기본 전립선 세포 분화에 대한 신속한 필터 삽입 기반의 3D 문화 시스템

환자 유래 일차 세포를 위한 이 필터 인서트 기반 3D 배양 시스템의 전반적인 목표는 전립선암 연구를 위한 생물학적으로 더 관련성이 높은 체외 모델 시스템을 구축하는 것입니다. 1차 인간 세포를 사용함으로써 이 방법은 전립선 발달 생물학과 전립선암의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 RNA, DNA 및 단백질과 같은 생체 분자를 신속하게 분리할 수 있는 분화된 1차 전립선 세포의 확립을 위한 비교적 빠른 체외 방법론이라는 것입니다.

이러한 방법의 시각적 시연은 조직학 또는 RNA 및 단백질 수집을 위한 필터 인서트의 세포 처리가 섬세하고 시간에 민감하기 때문에 매우 중요합니다. 생물 안전 캐비닛의 챔버 간 확산을 제한하려면 인서트의 바닥면에 0.1% 젤라틴을 얇게 바르고 건조시킵니다. 이 절차를 두 번 더 반복합니다.

그런 다음 젤라틴으로 코팅된 삽입물의 내부 챔버에 세포를 적용하고 최대 2주 동안 배양합니다. 2주 후, 배양된 필터 인서트를 다음에 자세히 설명된 적절한 다운스트림 응용 분야 중 하나에 직접 적용합니다. 이 절차를 시작하려면 외부 챔버에서 PBS를 흡인하고 내부 챔버에서 PBS를 조심스럽게 제거합니다.

배양된 삽입물은 응용 프로그램을 시작할 준비가 될 때까지 PBS에 잠시 보관할 수 있지만 멤브레인이 건조되지 않도록 합니다. 다음으로 각 내부 챔버에 100 마이크로 리터의 0.25 % 트립신 EDTA를 첨가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.

그 후, 위아래로 피펫팅하면서 200마이크로리터 피펫으로 멤브레인 표면의 세포를 짧고 조심스럽게 긁어냅니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 1분 동안 배양합니다. 1분 후 250마이크로리터의 컨디셔닝된 매체를 첫 번째 내부 챔버에 추가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 필터를 헹굽니다.

그런 다음 재현탁 세포를 동일한 매체 조건을 포함하는 인접한 필터 챔버로 옮기고 위아래로 피펫팅을 반복합니다. 단일 조건의 각 삽입에 대해 이 절차를 반복합니다. 그런 다음 세포를 수집하여 1.5ml 원심분리 튜브로 옮깁니다.

추가로 100-200마이크로리터의 컨디셔닝 배지로 각 내부 챔버를 헹구어 남은 세포를 수집하고 1.5ml 원심분리기 튜브에 추가합니다. 그런 다음 섭씨 4도의 마이크로 원심분리기에서 5분 동안 세포를 회전시킵니다. 그 후에 상등액을 흡인하고 1, PBS의 000 마이크로리터로 세포 펠릿을 한 번 세척하십시오.

섭씨 4도의 마이크로 원심분리기에서 5분 동안 세포를 다시 돌립니다. 5분 후 PBS를 흡입하고 나중에 사용할 수 있도록 시료를 섭씨 영하 80도에서 동결합니다. 이 절차에서 200마이크로리터의 구아니디늄, 티오시아네이트, 페놀 클로로포름 또는 이와 유사한 추출 시약을 내부 챔버에 추가하고 위아래로 피펫팅하여 멤브레인 표면의 세포를 잠시 교반합니다.

그런 다음 추출 시약의 세포를 실온에서 5분 동안 배양하고 외부 챔버를 건조한 상태로 둡니다. 그런 다음 추출 용액을 위아래로 피펫팅하여 필터 멤브레인을 세척합니다. 6개의 웰 플레이트를 기울여 잔류 액체를 흡인하여 가능한 한 많은 추출 시약을 수집합니다.

필터가 인서트에서 분리될 수 있습니다. 분리된 필터 멤브레인이 부착된 경우 세척합니다. 그런 다음 가능한 한 많은 추출 시약을 수집하고 DNA, RNA 또는 단백질의 정제 및 회수를 위한 제조업체의 프로토콜을 따릅니다.

guanidinium thiocyanate로 세포와 필터를 세척할 때 과도한 교반은 품질이 낮은 RNA를 생성할 수 있으므로 주의해야 합니다. 필터 인서트에서 단백질을 분리하려면 필터 인서트를 얼음 위의 6웰 플레이트에 놓습니다. 그런 다음 10마이크로리터의 단백질 용해 완충액을 내부 챔버에 추가합니다.

위아래로 피펫팅하면서 멤브레인 표면의 세포를 교반하고 긁어내고 용해 완충액에서 기포가 생성되지 않도록 합니다. 그 후, 필터 인서트가 있는 6웰 플레이트를 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 긁기를 반복한 다음 용해 완충액으로 멤브레인 표면을 헹굽니다.

6개의 인서트에서 용해물을 모아 얼음 위의 1.5ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 10마이크로리터의 용해 완충액으로 첫 번째 멤브레인을 헹구고 다음 필터로 옮깁니다. 주어진 실험 조건의 모든 삽입물에 대해 이 절차를 반복하여 잔류 용해 완충액을 수집하고 1.5ml 튜브에 추가합니다.

얼음 위에서 샘플을 추가로 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 15분 동안 최대 속도로 돌립니다. 완료되면 용해물을 새로운 1.5mm 튜브에 피펫으로 넣습니다.

그런 다음 단백질 농도 분석을 진행하거나 용해물을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 이 절차에서 내부 및 외부 챔버에 각각 500 마이크로 리터와 1 밀리리터의 10 % NBF를 추가합니다. 섭씨 4도에서 밤새 배양하십시오.

다음 날 외부 챔버에서 NBF를 흡입하고 1.5ml 원심분리기 튜브에 1ml의 HEA 처리 젤을 추가합니다. 아가로스를 저전력으로 전자레인지에 천천히 녹이고 아가로스가 녹을 때까지 10초 펄스를 반복합니다. 사용할 준비가 될 때까지 응고를 방지하기 위해 HEA를 섭씨 37도의 따뜻한 욕조에 보관하십시오.

다음으로 내부 챔버에서 NBF를 제거합니다. 25마이크로리터의 용융된 HEA를 내부 챔버에 바르고 아가로스가 2-5분 동안 응고되도록 합니다. 그런 다음 두 개의 폼 조직학 패드를 10%NBF에 적시고 한 패드를 임베딩 카세트에 놓습니다.

HistoGel을 사용하여 필터 삽입체의 세포층의 무결성을 보호하는 것은 조직학적 절편을 위해 온전한 세포층을 보존하기 위한 중요한 단계입니다. 그런 다음 숫자 11 블레이드 메스를 사용하여 플라스틱 삽입 챔버의 바닥에서 필터에 점수를 매기고 부분적으로 해제합니다. 페트리 접시에 100-200마이크로리터의 NBF를 놓고 부분적으로 제거된 필터를 NBF에 담그십시오.

숫자 10 블레이드 메스를 사용하여 인서트 챔버 내부에서 필터 중앙을 부드럽게 눌러 인서트 배럴에서 필터를 완전히 제거합니다. 배럴에 아직 필터 부분이 부착되어 있으면 메스로 절단하십시오. 그런 다음 HEA 코팅 필터를 반으로 자릅니다.

필터의 각 절반을 준비된 조직학 카세트의 폼 패드에 놓습니다. 그런 다음 두 번째 10%NBF에 적신 스폰지를 카세트에 넣고 필터를 끼웁니다. 다음으로 카세트를 스냅 씰링합니다.

NBF에 넣고 밤새 배양하십시오. 이 명시야 이미지는 다공성 막 위에 있는 다층 세포층을 보여줍니다. 핵, P63 및 안드로겐 수용체에 대한 개별 형광 이미지가 표시되며, 세 가지 형광 마커가 모두 병합된 것도 표시됩니다.

마지막으로, 복합 명시야(bright field)와 면역형광 오버레이(immunofluorescence overlay)가 표시되어 세포와 필터에 대한 형광 신호의 위치를 확인합니다. 다음은 온전한 전립선의 관 상피층과 비교한 필터 삽입물의 단면 이미지를 보여줍니다. 이 기술을 완전히 익히면 2주 안에 완료할 수 있으며, 세포와 필터 인서트 또는 원하는 생체 분자를 최종적으로 분리하는 데 30분 미만

이 절차를 수행하는 동안 필터 인서트로 작업할 때 세포층이나 기본 필터가 손상되지 않도록 항상 주의를 기울여야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 경로 분석 및 암세포와 관련된 추가 질문에 답하기 위해 웨스턴 블롯, RNA 마이크로어레이 및 단백질체 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 전립선암 분야의 연구자들이 1차 전립선 세포를 사용하여 전립선암의 토대뿐만 아니라 전립선 생물학을 더 잘 탐구할 수 있는 길을 닦는 데 도움이 될 것입니다.

이 비디오를 시청한 후에는 이 3D 배양 시스템에서 배양된 1차 전립선 세포를 적절하게 설정하고 복구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.