Name: 전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 배우세요 전자현미경용 나노리터 샘플 준비 기법을 통해 민감한 단백질을 분석하는 방법을. 종이 블로팅 없이 샘플 손실을 최소화하여 단일 세포 단백체학 연구에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

저자 그들의 지원, S. A. 뮐러 중요 한 토론 및 신중 하 게 읽고 원고, A. Fecteau-LeFebvre EM, 리카 르도 Adaixo, 프랭크와 기술 지원에 대 한 바젤 대학의 Biozentrum의 워크샵을 감사 하 고 싶습니다. 레만 막 단백질에 대 한 테스트 샘플 (C-중국, Biozentrum, 바젤의 대학에서 모두)와 A. 엥 겔, 그의 영감 대화에 대 한 명예 대학 바젤. 테스트 샘플 P. Ringler, M. A. 제공한 친절 하 게 Mahi, T. Schwede (Biozentrum, 바젤의 대학), P. Leiman (구조 생물학 및 생물 물리학, EPFL의 실험실) 및 R. 디아즈-아 (뉴욕 구조상 생물학 센터, 미국). 프로젝트는 스위스 Nanoscience 연구소 (SNI, 프로젝트 P1401, ARGOVIA 프로젝트 MiPIS)와 스위스 국립 과학 재단 (SNF, 프로젝트 200021_162521)에 의해 지원 되었다.

<ol><li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%3A+The+resolution+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biochemistry: The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li>
<li>Bai, X. -c, McMullan, G., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cryo-EM+is+revolutionizing+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">How cryo-EM is revolutionizing structural biology.</a> Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).</li>
<li>Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. J., Homo, J. C., Lepault, J., McDowall, A. W., Schultz, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3043536">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).</li>
<li>Lepault, J., Booy, F. P., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+frozen+biological+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of frozen biological suspensions.</a> J Microsc. 129, Pt 1 89-102 (1983).</li>
<li>Baker, L. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+damage+in+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Radiation damage in electron cryomicroscopy.</a> Methods Enzymol. , (2010).</li>
<li>Crewe, A. V., Eggenberger, D. N., Wall, J., Welter, L. M. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.1683435">Electron gun using a field emission source.</a> Rev Sci Instrum. , (2003).</li>
<li>Zemlin, F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0968432894900264">Expected contribution of the field-emission gun to high-resolution transmission electron microscopy.</a> Micron. 25 (3), 223-226 (1994).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FREALIGN%3A+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).</li>
<li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. a, Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nat methods. 10, 584-590 (2013).</li>
<li>Milazzo, A. -C., Cheng, A., Moeller, A., Lyumkis, D., Jacovetty, E., Polukas, J., Ellisman, M. H., Xuong, N. -H., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+evaluation+of+a+direct+detection+device+detector+for+single+particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Initial evaluation of a direct detection device detector for single particle cryo-electron microscopy.</a> J Struct Biol. 176 (3), 404-408 (2011).</li>
<li>Ruskin, R. S., Yu, Z., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+electron+detectors+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of electron detectors for transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 184 (3), 385-393 (2013).</li>
<li>Veesler, D., Campbell, M. G., Cheng, A., Fu, C. -y, Murez, Z., Johnson, J. E., Potter, C. S., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+the+potential+of+electron+cryomicroscopy+data+collected+using+direct+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Maximizing the potential of electron cryomicroscopy data collected using direct detectors.</a> J Struct Biol. 184 (2), 193-202 (2013).</li>
<li>Campbell, M. G., Cheng, A., Brilot, A. F., Moeller, A., Lyumkis, D., Veesler, D., Pan, J., Harrison, S. C., Potter, C. S., Carragher, B., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+Cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron Cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li>
<li>Ripstein, Z. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+Cryo-EM+movie+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Processing of Cryo-EM movie data.</a> Methods in Enzymology. 579, 103-124 (2016).</li>
<li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>McLeod, R. A., Kowal, J., Ringler, P., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+image+alignment+for+cryogenic+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Robust image alignment for cryogenic transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 197 (3), 279-293 (2017).</li>
<li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+to+single-particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A primer to single-particle cryo-electron microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li>
<li>Brenner, S., Horne, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+negative+staining+method+for+high+resolution+electron+microscopy+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses.</a> Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).</li>
<li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+good+can+cryo-EM+become%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">How good can cryo-EM become.</a> Nat Methods. 13, 28-32 (2016).</li>
<li>Engel, A. in . <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783642025969">Single Molecule Spectroscopy in Chemistry, Physics and Biology</a>. Graslund, A., Rigler, R., Widengren, J. 96, Springer Berlin. Heidelberg, Berlin. 417-431 (2010).</li>
<li>Kemmerling, S., Ziegler, J., Schweighauser, G., Arnold, S. A., Giss, D., Müller, S. A., Ringler, P., Goldie, K. N., Goedecke, N., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Engel, A., Braun, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22094535">Connecting µ-fluidics to electron microscopy.</a> J Struct Biol. 177 (1), 128-134 (2012).</li>
<li>Arnold, S. A., Albiez, S., Opara, N., Chami, M., Schmidli, C., Bieri, A., Padeste, C., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+sample+conditioning+and+preparation+of+nanoliter+volumes+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Total sample conditioning and preparation of nanoliter volumes for electron microscopy.</a> ACS nano. 10 (5), 4981-4988 (2016).</li>
<li>Kemmerling, S., Arnold, S. A., Bircher, B. A., Sauter, N., Escobedo, C., Dernick, G., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+lysis+for+visual+analysis+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell lysis for visual analysis by electron microscopy.</a> J Struct Biol. 183, 467-473 (2013).</li>
<li>Arnold, S. A., Albiez, S., Bieri, A., Syntychaki, A., Adaixo, R., McLeod, R. A., Goldie, K. N., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> J Struct Biol. 197 (3), 220-226 (2017).</li>
<li>Ramakrishnan, C., Bieri, A., Sauter, N., Roizard, S., Ringler, P., Müller, S. A., Goldie, K. N., Enimanev, K., Stahlberg, H., Rinn, B., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((openBEB%3A+open+biological+experiment+browser+for+correlative+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">openBEB: open biological experiment browser for correlative measurements.</a> BMC Bioinformatics. 15, 84(2014).</li>
<li>Giss, D., Kemmerling, S., Dandey, V., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+interactome%3A+microfluidic+isolation+of+proteins+and+interacting+partners+for+quantitative+analysis+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Exploring the interactome: microfluidic isolation of proteins and interacting partners for quantitative analysis by electron microscopy.</a> Anal Chem. 86, 4680-4687 (2014).</li>
</ol>

저자 스테판 A. 아놀드, 헤 닝 Stahlberg와 토마스 브라운 선언 다음 경쟁 금융 이자: cryoWriter 개념은 부분의 특허 출원 PCT / EP2015/065398 및 EP16194230.

'CryoWriter' 악기와 샘플 격자에 대 한 NS 및 곳을 알아내는-EM 크기 nL 총 샘플 볼륨에서 준비 하 고 고전적인 종이 blotting 단계를 완전히 방지 하는 데 필요한 프로토콜도 제공 됩니다. 미세 원칙과 micromechanical 시스템은 이것을 가능 하 게 cryoWriter에 결합 됩니다.
우리의 경험을 보여줍니다이 원고에 소형된 메서드를 사용 하면 EM-그리드 준비에 대 한 매개 변수 공간 고아 한 방법, 그리고 엄격한 사용자 통제 보다 큰. 중요 한 것은, 달성 증가 재현성 샘플 버퍼 시스템, 실제 실험을 수행 하기 전에 최적의 매개 변수를 확인 하기 위해 쉽게 사용할 수 있는 테스트 단백질 보충 사전 검열 수 있습니다. 이 최소는 절대 관심의 샘플의 소비를 유지 하 고는 것이 좋습니다. 두 NS 및 곳을 알아내는 EM 그리드 준비에 대 한 중요 한 단계는: (i) 못쓰게 펌프 시스템; 하위 nanoliter 볼륨 분배, 시스템의 액체 (물) 고 해야 합니다 degassed 무료 거품. (글로우 방전의 플라즈마 청소 단계; ii) 정밀 하 게 제어 그들 격자의 표면 특성은 재현성 결과 위해 중요 한. (iii) 샘플 컨디셔닝; 컨디셔닝, 예를 들어, NS와 필요한 시간은 microcapillary24의 노즐 형상에 뿐만 아니라 버퍼 유형, 소금 콘텐츠 및 농도 (그림 3)에 따라 달라 집니다. (4) 증발 속도 NS EM 양적 EM;에 대 한 준비에 대 한 커피 고리 효과 NS 그들 준비의 정량 분석을 금지 수 있습니다 그리고 느린 증발 속도 DP-단계에 의해 제어에 의해 억압 해야 합니다.
제시 그리드 준비 방법의 다른 측면은 특정 샘플에 대 한 다양 한 프로토콜의 개발을 수 있도록 자유롭게 결합 수 있습니다. 전형적인 예는 cryo-EM;에 대 한 그리드 준비 전에 컨디셔닝 단계 고해상도 그들, 예를 들어, 글리세롤, 방지 하는 물질의 제거 될 것 이라고 ligands는 격자 준비가; 전에 컨디셔닝에 의해와 같은 중재자 분자의 도입 또는 단일 세포 lysate 여 NS 또는 곳을 알아내는-EM (그림 6)의 검사.
마이크로 및 제시 방법에 최소한의 샘플 금액을 사용 하 여 완전히 종이 blotting 단계에 대 한 필요성을 제거합니다. 이것은 큰 장점은 종이 럽은 단백질, 잠재적으로 원치 않는 이온 샘플 오염 및 본질적으로 이어지는 대규모 샘플 손실에 대 한 가혹한 치료 때문. 다른 한편으로, 잠재적으로 형성 하는 곳을 알아내는-EM 샘플 고전적인 방식으로 준비가 때 얇은 샘플 영화의 공기-물 인터페이스에 의해 발생 하는 효과 cryoWriter 사용 하는 경우를 방지 하지 됩니다. 곳을 알아내는-그들에 대 한 적합 한 격자는 샘플 응용 프로그램 및 vitrification (데이터 표시 되지 않음) 사이의 미만 0.2 s 대기 시간으로 준비 수 있습니다. 그러나, 단백질 보급에 의해 몇 나노초에 나노미터의 몇 가지 tenths 여행, 아직 충분 한 시간이 있다 100 nm 두꺼운 샘플 영화의 공기-물 인터페이스와 여러 번 충돌 하. 그러나, 공기-물 인터페이스에 집착 하는 단백질의이 짧은 시간 간격으로 크게 줄어들 수 있습니다 및 단백질 변성을 방지 수 있습니다 또는 입자 방향 제한. 공기-물 인터페이스에서 중요 한 단백질을 보호할 수 있습니다 또 다른 유망한 방법은 낮은 분자량 표면 활성 물질에 의해 샘플 영화를 커버입니다. 이러한 화합물 그리드 준비 하기 전에 cryoWriter에서 컨디셔닝 단계 빠르게 도입 될 수 있습니다. 미세 시스템의 높은 표면 볼륨 비율 샘플 microcapillary 표면에 난다 흡착에 의해 잠재적으로 손실 될 수 및 입자를 계산 하 여 정량 분석을 방해로 cryoWriter의 더 한계입니다. 문제는 두 가지 방법으로 해결: 먼저, 샘플은 microcapillary 내에서 긴 거리를 여행 하지 않습니다. 실제로, nanoliter 샘플 볼륨 처리를 통해 모 세관 끝에 남아 있습니다. 둘째, 셋째 비교적 큰 내부 직경, 예를 들어, 180 µ m.와 microcapillaries을 사용 하 여 볼륨 비율을 감소 추가,는 microcapillaries의 표면 필요한 경우 쉽게 패 수 있습니다 예를 들어, 그들을 치료 하 여 상업적으로 사용 가능한 polylysine 에탄올 glycols (PLL-PEG)와 함께
EM에 사용 되는 단일 입자 접근 방식에 의해 단백질의 고해상도 분석에는 개별 단백질 입자의 몇 백만 이미지 100000을 필요 합니다. 즉, 미세 기술 구조 조사에 대 한 충분 한 단백질 복합물을 제공할 수 있습니다. 단백질 복합물 (약 1 시간) 최소 셀 금액 (약 40, 000 셀)에서 빠른 격리에 대 한 소형된 면역-강수량 메서드 이전28개발 되었다. 이 메서드는 cryoWriter의 소형된 샘플 준비 단계에 직접 연결 됩니다 이제. 최종 목표는 모든 미만 2 시간을 요구 하는 빠른 단백질 분리 및 곳을 알아내는-EM 그리드 준비에 대 한 통합 된 미세 파이프라인을 개발 하는 것입니다. 또한, 그림 6, 분 양과 샘플 준비와 거의 무손실 컨디셔닝 및 그리드 준비 절차는 cryoWriter를 사용 하 여 달성에 필요한 자료의 볼륨에 의해 증명으로 가능 하 게 단백질 연구 개별 셀 단지 함께, 소형된 면역-강수량 메서드와 cryoWriter 같이 우리가 최근 열 충격 실험24"단일 셀 시각적 proteomics" 라는 새로운 단백질 방법의 기초를 하다. 데이터 분석 알고리즘 "비주얼 proteomics" 이미지의 분석에는 현재 테스트 되 고.

하드웨어 및 소프트웨어 전송 전자 현미경 (TEM)에 의해 단백질 복합물의 구조 분석에 대 한 대규모 최근 몇 년 동안 선진 했다. 개선 사항을 "해상도 혁명"1,2 도를 포장 하 고 근본적으로 구조 연구를 변경. Cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM)3,4, 방사선 민감도 감소 방지 하는 동안 생리 적 조건에 가까운 아래 생물 샘플의 준비를 허용의 도래와 함께 시작 하는 혁명 높은 진공에 샘플 증발 전송 전자 현미경5 다음 년에서 증분 기술 진보는 점차적으로 달성 해상도 증가. 이러한 혁신 중 필드-방출 총6,7, 적용 되었고, 더 최근에, 최대 가능성 방법8,9등 데이터 분석 알고리즘을 개선. 직접 전자 탐지기 카메라10,11,,1213, 영화 모드 이미징 및 동반 소프트웨어 개발14,15, 16 , 단일 입자 분석 (대 한 검토 보고 챙, Grigorieff, 외. 생물 학적 샘플에 대 한 원자 해상도 달성 하는 데 필요한 마지막 돌파구를 제공 하는 17, 18). 곳을 알아내는-그들의 중요성 최근 개척자의 3 화학을 위한 노벨상의 포상에 의해 인식 되었다.
가장에 의해 생물 학적 샘플 이미지, 샘플 (이후 "그리드 준비" 라고도 함) 안에 그리드를 로드 하는 데 사용 하는 방법 결과 샘플 레이어 (i) 충분히 얇은 인지 확인 해야 합니다 (&lt; 100 nm) 흩어져 탄력에 의해 광범위 한 소음을 방지 또는 곱하기 전자 현미경의 높은 진공을 견 디는 전자, (ii)와 (iii) 방사선 손상에서는 생체를 보호 합니다. 두 가지 주요 방법 이러한 빌드하거나 수행 하는 데 사용 됩니다: 부정적인 얼룩(NS)19,20 절차 (그림 1A) 얇은 탄소 필름 샘플을 흡착, 비정 질 중 금속에는 생체를 포함 그리고 어셈블리 공기에 건조를 허용 합니다. 이것은 간단 하 고 빠른, 그리고 로드 EM 격자 (이후 "샘플 격자" 라고도 함)는 쉽게 저장 하 고 시간의 연장된 기간에 대 한 유지 될 수 있다 (일반적으로 년). 가장, 준비 NS 인해 높은 콘트라스트를 전시 하 고, cryo-준비 보다 더 높은 전자 복용량을 용납 하지만 해상도 약 20 Å. Cryo-EM 절차 (그림 1B) 고용 홀리 탄소 지원 제한. 샘플 솔루션의 박막 구멍에 걸쳐 스팬 및 EM 그리드 제, 일반적으로 액 화 탄을 급속 하 게 그것은-150 ° c에 뛰어들었다 결과 아 몰 퍼스, vitrified, 50 ~ 100 nm 두꺼운 필름 지원 구멍에서 솔루션의. 이 얇은, 비정 질 영화 견 디는 전자 현미경에서 높은 진공으로, 이상적인 케이스에서 그들의 네이티브 국가에서 생물 학적 구조 합니다. 프로시저에서 고해상도 이미지를 생물 학적 샘플 수 있습니다. 그러나, 샘플 그리드 유지 되어야 한다 온도 아래에서-150 ° C 깡통을 피하기 위해 모든 시간에. 때문에 낮은 온도, 하지만 대비 상대적으로 높은 전자 복용량을 사용 하 여 이미지 수 이며 신호 대 잡음 비율 역시 낮은. 따라서 평균 기술 대비 증가 고용 하 고, 고해상도 3 차원 (3D) 지도 제공 하는 샘플은 다른 각도에서 몇 군데, 개축 될 수 있다. 가장 일반적으로 사용 하 고 매우 성공적인 지금 3D 재구성 방법은 단일 입자 접근. 최근 검토 쳉 여러분18참조.
부정적인 얼룩 가장 (NS-EM) 인지 검사 및 품질 관리에 대 한 중요 한 높은 콘트라스트 필요할 때 제한 된 양의 샘플을 사용할 수 있는 경우 (흡착 탄소 필름에 일반적으로 집중 하 고 샘플). 단일 입자 cryo-그들은 단백질 구조의 고해상도 3D 복원에 대 한 겨냥 한 경우 골드 표준 방법입니다.
<img alt="마이크로 조작 기술 다이어그램; 액적 증착, 나노 구조 추출 및 전달이 포함됩니다." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 원리의 가장 그리드 준비 및 클래식 (패널 A, B)와 미세 접근 (패널 C, D) 사이 비교. A) 클래식 NS-EM 그리드 준비: 샘플의 µ L 3에 대 한 지속적인 탄소 필름 (이후에 'NS-EM 격자' 라고도 함)으로 덮여는 그들 격자에 손으로 pipetted는 (i). 약 10 부 화 후 s, 필터 종이 얇은 물 필름에 흡착된 생체를 떠나 측면 (ii)에서 과잉 액체를 멀리 오 점 하는 데 사용 됩니다. 그 후, 단백질 중 금속 소금 솔루션, 예를 들어, 20 2 %uranyl 아세테이트 incubated s (iii), 그리고 다시 액체 필터 종이 (iv)를 사용 하 여 측면에서 blotting에 의해 제거 됩니다. 마지막으로, EM-그리드 건조 한 공기에 남아. B) 클래식 cryo-EM 그리드 준비: 샘플에 대 한 3 µ L 홀리 탄소 필름에 손으로 pipetted는. 얇은 샘플 영화를, 과잉 액체 종이 blotting 얼굴-에 의해 하나 또는 양쪽 (ii)에서 제거 됩니다. 마지막으로, 격자는 급속 하 게 속으로 뛰어들었다 vitrification (iii)에 대 한 액체 탄. C) cryoWriter 설정을 사용 하 여 NS-EM 그리드 준비: A 5 nL 볼륨 (i) microcapillary를 사용 하 여 샘플 재고에서 발음. 샘플 컨디셔닝, microcapillary 팁은 컨디셔닝 솔루션으로, 예를 들어, 2% 염화 아세테이트 포장 되어있습니다. 이온 및 작은 분자 확산 (ii)로 교환 됩니다. 참고는 microcapillary의 크기는 전체 프로세스를 구동 하는 보급을 보장 하는. 단백질 소금 이온 보다 훨씬 낮은 확산 상수 있고24를 크게 잃지는. 마지막으로, 샘플 격자에 적절 하 게 이며 (iii) 건조 수 있었습니다. D) cryoWriter 기반 방법을 사용 하 여 곳을 알아내는-EM 그리드 준비의 원칙: 홀리 탄소 필름으로 커버는 그들 격자 온도 제어 플랫폼의 표면에 놓이고 핀셋에 의해 개최. 플랫폼의 온도 노점 온도 그리드 환경에서 오프셋에서 제어 됩니다. 그리드 샘플을 포함 하는 microcapillary를 기준으로 이동 하 고는 microcapillary 그리드 위에 몇 마이크로미터까지 낮춘 다. 그 후, 샘플의 몇 nanoliters는 적절 하 게 그것에서 무대 나선형 패턴;에 이동 하는 동안 과잉 액체는 다시 발음 (i). 못쓰게는 그들 격자 후는 microcapillary 철회 하 고 격자 온도 제어 플랫폼에서 (그 후이 슬 포인트 (DP) 단계 라고 함) 제어 양의 샘플 증발을 허용 하도록 짧은 시간 동안 남아 있습니다. 동결 하는 식이 대 한 그리드 빠르게 핀셋 (ii)를 사용 하 여 스테이지에서 철수, 수직 위치에 90 °에 의해 뒤집힌 이며 제 목욕 (iii) (이후 ' 선택 및 식이 ' 메커니즘 이라고 함)으로. <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
불행히도, NS 및 곳을 알아내는-EM 사용 그리드 준비 방법은 그들은 발명 이후 크게 개선 하지 했습니다. 현재 단점 높은 샘플 소비 (1 mg/mL 단백질의 약 3 µ L) 이며 샘플의 다량 (&gt; 99%) (그림 1A, B)를 잃었다. 또한, 클래식 cryo-그들에 대 한 격자를 준비 하는 데 사용 방법은 단백질에 대 한 가혹한 절차: 먼저, 그것은 포함 한 광범위 한 얼굴에 종이 blotting 단계 (그림 1B, ii), 그리고, 둘째, 단백질은 공기-물 인터페이스에 노출 되 21의 상당한 양에 대 한입니다. 여기, 사전 조건 샘플에 대 한 다른 방법, 샘플 그리드 준비 및 사후 처리 (그리드 건조 또는 vitrification) NS-EM (그림 1C) 또는 곳을 알아내는-EM (그림 1D)에 대 한 제공 됩니다. "CryoWriter" 라는 자체 내장된 설치 소형된 샘플 처리 기술 및 미세 원리를 사용 하 여 발음, 조건 샘플, 피하 종이 완전히 더 럽 히 고 얇은 샘플에 대 한 대체 방법을 제공 하는 걸을 곳을 알아내는-EM. 그것은 크게 샘플 소비를 감소 하 고 전체 샘플 준비에 사용자 제어를 향상. 또한, 메서드 수 소설 실험적인 응용 프로그램; "단일 셀 시각적 proteomics"22,23,,2425라는 접근 방식에서 개별 셀의 격리 된 생물 학적 구성 요소 작성 등

<table><tbody><tr><td><강한>액체 처리</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로캐필러리 팁</td><td>새로운 Objective</td><td>FS360-100-30-N-20</td><td>SilicaTips 30 &micro; m 팁 ID, 100 &마이크로; m ID , pk. 20</td></tr><tr><td></td><td></td><td>FS360-150-30-N-20</td><td>실리카팁 30 &마이크로; m 팁 ID, 150 &마이크로; m ID, pk. 20</td></tr><tr><td>전도성 슬리브</td><td>새로운 대물</td>렌즈 <td>CONGAS-1&nbsp;</td><td>HV 접점용 전도성 엘라스토머, 12인치 길이</td></tr><tr><td>용융 실리카 튜브</td><td>BGB-Analytik</td><td>TSP-150375</td><td>TSP 표준 FS 튜브, 150 &마이크로; m ID, 363 &마이크로; m OD, 5미터</td></tr><tr><td>프레스핏 커넥터</td><td>BGB-Analytik</td><td>2525LD</td><td>Deact. PressFit 커넥터 0.25에서 0.25 mm ID, pk. 25&nbsp;</td></tr><tr><td>주사기 10 & 마이크로; l</td><td>BGB-Analytik</td><td>HA-80001</td><td>Hamilton 1701 LT - 루어 팁 (바늘 미포함)&nbsp;</td></tr><tr><td>시린지 펌프 컨트롤러</td><td>Cetoni</td><td>A3921000093</td><td>neMESYS 컨트롤러</td></tr> 시<tr><td>린지 펌프 도징 유닛</td><td>Cetoni</td><td>A3921000095</td><td>neMESYS 도징 유닛</td></tr> <tr><td><강>온도 제어</강></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>이슬점 센서</td><td>Meltec</td><td>UFT75-AT</td><td>습도/온도 센서, 이슬점 계산, USB 및 임베디드 DLL</td></tr><tr><td>온도 센서</td><td>Sensorshop24.ch</td><td>LS7-PT1000-1.0-3L</td><td>표면 장착 가능한 온도 센서 Pt1000</td></tr><tr><td>펠티에 컨트롤러</td><td>Cooltronic</td><td>TC2812&nbsp;</td><td>정전압 출력으로 펠티에 구동 시스템의 활성화를 위한 PID 온도 컨트롤러</td></tr><tr><td>펠티에 요소</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-127-14-15-S</td><td>40x40mm</td></tr><tr><td>수냉식 블록</td><td>-</td><td>-</td><td>40x40mm 펠티에 요소용 수냉식 블록, 구리 베이스</td></tr><tr><td>워터 펌프</td><td></td><td>Digitec.ch 294877</td><td>XSPC X20 750 듀얼 5.25 베이 저수지 펌프 블랙 V4</td></tr><tr><td>물 열교환기 블록</td><td>-</td><td>-</td><td>순환수를 냉각시키기 위한 2개의 팬이 있는 물 열교환기 블록</td></tr><tr><td>소형 냉각기</td><td>PCHC.ch</td><td>223050</td><td>Alphacool MCX 램 구리 에디션 2 개</td></tr><tr><td>소형 펠티에 요소</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-031-10-15-S</td><td>Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 &deg; C, 2 개</td></tr><tr><td><강한>기계</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>선형 스테이지 z축</td><td>Dyneos AG</td><td>M-404.2PD</td><td>고하중 정밀 변환 스테이지, 50mm 이동 범위, DC 모터</td></tr><tr><td>스테이지 컨트롤러</td><td>Dyneos AG</td><td>C-863</td><td>Mercury 서보 컨트롤러</td></tr><tr><td>현미경 xy축 스테이지</td><td>Prior Scientific</td><td></td><td>H117EIL5 Zeiss Axiovert 200용 전동 스테이지 도립 현미경</td></tr><tr><td>소형 영구 자석</td><td>Supermagnete</td><td>S-05-08-N</td><td>Rod magnet &Oslash; 5 mm, 높이 8.47 mm, 네오디뮴, N45, 니켈 도금, pk. 10</td></tr><tr><td>소형 전자석</td><td>Schramme</td><td>EG1025A02/110</td><td>전자석 24V 220 N 150 N 2,5 W</td></tr><tr><td>컨트롤러 전자석</td><td>Conrad.ch</td><td>MST-1630.001 7</td><td>전자석 제어 PCB 보드</td></tr><tr><td>솔레노이드 허브</td><td>Distrelec.ch</td><td>HD8286-R-F-24V100%</td><td>Kuhnke 솔레니드 허브 30mm 16 N 2 N 16 W</td></tr><tr><td>미니 핀셋</td><td>전자 현미경 과학</td><td>0302-M5S-PS</td><td>Dumont Type 5 mini, 초박형 팁</td></tr><tr><td>다양한 광기계 부품</td><td>Thorlabs</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-다양한 기계 부품</td><td>Workshop Biozentrum, University Basel</td><td>-</td><td>맞춤형 설계 어댑터 플레이트, 홀더 등 첨부된 CAD 파일 참조</td></tr><tr><td>< 강> 광학< / 강력 ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>레이저 다이오드</td><td>Thorlabs</td><td>CPS780S</td><td>780 nm 레이저 다이오드 모듈 2.5 mW</td></tr><tr><td>광 검출기</td><td>Thorlabs</td><td>PDA100A-EC</td><td>Si 전환 가능 이득 검출기, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2</td></tr><tr><td>EM grids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DURASIN FILM TEM</td><td></td> <td>emsdiasum.comDTF-03523</td><td>30 nm DuraSiN&trade; TEM용 실리콘 나이트라이드 막, 5개 팩</td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffers / Neg. stain</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537&nbsp; 시그마</td><td>둘베코' s 인산염 완충 식염수</td></tr><tr><td>NanoVan 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>음성 염색 바나듐 기반</td></tr><tr><td>NanoW 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>음성 염색 텅스텐 기반</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>openBEB</td><td></td><td></td><td>openBEB 2 프레임워크는 요청 시 사용할 수 있으며 버전 3은 CryoWriter 컨트롤을 다운로드할 수 있습니다</td></tr>.<tr><td> 소프트웨어(openBEB 플러그인)</td><td></td><td>요청 시 사용할 수 있으며, 타사 드라이버 소프트웨어에 대한 추가 요금이 적용될 수 있습니다.</td><td></td></tr></tbody></table>

전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

최근 기술적 진보 때문 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM) 급속 하 게 원자 해상도로 단백질 복합물의 구조 분석에 대 한 표준 방법 되고있다. 그러나, 단백질 분리 기술 및 그들에 대 한 샘플 준비 방법 병목 현상 유지. 개별 단백질 입자의 비교적 적은 수 (몇 백만에 100000) 단일 입자 그들 접근, 소형된 샘플 처리 기술 및 미세 원칙 하에 의해 단백질의 고해상도 분석에 대 한 이미지 필요 가능.
소형된 종이 blotting 무료 EM 그리드 준비 방법 샘플 사전, EM 그리드 못쓰게 조화와 nanoliter-볼륨 샘플의 사용 후 처리에 대 한 제공 됩니다. 메서드를 사용 하 여 분배 시스템 하위 nanoliter 정밀 제어 액체 통풍 관 및 EM 그리드 못쓰게, 플랫폼 위에 EM 그리드 및 선택-및-다이빙-메커니즘 샘플에 대 한 상대 습도 그로 인하여 결정 격자 온도 제어 vitrification입니다. 곳을 알아내는-EM, EM 격자 온도 제어 스테이지에 배치 및 모 세관으로 발음 하는 샘플은. 모 세관 팁 격자 표면에 근접에서 위치, 그리드 샘플 로드 되 고 초과 microcapillary로 다시 발음입니다. 그 후, 샘플 영화 안정 이며이 슬 포인트를 기준으로 플랫폼 온도 오프셋에 의해 통제 하는 제어 물 증발에 의해 약간 박 형. 주어진된 시점에서 선택 식이 메커니즘 샘플 vitrification에 대 한 액체 탄 액된 EM 그리드 전송 빠르게 실행 됩니다. 또한, 샘플 컨디셔닝 방법 부정적인 얼룩 (NS) 그들에 대 한 nanoliter 크기의 샘플 볼륨을 준비 사용할 수 있습니다.
방법론 크게 샘플 소비 하 고 기존의 방법에서 사용 필터 종이 blotting 단백질, 잠재적으로 유해한 접근을 피하십시오. 또한, 필요한 샘플의 소문자 금액 수 있습니다 빠른 샘플 컨디셔닝, "시각적 proteomics,"에 대 한 단일 셀 세포 또는 정량 분석을 위한 "무손실" 총 샘플 준비와 함께 같은 새로운 실험 전략을 복잡 한 샘플입니다.

"CryoWriter" 설치 그림 1C, D에에서 제안 된 소형된 EM 그리드 준비 절차를 테스트 하기 위해 ( 그림 2에 묘사 된) 개발 되었다. 그림 2 A 역 형광 현미경에 장착 하는 다양 한 구성 요소에 대 한 개요를 보여 줍니다. 세포 배양 모듈 현미경;의 왼쪽에 설치 EM 그리드 준비에 대 한 모듈은 오른쪽에 있습니다. 세포 배양 모듈 (그림 2B)는 가벼운 현미경에 의해 부착 진 핵 세포의 성장 및 세포 배양의 라이브 셀 이미징 있습니다. 개별 세포는 삼투성 충격, electroporation 및 (그림 2B, 그림 6A) microcapillary,2425에 셀 내용의 포부의 결합된 한 활동에 의해 lysed. Aspirated lysate 샘플 다음 준비 격자에 대 한 NS 또는 곳을 알아내는-EM을 사용할 수 있습니다. 또는, PCR 튜브에서 재고 단백질 솔루션 샘플 소스를 될 수 있습니다. Microcapillary (그림 2B) 고용 발음 하 여 하위-nL 정밀도와 적절 하 게 샘플 볼륨을 수 있도록 높은-정밀 펌프 시스템에 연결 됩니다. 자세한 프로토콜에서 모든 샘플 처리가이 microcapillary 또는 중요 한 샘플 전송 없이 자체 EM 격자에 수행 됩니다. 예를 들어 동일한 microcapillary 개별 진 핵 세포를 lyse, lysate를 발음, 그것, 그리고 마지막으로 분배 EM 격자에 aliquots에 사용 됩니다. EM 격자에 그것을 정확 하 게 제어 (그림 2C)의 온도 허용 하는 움직일 수 있는 DP 단계 그리드 준비 모듈에 의하여 이루어져 있다. NS-가장에 대 한 준비 샘플 격자 수 다음 단순히 차가운 단계에서 제거 되며 실내 온도에 공기에서 건조를 허용. 그러나, 다음 발생할 수 있는 소위 커피 고리 효과 양적 가장 단백질 '입자' 계산 됩니다에 대 한 피할 필요가 있다. 이렇게 하려면, 격자는 액체의 증발 속도를 점차적으로 증가 온도 기울기를 사용 하 여 DP 단계에 천천히 건조 수 있습니다. 곳을 알아내는-그들에 대 한 격자의 온도 노점; 가까이 보관 약 8 ° C의 양수 오프셋을 선택 하면 필요한 경우 센서에 의해 모니터링 될 수 있다 이다 박막 및 숱이 대 한 샘플 액체의 제어 증발 수 있도록26. 선택한 숱이 시간이 후 선택 식이 메커니즘을 활성화 하 고 샘플 vitrified (그림 2C). 참고가 폭락 메커니즘 실내 온도에 저장 되는 NS EM 격자에 대 한 필요 하지 않습니다.
<img alt="3D 이미징을 위한 현미경 설정, 분광 테이블에서 레이저 경로 및 샘플 위치 지정을 자세히 설명합니다." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: cryoWriter 설치의 개요. A) cryoWriter 설정의 개요는의 역 빛-(1) 현미경에 장착. B) 영역의 삽입 샘플 조작 및 세포 세포의 용 해 소형된 PDMS 기반 셀 문화 접시 (4) 위에 위치에 대 한 microcapillary (3) 패널 A. 셀 자란 구획 (2), 왼쪽에 표시. C) 영역의 삽입 패널 A. ' 선택-및-식이 ' 메커니즘에서 오른쪽에 표시. 홀리 탄소 필름 EM 격자 (5) 핀셋 (6)의 끝 사이 탑재 하 고 온도 제어 스테이지 (7), 주요 텍스트에서 노점 단계 (DP-단계)으로 직접 접촉에 가로로 배치. 단계 온도 PID 컨트롤러와 물의 Peltier 요소, 또는 주변 환경에 따라 노점 온도 가까이 유지를 통해 긴밀 하 게 제어 됩니다. DP 단계 (7)는 microcapillary 기준으로 그리드를 이동 하는 전동된 xy 축에 거치 된다. 자체 microcapillary z 단에 탑재 되 고 그것은 매우는 그들 격자의 표면 가까이 낮 췄 다 고 수 (연속 얇은 탄소 층 NS-EM 또는 cr에 대 한 홀리 탄소 필름을 덮고 샘플 지원에 nanoliter 크기의 볼륨을 분배 하는 데 사용 요-EM)입니다. Note 액체 흡수와 분배 정밀 펌프 시스템 (8)를 사용 하 여 수행 됩니다. 분사 액체는 나선형 패턴에는 microcapillary 기준으로 그리드를 이동 하 여 배포할 수 있습니다. 곳을 알아내는-EM 준비에 대 한 선택 식이 얼어 메커니즘 (9) 빠르게 샘플 로드 그리드 샘플 vitrification 급속 한 냉각 한 액체 탄 (10)으로 전송합니다. <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
그림 3 은 NS EM 격자 cryoWriter 설정을 사용 하 여 준비에 대 한 대표적인 결과 보여준다. microcapillary의 팁 5 로드 NS와 소금 이온의 퍼지는 교환 수 있도록 재고 솔루션에서 샘플 및 몇 분 동안 NS 솔루션 (2% methylamine tungstate)의 저수지로 감소의 nL (이론적인 토론 참조 아놀드, 외 그 외 여러분 24). 나중에, 조건된 샘플 NS EM 격자의 얇은 탄소 필름에 적절 하 게 되었고 건조. 그림 3 A 양적 가장에 필요한 완전 한 방울을 시각화 하기 위해 같은 방법으로 슬롯 격자의 사용을 보여줍니다. 커피 고리 효과 피하려면 갓 글로우 방전 그리드-노점 온도 (물 증발)에서 처음 개최 되었고 천천히 데워 DP-무대에. Note는 대부분의 응용 프로그램 (예를 들어, 샘플 또는 구조 분석의 품질 관리)에 대 한 느린 건조 과정이 필요 하지 않습니다. 높은-품질 NS- 그림 3B, C와같이 준비 없이, 얻을 수 있습니다. 컨디셔닝 시간 낮은 인산 염-무료 소금 버퍼는 약 3 분, 예를 들어, 낮은 소금 Tris 버퍼 (20 mM Tris HCl pH 7.4 50 m m NaCl), 담배 모자이크 바이러스 (TMV)를 사용 하 여 그림 3B 와 같이 샘플으로. 그림 3 C 는 TMV PBS 버퍼 (2.7 m m KCl, 1.5 m m KH2포4, 136.9 m m NaCl, 8.9 mM 나2HPO4·7H2O, pH 7.4)에 최악의 시나리오를 제공 합니다. 인산 염 이온 NS ( 그림 5C참조)의 중 금속 이온을 길게 하는 컨디셔닝 시간 (7 분) 과도 결정을 형성 한다. 다른 중 금속 소금 격자 준비 모듈, 예를 들면, 2 %methylamine 바 또는 황화 몰 리브 덴도 사용할 수 있습니다 (참고 아놀드, 외. 그러나 24)., uranyl 아세테이트는 적합 한; 이 얼룩의 가교 효과 리드 집계 경우 탄소에 흡착 (참조 그림 5E)23영화 전에 단백질 샘플 솔루션에서 조절 된다.
<img alt="나노 구조 및 섬유의 전자 현미경, 상세한 줌은 표면 형태를 보여줍니다." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: 그림 1C에서 cryoWriter 설치를 사용 하 여 준비 하는 NS 격자에 대 한 일반적인 결과. A) 2% methylamine tungstate와 컨디셔닝 후 슬롯 격자에 적절 하 게 3 nL 물방울의 개요 이미지. B) TMV 20 mM TRIS 버퍼에. 삽입 표시 된 영역의 3 배 확대를 보여줍니다. 아놀드, 외.24 에서 적응 (발췌 자료에 관련 된 추가 권한을 ACS에 직접 해야 합니다). C) PBS 버퍼에서 담배 모자이크 바이러스 (TMV). 삽입 표시 된 영역의 3 배 확대를 보여줍니다. 아놀드, 외.24 에서 적응 (발췌 자료에 관련 된 추가 권한을 ACS에 직접 해야 합니다). 스케일 바: A, 100 µ m; B, 50 nm; C, 80 nm. <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
CryoWriter 설치를 사용 하 여 준비 하는 곳을 알아내는-EM 격자에 대 한 일반적인 결과 그림 4에 묘사 된다. 패널 4A 그리드 아틀라스를 vitrified 샘플 영역을 보여 줍니다. 패널 4B 선택한 그리드 슬롯에 유리 같은 얼음의 동질성을 보여준다. 두 경우 모두, 샘플 25mm HEPES 코 pH 7.5, 50 m m NaCl 버퍼 0.05% 포 14 세제를 포함 했다. 많은 샘플 및 버퍼 테스트와 유사한 고품질 유리 얼음 얻은, 하지만 필요 조건은 종속 버퍼 ( 그림 5의 내용 참조). 패널 4 C 증가 대비 높은 defocus에서 몇 군데 Tris HCl 버퍼 (20 mM Tris HCl, 50 mM NaCl, pH 7.4)에 apoferritin 입자와는 살 균 소를 보여줍니다. 패널 4 D amphipoles에 의해 안정 200 kDa 막 단백질을 보여줍니다.
<img alt="Cryo-EM 그리드 분석, 나노입자 분포; 전자 현미경 이미지, 구조 연구." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4: 그림 1D에 표시 된 대로 cryoWriter 설치를 사용 하 여 준비 하는 곳을 알아내는-EM 격자에 대 한 일반적인 결과. 샘플 및 버퍼 표시 하는 예제에서 다. 모든 샘플은 홀리 탄소 필름에 로드 되었습니다. A) 150 kDa 막 단백질, 유리 같은 얼음의 주변을 포함 하는 샘플의 개요 이미지 ("그리드 아틀라스")의 콜라주 흰색 화살표로 표시 됩니다. B) 유리 얼음 홀리 탄소 필름을 보여주는 동일한 버퍼 준비 그리드에서 확장 그리드 슬롯. 어떤 구멍은 하지 흰색 화살표에 표시 된 대로 샘플 버퍼를 채워진다. C) 탄소 구멍 vitrified 샘플 포함 하는 apoferritin 단백질 복합물 및 살 균 소. 삽입: 두 가지 확대는 살 균 소의 꼬리를 보여주는. 흰색 별표가 나타냅니다 탄소 필름. 참고 이미지 대비를 증가 높은 defocus 함께 기록 되었다. D) amphipols에서 재구성 한 200 kDa 막 단백질. 삽입: 증가 대비 표시 표시 된 영역의 2 배 확대. 스케일 바: A, 100 µ m; B, 10 µ m; C와 D, 80 nm. <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
CryoWriter 설치 허용 체계적인 최적의 EM-그리드 준비 조건;에 대 한 심사 예를 들어 그림 5A 에 표시 됩니다 (25mm HEPES 코 pH 7.5, 50 mM NaCl, 0.05%에서에서 apoferritin 포 14). 이 실험에서 "대머리" 온도 유리 얼음 다양 했다, 하지만 (즉, 샘플 응용 프로그램 및 식이 어 간의 시간 간격) 숱이 시간 상수 (1 s). 낮은 오프셋된 온도에서 (예를 들어, 8 K), 샘플 레이어 너무 두꺼운 했다. 오프셋된 고온에서 구멍에 유리 얼음이 얇은 (10k, 12k) 될 때까지 (위 18 K) 어떤 단계에서 격자 완전히 건조 (표시 되지). 결과에서 제시 여기, 유리 같은 얼음의 큰 균질 지역 12 K의 오프셋 검은 화살표에 표시 된 대로. "테스트" 단백질 (예: apoferritin)를 사용 하 여 대상 샘플의 버퍼와 같은 최적화 실험을 수행할 수 있습니다. 발견 최고의 조건 대상 샘플에 적용 됩니다. 또한, 최적의 멀리 매개 변수와 함께 격자 준비 절차 동안 자주 인식 될 수 있다 하 고 상당한 시간을 절약 하는 전자 현미경에서 상영 될 필요가 없습니다. 그림 5<img alt="극저온 전자 현미경 이미지; 8K, 10K, 12K의 샘플 그리드; 단백질 구조 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig5large.jpg" target="_blank"></a><img alt="극저온 전자 현미경 설정 및 결과; 세포 구조 분석을 보여주는 다이어그램 및 이미지." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig6large.jpg" target="_blank"></a>

악기 및 전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 nanoliter 크기의 샘플 볼륨의 준비를 위한 방법 제공 됩니다. 아무 종이 blotting 단계 필요, 따라서이 단백질, 크게 샘플 손실을 감소 시키고 단일 세포 lysate 시각적 proteomics에 대 한 분석을 사용에 대 한 가질 수 해로운 결과 피하는.

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

이 방법은 제한된 양의 단백질을 사용할 수 있는 민감한 단백질의 준비와 같은 구조 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 표준 시료 전처리 방법에 비해 극소량의 시료만 필요하고 거친 종이 블로팅 단계가 필요하지 않다는 것입니다. 이 기술의 의미는 시각적 단백질체학에 의한 단일 세포 분석 또는 단백질 관련 질병의 진단으로 확장됩니다.우리는 약 100,000개의 개별 입자만으로 고해상도 구조를 해결할 수 있는 기술을 가지고 있었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 가졌습니다. 시작하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 준비합니다. 다음으로 에탄 컵, 크라이오 박스 홀더 및 스파이더를 조립합니다.그리고 극저온 용기에 액체 질소를 가득 채웁니다. 몇 분 후, 컵은 시원해지고 액체 질소가 없어집니다. 그런 다음 에탄 가스통을 열고 가스가 에탄 컵으로 천천히 흐르도록 합니다.레벨이 상단 아래 2-3mm가 될 때까지 컵에 액체 에탄을 채웁니다. 이 작업은 몇 분이 소요되며 약 5ml의 액체 에탄이 필요합니다. 스파이더를 제거하고 그 위에 폴리스티롤 뚜껑을 놓고 극저온 처리기의 마운팅에 극저온 용기를 놓습니다.극저온 라이터 핀셋으로 글로우 방전 EM 그리드를 잡고 전자석의 핀셋을 매듭짓고 마이크로 매니퓰레이터를 나사로 조여 그리드를 탄소 필름 면이 위로 향하게 하여 스테이지에 평평하게 정렬합니다. 소프트웨어로 돌아가서 grid_save 두 번 클릭합니다. 그런 다음 팁이 그리드 표면에서 약 10마이크로미터 위에 있도록 미세 모세관 위치를 조정합니다.미세 모세관이 어디에도 닿지 않고 그리드를 가로질러 자유롭게 이동할 수 있는지 확인하십시오. 그리고 필요한 경우 미세 모세관을 몇 마이크로미터 빼냅니다. 그런 다음 그리드의 중앙으로 다시 가져오고 새 위치를 그리드로 저장합니다.미세 모세관을 다시 홈 위치로 이동합니다. 다음으로, 수십 나노리터의 시스템 액체로 미세모세관을 세척하고 보푸라기가 없는 조직을 사용하여 미세모세관에서 물방울을 제거합니다. 이제 모든 것이 준비되었으므로 매크로 스크립트를 시작합니다.매크로는 먼저 제자리로 이동하고 5나노리터의 시스템 액체를 분배하여 팁의 기포를 제거한 다음 샘플 위치로 이동합니다. 다음으로, 65나노리터의 샘플을 흡인한 다음 5나노리터를 샘플 튜브에 다시 주입합니다. 이것은 시스템 백래시를 고려하고 동기화된 쓰기를 허용합니다.그리드 위치로 이동한 후 쓰기 패턴을 시작하여 미세 모세관이 그리드를 가로질러 이동하고 동시에 45나노리터의 샘플을 분배합니다. 그런 다음 마이크로 모세관을 그리드의 중앙으로 다시 이동시키고 10마이크로미터 더 낮추고 과도한 샘플 액체를 회수합니다. 마지막으로, 매크로는 미세 모세관을 회수하고 전자석을 꺼서 플런지 동결 메커니즘을 시작합니다.자석에서 해제되면 플런저에서 자기 어댑터를 조심스럽게 분리하고 에탄 컵의 그리드를 극저온 상자가 포함된 극저온 용기로 빠르게 전송하여 그리드를 빈 슬롯에 배치합니다. 시작하려면 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 준비하고 인듐 주석 산화물 슬라이드를 현미경 삽입물에 장착합니다. 두 개의 나사를 사용하여 알루미늄 인서트에 슬라이드를 고정하고 슬라이드의 인듐 주석 산화물 코팅과 전기적으로 접지된 알루미늄 프레임 사이의 전기 접촉을 보장합니다.그런 다음 웰에서 세포 배양 배지를 제거하고 300마이크로리터의 전기천공 완충액으로 세포를 두 번 세척합니다. 마지막 세척 후 세포를 electroporation buffer에 보관하십시오. 다음으로, Live Cell Incubator 스테이지의 인듐 주석 산화물 슬라이드를 고정하고 있는 알루미늄 인서트를 셋업에 놓습니다.현미경을 사용하여 세포 배양액을 찾고 세포가 없는 영역을 선택합니다. 슬라이드 표면의 미세 모세관 팁에 접근하여 부드럽게 만집니다. 그런 다음 팁을 100 마이크로 미터로 빼내고 위치를 셀로 저장하십시오.이제 세포 배양을 빠르게 종료하고 수십 나노리터의 시스템 액체로 미세 모세관 팁을 플러시한 다음 다시 세포 배양에 넣습니다. PDMS 웰에 담그는 동안 몇 나노리터를 분사하여 팁에 기포가 갇히지 않도록 합니다. 셀의 위치를 두 번 클릭하고 인듐 주석 산화물 슬라이드의 표면에 부드럽게 접근하고 접촉하면 팁을 10마이크로미터 후퇴시킵니다.이 시점에서 용해할 가까운 세포를 선택합니다.를 선택하고 미세 모세관의 끝을 대상 세포 위에 놓습니다. 그런 다음 단일 세포 용해를 위한 매크로 스크립트를 시작합니다.일단 시작되면, 스크립트는 세포가 성공적으로 용해된 후 미세모세관을 이동해야 하는 위치를 묻습니다. EM 그리드에 대해 원하는 위치(예: 그리드)를 입력합니다. 그런 다음 매크로는 사용자 개입 없이 진행되며, 세포 배양에서 현미경의 단계를 100마이크로미터 왼쪽으로 이동하여 대상 세포의 스냅샷을 촬영하는 것으로 시작합니다.그런 다음 15나노리터의 이중 증류수가 미세모세관 튜브에서 분배되어 고염 완충액을 대체 및 희석하고 세포에 삼투압을 가합니다. 다음으로, 스테이지는 다시 이동하여 팁을 대상 셀 위에 다시 배치합니다. 여기에서 사전 정의된 전압 버스트가 적용되고 500밀리초 후에 펌프 시스템이 분당 2마이크로리터의 유속으로 3나노리터의 샘플을 흡입하기 시작합니다.마지막으로 스테이지가 다시 왼쪽으로 이동하여 셀을 검사할 수 있습니다. 사용자 입력을 요청하는 창이 나타납니다. 셀이 성공적이면 yes를 입력하여 용해된 셀의 스냅샷을 만듭니다.그 후, 미세모세관은 저수지 액체에 잠긴 상태로 엔도 위치로 이동합니다. 노즐 형상에 따라 8분에서 12분 동안 미세 모세관을 담가 둡니다. 다음으로, 5나노리터의 컨디셔닝된 세포 용해물을 그리드에 분배합니다.미세 모세관을 빼내고 컨디셔닝된 샘플을 이슬점 단계에서 천천히 건조시킵니다. 마지막으로 스테이지에서 그리드를 제거하고 그리드 상자에 실온으로 보관합니다. 여기에 표시된 것은 설명된 CryoWriter 설정을 사용한 냉동 샘플의 일반적인 cryo 이미지입니다.그리드 개요에서 유리체 얼음의 주변을 명확하게 볼 수 있습니다. 유리체 얼음이 들어있는 구멍이 뚫린 탄소 필름이 있는 그리드 슬롯을 자세히 살펴보면 흰색 구멍이 발견될 수 있으며, 이는 모든 구멍이 샘플 완충액으로 채워지지 않았음을 나타냅니다. 탄소 구멍이 있는 샘플 중 하나에서 박테리오파지의 꼬리를 자세히 볼 수 있습니다.단세포 시각적 단백질체학을 수행하도록 설정된 CryoWriter를 사용하면 개별 단백질, 예를 들어 필라멘트 액틴 및 단백질이 부착된 멤브레인 패치와 같은 것을 볼 수 있습니다. 패널 6b에서 볼 수 있는 이미지는 유기 텅스텐 화합물을 기반으로 2% 음성 염색으로 음으로 염색되었습니다. 패널 c는 cryo EM을 위해 준비된 단일 세포 용해물을 보여줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 나노리터의 총 단백질 샘플 또는 단일 세포 추출물에서 음성 염색 또는 cryo EM 그리드를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.액체 에탄 및 질소로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 항상 이 절차를 수행하여 보안경과 실험복을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

miniaturized-sample-preparation-for-transmission-electron-microscopy

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

극저온 전자 현미경은 스캐닝 (SEM) 또는 전송 (TEM) 중 하나는, 널리 높은 수분 함량 1 생체 시료 또는 기타 자료의 특성에 사용됩니다. SEM / 집중 이온 빔 (FIB)는 샘플에 대한 관심의 기능을 식별하고 극저온 TEM에 전송을위한 얇은 전자 투명한 얇은 판을 추출하는 데 사용됩니다.

집중 이온 빔의 극저온 전자 현미경 표본 준비하여 의미

여기에서는 투과전자현미경(TEM) 분석을 위해 세포 수가 적은 샘플을 준비하는 프로토콜을 제시합니다.

TEM 분석을위한 낮은 셀 번호와 샘플 준비를위한 다른 방법

이 보고서는 두꺼운 생물학적 표본의 주사 투과 전자 단층 촬영을 수행하기 위한 샘플 준비 프로토콜과 특정 이미징 조건을 설명합니다.

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

이 연구는 전송 전자 현미경 검사 법에서 고가의 장비 없이 미생물의 직렬 ultrathin 섹션을 얻기 위한 안정적이 고 쉽게 절차를 선물 한다.

전송 전자 현미경 검사 법에서 미생물의 직렬 Ultrathin 섹션을 얻기위한 방법

이 프로토콜 전송 전자 현미경 검사 법이 부정적인 얼룩이 지기, 상세한 구조 및 면역-골드 라벨 exosomes에 특정 단백질의 위치를 확인 하려면 ultrathin 단면에 필요한 다양 한 기법을 설명 합니다.

샘플 준비 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 Exosomes의 영상

여기에 우리가 두 개의 샘플 처리 기술, 냉동 고압을 결합에 대 한 프로토콜을 현재 그리고 전자 레인지를 이용한 샘플 처리, 집중 된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 (SEM 거짓말)와 데이터 획득에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지. 이 마우스 tibial 신경 샘플와 꼬마 선 충을 사용 하 여 보여 줍니다.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

이 보고서는 Drosophila Larvae의 신경근 접합부를 시각화하기 위한 새로운 샘플 준비 절차를 제공합니다. 이 방법은 기존 방법에 비해 샘플의 말림을 방지하는 데 더 효과적이며 초파리 신경근 접합부 초구조 분석에 특히 유용합니다.

Drosophila 유충의 신경근 접합부의 투과 전자 현미경을 위한 시료 전처리 공정 최적화

이 프로토콜은 시료 전처리 최적화를 통해 불균일한 입자 분포를 해결하기 위한 Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)를 예로 사용하는 실용적인 방법을 제시하며, 연구자가 극저온 전자 현미경(cryo-EM)을 사용하여 고분자 구조를 효율적으로 규명할 수 있는 참고 자료를 제공합니다.

극저온 전자 현미경을 위한 시료 전처리 최적화

이 비디오 프로토콜은 바이러스 표본의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영을 수행하는 방법을 보여줍니다. 최적의 결과를 위해 샘플은 고압 냉동 및 후속 동결 대체를 통해 준비됩니다.

바이러스학의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영: 고압 냉동, 동결 치환 샘플의 3D 이미징

우리는 sectioning, 고정, 삽입을위한 과정을 설명하고, 늦은 단계의...

의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관

배우세요 전자현미경용 나노리터 샘플 준비 기법을 통해 민감한 단백질을 분석하는 방법을. 종이 블로팅 없이 샘플 손실을 최소화하여 단일 세포 단백체학 연구에 활용할 수 있습니다.

전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비

더 많은 동영상 탐색