방법은 3D로 재배 원주민 소장과 카코 2 세포에서 상피 전송 단백질의 기능과 발현을 연구하는

이 프로토콜의 전반적인 목표는 장 Caco-2 세포를 3차원으로 성장시키고 세로토닌 수송체 조절에 대한 연구에서 Ussing 챔버의 사용을 입증하는 것입니다. 여기에 표시된 방법은 장 세로토닌 수송체, SERT가 어떻게 조절되는지와 같은 상피 수송 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 3D Caco-2의 주요 장점은 단층보다 세포 간 및 세포 간 기질 상호 작용을 더 정확하게 반영한다는 것입니다.

또한 Ussing 챔버 기술을 사용하면 장 상피의 수송 기능을 정밀하게 측정할 수 있습니다. 3D, Caco 배양의 의미는 이러한 모델을 통해 변경된 수송 기능과 관련된 질병에 대한 병원체를 스크리닝할 수 있기 때문에 치료법 발견으로 확장됩니다. 이 방법은 세로토닌 수송체 조절에 대한 통찰력을 제공하지만 나트륨 및 염화물과 같은 다른 전해질 수송체 연구에도 적용할 수 있습니다.

이러한 기술을 시각적으로 시연하는 것은 매우 중요한데, 혈청근층을 벗겨내고 장 점막을 Ussing chamber에 장착하는 것은 배우기 어렵기 때문입니다. 3D Caco-2 세포 절차를 시연하는 것은 강사인 Ishita Chatterjee와 우리 그룹의 박사후 연구원인 Anoop Kumar가 맡을 것입니다. 쥐 회장에서 혈청근층이 벗겨지는 것을 시연하는 것은 제 연구실의 선임 연구 전문가인 Sangeeta Tyagi가 시연할 것입니다.

또한 벗겨진 점막을 장착하고 Ussing 챔버에 삽입하는 방법을 시연하는 것은 제 연구실의 강사인 Shubha Priyamvada와 Arivarasu Natarajan이 할 것입니다. 먼저 성장 인자 감소 젤라틴 단백질 용액을 섭씨 4도의 냉장고에서 얼음으로 하룻밤 동안 해동합니다. 해동되면 1ml 또는 500마이크로리터 부분 표본을 준비합니다.

문화의 날에는 얼음 위에서 챔버 슬라이드를 예열하십시오. 그런 다음 30마이크로리터의 젤라틴 단백질 용액을 8웰 챔버 유리 슬라이드의 각 웰에 넣고 고르게 펴 바릅니다. 챔버 슬라이드 또는 플레이트에 젤라틴 혼합물을 도금하는 동안 세포가 분리될 수 있으므로 기포 형성을 방지하기 위해 주의해야 합니다.

배양된 접시를 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에 15-30분 동안 넣어 용액이 응고되도록 합니다. 다음으로, 트립신을 사용하여 배양 플라스크에서 confluent Caco-2 세포를 분리합니다. 그런 다음 혈구계에서 세포를 세고 섭씨 4도에서 5분 동안 500배 g으로 원심분리합니다.

생성된 세포 펠릿을 3D Caco-2 배지에 다시 현탁시켜 원하는 밀도의 현탁액을 얻습니다. 준비된 세포 현탁액을 사용하여 유리 챔버 슬라이드에 웰 당 4, 000 개의 세포를 시드하고 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 12-14 일 동안 성장하도록합니다. 세포를 염색하려면 먼저 배지를 흡인하고 400 마이크로 리터의 2 % PFA로 세포를 고정하십시오.

실온에서 20분 동안 셀을 계속 고정합니다. PBS에서 세포를 두 번 세척한 후, 15분 이상 PBS에서 0.5%Triton 용액으로 세포를 투과화합니다. PBS 글리신 완충액에서 세포를 두 번 헹군 다음 실온에서 10분 동안 IF 완충액에서 투과화된 세포를 세척합니다.

IF buffer에 5%normal goat serum을 사용하여 세포를 차단합니다. 그런 다음 1% 염소 혈청이 보충된 IF 완충액에 희석된 200마이크로리터의 1차 항체로 실온에서 1-2시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 IF 완충액으로 세포를 세 번 세척합니다.

세척된 세포를 1% 염소 혈청이 보충된 IF 완충액에 희석한 200마이크로리터의 2차 항체로 실온에서 1시간 동안 배양합니다. IF 버퍼로 셀을 10분 동안 세 번 세척합니다. 유리 슬라이드용 챔버를 분리하려면 먼저 슬라이드를 슬라이드 베이스 홀더에 놓은 다음 흰색 리프터가 웰 가장자리에 닿을 때까지 홀더를 통해 밀어 넣습니다.

챔버를 부드럽게 당겨 슬라이드에서 제거합니다. 덮개를 씌운 블랙 박스를 사용하여 슬라이드를 빛으로부터 보호하십시오. 느린 페이드 방지 매체로 슬라이드를 장착하고 커버 슬립으로 덮습니다.

슬라이드를 실온에서 10분 동안 건조시킨 후 이미징하기 전에 매니큐어로 밀봉합니다. text protocol에 설명된 절차에 따라 마우스 회장을 분리합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 장을 세로로 엽니다.

생성된 조직 절편을 1마이크로몰 인도메타신이 포함된 얼음처럼 차가운 가스 주입 KBR 완충액에 10분 동안 배양합니다. 약 1cm 길이의 장 부분을 점막 쪽이 아래로 향하게 하여 0.5cm 두께의 7% 아가로스 또는 경화된 실리콘 엘라스토머가 들어 있는 플레이트에 고정합니다. 바닥 조명이 있는 해부 실체 현미경을 사용하여 혈청근층을 벗겨냅니다.

그런 다음 깃털 메스 칼날로 혈청 근육 층을 자릅니다. 가는 집게를 사용하여 장의 세로축을 따라 층의 가장자리를 들어 올립니다. 마지막으로 슬라이더의 핀에 점막을 조심스럽게 장착합니다.

벗겨진 점막 조직의 가장자리를 잡고 찢어지지 않도록 합니다. 벗겨진 장골 점막을 슬라이더의 핀에 장착하는 동안 핀 머리에서 조직이 찢어지는 것을 방지하고 조직의 가장자리 손상을 최소화하기 위해 예방 조치를 취해야 합니다. 조직 치료 전에 95%의 산소, 5%의 이산화탄소로 가스화된 크렙스 용액을 준비합니다.

그런 다음 용액을 Ussing 챔버에 붓습니다. 10 micromol glucose를 serosal bath에 에너지 기질로 추가하고 10 micromolar mannitol을 추가하여 점막 bath에 삼투압 균형을 유지합니다. 그런 다음 점막이 장착된 슬라이더를 챔버에 삽입하여 조직의 정점 및 기저측 측면을 모두 Krebs 용액에 노출시킵니다.

10분 동안 욕조에서 회장 조직을 평형화시킵니다. 그런 다음 점막에서 혈청 플럭스를 측정하기 위해 10마이크로몰 플루옥세틴으로 정점 쪽을 30분 동안 전처리합니다. 최종적으로, 조직의 기저측 측을 1시간 동안 밀리리터당 10나노그램 TGF 베타 1로 치료한 다음 정점 측을 20나노몰 삼중체 5-HT로 30분 동안 배양합니다.

점막에서 혈청으로의 유속 속도를 계산하려면 혈청 저장소에서 0.75ml의 분취량을 수집하고 동일한 부피의 수조 매체로 대체하여 점막 전체의 정수압 차이를 방지합니다. 조직에 축적된 삼중화 5-HT를 정량화하려면 슬라이더에서 점막을 제거합니다. 얼음처럼 차가운 KRB 버퍼로 한 번 씻고 유리 배양 튜브에 넣습니다.

조직을 용해시키기 위해 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 0.5ml의 10%KOH로 점막을 배양합니다. 그런 다음 액체 섬광 계수기를 사용하여 용해물의 150마이크로리터 분취량에서 방사능을 3회 측정합니다. Bradford 방법을 사용하여 3-5마이크로리터의 분취액에서 용해물의 단백질 농도를 측정합니다.

다음은 액틴으로 염색된 3D 배양에서 성장한 Caco-2 낭종과 액틴, 핵 및 SERT 단백질에 대해 동시에 염색된 Caco-2 3D 낭종입니다. SERT는 내강막(luminal membrane)과 치근단 아래 구획(subapical compartments)에서 볼 수 있습니다. 2D Caco-2 단층에 비해 Caco-2 3D 구의 장점을 추가로 확인하기 위해 SERT 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 수행했습니다.

그 결과 2D Caco-2 세포와 비교하여 Caco-2 3D 구에서 SERT 단백질의 발현이 향상되었음을 보여주었습니다. 마지막으로, TGF 베타가 점막에서 혈청 플럭스로 증가한다는 것을 보여주기 위해 Ussing 챔버 시스템을 사용하여 내강막에서 5-HT 흡수 증가와 회장 점막에서 관찰된 향상된 5-HT 축적을 반영했습니다. 이러한 발견은 내강막의 SERT 발현에 해당하는 플루옥세틴 처리에 대한 5-HT 흡수의 관찰된 민감도에 의해 뒷받침됩니다.

회장 점막을 벗겨내고 장착하는 이 기술을 숙달하면 15분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 채택하는 동안, 동물에서 제거할 때 extravio 장 제제는 생존력이 제한되어 있으며 최대 3시간 동안 지속될 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 3D Caco-2 낭종은 막 수송 이벤트, 유전자 발현 또는 상피 수송체의 단백질-단백질 상호 작용과 같은 다양한 연구에 활용될 수 있습니다.

3D Caco-2 기법은 개발 후 장 수송 분야의 연구자들이 유체 이동을 탐구하고 다리알 질환의 병태생리학을 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 방사능을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로 항상 PPE 사용 및 적절한 오염 제거 절차와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 이 동영상을 시청하면 3D 배양에서 Caco-2 세포를 성장시키고 이러한 배양을 활용하여 상피 수송체 발현을 조사할 수 있습니다.

또한 Ussing 챔버를 활용하여 네이티브 마우스 장에서 세로토닌 수송 기능을 연구할 수 있습니다.