December 27th, 2010
드립 흐름 반응기로 개방형 시스템 흐름 biofilms을 활용하여 디스크 원자로 회전을위한 프로토콜이 상세하게 제공됩니다.
이 절차의 전반적인 목표는 드립 플로우 생물막 반응기 또는 회전 디스크 반응기를 사용하여 낮거나 중간 정도의 순파력으로 박테리아 생물막을 성장시키는 것입니다. 생물막의 쿠폰은 먼저 박테리아를 접종하고 섭씨 37도에서 배양하여 박테리아 세포가 성장 표면에 부착할 수 있도록 반응합니다. 세포가 쿠폰에 부착되면 성장 매체의 흐름이 시작되어 생물막 발달 중에 작동하는 순수한 힘을 생성합니다.
그런 다음 생물막의 분석 관찰을 위해 성숙한 생물막을 수확할 수 있습니다. 주사 전자 현미경을 사용하여 생성 된 생물막의 초 구조를 결정할 수 있습니다. 저는 블레이즈 볼입니다.
플로우 셀(flow cell)과 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 높은 바이오매스 생산과 여러 개의 동일한 생물막을 쉽게 얻을 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 레이첼 스티븐슨(Rachel Stevenson)과 제 연구실의 기술자이자 대학원생인 켈리 슈워츠(Kelly Schwartz)입니다. 드립 플로우 생물막 반응기는 매체 유입을 위한 입력 포트와 폐기물 배출을 위한 유출 포트가 있는 4개의 챔버로 구성됩니다.
각 챔버 내부에는 생물막이 자라는 탈착식 쿠폰이 있습니다. 드립 플로우 생물막 반응기를 조립하려면 쿠폰을 각 병렬 챔버에 넣고 챔버 뚜껑을 고정합니다. 조립된 반응기와 유창한 영양 튜브를 고압 멸균하여 사용하기 전에 시스템을 멸균합니다.
또한 생물막 성장 배지를 고압 멸균하여 멸균된 드립 플로우 반응기를 접종합니다. 장치를 평평한 표면에 놓고 clamp 폐수 라인을 제거합니다. 다음으로, 각 챔버를 10ml의 멸균 삼부작 콩 육수 기반 성장 배지로 채우고 100마이크로리터의 황색포도상구균을 추가합니다.
하룻밤 배양은 각 챔버에 동일한 배지에서 개별적으로 성장했습니다. 접종된 반응기를 섭씨 37도의 인큐베이터에 18시간 동안 넣어 세포가 쿠폰 표면에 부착되도록 합니다. 배양 후 UNC는 폐수 튜브를 고정하고 반응기를 경사 나무 블록 절단기에 10도 각도로 놓습니다. 무균적으로.
Fluent 영양 튜브를 연속 흐름 영양 육수가 들어 있는 병에 연결합니다. 펌프를 통해 튜빙 라인을 공급하고 펌프를 최고 속도로 작동하여 튜빙을 프라이밍합니다. 유창한 튜브가 프라이밍되면 펌프를 중지하고 각 튜브 끝에 22 게이지 1인치 바늘을 부착합니다.
챔버 입구 마개를 에탄올 천으로 닦고 무균 상태로 닦습니다. 흡입구 스토퍼를 통해 바늘을 삽입합니다. 펌프를 켜고 매체가 쿠폰 위로 떨어지도록 합니다.
분당 약 125마이크로리터의 유속으로 매체는 입구 스토퍼 포트에서 폐수 포트로 아래쪽으로 흘러야 합니다. 3일 동안 반응기를 연속 흐름으로 작동하십시오. 때때로 반응기가 제대로 배수되는지 확인합니다.
배수는 챔버의 육안 검사를 통해 매체가 챔버에 고이지 않는지 확인합니다. 매체가 고이고 꼬집히는 경우 유출 튜브는 일반적으로 적절한 배수를 촉진하여 생물막을 수확하고 펌프를 중지하며 반응기에서 바늘을 제거합니다. 그런 다음 반응기를 평평한 표면에 놓습니다.
3일 동안 지속적으로 유동을 유지한 후, 황색포도상구균 생물막은 접종된 쿠폰의 길이를 따라 퍼진 노란색 바이오매스로 나타납니다. 생물막의 주사 전자 현미경 사진은 표면 관련 생물막 커뮤니티에서 쿠폰을 덮고 있는 황색포도상구균을 보여줍니다. 얻어진 바이오매스를 정량화하려면 멸균 겸자를 사용하여 가능한 한 격막으로 쿠폰을 제거하고 세포 스크레이퍼를 사용하여 박테리아를 수확한 다음 5ml의 멸균 PBS가 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
조직을 사용하여 균질화기는 균일한 현탁액이 얻어질 때까지 박테리아 덩어리를 분해합니다. 콜로니 형성 단위는 삼부작 sogar 플레이트에 연속 희석액을 도금하고 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하고 콜로니를 계수하여 정량화합니다. 회전 디스크 생물막 반응기는 성장 배지가 펌핑되는 케모스 스탯으로 구성됩니다.
별 막대가 있는 회전 디스크와 회전 디스크에 맞게 디자인된 18개의 쿠폰. 먼저 반응기를 조립하려면 회전 디스크 쿠폰을 회전 디스크의 슬롯에 로드합니다. 다음으로, 적재된 디스크를 오버플로 포트가 있는 1리터 유리 비커 안에 넣고 매체 흐름을 위한 구멍 하나와 폭기용 구멍 하나가 있는 숫자 15 고무 마개로 반응기를 덮습니다.
오토클레이브, 조립된 반응기 및 주입 튜브를 사용하여 시스템을 살균합니다. 반응기에 접종하려면 비커에 250ml의 멸균 배양 배지를 채우고 삼부작 콩 육수에서 자란 황색포도상구균의 하룻밤 배양 500마이크로리터를 추가합니다. 분당 250회 회전으로 설정된 교반 플레이트에 반응기를 놓고 섭씨 37도에서 밤새 배양하여 세포가 쿠폰을 준수할 수 있도록 합니다.
하룻밤 배양 후 주입 튜브를 매체 저장소의 포트와 연동 펌프에 연결합니다. 펌프를 켜고 유량을 분당 0.25밀리리터로 설정합니다. 반응기를 섭씨 37도에서 24시간 동안 작동시켜 생성된 생물막을 수확합니다.
반응기를 중지하고 무균 상태로 작동시킵니다. 쿠폰을 건드리지 않고 디스크를 제거합니다. 멸균 집게를 사용하여 쿠폰을 제거하고 각 쿠폰을 멸균 PBS에 조심스럽게 담궈 항균 화합물 테스트를 위해 느슨하게 부착된 박테리아를 제거합니다.
무균적으로, 관심 화합물이 들어있는 96 웰 플레이트의 개별 웰에 쿠폰을 놓습니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양합니다. 그런 다음 쿠폰을 PBS의 1배를 포함하는 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 균질화기를 사용하여 생물막을 분산시킵니다.
마지막으로, 영양소 한천 배지에서 세포를 연속적으로 플레이트로 희석하여 앞서 설명한 대로 샘플당 실행 가능한 콜로니 형성 단위의 수를 결정합니다. 이 그래프는 스피닝 디스크 반응기를 사용하여 준비되고 과산화수소에 노출된 생물막의 집락 형성 단위 수를 보여주며, 이는 최대 18개의 동일한 생물막을 생성할 수 있는 능력을 보여줍니다. 스피닝 디스크 반응기를 사용하는 이 기술은 항균 화합물 테스트에 이상적입니다.
이 비디오를 시청한 후에는 드립 플로우 및 회전 디스크 반응기 생물막을 실행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이러한 생물막 반응기는 플로우 셀 및 마이크로타이터 플레이트 생물막에 대한 대안을 제공하며, 많은 양의 생물막 바이오매스가 필요하거나 확립된 생물막에 대한 항균 검사가 필요한 경우에 이상적입니다.
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이 기사는 드립 플로우 반응기 및 회전 디스크 반응기를 사용한 박테리아 바이오필름 성장 프로토콜을 제시합니다. 절차는 쿠폰에 박테리아를 접종하고 조절된 전단력 하에서 바이오필름의 후속 개발을 상세히 설명합니다.
Robust biofilm models are essential for evaluating antimicrobial strategies and material performance in pharmaceutical and biotechnology R&D. Drip flow and rotating disk reactors enable reproducible, high-biomass Staphylococcus aureus biofilm formation under controlled shear, supporting predictive confidence in compound screening and device testing. These systems address critical early discovery and preclinical inflection points by standardizing biofilm growth for downstream quantitative analysis.
Drip flow and rotating disk reactors position biofilm analysis from early discovery through preclinical evaluation, bridging hypothesis testing, screening, and translational research.