Name: 기본 전립선 세포 분화에 대한 신속한 필터 삽입 기반의 3D 문화 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 배우세요 필터 삽입 기반 3D 배양 시스템을 이용한 전립선암 연구를 위한 환자 유래 원발성 전립선 상피세포의 신속한 분화 및 생물분자 분리 방법. 이 기법은 생물학적으로 관련성 높은 체외 모델을 제공합니다.

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이 연구는 T32 (CA 9686-18) 및 TL1 (TL1TR001431) 박사 교육 그랜트 상 (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA)뿐만 아니라 의해 지원되었다 U01 PAR-12-095 (쿠마)와 P30의 CA051008-21 (와이너). 샘플 고정, 절편 및 염색은 롬바르디 종합 암 센터의 조직학 및 조직 공유 자원에서 수행되었다. 우리는 도움이 토론 리처드 슈레 겔 제품 개발 부사장 감사합니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 암 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

3 차원 셀의 1. 설립 문화 삽입 시스템 <ol><li> 아래로 6 웰 플레이트 (그림 1A)에서 역 방향 (최대 필터 측) 2 폴리 카보네이트 세포 배양 삽입을 놓습니다. </li><li> 인서트의 바닥면에 물을 0.1 % 젤라틴의 얇은 층을 적용하고 멸균을 유지하기 위해 생물학적 안전 캐비넷 (10-20 분) 건조 할 수있다. </li><li> 단계를 반복 1.2 삽입에 0.1 % 젤라틴의 3 응용 프로그램의 총 두 번 더. 주 : 젤라틴 코팅 챔버 사이의 제한 확산 도움이 될 것입니다. </li><li> 문화 플라스크를 씻어 PBS의 5 mL를 넣고, 표준 배양 조건에서 차의 CRC를 수집합니다. <ol><li> 37 ° C에서 5 분 동안 0.25 % 트립신 EDTA (a T-75에 대한 T-25이 용액 1 ㎖)를 사용하여 세포를 Trypsinize. 부드럽게 세포를 빠지에 도움을 플라스크의 측면을 누릅니다. 이어서 트립신 반응을 정지하고 완전 DMEM 5 ㎖를 첨가하여 세포를 수집하기 위해 진행. </li><li> 수집<html> 15 ㎖의 튜브에 세포. 4 ° C와 188 XG에서 튜브를 원심 분리기 및 자동 셀 카운터 또는 혈구를 사용하여 계산합니다. </li><li> 미디어 (CM)를 조절 250 μL에 60의 CRC를 다시 일시 중단하고 제대로 지향 (필터면을 아래로) 문화 삽입 (그림 1B)에 추가 할 수 있습니다. 이는 내부 챔버로 지칭된다. 참고 : CM은 조사 J2 세포에 의해 조절 F-매체이며, 이전에 7, 8, 9, 11 설명 된대로 10 μm의 Y-27632이 포함되어 있습니다. </li></ol></li><li> 6 웰 플레이트의 외부 챔버에 CM의 2 용액을 적용하고 (최소 18 시간) 밤새 37 ° C에서 품어. </li><li> 조심스럽게 한 ML 200 μL 피펫으로 내부 챔버에 CM을 제거하고 천천히 풀 때까지 1 ML의 피펫 내부 챔버에 차별화 미디어 (DM)를 추가합니다. 셀 계층을 방해하지 않도록주의해야합니다. </li></ol>3D 문화의 제작 &quot;&gt; 2. 유지 관리 <ol><li> 매일 문화를 확인합니다. 그림 2와 같이 건강한 세포가 나타납니다. </li><li> 외부 챔버의 CM 매일 또는 세포의 신진 대사에 따라 매일 변경합니다. </li><li> (노란색) 내부 챔버 변경 색상의 매체는 조심스럽게 한 ML 200 μL 피펫으로 내부 필터 챔버에서 용지를 제거합니다. </li><li> 흡인 팁과 외부 6 웰 플레이트 챔버에서 미디어를 대기음. </li><li> 1 ML의 피펫을 사용하여 천천히 풀 때까지 내부 챔버에 신선한 DM을 적용합니다. 긁어하거나 셀 층을 제거하지 않도록주의하십시오. </li><li> 신선한 CM 2 mL로 외부 챔버에서 미디어를 교체합니다. </li><li> 2 주 문화를 유지 한 다음 원하는 생체 분자 분리에 대한 처리를 진행합니다. 주 : 6 웰 플레이트의 각 행은, 여섯 삽입 (그림 1B)의 총, DN에 대한 충분한 세포를 얻기 위해 실험에 따라 처리해야분석을 위해 A, RNA 또는 단백질. </li><li> 외측 챔버 대기음 매체 및 2 ㎖의 인산 완충 식염수 (PBS)로 헹군다. </li><li> 조심스럽게 한 ML 200 μL 피펫과 내부 챔버에서 미디어를 제거하고 500 μL PBS를 추가합니다. 긁어하거나 막에 세포를 방해하지 마십시오. </li><li> 기음 외부 챔버에서 PBS 조심스럽게은 1 mL를 200 μL 피펫으로 내부 챔버에서 PBS를 제거합니다. PBS를 제거하고 나면 아래에 설명 된 해당 응용 프로그램에 직접 진행합니다. 멤브레인이 건조하는 것을 허용하지 않습니다. 응용 프로그램이 시작할 준비가 될 때까지 배양은 PBS로 잠시 유지할 수있다. </li></ol> 3. 펠렛 은행의 필터 처리 <ol><li> 각 내부 챔버 100 μL 0.25 % 트립신 - EDTA를 추가하고 37 ℃에서 5 분 동안 품어. </li><li> 아래로 피펫 팅하는 동안 간단히 조심스럽게이 / 교반 200 μL 피펫으로 막 표면에 세포를 긁어 (punc을 피하기) 막을 튜링. 37 ° C에서 1 분 동안 품어. </li><li> 필터를 씻어 아래로 부드럽게 제 1 내부 챔버에 CM의 250 μL를 추가하고 최대 피펫합니다. </li><li> 전송 매체 같은 조건을 포함하고, 상하 피펫 팅을 반복하여 인접하는 필터 챔버에 세포를 재현 탁. </li><li> 단일 조건의 삽입 각각에 대해이 절차를 반복합니다. 수집 및 1.5 mL의 원심 분리기 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 남아있는 세포를 수집하는 CM의 추가로 100 ~ 200 μL 각 내부 챔버를 씻어. 단계 3.5에서 1.5 ML의 원심 분리기 튜브에 추가합니다. </li><li> 5 분 동안 4 ℃에서의 microcentrifuge 423 XG에 세포를 스핀. </li><li> 뜨는을 기음 1000 μL PBS로 한 번 세포 펠렛을 씻는다. </li><li> 5 분 동안 4 ° C에서의 microcentrifuge에서 423 XG에 다시 스핀. </li><li> 대기음 PBS하고 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 동결. </li></ol> 4. RNA 또는 DNA 분리에 대한 필터 처리 <ol&gt; <li> 내부 챔버를 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 추출 또는 유사 시약 200 μL를 첨가하고 잠시로 pipetting 아래로 막 표면에 세포를 교반한다. </li><li> 외부 챔버 건조한 실온에서 5 분간 추출 시약 부화. <ol><li> 필터 삽입로부터 해리되어 있으므로, 상하 추출 용액을 피펫 팅에 의해 해리 된 여과막을 씻는다. 6 웰 플레이트를 기울 남아있는 액체를 흡입하여 가능한 한 추출 시약의 정도를 수집합니다. </li></ol></li><li> 정화 및 DNA, RNA 또는 단백질의 복구를 위해 제조 업체의 프로토콜을 따르십시오. </li></ol> 5. 단백질 분리를위한 필터 처리 <ol><li> 얼음의 6 웰 플레이트에서 필터 인서트를 놓습니다. 상기 내부 챔버에 10 μL 1 mM의 불소화 나트륨 (NaF로부터), 1 mM 나트륨 바나 데이트 (NAV)를 100mM dithiothre 보충 된 단백질을 용해 완충액으로 추가itol (DTT) 및 안티 단백질 분해 효소 칵테일의 100 μL. </li><li> / 교반로 pipetting 상하 동안 20 μL 피펫 막 표면에서 세포를 긁어. 용해 버퍼에 거품을 생성하지 마십시오. </li><li> 10 분 동안 얼음에 필터 삽입과 6 웰 플레이트를 품어. </li><li> 스크래핑 반복 한 후 용해 완충액으로 막 표면을 헹군다. </li><li> 6 삽입에서 해물을 수집하고 얼음에 1.5 mL의 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 다음 필터 용해 완충액과 전사의 추가 10 μL와 제 막을 씻어. </li><li> 모든 삽입 단계를 반복 5.6, 잔류 용해 완충 용액을 수집하고 1.5 mL의 튜브 (단계 5.5)에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 추가로 5 분 동안 얼음에 샘플을 품어. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 최대 속도 (테이블 탑 원심 분리기에서 16,873 XG)에서 스핀. </li><li> 신선한 1.5 ML의 튜브에 피펫 해물 상청. </li><li> 단백질 농도 또는 석재의 분석을 진행-80 ° C에서 해물을 다시. </li></ol> H &amp; E 및 면역 염색 6. 처리 <ol><li> 내부 및 외부 챔버에 500 μL 10 %의 1 mL의 NBF (중성 완충 포르말린)를 추가하고 4 ℃에서 하룻밤 배양 할 수 있습니다. </li><li> 외부 챔버에서 NBF를 대기음 1 ML의 히드 록시 에틸 아가로 오스 (HEA) 1.5 mL를 원심 분리기로 처리 겔을 추가합니다. 천천히 낮은 전력을 사용하여 전자 레인지에 아가로 오스를 용융 아가로 오스가 용해 될 때까지 10 ~ 20의 펄스를 반복했다. </li><li> 사용할 준비가 될 때까지의 응고를 방지하기 위해 37 ℃ 온욕 중에서 HEA 유지. </li><li> 내부 챔버에서 NBF를 제거하고 내부 챔버에 용융 HEA의 25 μL를 적용하고 아가로 오스는 2-5 분 동안 응고 할 수 있습니다. </li><li> 10 % NBF 젖은 2 거품 조직학 패드 (그림 3D 참조) 포함 카세트에 하나의 패드를 배치합니다. </li><li> 삽입의 바닥면에서 필터를 점수 (매우 날카로운, 미세 뾰족한 날이있는)을 # 11 블레이드 메스를 사용하여챔버는 부분적으로 플라스틱 삽입 챔버에서 방출. </li><li> 페트리 접시에 NBF 소량 (100 ~ 200 μL)를 놓고 NBF (그림 3A)에서 부분적으로 벗겨져 필터를 체험. </li><li> A # 10 메스 블레이드 부드럽게 완전히 삽입 배럴 (도 3b)로부터 필터를 꺼 내려 삽입 챔버의 내부에서, 상기 필터의 중앙에 대해 누른다. 여전히 배럴에 부착 된 필터의 어느 부분이 있으면, 메스로 절단. </li><li> # 10 블레이드 메스 (그림 3C)와 함께 반으로 HEA 코팅 필터를 잘라. </li><li> 단계 6.4 (그림 3D)에서 제조 한 조직학 카세트의 폼 패드에 필터의 각각의 절반을 놓습니다. </li><li> 필터를 사이에두고, 카세트에 두 번째 10 % NBF 적신 스폰지를 추가합니다. </li><li> 스냅 NBF에서 카세트, 장소를 밀봉하고, 밤새 품어. </li><li> 단면 처리 및 염색 등을위한 파라핀 블록으로 처리 필터이전 12 설명했다. </li></ol>

<ol><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li>
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<li>Signoretti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+is+a+prostate+basal+cell+marker+and+is+required+for+prostate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development.</a> Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).</li>
<li>Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).</li>
<li>Ringer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+the+p53+tumor+suppressor+protein+bridges+the+apoptotic+and+autophagic+signaling+pathways+to+regulate+cell+death+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).</li>
<li>Pollock, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strigolactone+analogues+induce+apoptosis+through+activation+of+p38+and+the+stress+response+pathway+in+cancer+cell+lines+and+in+conditionally+reprogrammed+primary+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).</li>
<li>Crogliom, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26910887">Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Drug+Testing+of+Patient-derived+Conditionally+Reprogrammed+Cells+from+Castration-resistant+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer.</a> Eur Urol. , (2016).</li>
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<li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> J Vis Exp. (99), e52868(2015).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li>
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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

일차 세포주 암 연구의 중요하고 빠르게 개발 플랫폼이다. 배양 인서트 기반 3 차원 배양 시스템은 2 주 기간 내에 기본 전립선 CRC로의 분화를 지원한다. 상기 CRC 필터 방법은 전립선 연구를위한 새로운 중간 처리량 방법을 나타낸다. 기존 마우스 PDX 모델은 시간 소모적이며 매우 비싸고, 상기 PDX 샘플의 많은 연구자 시작한 실험과 그 유용성을 제한 배양에서 성장 될 수 없다. PDX 확립의 성공률을 크게 13 다르지만 또한, 상기 CRC 방법은 세 세포주를 확립하는데 성공의 높은 비율을 갖는다. 우리는 우리의 시스템은 R-spondin 기반 전립선 organoid 접근 방식을 보완 할 생각; 그러나, 차 전립선 암 organoids의 설정에 관해서 성공의 부족 (14)에보고되었다. 또한, 미디어, 설치 방법,과의 CRC의 유지 보수는 R-spondin 기반 전립선 organoid 접근 방식보...

개인에게 개인화 된 식별 및 암 치료의 사용은 암 연구의 주요 목표입니다. 최근, 새로운 접근법은 잠재적 모두 파악하고 맞춤형 치료를 테스트하는 방법을 제공하는 일차 세포 배양 확립 더 큰 용이성을 허용 개발되었다. 예를 들어, R-spondin 기반 전립선 organoid 접근법 1 허용 상용 외 매트릭스에서 정상 및 전이성 전립선 암 세포의 3 차원 배양 (예, 마트 리겔)에 대한 세포의 조건부 재 프로그래밍 (CRC) 법 반면 조지 타운 2에서 개발, 3 개 표준 2 차원 배양 조건을 사용한다. 구체적으로는, Rho 키나아제 억제제 (Y-27632) 및 조사 J2 뮤린 섬유 모세포 피더 세포의 결합은 각질 세포의 CRC가이 부정 배양 이어질. 상기 CRC 방법은매우 강력한 일차 전지 라인이 성공적으로 설립 전립선 및 기타 여러 정상 및 악성 상피 조직 (3)로부터 무기한 유지와 함께. 중요한 것은, 우리의 CRC 기술은 이전의 약물 치료의 숫자를 실패한 환자에서 재발 성 호흡기 유두종의 병인으로의 신속한 식별을 허용했다. 또한, 정상 및 종양 유래의 CRC를 사용하여, FDA의 성공적인 식별 초기 조직 생검의 2 주 이내에되었다, vorinostat을 약물을 승인했다. 환자들은 질환 (4)의 성공적인 치료 결과 vorinostat에 넣었다. 정상적인 전립선은 내강, 기초 및 희귀 신경 내분비 세포 (5)으로 구성되어 있습니다. 내강 세포 선의 원주 상피 층을 형성하고, 안드로겐 수용체 (AR),뿐만 아니라 8 및 18 cytokeratins 친 다른 내강 마커를 발현국가 특이 항원 (PSA) 6. 역으로, 기저 세포 내강 층 아래에 지역화 및 사이토 케라틴 5 P63 있지만, AR (5)의 낮은 레벨을 표현한다. 우리는 7, 8, 9, 10 등을 성공적 임상 약물 역학적 감도 연구에서 전립선의 CRC를 사용했다. 2D 표준 조직 배양 조건 하에서 성장 된 경우에는, 이들 세포가 완전히 열 신호 AR 맞물린 못한다. 면역 결핍 쥐의 신장 캡슐 아래에 위치 할 때 중요한 점은 CRC가이 허용 환경에 배치 할 때 전립선 CRC가 자신의 혈통의 의지를 유지할 것을 나타내는 정상 전립선 선의 구조와 기능을 회복했습니다. 여기에 설명 된 필터 인서트 계 세포 배양 시스템의 개발이 급속 (2 주)를위한 증명 B와 같은 전립선의 CRC의 체외 분화를 허용Y 증가 아칸소와 AR 대상 유전자의 발현도 감소 등의 P63 수준. 사용되는 필터 삽입은 포유 동물 세포의 배양을지지 할 수 카보네이트 멤브레인 (기공 크기 0.4 ㎛의)을 포함한다. 시스템이 개발로, 정상 및 악성 전립선 CRC로 6 웰 배양 접시 필터 인서트를 사용한다. J2 전지 (11)에 의해 조절 된 세포 배지는 상부 챔버 하부 측실 전립선 분화 배지에서 배치된다. 기술은 본원 맞춤 의학의 목적과 일치하는 2 주 기간 내에 전립선 내강 세포 분화를 지원 설명한다. 문화의 포괄적 인 분자 유전 학적 및 세포 프로파일을 허용 방법론을 개발하는 것이 필수적이었다. 필터 표면으로부터 방출 세포에서 DNA, RNA 및 단백질을 분리하는 방법을 개발하고 정확한 반복 시료 처리 간소화되었다. FINA에서야 베드로, 방법론은 H &amp; E, 면역 조직 화학 및 면역 형광 염색, 삽입을 사용할 수 있도록 필터를 제거 절편과 필요한 완전히 설명되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>코닝 Costar Snapwell 배양 인서트</td><td>Corning</td><td>3801</td><td></td></tr><tr><td>밀리셀 세포 배양 인서트</td><td>Millipore</td><td>PIHP01250</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6 웰</td><td>팔콘</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴 0.1 % 물</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>멸균 안전 Scapel 10 블레이드</td><td>Integra Miltex</td><td>4-510</td><td></td></tr><tr><td>멸균 표준 메스 11 블레이드</td><td>Integra Miltex</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 용해 및 추출 버퍼</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>불화나트륨</td><td>Fishcer Scientific</td><td>S299-100</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 바나데이트</td><td>Fishcer Scientific</td><td>13721-39-6</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨</td><td>시그마-알드리치</td><td>3483123</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 (AEBSF, 아프로티닌, 베스타틴, E-64, 루펩틴 및 펩스타틴 A)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA (1x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>글루타민</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25030081& 주의;</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>F-12 영양소 혼합 매체</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 디하이드로클로라이드 암석 억제제</td><td>Enzo</td><td>ALX-270-333-M025</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손</td><td>시그마-알드리치</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>PHG0315</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>콜레라 독소</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3012</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264550</td><td></td></tr><tr><td>Trizol 시약</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Histogel 검체 처리 젤 ( 하이드록시에틸 아가로스(HEA))</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Non-Adherent Dressing</td><td>Telfa</td><td>KDL2132Z</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture</td><td>Dish Sigma</td><td>SIAL0167</td><td></td></tr><tr><td>HISTOSETTE II 조직 처리/임베딩 카세트</td><td>Crystalgen</td><td>CG-M492</td><td></td></tr></tbody></table>

기본 전립선 세포 분화에 대한 신속한 필터 삽입 기반의 3d 문화 시스템

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

조건부 재 프로그램 세포 (CRC가)는 차 세포 ​​배양 및 환자 유래 세포 라인의 광범위한 &quot;살아있는 바이오 뱅크&quot;를 개발 할 수있는 능력에 대한 지속 가능한 방법을 제공한다. 상피 세포의 많은 유형의 다양한 삼차원 (3D) 배양 방법은 개선 된 분화 상태를 지원하는 것을 설명 하였다. CRC가 그들이 절연되어있는 조직에 자신의 혈통의 의지를 유지하는 동안, 그들은 보통 두 개의 차원 (2D) 배양 조건 하에서 성장하는 경우 원산지의 조직과 관련된 분화 마커의 많은 표현하지 못한다. 전립선 암 연구 환자 유래의 CRC의 적용을 강화하기 위해, 3 차원 배양 포맷은 정상 및 종양 유래 전립선 상피 세포 모두에서 급속한 (2 주 전체) 내강 세포 분화를 가능하게한다는 정의되었다. 여기서, 필터 삽입 기반 포맷은 정상 및 악성 전립선 CRC가 양자의 배양과 분화를 위해 설명된다. 드면역 조직 화학 및 면역 형광 염색 세포 수집 및 처리에 필요한 절차 꼬리 설명이 제공됩니다. 총체적으로 기본 CRC 라인과 함께 설명 된 3D 배양 형식은 biospecimen 기반 전립선 연구 처리량 모델 시스템을 릅니 중요한 중간을 제공한다.

세포 배양 인서트 기반 시스템 내강 세포 분화를 지원 전립선 CRC가 3 차원 배양 물을 제조하기위한 상대적으로 간단하고 신속한 방법이다. 시스템의 개략적 필터 인서트의 바닥면에 젤라틴 코팅의 적용을 강조 (도 1A)를 나타낸다. 삽입물은 젤라틴의 적용 번복된다. 도 1b에 필터는 배양에 적절한 방향이다. 투명 셀 인서트를 사용하여 3 차원 전립선 건강 CRC 문화의 대표 이미지 (10X) (도 2)를 나타낸다. 시연 건강의 CRC의 밀도 레이어는 설립 후 전형적인 표준 광학 현미경을 사용하여 시각 될 수있다. 초기 설정 동안, 상기 방법은 특정 세포주와 호환되도록 형성 세포의 층과 적절한 부착 라 시각화 중요세포의 에링가 발생했습니다. 위에서 설명한 바와 같이 HEA는...

여기에서는 일차 전립선 상피 세포의 3차원 배양 및 후속 내강 분화를 지원하는 신속한 체외 시스템을 구축하는 방법을 제시합니다.

기본 전립선 세포 분화에 대한 신속한 필터 삽입 기반의 3D 문화 시스템

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

환자 유래 일차 세포를 위한 이 필터 인서트 기반 3D 배양 시스템의 전반적인 목표는 전립선암 연구를 위해 생물학적으로 더 관련성이 높은 체외 모델 시스템을 구축하는 것입니다. 일차 인간 세포를 사용함으로써, 이 방법은 전립선 암뿐만 아니라 전립선 발달 생물학의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 분화된 일차 전립선 세포를 구축하기 위한 비교적 빠른 체외 방법론이라는 점이며, RNA, DNA 및 단백질과 같은 생체 분자를 신속하게 분리할 수 있다는 것입니다.필터 인서트 상의 세포를 조직학적 분석이나 RNA 및 단백질 수집을 위해 처리하는 과정은 매우 섬세하며 시간에 민감하므로, 이러한 방법들에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 생물학적 안전 작업대 내에서 챔버 간의 확산을 제한하려면, 인서트 바닥면에 0.1% gelatin을 얇게 도포하고 건조시키십시오. 이 과정을 두 번 더 반복하십시오.그런 다음 젤라틴이 코팅된 인서트의 내부 챔버에 세포를 도포하고 최대 2주 동안 배양합니다. 2주 후, 배양된 필터 인서트를 아래에 상세히 설명된 적절한 하위 응용 단계에 직접 적용합니다. 이 절차를 시작하려면 외부 챔버에서 PBS를 흡입하고 내부 챔버에서 PBS를 조심스럽게 제거하십시오.배양된 인서트는 준비가 완료될 때까지 PBS에 잠시 보관할 수 있으나, 멤브레인이 마르지 않도록 주의하십시오. 다음으로 각 내부 챔버에 0.25%Trypsin EDTA 100 µL를 첨가합니다. 그런 다음 37 °C에서 5분 동안 배양합니다.그 후, 200 µL 피펫을 사용하여 피펫팅을 반복하면서 멤브레인 표면의 세포들을 짧고 조심스럽게 긁어냅니다. 그런 다음 37 °C에서 1분 동안 배양합니다. 1분 후에 첫 번째 내부 챔버에 250 µL의 조건화 배지를 추가하고, 필터를 헹구기 위해 부드럽게 피펫팅을 반복합니다.이전 작업 후, 동일한 배지 조건이 포함된 인접한 필터 챔버로 재현탁된 세포를 옮기고 피펫팅을 반복합니다. 단일 조건의 각 인서트에 대해 이 절차를 반복합니다. 그런 다음 세포를 수집하여 1.5 milliliter 원심 분리 튜브로 옮깁니다.각 내부 챔버를 conditioned media 100 내지 200 µL로 추가로 헹구어 남아 있는 세포를 모두 수집하고, 이를 1.5 mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 다음으로 4 °C에서 5분 동안 마이크로원심분리기로 세포를 원심분리합니다. 그 후 상층액을 흡입하여 제거하고 세포 펠렛을 PBS 1,000 µL로 한 번 세척합니다.세포를 마이크로원심분리기로 4°C에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 5분 후 PBS를 흡입하여 제거하고, 나중에 사용하기 위해 샘플을 -80°C에서 냉동 보관합니다. 이 과정에서 guanidinium thiocyanate phenol chloroform 또는 유사한 추출 시약을 200 µL 내부 챔버에 넣고, 피펫팅을 통해 멤브레인 표면의 세포를 짧게 교반합니다.그 다음 추출 시약을 사용하여 세포를 실온에서 5분 동안 배양하고 외곽 챔버는 건조한 상태로 둡니다. 이후 추출액을 파이펫으로 위아래로 섞어 필터 막을 세척합니다. 6-웰 플레이트를 기울여 잔류 액체를 흡입함으로써 가능한 한 많은 양의 추출 시약을 수집합니다.필터가 인서트에서 분리될 수 있으니 주의하십시오. 분리된 필터 막이 부착되어 있다면 세척하십시오. 그 다음 추출 시약을 가능한 한 많이 수집하고, DNA, RNA 또는 단백질의 정제 및 회복을 위해 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.과도한 교반은 RNA의 품질을 저하시킬 수 있으므로, guanidinium thiocyanate로 세포와 필터를 세척할 때 주의해야 합니다. 필터 인서트에서 단백질을 분리하려면, 필터 인서트를 6-웰 플레이트의 얼음 위에 놓으십시오. 그다음 내부 챔버에 10 µL의 단백질 용해 버퍼를 추가하십시오.20 µL 피펫으로 피펫팅을 반복하며 멤브레인 표면의 세포를 교반하고 긁어내되, 용해 버퍼(lysis buffer) 내에 기포가 생성되지 않도록 주의하십시오. 그 후, 필터 인서트가 포함된 6-웰 플레이트를 얼음 위에서 10분 동안 배양하십시오. 세포 긁어내기 과정을 반복한 다음, 용해 버퍼로 멤브레인 표면을 헹굽니다.6개 삽입물(insert)에서 용해물을 수집하여 얼음 위에 놓인 1.5 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그다음 첫 번째 막을 10 microliters의 용해 버퍼로 추가로 헹구고 다음 필터로 옮깁니다. 특정 실험 조건의 모든 삽입물에 대해 이 절차를 반복하며, 잔류 용해 버퍼 용액을 모두 수집하여 1.5 milliliter 튜브에 추가합니다.샘플을 얼음 위에서 5분 동안 추가로 배양합니다. 그런 다음 4°C에서 최대 속도로 15분 동안 원심 분리합니다. 완료되면 용해물을 새 1.5 mm 튜브에 피펫으로 옮깁니다.그 후 단백질 농도 분석을 진행하거나 용해물을 -80 °C에서 보관하십시오. 이 절차에서는 내부 및 외부 챔버에 각각 500 µL와 1 mL의 10% NBF를 첨가하십시오. 이를 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.다음 날 외곽 챔버에서 NBF를 흡입하고, 1.5 mL 원심분리 튜브에 HEA 처리 젤 1 mL를 넣습니다. 마이크로웨이브의 낮은 출력으로 10초 간격으로 반복해서 가열하여 아가로스가 녹을 때까지 천천히 녹입니다. 사용 전까지 응고를 방지하기 위해 HEA를 37 °C 온욕조에 보관하십시오.다음으로 내부 챔버에서 NBF를 제거합니다. 녹은 HEA 25 µL를 내부 챔버에 도포하고 아가로스가 2~5분 동안 굳도록 둡니다. 그런 다음 10% NBF에 포밍 조직학 패드 두 개를 적신 후, 패드 하나를 임베딩 카세트에 넣습니다.HistoGel을 사용하여 필터 인서트 상의 세포층 무결성을 보호하는 것은 조직 절편 제작을 위해 온전한 세포층을 보존하는 매우 중요한 단계입니다. 그 후, 11번 메스 날을 사용하여 플라스틱 인서트 챔버의 바닥면에서 필터에 흠집을 내어 부분적으로 분리합니다. 페트리 접시에 NBF 100-200 µL를 넣고, 부분적으로 분리된 필터를 NBF에 담급니다.10번 메스 날을 사용하여 인서트 챔버 내부에서 필터 중앙을 부드럽게 눌러 필터를 인서트 배럴에서 완전히 분리합니다. 필터의 일부가 여전히 배럴에 붙어 있는 경우, 메스로 이를 절단합니다. 그 후 HEA 코팅 필터를 반으로 자릅니다.준비된 조직학 카세트 내의 폼 패드 위에 필터의 각 절반을 놓습니다. 그런 다음 10% NBF에 적신 두 번째 스펀지를 카세트에 추가하여 필터를 사이에 끼웁니다. 마지막으로 카세트를 스냅 씰(snap seal)로 밀봉합니다.이를 NBF에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 이 명시야 이미지는 다공성 막 위에 형성된 다층 세포층을 보여줍니다. 핵, P63 및 안드로겐 수용체의 개별 형광 이미지와 세 가지 형광 마커를 모두 합성한 이미지가 표시됩니다.마지막으로 명시야와 면역형광 중첩 합성 이미지를 통해 세포 및 필터와 대비한 형광 신호의 위치를 확인합니다. 여기서는 온전한 전립선 DUCTAL 상피층과 비교한 필터 인서트의 단면 이미지를 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 2주 안에 완료할 수 있으며, 적절히 수행될 경우 세포와 필터 인서트 또는 원하는 생체 분자의 최종 분리에 30분 미만이 소요됩니다.이 절차를 수행하는 동안, 세포층이나 하단의 필터에 손상이 가지 않도록 필터 인서트를 다룰 때 항상 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 경로 분석 및 암세포와 관련된 추가적인 질문에 답하기 위해 Western blot, RNA 마이크로어레이 및 프로테옴 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 전립선암 분야의 연구자들이 일차 전립선 세포를 사용하여 전립선 생물학뿐만 아니라 전립선암의 근본 원인을 더 잘 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 이 3D 배양 시스템에서 배양된 일차 전립선 세포를 적절하게 설정하고 회수하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오에서는 매트릭스 겔링 기반 배양 기술을 사용하여 분리된 마우스 전립선 상피 세포를 배양하는 방법을 보여줍니다. 이 접근법은 유전적 또는 약리학적 조작에 반응하여 3D 선상 구조를 형성하기 위한 전립선 상피 세포의 분화 능력에 대한 보완적인 정보를 제공할 수 있습니다.

전립선 오가노이드 분석법(Prostate Organoid Assay): 전립선 상피 세포의 분화 능력을 연구하기 위한 매트릭스 겔 링 기반 생체 외 배양 기술

종양 미세환경(TME)을 모방하기 위해 투과성 미다공성 멤브레인 삽입물을 조정했습니다. 이 모델은 혼합 세포 배양으로 구성되며, 형광 태깅 또는 세포 분류를 사용하지 않고 고도로 농축된 개별 세포 집단을 간단하게 생성할 수 있으며, 정상 또는 스트레스 조건에서 TME 내 세포 간 통신을 연구할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

이 프로토콜 pluripotent 줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 생산 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하 여 성장 인자와 작은 분자의 조합 분화 줄기 세포의 미 숙 RPE로 14 일에 성숙, 기능 RPE 3 개월 후.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

유전자 조작된 생쥐 전립선 암 메커니즘을 조사를 위해 유용한 모델이 있습니다. 여기를 식별 하 고 마우스 비뇨 생식 기 시스템에서 전립선 엽 해 부, 조직학에 따라 구분 하 고 분리 다운스트림 분석에 대 한 spheroids로 기본 전립선 세포에는 생체 외에서 문화 프로토콜 선물이.

식별, 조직학 특성화 및 체 외 3D 회전 타원 체 문화 모델에 대 한 마우스 전립선 돌출부의 해 부

여기, 우리 인간의 기본 전립선 organoid 처리 안내 다음 끝점 표현 형을 평가 하는 것이 좋습니다 프로토콜을 제시. 시드, 문화 유지 보수, 매트릭스 젤에서 복구 형태 론 적 정량화, 포함 및 단면, FFPE 단면, 전체 마운트 얼룩, 및 상업적인 분석의 응용 프로그램 설명 합니다.

처리 및 인간의 기본 전립선 Organoid 문화에 대 한 평가

마우스 전립선 오르가노이드는 분화를 조절하는 메커니즘을 평가하는 유망한 맥락을 나타낸다. 이 논문은 전립선 오르가노이드를 확립하기 위한 개선된 접근법을 설명하고, (1) 오르가노이드로부터 단백질 용해액을 수집하고, (2) 전체 마운트 공초점 현미경검사법에 대한 수정 및 얼룩 오르가노이드를 수집하는 방법을 소개합니다.

유기체 배양을 사용하여 마우스 전립선 상피 세포의 분화 능력 평가

여기에 제시된 것은 전립선 상피 오르가노이드의 약리학적 반응을 연구하는 프로토콜이다. 오르가노이드는 생체 생물학과 밀접하게 유사하며 환자 유전학을 재현하여 매력적인 모델 시스템을 만듭니다. 전립선 오르가노이드는 야생형 전립선, 유전자 조작 마우스 모델, 양성 인간 조직 및 고급 전립선암에서 확립될 수 있습니다.

약리학적 반응에 유전형과 돌연변이 단면도를 번역하는 공구로 전립선 오르가노이드 문화

인간의 1차 전립선 상피 세포를 사용하여, 우리는 스페로이드 기반 의 라벨 보유 분석법에 의해 줄기 유사 세포의 기능적 특성화의 새로운 바이오마커 없는 방법을 보고합니다. BrdU, CFSE, 또는 파 레드 2D 셀 라벨링에 대해 단계별 프로토콜이 기재되어; 3 차원 스페로이드 형성; 면역 세포 화학에 의한 라벨-유지 줄기 유사 세포 식별; 및 FACS에 의해 격리.

3차원 스페로이드 배양에서 줄기와 같은 세포의 분리

이 프로토콜은 인간 혈액-뇌 장벽(BBB) 시험관내 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 내피 세포와 혈관주위세포는 삽입 필터의 양쪽(혈액 구획)에 파종되고 성상세포는 하단 웰(뇌 구획)에 파종됩니다. 상기 모델 특성화는 나노입자 수송 실험에 사용되었다.

인간 혈액-뇌 장벽을 모델링하는 삼중 배양 세포 시스템

이 논문에서는 새로 설계된 3D 프린팅 인서트를 공동 배양 모델로 제시하고 내피 세포와 각질 세포 사이의 측분비 세포 간 통신 연구를 통해 검증합니다.

간단한 2D 및 3D 세포 배양이 가능하도록 설계된 혁신적인 3D 프린팅 인서트

이 프로토콜은 근치적 전립선 절제술에서 섬유아세포를 분리, 확장 및 불멸화하기 위한 포괄적인 절차를 제공합니다. 또한, 섬유아세포-종양 세포 누화의 기능적 효과를 평가하기 위해 개발된 분석법을 설명하며, 조건화된 배지를 사용한 치료와 공동 배양을 모두 활용합니다.

전립선암 관련 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

배우세요 필터 삽입 기반 3D 배양 시스템을 이용한 전립선암 연구를 위한 환자 유래 원발성 전립선 상피세포의 신속한 분화 및 생물분자 분리 방법. 이 기법은 생물학적으로 관련성 높은 체외 모델을 제공합니다.

기본 전립선 세포 분화에 대한 신속한 필터 삽입 기반의 3D 문화 시스템

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