전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비

이 방법은 제한된 양의 단백질을 사용할 수 있는 민감한 단백질의 준비와 같은 구조 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 표준 시료 전처리 방법에 비해 극소량의 시료만 필요하고 거친 종이 블로팅 단계가 필요하지 않다는 것입니다. 이 기술의 의미는 시각적 단백질체학에 의한 단일 세포 분석 또는 단백질 관련 질병의 진단으로 확장됩니다.

우리는 약 100,000개의 개별 입자만으로 고해상도 구조를 해결할 수 있는 기술을 가지고 있었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 가졌습니다. 시작하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 준비합니다. 다음으로 에탄 컵, 크라이오 박스 홀더 및 스파이더를 조립합니다.

그리고 극저온 용기에 액체 질소를 가득 채웁니다. 몇 분 후, 컵은 시원해지고 액체 질소가 없어집니다. 그런 다음 에탄 가스통을 열고 가스가 에탄 컵으로 천천히 흐르도록 합니다.

레벨이 상단 아래 2-3mm가 될 때까지 컵에 액체 에탄을 채웁니다. 이 작업은 몇 분이 소요되며 약 5ml의 액체 에탄이 필요합니다. 스파이더를 제거하고 그 위에 폴리스티롤 뚜껑을 놓고 극저온 처리기의 마운팅에 극저온 용기를 놓습니다.

극저온 라이터 핀셋으로 글로우 방전 EM 그리드를 잡고 전자석의 핀셋을 매듭짓고 마이크로 매니퓰레이터를 나사로 조여 그리드를 탄소 필름 면이 위로 향하게 하여 스테이지에 평평하게 정렬합니다. 소프트웨어로 돌아가서 grid_save 두 번 클릭합니다. 그런 다음 팁이 그리드 표면에서 약 10마이크로미터 위에 있도록 미세 모세관 위치를 조정합니다.

미세 모세관이 어디에도 닿지 않고 그리드를 가로질러 자유롭게 이동할 수 있는지 확인하십시오. 그리고 필요한 경우 미세 모세관을 몇 마이크로미터 빼냅니다. 그런 다음 그리드의 중앙으로 다시 가져오고 새 위치를 그리드로 저장합니다.

미세 모세관을 다시 홈 위치로 이동합니다. 다음으로, 수십 나노리터의 시스템 액체로 미세모세관을 세척하고 보푸라기가 없는 조직을 사용하여 미세모세관에서 물방울을 제거합니다. 이제 모든 것이 준비되었으므로 매크로 스크립트를 시작합니다.

매크로는 먼저 제자리로 이동하고 5나노리터의 시스템 액체를 분배하여 팁의 기포를 제거한 다음 샘플 위치로 이동합니다. 다음으로, 65나노리터의 샘플을 흡인한 다음 5나노리터를 샘플 튜브에 다시 주입합니다. 이것은 시스템 백래시를 고려하고 동기화된 쓰기를 허용합니다.

그리드 위치로 이동한 후 쓰기 패턴을 시작하여 미세 모세관이 그리드를 가로질러 이동하고 동시에 45나노리터의 샘플을 분배합니다. 그런 다음 마이크로 모세관을 그리드의 중앙으로 다시 이동시키고 10마이크로미터 더 낮추고 과도한 샘플 액체를 회수합니다. 마지막으로, 매크로는 미세 모세관을 회수하고 전자석을 꺼서 플런지 동결 메커니즘을 시작합니다.

자석에서 해제되면 플런저에서 자기 어댑터를 조심스럽게 분리하고 에탄 컵의 그리드를 극저온 상자가 포함된 극저온 용기로 빠르게 전송하여 그리드를 빈 슬롯에 배치합니다. 시작하려면 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 준비하고 인듐 주석 산화물 슬라이드를 현미경 삽입물에 장착합니다. 두 개의 나사를 사용하여 알루미늄 인서트에 슬라이드를 고정하고 슬라이드의 인듐 주석 산화물 코팅과 전기적으로 접지된 알루미늄 프레임 사이의 전기 접촉을 보장합니다.

그런 다음 웰에서 세포 배양 배지를 제거하고 300마이크로리터의 전기천공 완충액으로 세포를 두 번 세척합니다. 마지막 세척 후 세포를 electroporation buffer에 보관하십시오. 다음으로, Live Cell Incubator 스테이지의 인듐 주석 산화물 슬라이드를 고정하고 있는 알루미늄 인서트를 셋업에 놓습니다.

현미경을 사용하여 세포 배양액을 찾고 세포가 없는 영역을 선택합니다. 슬라이드 표면의 미세 모세관 팁에 접근하여 부드럽게 만집니다. 그런 다음 팁을 100 마이크로 미터로 빼내고 위치를 셀로 저장하십시오.

이제 세포 배양을 빠르게 종료하고 수십 나노리터의 시스템 액체로 미세 모세관 팁을 플러시한 다음 다시 세포 배양에 넣습니다. PDMS 웰에 담그는 동안 몇 나노리터를 분사하여 팁에 기포가 갇히지 않도록 합니다. 셀의 위치를 두 번 클릭하고 인듐 주석 산화물 슬라이드의 표면에 부드럽게 접근하고 접촉하면 팁을 10마이크로미터 후퇴시킵니다.

이 시점에서 용해할 가까운 세포를 선택합니다.를 선택하고 미세 모세관의 끝을 대상 세포 위에 놓습니다. 그런 다음 단일 세포 용해를 위한 매크로 스크립트를 시작합니다.

일단 시작되면, 스크립트는 세포가 성공적으로 용해된 후 미세모세관을 이동해야 하는 위치를 묻습니다. EM 그리드에 대해 원하는 위치(예: 그리드)를 입력합니다. 그런 다음 매크로는 사용자 개입 없이 진행되며, 세포 배양에서 현미경의 단계를 100마이크로미터 왼쪽으로 이동하여 대상 세포의 스냅샷을 촬영하는 것으로 시작합니다.

그런 다음 15나노리터의 이중 증류수가 미세모세관 튜브에서 분배되어 고염 완충액을 대체 및 희석하고 세포에 삼투압을 가합니다. 다음으로, 스테이지는 다시 이동하여 팁을 대상 셀 위에 다시 배치합니다. 여기에서 사전 정의된 전압 버스트가 적용되고 500밀리초 후에 펌프 시스템이 분당 2마이크로리터의 유속으로 3나노리터의 샘플을 흡입하기 시작합니다.

마지막으로 스테이지가 다시 왼쪽으로 이동하여 셀을 검사할 수 있습니다. 사용자 입력을 요청하는 창이 나타납니다. 셀이 성공적이면 yes를 입력하여 용해된 셀의 스냅샷을 만듭니다.

그 후, 미세모세관은 저수지 액체에 잠긴 상태로 엔도 위치로 이동합니다. 노즐 형상에 따라 8분에서 12분 동안 미세 모세관을 담가 둡니다. 다음으로, 5나노리터의 컨디셔닝된 세포 용해물을 그리드에 분배합니다.

미세 모세관을 빼내고 컨디셔닝된 샘플을 이슬점 단계에서 천천히 건조시킵니다. 마지막으로 스테이지에서 그리드를 제거하고 그리드 상자에 실온으로 보관합니다. 여기에 표시된 것은 설명된 CryoWriter 설정을 사용한 냉동 샘플의 일반적인 cryo 이미지입니다.

그리드 개요에서 유리체 얼음의 주변을 명확하게 볼 수 있습니다. 유리체 얼음이 들어있는 구멍이 뚫린 탄소 필름이 있는 그리드 슬롯을 자세히 살펴보면 흰색 구멍이 발견될 수 있으며, 이는 모든 구멍이 샘플 완충액으로 채워지지 않았음을 나타냅니다. 탄소 구멍이 있는 샘플 중 하나에서 박테리오파지의 꼬리를 자세히 볼 수 있습니다.

단세포 시각적 단백질체학을 수행하도록 설정된 CryoWriter를 사용하면 개별 단백질, 예를 들어 필라멘트 액틴 및 단백질이 부착된 멤브레인 패치와 같은 것을 볼 수 있습니다. 패널 6b에서 볼 수 있는 이미지는 유기 텅스텐 화합물을 기반으로 2% 음성 염색으로 음으로 염색되었습니다. 패널 c는 cryo EM을 위해 준비된 단일 세포 용해물을 보여줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 나노리터의 총 단백질 샘플 또는 단일 세포 추출물에서 음성 염색 또는 cryo EM 그리드를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

액체 에탄 및 질소로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 항상 이 절차를 수행하여 보안경과 실험복을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.