Name: 방법은 3D로 재배 원주민 소장과 카코 2 세포에서 상피 전송 단백질의 기능과 발현을 연구하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 배우세요 3D Caco-2 세포 배양과 Ussing 챔버 기술을 활용한 상피 세로토닌 전송체(SERT) 조절 연구 방법입니다. 이 기법은 장 상피 수송 기능을 정밀 측정하여 운반체 관련 질환 치료제 발굴에 활용됩니다.

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원고 편집과 교정에 도움을 주신 RKG 연구실의 MD/PhD 학생인 Christopher Manzella 씨에게 감사드립니다.

젤라틴 단백질 혼합물에 성장 3D 카코 2 세포 배양 : 카코 2의 3D 문화 시스템에 소장 전송기 1. 연구 <ol><li> 해동 성장 인자는 8 시간 동안 얼음에 젤라틴 단백질 혼합물을 감소 (또는 O / N) 4 ℃에서. 일단 1 mL를하거나 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 사용하거나 보관 500 μL 씩을, 해동. </li><li> 문화의 날, 얼음에 문화 (RNA 및 단백질 추출을위한) 판 또는 (면역 염색 용) 챔버 슬라이드를 사전 냉각. 여덟 잘 챔버 유리 슬라이드 (또는 6 웰 플레이트의 웰 당 120 μL)의 각 웰에 젤라틴 단백질 혼합물의 30 μL를 추가하고 균일하게 확산. 과정에서 기포가 발생하지 않도록주의하십시오. </li><li> (15) 37 ℃에서 세포 배양 용 인큐베이터 안에서 슬라이드 / 플레이트 플레이스 - 30 분, 젤라틴 단백질 혼합물을 응고 할 수있다. </li><li> 젤라틴 단백질 혼합물이 응고하는 동안, 카코 -2 세포의 합류 플라스크를 Trypsinize. </li><li> 수를 계산세포의 5 분 탁상 원심 분리기 500 XG에서 그들을 스핀. 필요한 3D 카코이 배지에서 세포 펠렛을 다시 일시. </li><li> (플레이트 잘 당 20,000) 잘 4,000 세포에서 유리 챔버 슬라이드를 시드. 세포를 37 ℃에서 5 % CO 2 인큐베이터에서 성장 가습 할 수있다. 4 D - 매체 매 3을 변경합니다. </li></ol> 3D 카코이 세포의 상피 전송기 2. 면역 형광 염색법 : 1 일 <ol><li> 배지를 흡인하고 RT에서 30 분 동안 (NaOH로 8.5로 조정하여 pH PBS)에서 2 % 파라 포름 알데히드 400 μL (PFA)으로 세포를 고정한다. 주 : PFA 용액을 39 ° C에서 이상 1 주간 저장해서는 안되며 갓 만든 용액을 사용할 수있다. 주의 : PFA는 매우 독성 및 잠재적 인 발암 물질이다. 항상 화학 후드주의 및 개인 보호 장비를 사용하여 그것을 처리 할 수 ​​있습니다. </li><li> (1X PBS로 두 번 우물을 씻어 PBS에 4 ° C에서 슬라이드를 저장하는 400 μL /잘). 일단 고정, 최대 일주일 동안 4 ° C에 저장합니다. </li><li> RT로 챔버 슬라이드 (이는 젤라틴 단백질 혼합물 층을 경화하고, 세척 단계 동안에 흡하기 쉽게 만들) 가온. </li><li> 더 이상 15 분 동안 PBS에서 0.5 % 트리톤으로 세포를 Permeabilize 하시려면. </li><li> PBS-글리신 완충액 (130 mM의 염화나트륨, 7 밀리미터 나 2 HPO 4, 3.5 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 100 mM의 글리신)을 준비합니다. RT에서 10 분마다 1X PBS-글리신과 함께 배를 씻어. </li><li> 면역 완충액 (IF)를 제조 하였다 : 130 mM의 염화나트륨을 7 밀리미터 나 2 HPO 4, 3.5 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 100mM의 글리신, 7.7 mM의 NaN이 3, 0.1 % BSA, 0.2 % 트리톤-100, 0.05 % 트윈 -20 . </li><li> IF의 워시 배 실온에서 10 분마다 버퍼. 5 %의 블록 IF 버퍼에 정상 염소 혈청 (NGS). IF + 1 % 염소 혈청 희석 차 항체, 200 μL에 품어 / 웰, 1 - 실온에서 2 시간. 10 분마다 IF 버퍼 3 배 씻으시오. </li><li> 이차 항에 품어본체 (1 : 200)을 실온에서 1 시간 동안, IF + 1 % NGS 200 μL / 웰의 희석. </li><li> 10 분마다 IF 버퍼로 3 회 씻는다. 이 단계에서 어둠 속에서 슬라이드를 유지합니다. 가장자리 연락처 우물의 가장자리까지 홀더를 통해 흰색 리프터 검은 색 홀더에 챔버 슬라이드를 배치하고 슬라이딩하여 유리 슬라이드에서 플라스틱 챔버를 들어 올립니다. 조심스럽게 챔버 (홀더 및 리프터는 문화 슬라이드와 함께합니다)를 잡아 당깁니다. </li><li> 느린 안티 - 페이드 매체를 탑재하고 실온에서 10 분간 건조 할 수 있습니다. </li><li> 완전히 건조되면, 매니큐어 및 공 초점 현미경과 이미지를 함께 슬라이드를 밀봉. 2 주 또는 몇 달 동안 -20 ° C에서 4 ° C에서 슬라이드를 저장합니다. </li></ol> 3D 카코 -2 세포 3. RNA와 단백질 추출 <ol><li> 이러한 TGF-β1의 같은 시험 제제와 함께 14 일 (10 NG / ㎖, 1H) - (12) 젤라틴 단백질 혼합물에서 배양 세포를 처리한다. </li><li> 치료 후 1 셀을 씻어X PBS. 30 분은 젤라틴 단백질 혼합물을 액화하는 얼음에 세포를 유지합니다. </li><li> 냉장 PBS로 우물을 세척하고 각각의 원심 분리기 튜브에 세포를 수집합니다. 500 × g으로 10 분간 4 ℃에서 저속 원심 분리하여 세포를 수집한다. 표준 절차를 사용하여 RNA를 추출하고 실시간 RT-PCR을 사용합니다. </li><li> 단백질 추출을 위해, 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (1X)로 보충 된 세포 용해 완충액을 사용하여 세포를 용균. 펠렛을 세포 용해 완충액을 첨가 한 후, 초음파 처리로 세포를 용균 및 7,500 × g으로 10 분간 4 ℃에서 원심 분리하여 세포 파편을 제거한다. </li></ol> Ussing 챔버 활용 마우스 회장의 5-HT 통풍 관 4. 측정 : 창자 준비 및 Seromuscular 스트립 댄스 <ol><li> 안락사 후, 쥐를 해부하고 (위 후 맹장 전) 작은 창자를 제거합니다. 세 부분으로 소장을 나눈다. 중간 제를 폐기 근위 제를 사용공장으로, 그리고 회장 등 원위 세 번째를 사용합니다. 상피의 손상을 방지하기 위해 장간막 첨부 파일에서 장을 당겨하지 마십시오. 얼음처럼 차가운 크렙스 - 링거 중탄산 (KBR) 버퍼를 덮어 조직 섹션 감기를 유지합니다. </li><li> 세로로 가위를 사용하여 장을 엽니 다. KBR은 seromuscular를 제거하기 전에 10 분 동안 1 μM의 인도 메타 신 (indomethacin)를 포함하는 가스를 발산, 얼음처럼 차가운에서 갓 절제 장 섹션을 품어. </li><li> 7 % 아가 로스 또는 경화 된 실리콘 엘라스토머 (0.5 cm 두께)를 포함하는 플레이트에 아래 장내 부 (길이 1 ~ cm) 점막 측에 핀. </li><li> 바닥 조명 해부 실체 현미경 하에서 seromuscular 층을 제거. 깃털 메스 블레이드를 사용하여 seromuscular 층을 잘라. 소장의 길이 방향 축을 따라 층의 에지를 얻는 미세 집게를 사용한다. 참고 : 제거 절차 동안, 실체 현미경의 바닥 조명 파이어 판으로 영역을 파악하고 방지하는 데 도움이에스. </li><li> seromuscular 탈기 종료 후, 반 Ussing 챔버의 핀을 잘 점막 마운트. 전체 과정 동안, 찢어지지 않도록 가장자리에 의해 제거 점막 조직을 유지하도록주의하십시오. </li></ol> 5. 평형 및 조직 치료 <ol><li> Kreb의 용액 조제 : 115 mM의 염화나트륨, 25 mM의 NaHCO3을을 2.4 mM의 K 2 HPO 4, 1.2 mM의 CaCl2를 1.2 밀리미터의 MgCl 2, 95 % O 2 / 5 %로 가스실 pH가 7.4에서 0.4mm의 KH 2 PO 4, 37 ° C에서 CO 2. 삼투압 균형을 유지하기 위해 점막 화장실에 에너지 기판과 10 mM의 만니톨로 사용하기 위해 장막 욕조에 10 mM의 포도당을 추가합니다. 참고 Kreb의 용액을 세포 내 5-HT의 열화를 방지하기 위해 L 아스코르브 산 (100 μM) 및 질라 (100 μM, 모노 아민 옥시 다제 억제제)로 보충된다. </li><li> 꼭대기 (내강)시 모두 노출 챔버로 슬라이더를 삽입드와 Kreb의 솔루션에 대한 조직의 기저 (장막) 측. </li><li> 10 분의 평형 기간 후, J 밀리 초 (점막 - 투 - 장막 플럭스)의 정점 측에 30 분 동안 플루옥세틴 (10 μM)과 회장 조직을 전처리. </li><li> 기저 측에서 1 시간 동안 TGF-β1 (10 NG / mL)로 조직을 치료하고 근단 측에서 30 분 동안 3의 H] -5-HT (20 ㎚)와 함께 배양한다. </li></ol> 장막 플럭스 (J 밀리 초) 및 3의 H] 티슈에 -5-HT의 축적에 점막의 6 정량화 <ol><li> 액체 섬광 계수기의 방사능을 측정하고 점막 - 투 - 장막 (J 밀리 초) 유동 비율을 계산하기 위해 (총 5 ㎖의)에 장막 저수지에서 0.75 mL를 분취 액을 수집; 플루옥세틴에 민감한 플럭스는 3 [H] -5-HT 흡수를 SERT이 매개 나타냅니다. </li><li> 장막 측과 재에서 샘플을 채취, 플럭스 기간 동안 점막에서 수압 차이를 방지하려면목욕 매체의 동일한 볼륨에 배치합니다. 참고 : 플럭스 계산은 최종 샘플 (4.25 ㎖ / 5 ㎖ = 0.85)의 희석 수정합니다. </li><li> 3의 H] 조직에 축적 -5-HT의 정량화를 들어, 슬라이더에서 점막을 분리 얼음처럼 차가운 KRB 버퍼로 한번 씻어, 유리 문화 튜브에 넣습니다. </li><li> 밤새 37 ° C에서 10 % KOH 0.5 ㎖의 점막 부화. 액체 섬광 계수기를 사용하여 (삼중)에 용 해물을 150 μL 씩의 방사능을 측정한다. </li><li> 브래드 포드 (Bradford) 방법을 이용하여 단백질 농도를 측정 해물의 - (5 μL 3) 분취 량을 사용한다. 주 : 방사성 세로토닌을 함유하는 배양 배지 10 mL를 표준으로 사용된다. 5-HT는 pmol의 / mg protein / min으로 산출되는 조직에서 유지. </li></ol>

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장내 트랜스 10, 11, 12, 13, 14, 15 공부 상피 단층 편광으로 완전히 분화 카코 -2 세포 단층을 광범위하게 사용되어왔다. 그러나, 장 상피 세포의 생체 조직을 모방하는 3 차원의 카코 -2 문화의 발달에 상당한 관심이 있었다. 장 상피 세포에 대한 3 차원 세포 배양 모델의 수는 최근 원시 세포 - 세포 및 세포 - 세포 외 기질 (ECM)의 2D 시스템 (16)보다 큰 생체 적합성과의 상호 작용을 모방 개발되었다. 따라서, (예를 들면 라미닌, 콜라겐 IV 및 헤파린 설페이트 프로테오글리칸과 같은) 공통의 요소를 포...

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Arivarasu N. Anabazhagan
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Arivarasu N. Anbazhagan

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Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

장 상피 세포는 루멘에 유체의 분비 및 이온 다양한 수송 단백질 (채널, -ATPase를, 공동 운송 및 기) 영양소, 전해질의 흡수에 이르기까지 다양한 기능을 수행하고, 마약을 갖추고있다. 수송 단백질이 방식의 vectorial 이온 또는 분자의 이동을 허용하는 전기 화학적 구배를 생성한다. 이것은 편광 상피 세포의 정단 및 기저 세포막 반송 시스템의 비대칭 분포에 의해 달성된다. 또한, 인접하는 상피 세포 밧줄 단단한 접합부는 꼭대기 및 기저 멤브레인 도메인 사이 intramembrane 성분의 확산에 대한 장벽으로서이 과정에서 중요한 역할을한다. 네이티브 소장의 이러한 특징적인 기능을 흉내 낸 적합한 모델 시스템 (즉, 극성, 분화, 꽉 접합 무결성)은 능의 연구에 중요한상피 교통 시스템의 된 스위치들. 모델에 관해서는, 장 상피 전송 연구에 현재 사용되는 전형적인 세포주는 카코이 완전히 분화의 모델이다 소장 상피 세포를 흡수; 및 T-84 세포 또는 HT-29 서브 클론, 토굴에서 파생 된 큰 장 상피 세포 하나의 모델. 통상적으로, 이러한 세포 라인은 플라스틱 표면에 단일 층 또는 코팅 된 트랜스 웰 인서트에서 재배된다. 어느 정도 트랜스 웰 세포 배양 인서트 편광 세포 basolaterally 공급할 수 있도록하여 생체 내 환경을 닮은. 그러나, 종래의 2 차원 배양 시스템에 제한은 세포가 인공 편평하고 단단한 표면에 적응하도록 강요된다는 것이다. 따라서, 원시 상피 생리 복잡성 정확하게 차원 시스템에 반영되지 않는다. 이 제한은 예컨대 젤라틴 단백질 mixtur 같은 특정 미세 차원에서 세포를 성장하는 방법에 의해 극복되었다즉, 세포 외 매트릭스 성분 (2, 3)의 종류를 포함. 그럼에도 불구하고, 체외 배양 여러 세포 유형과 장내 영역 특정 구조를 갖는 장 상피의 복잡성을 시뮬레이션 할 수있다. 따라서, 세포 배양 모델을 이용하여 연구를 기본 대장에 추가 검증을 요구한다. 체외 3D 세포 배양 및 마우스 장 점막을 사용하여, 우리는 장 세로토닌 수송 (SLC6A4, SERT)의 조절을 연구하기 위해 여기에 간단한 방법을 설명합니다. 의존적 과정 - SERT 수송이 급격히 나 + / CL을 통해 운반하여, 중요한 호르몬 및 신경 전달 물질 5- 하이드 록시 (5-HT)의 세포 외 가용성을 조절한다. SERT는 항우울제의 알려진 대상 최근 설사와 장의 염증과 같은 위장관 질환의 새로운 치료 대상으로 떠오르고있다.방법은 장내 상피 세포에서 5-HT의 흡수가 이전에 기술 된 조사합니다. 예를 들어, 플라스틱 또는 투과성 지지체 인서트 성장 카코 -2 세포는 정단 및 기저 영역에서 모두 4 플루옥세틴 성 3 H-5-HT 흡수를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 인간 장기 기증자 소장으로부터 제조 된 절연 브러시 테두리 막 소포 (BBMVs)에 SERT 함수의 측정은 또한 우리 (5)에 의해 설명되었다. 인간 BBVMs 3 H-5-HT 흡수는 플루옥세틴 성 및 나트륨 + / CL 것으로 나타났다 - 의존성과는 300 K에서 5 nM의 m 포화 동력학을 나타내었다. 유사한 방법을 활용, 우리는 이전에 마우스 장 BBMVs 6 세 H-5-HT 흡수로 SERT 기능을 측정 하였다. 그러나, 순수한 세포막 소포의 제조 조직 점막 많은 양을 필요로한다. 예 radiog 같은 다른 방법3 H-5-HT 흡수 사이트의 raphic 시각화는 또한 기니 돼지와 쥐 소장 (7) 이전에 표시되었습니다. Ussing 챔버 여러 상피 조직에 걸쳐 이온, 영양분, 약물의 이동을 측정하는 이상의 생체 시스템을 제공한다. Ussing 챔버 기술의 주요 장점은 그대로 편광 장 상피의 전기 및 전송 파라미터의 정확한 측정을 가능하게한다는 것이다. 또한, 내장 신경 근육 시스템의 영향을 최소화하기 위해, 장 점막의 seromuscular 박리는 상피 8 수송의 조절을 조사하기 위해 수행 될 수있다. 우리는 젤라틴 단백질에 3D로 성장 카코이 세포는 별개의 혀끝과 기저 마커를 발현하는 중공 루멘을 형성하는 것을 보여줍니다. 이 세포들은 2D 카코이 세포에 비해 SERT의 높은 표현을 보여줍니다. 방법 3D 세포를 성장하고 퍼가기하기rform의 면역 염색 또는 RNA 및 단백질 추출 기술되어있다. 또한, 우리는 Ussing 챔버 기술을 이용하여, 소장 점막 TGF-β1하는다면 발현 성 시토 킨에 의해 SERT 및 규제 기능을 연구하는 방법을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>ATCC</td><td>ATCC를 참조하십시오. HTB&샤이; 37&트레이드;</td><td>셀</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>마이크로소프 for confocal Imaging</td></tr><tr><td>3[H]-5-HT&nbsp;</td><td>LabtekII</td><td>152453</td><td>현미경 검사용 세포 배양</td></tr><tr><td>5-HT&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>70013-032</td><td>유해 물질 아님</td></tr><tr><td>95% O2- 5% CO2 실린더</td><td>KPL</td><td>71-00-27</td><td>유해 물질 아님</td></tr><tr><td>한천 (한천 플레이트용)</td><td>Fischer</td><td>BP151-100</td><td>급성 독성, Ora</td></tr><tr><td>한천 (전극용)</td><td>Sigma</td><td>G7126-1KG</td><td>유해 물질 아님</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Phalloidin</td><td>Sigma</td><td>C3867-1VL</td><td>유해 물질 아님</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>삼키거나 흡입하면 유해</td></tr>함 <tr><td>CaCl2</td><td>LifeTechnologies</td><td>A12380</td><td>유해 물질 아님</td></tr><tr><td>Caco-2 Cells</td><td>Sigma</td><td>A8806-5G</td><td>유해 물질 아님</td></tr><tr><td>Cell lysis Buffer</td><td>Fischer</td><td>BP337-100</td><td>Not a a 유해 물질</td></tr><tr><td>Chabered 슬라이드</td><td>Sigma</td><td>S5886-1KG</td><td>유해 물질 아님</td></tr><tr><td>콜라겐 1형 용액</td><td>Sigma</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>전극</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>EMEM</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>세포외 기질로 사용</td></tr><tr><td>플루옥세틴</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>세포 배양 매체</td></tr><tr><td>글리신</td><td>세포 신호전달, Danvers, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>L-아스코르빈산&nbsp;</td><td>생명 과학의 Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>액체 섬광 카운터&nbsp;</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>70013--032</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 Meta</td><td>Physiologic Instruments, 샌디에고, 캘리포니아&nbsp;</td><td>EM-CSYS-8</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Physiologic Instruments, 샌디에이고, CA&nbsp;</td><td>P2304</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Physiologic Instruments, 샌디에이고, 캘리포니아&nbsp;</td><td>VCC MC8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Physiologic Instruments, 샌디에이고, 캘리포니아&nbsp;</td><td>DM MC6</td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 전압/전류 클램프</td><td>생리학적 기기, 샌디에고, 캘리포니아&nbsp;</td><td>P2300</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>생리학적 기기, 캘리포니아주 샌디에이고&nbsp;</td><td>P2023-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>BP1423</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청(NGS, 10%)</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strp</td><td>Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리</td>주 <td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분석 시약</td><td>시그마-알드리치, 세인트루이스, MO</td><td>10420</td><td></td></tr><tr><td>단백질분해효소 억제제 칵테일</td><td>메독스, 시카고, 일리노이주;</td><td>스타일 G- 12300</td><td></td></tr><tr><td>RNA 쉬운 미니 키트</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>단일 채널 전극 입력 모듈&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>스냅웰 챔버용 슬라이더</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>H9523</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨(Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>F132</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨(NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>T7039</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 1</td><td>Perkin-Elmer,Waltham, MA</td><td>NFT1167250UC</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Packard Instruments, Downers Grove, IL</td><td>B1600</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Ussing Chamber (챔버 전용)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>Ussing 챔버 시스템</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>A1296</td><td></td></tr></tbody></table>

방법은 3d로 재배 원주민 소장과 카코 2 세포에서 상피 전송 단백질의 기능과 발현을 연구하는

Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

장 상피 세포는 이물질에 대한 장벽을 제공하면서 신체의 정상적인 생리 기능에 중요한 역할을 중요 전송 및 장벽 기능이 있습니다. 손상된 상피 전송 (이온 영양 또는 약물)는 많은 질환과 관련되어 있으며, 상피 무결성 및 장내 마이크로 바이 영향으로 같은 컨베이어의 정상적인 생리 학적 기능을 넘어 연장 결과를 가져올 수있다. 기능 및 수송 단백질의 조절을 이해하는 것은 개선 된 치료 적 개입의 발전을 위해 중요하다. 상피 수송의 연구에서 가장 큰 문제는 네이티브 장 상피 세포의 중요한 기능 되풀이되었습니다 적합한 모델 시스템을 개발하고있다. 예컨대 카코-2, T-84, 및 HT-29 세포 Cl.19A 여러 시험 관내 세포 배양 모델은 일반적으로 상피 전송 연구에 사용된다. 이 세포주는 전자를 모델링에 환원 접근 방식을 나타냅니다pithelium 및 상피 미생물 작용들의 검사를 포함한 다양한 역학적 연구에서 사용되어왔다. 그러나, 세포 단일 층 정확하게 세포 - 세포 상호 작용과 생체 내 미세 환경을 반영하지 않습니다. 3D에서 자란 세포는 약물 투과 연구 모델 유망한 것으로 도시 하였다. 우리는 3 차원의 카코 -2 세포는 상피 수송을 연구하는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 카코 2 세포 연구는 세포 특정 효과를 배제하고 계정에 기본 대장의 복잡성을 다른 모델로하고 있습니다 것이 중요하다. 여러 방법들이 이전에 이러한 절연 상피 세포 또는 절연 세포막 소포에 everted SAC와 같은 흡수 수송의 기능을 평가하기 위해 사용되었다. 모델에 대한 및 수송 기능의 측정을 고려하여 현장에서 문제를 가지고, 여기에서 3D 카코 -2 세포 성장과 같은 Ussing 챔버의 사용을 설명하기위한 프로토콜을 보여효과적인 접근법은 그대로 편광 장내 상피 같이 세로토닌 수송을 측정한다.

3D 카코 2 낭종의 면역 염색은 그림 1과 같다. 팔로이 딘의 굴지 염색 차원 낭종에 잘 경계가 루멘을 나타내는 XY 평면의 대표적인 이미지는도 1a에 도시되어있다. 루멘에 직면 측면은 혀끝의 측면이다. 강력한 상피 표현형의 3D 환경의 결과에서 배양 상피 세포. 액틴과 SERT 공동 염색 하루 12에 다른 카코 2 낭종은 그림 1B에 표시됩니다. XY 평면 (도 1a에 도시 된 평면과 다른)이 표현에서, SERT 염색 서브 정점 염색과 함께 주로 내강 막에서 볼 수있다. 도 2는 12 일째의 postplating에서 단층으로 성장 카코 -2 세포에 비해 SERT 단백질 수준 3D 낭종에서 높은 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 카코 2 세포의 3 차원 문화 노나 모방 신호 이벤트를 트리거 수 있음...

우리는 3 차원으로 성장 카코 -2 세포를 시험관 내 세포 배양 모델 및 마우스 창자의 생체 모델을 이용하여 장내 세로토닌 운반체 (SERT) 기능과 발현의 조절을 연구하는 간단한 방법을 설명한다. 이러한 방법은 다른 상피 수송의 연구에 적용 할 수있다.

방법은 3D로 재배 원주민 소장과 카코 2 세포에서 상피 전송 단백질의 기능과 발현을 연구하는

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 장 Caco-2 세포를 3차원으로 배양하고, 세로토닌 운반체 조절 연구에서 Ussing chamber의 활용법을 입증하는 것입니다. 여기에 제시된 방법들은 장 세로토닌 운반체인 SERT가 어떻게 조절되는지와 같은 상피 운반 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 제시할 수 있습니다. 3D Caco-2 배양의 주요 장점은 단층 배양보다 세포 간 상호작용 및 세포와 세포외 기질 간의 상호작용을 더 정확하게 반영한다는 점입니다.또한 Ussing chamber 기술을 통해 장 상피의 수송 기능을 정밀하게 측정할 수 있습니다. 3D Caco 배양의 의의는 이러한 모델을 통해 수송 기능 변화와 관련된 질환에 대한 약물 스크리닝이 가능하므로 치료제 발견으로 확장될 수 있다는 점에 있습니다. 이 방법은 세로토닌 수송체 조절에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 나트륨 및 염화물과 같은 다른 전해질 수송체 연구에도 적용될 수 있습니다.장막근층을 제거하고 장점막을 Ussing chamber에 장착하는 과정은 습득하기 어렵기 때문에, 이러한 기술들에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 3D Caco-2 세포 실험 절차는 지도 강사인 Ishita Chatterjee와 저희 그룹의 박사후 연구원인 Anoop Kumar가 시연할 것입니다. 마우스 회장에서 장막근층을 제거하는 과정은 제 연구실의 선임 연구 전문가인 Sangeeta Tyagi가 시연할 예정입니다.또한 제 실험실의 강사들인 Shubha Priyamvada와 Arivarasu Natarajan이 박리된 점막의 장착과 Ussing chamber 삽입 과정을 시연할 것입니다. 먼저, 성장 인자가 제거된 젤라틴성 단백질 용액을 4°C 냉장고에서 얼음 위에 올려 하룻밤 동안 해동하십시오. 해동이 완료되면, 1 mL 또는 500 µL씩 분주하여 준비하십시오.배양 당일에 챔버 슬라이드를 얼음 위에서 사전 냉각합니다. 그런 다음, 8-웰 챔버 글라스 슬라이드의 각 웰에 젤라틴성 단백질 용액 30 µL를 첨가하고 고르게 펴 바릅니다. 챔버 슬라이드나 플레이트에 젤라틴 혼합물을 플레이팅할 때, 세포가 탈락할 수 있으므로 기포가 형성되지 않도록 주의해야 합니다.용액이 응고될 수 있도록 배양 접시를 37 °C 세포 배양 인큐베이터에 15분에서 30분 동안 넣어둡니다. 다음으로, trypsin을 사용하여 배양 플라스크에서 합류된 Caco-2 세포를 분리합니다. 그 후, 혈구계수기로 세포 수를 측정하고 4 °C에서 500 ×g로 5분 동안 원심 분리합니다.결과물인 세포 펠릿을 3D Caco-2 배지로 다시 현탁하여 원하는 밀도의 현탁액을 얻습니다. 준비된 세포 현탁액을 사용하여 유리 챔버 슬라이드의 웰당 4,000개의 세포를 분주하고, 37 °C의 5% carbon dioxide 습윤 배양기에서 12~14일 동안 배양합니다. 세포를 염색하려면 먼저 배지를 흡입하여 제거하고 400 µL의 2% PFA로 세포를 고정합니다.상온에서 20분 동안 세포 고정을 계속합니다. PBS로 세포를 두 번 세척한 후, PBS에 희석된 0.5% Triton 용액으로 15분 이내로 투과화합니다. PBS glycine 버퍼로 세포를 두 번 헹군 다음, 투과화된 세포를 상온에서 IF 버퍼로 10분 동안 세척합니다.IF 버퍼에 5% normal goat serum을 첨가하여 세포를 블로킹합니다. 그 다음, 1% goat serum이 보충된 IF 버퍼로 희석한 1차 항체 200 microliters를 처리하여 상온에서 1~2시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후, IF 버퍼로 세포를 3회 세척합니다.세척된 세포를 1% goat serum이 첨가된 IF buffer에 희석한 2차 항체 200 microliters와 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다. IF buffer로 세포를 10분씩 3회 세척합니다. 유리 슬라이드의 챔버를 분리하려면, 먼저 슬라이드를 슬라이드 베이스 홀더에 놓고, 화이트 리프터를 홀더를 통해 웰의 가장자리에 닿을 때까지 밀어 넣으십시오.챔버를 조심스럽게 당겨 슬라이드에서 제거합니다. 빛으로부터 슬라이드를 보호하기 위해 덮개가 있는 검은색 상자를 사용하십시오. 슬라이드에 slow anti-fade medium을 도포하여 고정하고 커버슬립으로 덮습니다.슬라이드를 상온에서 10분 동안 건조시킨 후, 이미징 전에 매니큐어로 밀봉합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 절차에 따라 마우스 회장(ileum)을 분리합니다. 그런 다음, 가위를 사용하여 장을 세로 방향으로 절개하여 엽니다.결과물인 조직 절편을 1 µM indomethacin이 포함된 얼음처럼 차가운 gassing KBR buffer에서 10분 동안 배양합니다. 약 1 cm 길이의 장 절편을 점막면이 아래로 향하게 하여 0.5 cm 두께의 7% agarose 또는 경화된 silicone elastomer가 들어 있는 플레이트에 핀으로 고정합니다. 하단 조명이 있는 해부용 실체 현미경을 사용하여 장막근층을 제거합니다.그런 다음, 페더 스칼펠 블레이드로 장막근층을 절개합니다. 미세 핀셋을 사용하여 장의 세로축을 따라 해당 층의 가장자리를 들어 올립니다. 마지막으로, 점막을 슬라이더의 핀 위에 조심스럽게 고정합니다.조직이 찢어지는 것을 방지하기 위해 박리된 점막 조직의 가장자리를 잡으십시오. 슬라이더 핀에 박리된 회장 점막을 고정할 때는 핀 머리 부분에서 조직이 찢어지지 않도록 주의하고 조직 가장자리의 손상을 최소화해야 합니다. 조직 처리 전에 95% oxygen, 5% carbon dioxide 가스가 주입된 Krebs 용액을 준비하십시오.그 다음, 용액을 Ussing chamber에 붓습니다. 장막측 욕조(serosal bath)에는 에너지 기질로 10 µM glucose를 추가하고, 점막측 욕조(mucosal bath)에는 삼투압 균형 유지를 위해 10 µM mannitol을 추가합니다. 이어서, 점막이 장착된 슬라이더를 chamber에 삽입하여 조직의 정단면(apical side)과 기저측면(basolateral side)이 모두 Krebs 용액에 노출되도록 합니다.회장 조직을 배스(bath)에서 10분 동안 평형화합니다. 그다음, 점막측에서 장막측으로의 플럭스(flux)를 측정하기 위해 첨단면(apical side)을 10 µM fluoxetine으로 30분 동안 전처리합니다. 마지막으로, 조직의 기저외측(basolateral side)을 10 ng/mL TGF beta 1으로 1시간 동안 처리한 후, 첨단면을 20 nM tritiated 5-HT와 함께 30분 동안 배양합니다.점막측에서 장막측으로의 플럭스 속도를 계산하려면, 장막측 저장조에서 0.75 milliliter의 분주액을 채취하고, 점막 양단에 정수압 차이가 발생하는 것을 방지하기 위해 이를 동일한 부피의 배양액으로 대체하십시오. 조직에 축적된 tritium 표지 5-HT를 정량화하려면, 슬라이더에서 점막을 제거하십시오. 이를 얼음처럼 차가운 KRB 버퍼로 한 번 세척한 후 유리 배양 튜브에 넣으십시오.조직을 용해시키기 위해 점막을 0.5 milliliters의 10%KOH에 넣고 37 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그 후, 액체 섬광 계수기를 사용하여 용해물의 150 microliter 분주액을 3회 반복 측정하여 방사능을 측정합니다. Bradford법을 사용하여 용해물의 3~5 microliter 분주액에서 단백질 농도를 측정합니다.여기에 제시된 것은 액틴으로 염색된 3D 배양 Caco-2 낭종과 액틴, 핵 및 SERT 단백질로 동시에 염색된 Caco-2 3D 낭종입니다. SERT는 루멘 막(luminal membrane)과 하정단 구획(subapical compartments)에서 관찰됩니다. 2D Caco-2 단층에 비해 Caco-2 3D 구체의 이점을 추가로 확인하기 위해 SERT 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였습니다.결과에 따르면, 2D Caco-2 세포와 비교하여 Caco-2 3D 구체에서 SERT 단백질의 발현이 증가한 것으로 나타났습니다. 마지막으로, Ussing chamber 시스템을 사용하여 TGF beta가 점막측에서 장막측으로의 플럭스를 증가시킴을 보여주었으며, 이는 루미날 막에서의 5-HT 흡수 증가와 회장 점막에서 관찰된 5-HT 축적 증가를 반영합니다. 이러한 결과는 루미날 막의 SERT 발현에 상응하는 fluoxetine 처리에 따른 5-HT 흡수의 민감도 관찰을 통해 뒷받침됩니다.숙련되면 회장 점막을 박리하고 장착하는 이 기술은 15분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 채택할 때, 동물로부터 적출된 장외 준비물은 생존 능력이 제한적이며 최대 3시간 동안 유지될 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 3D Caco-2 낭종은 막 수송 사건, 유전자 발현 또는 상피 수송체의 단백질-단백질 상호작용과 같은 다양한 연구에 활용될 수 있습니다.3D Caco-2 기술은 개발 이후, 장관 수송 분야의 연구자들이 유체 이동을 탐구하고 장 질환의 병태생리학을 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 방사성 물질을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, PPE(개인 보호 장구) 착용 및 적절한 제염 절차와 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 유념하십시오. 이 영상을 시청하고 나면 Caco-2 세포를 3D 배양으로 성장시키고, 이러한 배양물을 활용하여 상피 수송체 발현을 조사할 수 있게 될 것입니다.또한 Ussing chamber를 사용하여 생체 내 마우스 장 내의 세로토닌 수송 기능을 연구할 수 있습니다.

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연구

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Biology

생물학

많은 치료 응용 프로그램은 신체의 세포 장벽에 걸쳐 약물 사업자와 그들의화물의 안전하고 효율적인 전송을 필요로합니다. 이 문서는 위장 (GI) 상피 세포와 같은 세포 장벽에 걸쳐 약 nanocarriers (나노 결정)의 전송 속도와 메커니즘을 평가하기 위해 설립 방법의 적응을 설명합니다.

모델 및 세포 장벽에 걸쳐 약물 전달 시스템의 전송을 평가하는 방법

Caco-2 세포는 지질 및 지용성 약물/비타민의 장세포세포 수송을 연구하기 위한 시험관 내 모델로 사용할 수 있습니다. 투과성 멤브레인 시스템은 정점과 기저측 구획을 분리하는 반면, 렌티바이러스 발현 시스템은 효과적인 유전자 과발현 방법을 제공합니다. 지단백질의 분리는 TEM에 의해 확인됩니다.

소장에 의해 지질 전송을 연구하기 위해 카코 2 셀을 사용하여

선물이 vivo에서 조직에서 장 3 차원 구조의 절연에 대 한 프로토콜 및 지하실 매트릭스 생체 외에서 organoids, 및 세부 다른 정착 immuno-microtubule의 라벨에 대 한 최적화 된 프로토콜을 얼룩이 지 포함 centrosomal, 그리고 접합 단백질도로 표식 줄기 세포 단백질 Lgr5를 포함 하 여 셀.

Microtubules 및 전 비보 장 조직 및 장 Organoids 3 차원 생체 외에서 Centrosomal 단백질의 면역 형광 라벨

이 프로토콜 상피 장벽 침투성 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 인간의 창 자 organoids에서 실시간 다음 약리학 적인 치료에서의 측정을 설명 하 고 라이브 셀 현미경 검사 법.

인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

두 가지 방법은 여기 장 장벽 기능을 결정 하 되 게 됩니다. 상피 미터 (볼트/옴)의 조직 문화 우물에서 직접 경작된 epithelia의 transepithelial 전기 저항 측정에 사용 됩니다. 쥐, FITC dextran gavage 메서드는 vivo에서창 자 침투성 결정 하 사용 됩니다.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 접근 장 상피 세포 침투성을 결정 하

여기, 우리 문화 인간 enteroid 또는 셀룰러 및 생 화 확 적인 수준에서 호스트 상피 microbiota 상호 작용 연구를 그대로 배리어 기능이 있는 colonoid monolayers 프로토콜을 제시.

병원 균, 공생, 그리고 호스트 창 자 상피 사이 상호 작용을 공부 하는 인간 Colonoid Monolayers

여기에서 우리는 소장 오르가노이드의 장벽 무결성을 정량화하는 기술을 기술합니다. 이 방법이 살아있는 오르가노이드를 기반으로 한다는 사실은 시간 해결 방식으로 상이한 장벽 무결성 변조 물질 또는 이들의 조합에 대한 순차적 조사를 가능하게 한다.

살아있는 오르가노이드의 장 장벽 고장 조사

여기에서, 우리는 장 장벽 기능, 투과성 및 수송을 연구하기 위한 인간 오가노이드 유래 장 상피 단층의 제조를 기술한다. 오가노이드가 외부 자극에 대한 원래의 상피 조직 반응을 나타내기 때문에, 이들 모델은 세포주의 확장성과 일차 조직의 관련성 및 복잡성의 이점을 결합한다.

오가노이드 유래 상피 단층: 장 장벽 기능을 위한 임상적으로 관련된 시험관내 모델

여기서는 장 적정별 상호 작용을 모델링할 수 있는 두 가지 프로토콜을 제시합니다. 오르가노이드 유래 장 단층층 및 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양은 발광 및 바생측 모두에서 접근할 수 있는 잘 차별화된 상피생성을 용이하게 하는 반면, 극성 반전장 기관가의 측면은 그들의 정면을 노출시키고 높은 처리량 분석에 적합합니다.

장 관성 오르가노이드 모델을 사용하여 정법별 상호 작용을 연구하는 문화 방법

이 연구는 소장과 대장에서 유래한 돼지 오가노이드의 2D 단층을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 단층의 성장은 TEER 값의 증가로 표시되며, 이는 견고한 상피 무결성을 나타냅니다. 게다가, 이 단층은 forskolin의 신청에 따르는 Ussing 약실 실험에 있는 생리적인 분비 반응을 전시합니다.

토종 장의 생리학적 특성을 반영하는 2차원 돼지 장 오가노이드(Two-dimensional Porcine Intestinal Organoids)

배우세요 3D Caco-2 세포 배양과 Ussing 챔버 기술을 활용한 상피 세로토닌 전송체(SERT) 조절 연구 방법입니다. 이 기법은 장 상피 수송 기능을 정밀 측정하여 운반체 관련 질환 치료제 발굴에 활용됩니다.

방법은 3D로 재배 원주민 소장과 카코 2 세포에서 상피 전송 단백질의 기능과 발현을 연구하는

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