로 세포측정을 유동하여 확인할 수 있다. 형광의 접이식 차이는 일반적으로 낮습니다. 형광 측정의 변화는 기자의 이기종 발현 때문일 수 있다.예를 들어, 이들 대표적인 샘플에서 일부 병변은 동일한 조직 샘플에서 약 100 마이크로미터 의 거리 내에서 기자 중 하나 또는 둘 다 발현되는 것을 관찰하였다. 황색포도상구균 abcess 지역 사회에서 단일 세포 해상도로 기자 활동을 검사하면 강한 DAPI 염색으로 외딴 농양에서 포도상 구균 오레우스 열뉴클레인 발현의 공간 적 조절이 밝혀지며 호중구 외세포 트랩의 형성 및 방출과 관련이 있습니다. 예를 들어, 상당히 높은 포도상구균 아우레우스 열핵증 GFP 융합 형광은 주변 지역에 국한된 것에 비해 포도상 구균 abcess 커뮤니티의 내부 코어에서 관찰된다.같은 abcess에서, 탠덤 희미한 토마토 융합 형광에 대한 패턴은 반전 된 것으로 보인다. 그러나, 본 실험의 패턴은 통계적으로 유의하지 않았다. 동결에 내장된 해부를 얻는 것은 형광 이미지 분석에 필수적이며 신중하게 수행해야 합니다.RNA-Seq 분석과 결합하여 다양한 범위로 융합을 발현하는 하위 집단을 포착하기 위해 세균 세포의 분류는 전사에 있는 게놈 넓은 변화를 조명할 수 있었다. 발암 물질이기 때문에 포르말린으로 작업할 때주의해야 하며 직접 노출시 피부 자극, 알레르기 반응 또는 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. 관심있는 형광 기자를 운반하는 균주의 돌연변이 유도체를 생성하는 것은 관찰 된 공간 조절 패턴에 대한 유전 적 기초를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

생활 동물 세균성 감염의 bioluminescence 이미징을위한 방법은 설명되어 있습니다. 병원균은 살아있는 동물에 감염 광학 온 몸이 이미징을 허용 루시페라제 표현을 수정합니다. 동물 모델은 루시페라제 표현 병원균에 감염과 질병의 발생 과정은 bioluminescence 이미징에 의해 실시간으로 시각하실 수 있습니다.

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

발광 생물 세균 이미징<em&gt; 생체 내</em

출처: 베헤라, R. K. 외. 감염된 조직에서 박테리아 유전자 조절을 연구하는 형광 기반 방법. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 이중 형광 리포터를 이용해 감염된 마우스 신장 조직을 준비하고, DNA 염색하며, 박테리아 유전자 발현을 검출하는 방법을 시연합니다. 빨간색은 모든 박테리아를, 초록색은 감염 반응성 세포를 표시합니다.

쥐 신장 조직에서 박테리아 집락화의 형광 영상

이 비디오는 Mycobacterium tuberculosis 감염의 생체 내 검출을 위한 리포터 효소 형광(REF) 이미징을 보여줍니다. 감염된 마우스는 REF 이미징을 위해 복강내 기질을 주입합니다. 박테리아 β-락타마제 효소에 의해 가수분해되면 기질은 형광을 방출하며, 이를 감지하면 감염 평가에 도움이 됩니다.

Reporter Enzyme Fluorescence Imaging for In Vivo Tracking of Bacterial Infection(세균 감염의 생체 내 추적을 위한 Reporter Enzyme Fluorescence Imaging)

세균성 병인 분야의 중심에는 미생물이 진핵 세포에 노출 된 후 생존 방법 경우 정의 할 수있는 기능입니다. 이 문서는 내부와 숙주 세포와 관련된 개별 박테리아의 생존을 공개 형광 염료의 사용에 대한 프로토콜을 설명합니다.

포유 동물 세포와 관련있는 박테리아의 생존을 확인하는 방법에 대한 형광 현미경 방법

진화 시나리오되지만 (공간적 분리)의 역할은 공간 분포의 조정을 허용하는 제어 실험실에서 미생물 단순한 시스템을 사용하여 조사 할 수있다. 설립자 셀 밀도를 수정하여, 다양한 구색 수준은 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)의 식민지 바이오 필름에 형광 표지 된 박테리아 균주를 사용하여 시각화 할 수 있습니다.

표면 식민지 미생물 집단에 공간 분리를 모니터링

이 문서는 단백질 세포 외 지역화 역학을 조사하고 바실러스 subtilis 및 황색 포도상 구균에 있는 고분해능 형광 현미경 검사법을 사용하여 형태학적 인 변화를 감시하기 위하여 단계별 가이드를 제공합니다.

박테리아의 세포 외 단백질 국소화 및 세포 형태 변화를 조사하는 살아있는 세포 형광 현미경 검사법

형광 태그 항생제는 항균 저항의 다중 양상을 공부하기 위하여 이용될 수 있는 강력한 공구입니다. 이 문서는 형광 태그 항생제의 제조 및 박테리아에서 항생제 저항을 공부 하는 그들의 응용 프로그램을 설명 합니다. 프로브는 분광광도법, 유세포 분석 및 현미경 검사법에 의한 세균 저항(예: 유출)의 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

형광 항생제 프로브를 사용한 세균 저항성 시각화

이 살아있는 세균성 세포 화상 진찰 프로토콜은 시간이 지남에 따라 단세포 수준에서 다중 세균성 종 사이 상호 작용의 시각화를 허용합니다. 시간 경과 화상 진찰은 개별 세포 운동성 및 생존성을 포함하여 다종 세균성 지역 사회에서 종 간 상호 작용을 심문하기 위하여 단배문화 또는 공동 문화에서 각 세균성 종의 관찰을 허용합니다.

단세포 종 간 세균성 상호 작용의 운동 시각화

여기에서는 감염 중 병원성 박테리아를 장기 전체에서 검출하고 형광 리포터 활동을 정량화할 수 있는 절차에 대해 설명합니다.

고분해능 3차원 전장기 단층촬영(High-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections)

학습하세요 형광 기반 방법으로 감염된 동물 조직에서 Staphylococcus aureus의 공간적 유전자 발현 패턴과 세포 간 이질성을 분석하는 기술입니다. 이 방법은 새로운 항균 표적을 식별하는 데 활용됩니다.

감염 된 조직에서 세균 유전자 규칙을 공부 하는 형광 기반 방법

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