Name: 에 대한 드립 흐름 및 회전 디스크 원자로의 사용 포도상 구균 Biofilm 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 배우세요 드립 흐름 및 회전 디스크 원자로를 사용하여 Staphylococcus aureus 바이오필름을 배양하는 방법을. 이 기술은 전단력 조건에서 바이오필름 형성을 연구하고 항균 물질 테스트에 활용할 수 있습니다.

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NIAID 부여 K22AI081748.

1. 드립 흐름 Biofilm 반응기 <ol><li> 드립 흐름 biofilm 반응기가 조립 autoclaved입니다 (Biosurface 기술 또는 사용자 정의 디자인 버전에서 사용할 수 일반적으로 대학의 기계 상점으로 만들 수 있습니다, 그림 1 참조). 조립 실 및 확보 챔버 뚜껑에 affixing 쿠폰을 포함한다. biofilm 매체 (tryptic 간장 국물 2g / L과 포도당 2g / L) 및 유입 영양 튜브와 함께 챔버는 autoclaving 소독을하고 있습니다. </li><li> 드립 흐름 반응기의 접종은 평평한 표면에 반응기를 삽입 유출 튜브 라인을 클램핑, 10 ML tryptic 간장 국물과 함께 각각의 챔버를 작성하고 S. 10 μL를 추가하여 preformed입니다 구균 문화는 tryptic 간장 국물에 하룻밤 성장. 주사 원자로 그때가 18 시간 동안 37 ° C 배양기에서 개최됩니다. </li><li> 배양 18 시간 후, 유출 튜브는 unclamped되고 반응은 10 ° 각도로 절단 나무 블록에 위치합니다. </li><li> 무균 지속적인 흐름 영양의 국물이 들어있는 병에 유입 영양 튜브를 연결합니다. 최대 속도 (펌프 모델에 따라 달라질 수 있습니다)에서 펌프를 실행하여 펌프 및 주요 튜브를 통해 튜브 라인 피드. </li><li> 일단 유입 튜브는 펌프를 중지하고 각 튜브의 끝 부분에 연결 바늘 (22 게이지 1 인치)를 첨부하여 준비하는 것입니다. 에탄올 닦아 및 무균 입구 마개를 통해 바늘을 삽입과 챔버 입구 마개를 닦아주십시오. </li><li> 펌프의 전원을 켜고 쿠폰 이상 (유량 ~ 125 μL / 분) 미디어가 천천히 똑 수 있습니다. 미디어 입구 마개 포트에서 유출 포트에 쿠폰을 따라 아래로 흐름을해야합니다. 때때로 적절한 배수에 대한 반응을 확인, 2-5일 (응용 프로그램에 따라 다름)에 대한 지속적인 흐름에서 원자로를 운영하고 있습니다. </li><li> 드립 흐름 반응기 biofilms를 수확하기 위해 펌프를 중지하고 신중하게 반응에서 바늘을 제거하십시오. 반응은 다음 평평한 표면에 배치 수 있으며 쿠폰은 무균 살균 집게를 사용하여 제거할 수 있습니다. 현미경을 원하는 경우, 쿠폰 이제 적절하게 처리할 수 있습니다 (그림 2B는 드립의 biofilm 반응기 재배 S. 구균의 biofilm의 스캐닝 전자 현미경입니다.) biofilm의 바이오 매스 혹은 생리학 연구 부량이 연구의 목적 경우, biofilm은 세포 스크레이퍼를 사용하여 쿠폰에서 제거할 수 있습니다. 포셉과 쿠폰을 들고 있지만, 부드럽게 인산염을 포함하는 원뿔 관에 쿠폰 해제 biofilm을 다쳤고,이 세포 스크레이퍼를 사용하여 염분 버퍼. 참고 : biofilms의 단위를 형성 식민지를 정할, 그것이 대단히 짧은 시간을 disaggregate하고 동질적인 정지를 형성 균 질기 조직으로 수확 biofilms를 균질 필요합니다. 조직 homogenizers 다양한 모델이 응용 프로그램에 적합합니다. 우리는 biofilm 샘플을 균질 1 분간 최대 속도 피셔 사이 언티픽 Tissuemiser 균 질기를 (제품 # 15-338-420) 활용. biofilm을 균질하지 않으면 예제에있는 단위를 형성 식민지의 싼 견적가 발생합니다. </li></ol> 2. 회전 디스크 Biofilm 반응기 <ol><li> 회전 디스크 biofilm 반응기는 (만들어, 그림 3을 참조하십시오 Biosurface 기술에서 사용할 수에서 제공 또는 사용자 정의 가능) 조립 autoclaved입니다. 처음으로 원자로를 조립 회전 디스크의 슬롯에 디스크 쿠폰을 회전하고 오버플로 포트와 1 리터 유리 비커에 넣어. 미디어 흐름과 통기를 허용하도록 거기에 뚫고 구멍 번호 15 고무 마개는 원자로의 뚜껑으로 사용됩니다. 반응기, biofilm 미디어 (tryptic 간장 국물 2가 G / L과 포도당 2g / L) 및 유입 관은 다음 autoclaving 소독을하고 있습니다. </li><li> 회전 디스크 biofilm 반응기는 반응기로 멸균 매체 250 MLS를 배치하여 주사하고, 밤새 S. 0.5 ML를 추가합니다 구균 문화는 tryptic 간장 국물 재배. 반응은 다음 RPM을 250으로 설정 저어 접시에 위치하고 원하는 온도에서 하룻밤 incubated입니다. </li><li> 배양 16 시간 중간 저수지에있는 포트에 유입 튜브를 연결하고 연동 펌프에 연결 후. 펌프는 다음을 설정하고 흐름 ~ 0.25 ML / 분 (흐름이 원하는 성장 속도에 따라 변경될 수 있음)으로 설정합니다. </li><li> 24 시간 후에 반응을 중단하고 무균 biofilm 쿠폰을 건드리지 않고도 디스크를 제거합니다. 멸균 집게를 사용하여 쿠폰을 제거하고 인산으로 각각의 하나를 찍어은 느슨하게 연결된 박테리아를 제거하는 살린 버퍼. </li><li> 항균 화합물 테스트, 칩의는 관심의 화합물을 포함하는 96 잘 접시의 각각의 우물에 삽입할 수 있습니다. 부화 후, 과자는 1 ML 인산 버퍼 호수를 포함하는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 전송되며 그대로 biofilm을 해산하기 위해 균 질기 휴지로 균질. </li><li> 전지는 다음 직렬 희석하여 가능한 식민지 formi을 결정하는 영양 한천 배지에 비쳐지게 만들려합니다NG 단위. </li><li> 참고 : 많은 변화가 위의 프로토콜에 만들 수 있습니다. 예를 들어, 회전 디스크 쿠폰과 코팅 수있는이나 효능을 테스트하기 위해 잠재적인 안티 biofilm 화합물로 만들어. Biofilm의 dispersants 또한 분산제 화합물과 연결된 대 분리 quantifying 박테리아에 쿠폰을 잠복기 수 평가할 수 있습니다. </li></ol> 3. 대표 결과 드립 흐름 반응기까지 일련의 예제는 그림 1하면 표시됩니다. 흐름 3 일 후에 biofilm의 풍부한 금액은 쿠폰 표면, 그림 2A에 축적됩니다. 총 바이오 매스는 박테리아 변종과 정확한 성장 조건에 따라 달라집니다. S.의 검색 전자 현미경 드립 흐름 반응기에서 재배 구균의 biofilm은 그림 2B에 표시됩니다. 회전 디스크 반응기는 그림 3A에 표시됩니다. 설명 프로토콜은 biofilm을 형성 능력이 일반적으로 어떤 미생물의 특정 요구 사항을 적용할 수 있습니다. 그림 3B 18 플라스틱 디스크 부착된와 함께 회전하는 디스크를 보여줍니다. 이러한 디스크 성장 biofilms은 특히 항균 테스트에 적합하고 높은 재현성 결과가 11을 얻을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 드립 흐름 반응기 설정. 중요 구성 요소가 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 드립 흐름의 예 S. 구균의 biofilm. A)이 biofilm은 설명된 프로토콜을 다음 세 가지 일 동안 성장했다. 반응기의 처음 두 챔버의 뚜껑은 노란색 S. 보여주 제거 구균의 biofilm의 바이오 매스. S.의 B) Sacnning 전자 현미경 구균의 biofilm은 똑 흐름 반응기에서 재배. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 회전 디스크 반응기. 실행중인 회전 디스크 원자로의) 예. 주요 구성 요소가 표시됩니다. B) 회전 디스크의보기를 닫습니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

다른 원자로 재배 Biofilms는 종종 서로 다른 특성을 것입니다 각 반응기의 다른 응용 프로그램이 있습니다. 드립 흐름 biofilm 반응기와 회전 디스크 반응 :이 작품에서 우리는 두 biofilm 원자로의 사용을 설명합니다. 드립 흐름 원자로 공기 - 액체 인터페이스 낮은 전단 biofilms 성장을위한 유용하고 다양한 상황에 적용할 수 있습니다. 우리는 biofilm의 바이오 매스의 대량이 바람직 연구들이 매우 편리하게 찾아보세요. 이 설정은 쉽게 microsensor 감시하고 잠재적인 antibiofilm 표면의 테스트를 포함 공부를 적용할 수 있습니다. 회전 디스크 반응기 중간 전단 환경에서 제거하는 디스크에서 여러 동일한 biofilm 성장하는 데 유용합니다. 이동식 디스크에 여러 개의 동일한 biofilms를 생산하는이 원자로의 능력 항균 화합물 및 biofilm 모성 표면의 테스트를 포함 연구에 적합합니다. 이러한 biofilm의 원자로를 사용하고 연구자가 ...

Erratum: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

<table><tbody><tr><td>점적 흐름 반응기</td><td>BioSurface Technologies Corporation</td><td>DFR 110</td><td></td></tr><tr><td>회전 원판 반응기</td><td>BioSurface Technologies Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

에 대한 드립 흐름 및 회전 디스크 원자로의 사용 포도상 구균 biofilm 분석

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

자연의 대부분의 미생물이 1 세균성 biofilms는 매트릭스 안에 쌌다 있습니다. biofilms의 표면 관련된 커뮤니티와 같은 존재로 생각하고 표면 2. Biofilm 형성과 발전에 연결된하는 것은 일반적으로 이러한 microtiter 접시 또는 흐름으로 배치 시스템을 사용하여 실험실에서 연구 아르 이러한 흐름 - 세포와 같은 시스템. 이러한 방법은 돌연변이와 화학 라이브러리 (microtiter 접시) 시각화 (유동 세포) 4 3 또는 성장 biofilms를 검사하는 데 유용합니다. 드립 흐름 biofilm 반응기와 회전 디스크 biofilm 반응기 : 여기 우리는 흐름 시스템 biofilms 두 가지 추가적인 유형의 성장 포도상 구균에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 드립 흐름 biofilm 원자로는 낮은 전단 조건 하에서 재배 biofilms의 연구를 위해 설계되었습니다. 5 드립 흐름 반응기 네 가지 병렬 테스트 채널 하나의 표준 유리 현미경 슬라이드 크기의 쿠폰을 가지고 각각의 능력, 또는 카테 테르 또는 정량의 길이로 구성되어 있습니다. 드립 흐름 반응기 microsensor 모니터링, 일반 biofilm 연구, biofilm cryosectioning 샘플, 높은 바이오 매스 생산, 의료 재료 평가하고, 내재하는 의료 기기 테스트에 이상적입니다. 6,7,8,9가 회전 디스크 반응기 이동식 쿠폰에 대한 recesses를 포함하는 독보적인 디스크로 구성되어 있습니다. 10 이동식 쿠폰 어떠한 machinable 재료로 만든 수 있습니다. 회전 디스크의 아래쪽의 디스크 회전이 표면 플러시 쿠폰 걸쳐 액체 표면 전단을 만들 수 있도록하는 막대 자석이 포함되어 있습니다. 18 쿠폰을 포함하여 전체 디스크는 1000 ML 유리 사이드 암 원자로 용기에 배치됩니다. 디스크가 자기 활동가에 의해 회전하는 동안 액체 성장 미디어는 혈관을 통해 순환됩니다. 쿠폰은 원자로 용기에서 제거 후 진학이나 현미경 이미징을위한 biofilm 샘플을 수집하는 스크랩한 있습니다. 회전 디스크 원자로는 biocide의 효능, biofilm 제거 및 방지 오염 물질의 성능 실험실 평가를 위해 설계되었습니다. 9,11,12,13

드립 흐름 반응기로 개방형 시스템 흐름 biofilms을 활용하여 디스크 원자로 회전을위한 프로토콜이 상세하게 제공됩니다.

에 대한 드립 흐름 및 회전 디스크 원자로의 사용 포도상 구균 Biofilm 분석

자연계의 대부분의 미생물은 바이오필름 내의 표면 부착 공동체 형태로 존재한다고 생각됩니다.1 박테리아 바이오필름은 매트릭스 내에 둘러싸여 부착되어 있으며...

이 실험 절차의 전체적인 목표는 드립 흐름 바이오필름 반응기(drip flow biofilm reactor) 또는 회전 디스크 반응기(rotating disc reactor)를 사용하여 낮거나 중간 정도의 전단력 하에서 박테리아 바이오필름을 배양하는 것입니다. 바이오필름 반응기 내의 쿠폰에 박테리아를 먼저 접종하고 37 °C에서 배양하여 박테리아 세포가 성장 표면에 부착되도록 합니다. 세포가 쿠폰에 부착되면 성장 배지의 흐름을 시작하여 바이오필름 발달 과정 동안 작용하는 전단력을 생성합니다.성숙한 바이오필름을 수확하여 분석하고 관찰할 수 있습니다. 주사 전자 현미경을 사용하여 생성된 바이오필름의 초미세 구조를 결정할 수 있습니다. 저는 Blaze Balls입니다.이 기술이 플로우 셀(flow cells)과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은 높은 바이오매스 생산량을 달성하기 쉽고, 동일한 바이오필름을 여러 개 생성할 수 있다는 점입니다. 이 절차의 시연은 저희 실험실의 기술원인 Rachel Stevenson과 대학원생인 Kelly Schwartz가 맡아 진행하겠습니다. 드립 플로우 바이오필름 리액터(drip flow biofilm reactor)는 배지 주입을 위한 입력 포트와 폐액 배출을 위한 유출 포트가 있는 4개의 챔버로 구성되어 있습니다.각 챔버 내부에는 바이오필름이 성장하는 제거 가능한 쿠폰이 들어 있습니다. drip flow 바이오필름 리액터를 조립하려면, 각 평행 챔버에 쿠폰을 배치하고 챔버 덮개를 고정하십시오. 사용 전 시스템을 멸균하기 위해 조립된 리액터와 유입 영양분 튜브를 오토클레이브하십시오.멸균된 드립 흐름 반응기에 접종하기 위해 바이오필름 성장 배지 또한 오토클레이브로 멸균합니다. 장치를 평평한 표면에 놓고 유출 라인을 클램프로 고정합니다. 다음으로, 각 챔버에 10 milliliters의 멸균된 triptych soy broth 기반 성장 배지를 채우고, 100 microliters의 staphylococcus aureus를 첨가합니다.각 챔버에 동일한 배지로 배양한 하룻밤 배양액을 각각 접종합니다. 세포가 쿠폰 표면에 부착될 수 있도록 접종된 반응기를 37 °C 인큐베이터에서 18시간 동안 배양합니다. 배양 후, 유출 튜브의 클램프를 풀고 반응기를 10도 각도의 경사진 나무 블록 커터 위에 무균적으로 배치합니다.유동 영양액 튜브를 연속 흐름 영양 배지가 들어 있는 병에 연결합니다.

the-use-drip-flow-rotating-disk-reactors-for-staphylococcus-aureus

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

프로토콜 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)에 대한 미생물 biofilms 성장 분석을위한 플로우 전지 시스템의 응용 프로그램을 설명합니다.

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

이 비디오에서는 폴리-L-라이신으로 코팅된 멀티웰 플레이트에서 S. aureus에 의한 체외 생물막의 준비를 보여줍니다. 생물막 형성된 플레이트는 다운스트림 실험에 사용할 수 있습니다.

황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 의한 체외 생물막 합성(In vitro Biofilm Synthesis)

생물막은 주변 환경과 복잡한 상호 작용을 합니다. 생물막-환경 상호 작용을 종합적으로 조사하기 위해 여기서는 생물막 개발을 위한 이질적인 화학적 환경을 조성하고, 국소 유속을 정량화하고, 생물막 군집 내부 및 주변의 질량 수송을 분석하는 일련의 방법을 제시합니다.

바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법

대부분의 박테리아 감염은 생물막을 생성합니다. 환경 덕분에, 생물막 관련 박테리아는 종종 표현형 약물 내성을 가지고 있습니다. 따라서 생물막에서 박테리아를 죽이는 새로운 항균 분자는 최우선 순위입니다. 당사는 생물막을 박멸하는 데 효과적인 항균 화합물을 신속하게 스크리닝하기 위한 분석을 수립합니다.

바이오 필름 관련 타겟팅<em&gt; 황색 포도상 구균</em&gt; 사용 레사 주린 기반 약물 감수성 분석

이 원고는 황색 포도상구균 biofilm에 5-aminolevulinic 산-중재 photodynamic 치료 (PDT ALA)의 항균 효과 연구 하는 프로토콜을 설명 합니다. 미래에 PDT와 박테리아 biofilms의 치료 연구를 생체 외에서 모델을 개발 하는 것이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

황색 포도상구균 Biofilm에 5-Aminolevulinic 산-중재 Photodynamic 치료의 효과 연구 하는 체 외에서 모델

어셈블리, 동작, 설명 그리고 흐름에서 실시간으로에서 이미지 균 biofilm 형성 하도록 설계 흐름 기구의 청소. 우리는 또한 제공 하 고 인수 이미지에 사용할 수 양적 알고리즘 토론.

실시간 이미징 및 2 단계 반복 흐름 시스템을 사용 하 여 곰 팡이 Biofilm 개발의 정량화

여기, 우리 악기를 포함 한 녹색 형광 단백질을 표현 하는 녹 농 균 biofilms에 전단 응력 효과의 분석을 위한 형광 현미경과 함께 더 높은 처리량 미세 생물의 사용 설명 설정, biofilm 범위, 성장 율, 및 형태학 속성의 결정.

라이브 셀 분석의 전단 응력에 녹 농 균 등 처리량 미세 자동 시스템을 사용 하 여

이 프로토콜은 고처리량 96웰 고정 뚜껑 정적 생물막 스크리닝을 위해 자체 조립된 딥 웰 PCR 플레이트 장치를 사용하여 생물막 성장 및 바이오매스 측정을 수행하는 방법론을 제시합니다.

PCR-플레이트 딥웰 마이크로플레이트 장치를 이용한 더 큰 박테리아 바이오필름 바이오매스의 생성

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정적 방법과 동적 방법을 결합한 접근법을 사용하여 낙농 생물막을 박멸하기 위한 유기 과산화산의 효능 평가

Murine 피부와 부드러운 조직 감염 모델은 methicillin 내성 포도상 구균 (MRSA) 및 호스트 면역 응답의 독성 기능을 평가하기위한 활용합니다. 여기, 우리는 피부와 부드러운 조직 감염 피하 감염 모델을 소개하고 있습니다.

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에 대한 드립 흐름 및 회전 디스크 원자로의 사용 포도상 구균 Biofilm 분석

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