방법은 3D로 재배 원주민 소장과 카코 2 세포에서 상피 전송 단백질의 기능과 발현을 연구하는

본 프로토콜의 전반적인 목표는 장 Caco-2 세포를 3차원으로 배양하고, 세로토닌 운반체 조절 연구에서 Ussing chamber의 활용법을 입증하는 것입니다. 여기에 제시된 방법들은 장 세로토닌 운반체인 SERT가 어떻게 조절되는지와 같은 상피 운반 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 제시할 수 있습니다. 3D Caco-2 배양의 주요 장점은 단층 배양보다 세포 간 상호작용 및 세포와 세포외 기질 간의 상호작용을 더 정확하게 반영한다는 점입니다.

또한 Ussing chamber 기술을 통해 장 상피의 수송 기능을 정밀하게 측정할 수 있습니다. 3D Caco 배양의 의의는 이러한 모델을 통해 수송 기능 변화와 관련된 질환에 대한 약물 스크리닝이 가능하므로 치료제 발견으로 확장될 수 있다는 점에 있습니다. 이 방법은 세로토닌 수송체 조절에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 나트륨 및 염화물과 같은 다른 전해질 수송체 연구에도 적용될 수 있습니다.

장막근층을 제거하고 장점막을 Ussing chamber에 장착하는 과정은 습득하기 어렵기 때문에, 이러한 기술들에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 3D Caco-2 세포 실험 절차는 지도 강사인 Ishita Chatterjee와 저희 그룹의 박사후 연구원인 Anoop Kumar가 시연할 것입니다. 마우스 회장에서 장막근층을 제거하는 과정은 제 연구실의 선임 연구 전문가인 Sangeeta Tyagi가 시연할 예정입니다.

또한 제 실험실의 강사들인 Shubha Priyamvada와 Arivarasu Natarajan이 박리된 점막의 장착과 Ussing chamber 삽입 과정을 시연할 것입니다. 먼저, 성장 인자가 제거된 젤라틴성 단백질 용액을 4°C 냉장고에서 얼음 위에 올려 하룻밤 동안 해동하십시오. 해동이 완료되면, 1 mL 또는 500 µL씩 분주하여 준비하십시오.

배양 당일에 챔버 슬라이드를 얼음 위에서 사전 냉각합니다. 그런 다음, 8-웰 챔버 글라스 슬라이드의 각 웰에 젤라틴성 단백질 용액 30 µL를 첨가하고 고르게 펴 바릅니다. 챔버 슬라이드나 플레이트에 젤라틴 혼합물을 플레이팅할 때, 세포가 탈락할 수 있으므로 기포가 형성되지 않도록 주의해야 합니다.

용액이 응고될 수 있도록 배양 접시를 37 °C 세포 배양 인큐베이터에 15분에서 30분 동안 넣어둡니다. 다음으로, trypsin을 사용하여 배양 플라스크에서 합류된 Caco-2 세포를 분리합니다. 그 후, 혈구계수기로 세포 수를 측정하고 4 °C에서 500 ×g로 5분 동안 원심 분리합니다.

결과물인 세포 펠릿을 3D Caco-2 배지로 다시 현탁하여 원하는 밀도의 현탁액을 얻습니다. 준비된 세포 현탁액을 사용하여 유리 챔버 슬라이드의 웰당 4,000개의 세포를 분주하고, 37 °C의 5% carbon dioxide 습윤 배양기에서 12~14일 동안 배양합니다. 세포를 염색하려면 먼저 배지를 흡입하여 제거하고 400 µL의 2% PFA로 세포를 고정합니다.

상온에서 20분 동안 세포 고정을 계속합니다. PBS로 세포를 두 번 세척한 후, PBS에 희석된 0.5% Triton 용액으로 15분 이내로 투과화합니다. PBS glycine 버퍼로 세포를 두 번 헹군 다음, 투과화된 세포를 상온에서 IF 버퍼로 10분 동안 세척합니다.

IF 버퍼에 5% normal goat serum을 첨가하여 세포를 블로킹합니다. 그 다음, 1% goat serum이 보충된 IF 버퍼로 희석한 1차 항체 200 microliters를 처리하여 상온에서 1~2시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후, IF 버퍼로 세포를 3회 세척합니다.

세척된 세포를 1% goat serum이 첨가된 IF buffer에 희석한 2차 항체 200 microliters와 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다. IF buffer로 세포를 10분씩 3회 세척합니다. 유리 슬라이드의 챔버를 분리하려면, 먼저 슬라이드를 슬라이드 베이스 홀더에 놓고, 화이트 리프터를 홀더를 통해 웰의 가장자리에 닿을 때까지 밀어 넣으십시오.

챔버를 조심스럽게 당겨 슬라이드에서 제거합니다. 빛으로부터 슬라이드를 보호하기 위해 덮개가 있는 검은색 상자를 사용하십시오. 슬라이드에 slow anti-fade medium을 도포하여 고정하고 커버슬립으로 덮습니다.

슬라이드를 상온에서 10분 동안 건조시킨 후, 이미징 전에 매니큐어로 밀봉합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 절차에 따라 마우스 회장(ileum)을 분리합니다. 그런 다음, 가위를 사용하여 장을 세로 방향으로 절개하여 엽니다.

결과물인 조직 절편을 1 µM indomethacin이 포함된 얼음처럼 차가운 gassing KBR buffer에서 10분 동안 배양합니다. 약 1 cm 길이의 장 절편을 점막면이 아래로 향하게 하여 0.5 cm 두께의 7% agarose 또는 경화된 silicone elastomer가 들어 있는 플레이트에 핀으로 고정합니다. 하단 조명이 있는 해부용 실체 현미경을 사용하여 장막근층을 제거합니다.

그런 다음, 페더 스칼펠 블레이드로 장막근층을 절개합니다. 미세 핀셋을 사용하여 장의 세로축을 따라 해당 층의 가장자리를 들어 올립니다. 마지막으로, 점막을 슬라이더의 핀 위에 조심스럽게 고정합니다.

조직이 찢어지는 것을 방지하기 위해 박리된 점막 조직의 가장자리를 잡으십시오. 슬라이더 핀에 박리된 회장 점막을 고정할 때는 핀 머리 부분에서 조직이 찢어지지 않도록 주의하고 조직 가장자리의 손상을 최소화해야 합니다. 조직 처리 전에 95% oxygen, 5% carbon dioxide 가스가 주입된 Krebs 용액을 준비하십시오.

그 다음, 용액을 Ussing chamber에 붓습니다. 장막측 욕조(serosal bath)에는 에너지 기질로 10 µM glucose를 추가하고, 점막측 욕조(mucosal bath)에는 삼투압 균형 유지를 위해 10 µM mannitol을 추가합니다. 이어서, 점막이 장착된 슬라이더를 chamber에 삽입하여 조직의 정단면(apical side)과 기저측면(basolateral side)이 모두 Krebs 용액에 노출되도록 합니다.

회장 조직을 배스(bath)에서 10분 동안 평형화합니다. 그다음, 점막측에서 장막측으로의 플럭스(flux)를 측정하기 위해 첨단면(apical side)을 10 µM fluoxetine으로 30분 동안 전처리합니다. 마지막으로, 조직의 기저외측(basolateral side)을 10 ng/mL TGF beta 1으로 1시간 동안 처리한 후, 첨단면을 20 nM tritiated 5-HT와 함께 30분 동안 배양합니다.

점막측에서 장막측으로의 플럭스 속도를 계산하려면, 장막측 저장조에서 0.75 milliliter의 분주액을 채취하고, 점막 양단에 정수압 차이가 발생하는 것을 방지하기 위해 이를 동일한 부피의 배양액으로 대체하십시오. 조직에 축적된 tritium 표지 5-HT를 정량화하려면, 슬라이더에서 점막을 제거하십시오. 이를 얼음처럼 차가운 KRB 버퍼로 한 번 세척한 후 유리 배양 튜브에 넣으십시오.

조직을 용해시키기 위해 점막을 0.5 milliliters의 10%KOH에 넣고 37 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그 후, 액체 섬광 계수기를 사용하여 용해물의 150 microliter 분주액을 3회 반복 측정하여 방사능을 측정합니다. Bradford법을 사용하여 용해물의 3~5 microliter 분주액에서 단백질 농도를 측정합니다.

여기에 제시된 것은 액틴으로 염색된 3D 배양 Caco-2 낭종과 액틴, 핵 및 SERT 단백질로 동시에 염색된 Caco-2 3D 낭종입니다. SERT는 루멘 막(luminal membrane)과 하정단 구획(subapical compartments)에서 관찰됩니다. 2D Caco-2 단층에 비해 Caco-2 3D 구체의 이점을 추가로 확인하기 위해 SERT 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였습니다.

결과에 따르면, 2D Caco-2 세포와 비교하여 Caco-2 3D 구체에서 SERT 단백질의 발현이 증가한 것으로 나타났습니다. 마지막으로, Ussing chamber 시스템을 사용하여 TGF beta가 점막측에서 장막측으로의 플럭스를 증가시킴을 보여주었으며, 이는 루미날 막에서의 5-HT 흡수 증가와 회장 점막에서 관찰된 5-HT 축적 증가를 반영합니다. 이러한 결과는 루미날 막의 SERT 발현에 상응하는 fluoxetine 처리에 따른 5-HT 흡수의 민감도 관찰을 통해 뒷받침됩니다.

숙련되면 회장 점막을 박리하고 장착하는 이 기술은 15분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 채택할 때, 동물로부터 적출된 장외 준비물은 생존 능력이 제한적이며 최대 3시간 동안 유지될 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 3D Caco-2 낭종은 막 수송 사건, 유전자 발현 또는 상피 수송체의 단백질-단백질 상호작용과 같은 다양한 연구에 활용될 수 있습니다.

3D Caco-2 기술은 개발 이후, 장관 수송 분야의 연구자들이 유체 이동을 탐구하고 장 질환의 병태생리학을 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 방사성 물질을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, PPE(개인 보호 장구) 착용 및 적절한 제염 절차와 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 유념하십시오. 이 영상을 시청하고 나면 Caco-2 세포를 3D 배양으로 성장시키고, 이러한 배양물을 활용하여 상피 수송체 발현을 조사할 수 있게 될 것입니다.

또한 Ussing chamber를 사용하여 생체 내 마우스 장 내의 세로토닌 수송 기능을 연구할 수 있습니다.