3D 인쇄 가이드 및 반지 스태킹 방법을 사용하여 엔지니어링 혈관 이식의 크기 조정

이 방법의 전반적인 목표는 모든 크기의 엔지니어링된 혈관을 강력하고 일관되게 생성하는 것입니다. 이 기술은 혈관의 신뢰할 수 있고 효과적인 엔지니어링을 가능하게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 모든 크기의 용기를 쉽고 안정적으로 제작할 수 있다는 것입니다.

우리는 조직 튜브를 설계하는 방법을 논의할 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸고, 우리의 방법을 한 번에 한 세그먼트씩 도로 터널을 건설하는 것에 비유했습니다. 3D 프린팅 인서트를 준비하려면 먼저 35, 60 또는 100mm 페트리 접시의 바닥에 각각 2mL, 4mL 또는 6mL의 경화되지 않은 실리콘으로 된 얇은 층을 추가합니다. 35mm 플레이트용 포스트를 만들려면 PDMS를 7mm 높이의 다른 100mm 플레이트에 붓고 섭씨 60도의 핫플레이트에서 PDMS를 2-3시간 동안 가열합니다.

PDMS가 경화되면 5mm 생검 펀치를 사용하여 원통형 포스트를 만듭니다. 소량의 경화되지 않은 PDMS를 사용하여 실린더를 각 35mm 플레이트의 중앙에 고정합니다. 포스트에서 지름이 약 66.7mm인 3D 프린팅된 외부 쉘을 100mm 플레이트에 배치합니다.

60mm 및 100mm 플레이트 하단의 PDMS를 경화하기 전에 10mm 및 20mm 직경의 3D 프린팅 포스트를 각각 60mm 및 100mm 플레이트에 각각 중앙에 배치합니다. 섭씨 60도의 핫플레이트에서 2-3시간 동안 야외에서 접시를 경화시킨 다음 18시간 동안 폴리머 탈기를 수행합니다. 가스 제거가 끝나면 모든 플레이트의 내부를 70% 에탄올로 살균하고 각 플레이트를 30분 동안 덮습니다.

그런 다음 각 플레이트에서 에탄올을 조심스럽게 흡입하여 공기 건조를 허용합니다. 플레이트가 건조되면 해당 앞면이 위로 향하는 뚜껑 옆에 있는 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 재료를 자외선에 30분 동안 노출시켜 살균을 완료합니다.

피브린 하이드로겔을 준비하기 위해 먼저 피브린 겔과 TGF 베타 1이 보충된 0.5, 1.1 및 1.81mL의 성장 배지를 각각 35, 60 및 100mm 배양 접시에 추가합니다. 다음으로 40, 88.4, 145mm의 트롬빈을 각각 35, 60, 100mm 플레이트에 넣고 각 플레이트를 손으로 부드럽게 휘젓습니다. 트롬빈이 고르게 분포되면 35, 60, 100mm 플레이트의 트롬빈 배지 혼합물에 각각 160, 354, 580마이크로리터의 피브리노겐을 적방울 방향으로 원을 그리며 첨가하고 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 하이드로겔이 고르게 분포되도록 합니다.

하이드로겔이 실온에서 10-15분 동안 경화되도록 합니다. 그런 다음 150mm 세포 배양 플레이트에서 팽창한 관심 평활근 세포를 트립신화하고 원심화로 분리된 세포를 수집합니다. 펠릿을 3ml의 분화 배지에 다시 현탁시키고 2mL 피펫을 사용하여 세포를 격렬하게 분쇄하여 세포 덩어리를 분해합니다.

계수 후 세포를 50ml 원뿔형 튜브에서 mL 분취량당 2/10 10에서 6번째, 1/10 10에서 7번째 세포, 1.4 x 10에서 7번째 세포로 분할하고 해당 배양 플레이트에 따라 라벨링합니다. 각 튜브에 분화 배지를 추가하여 각 35, 60 및 100mm 플레이트에 대해 각각 2, 4 및 5mL의 최종 파스딩 부피를 얻습니다.그런 다음 세포 배양 인큐베이터에서 팽창하기 위해 각 해당 플레이트의 준비된 하이드로겔에 세포 용액을 조심스럽게 적하합니다. 2-4일이 지나면 고리는 기둥 쪽으로 완전히 수축됩니다.

따라서 10, 20 또는 35 mL의 TGF 베타 1을 각 35, 60 및 100 mm 링에 각각 첨가하십시오. 35mm 용기용 혈관 구조를 조립하려면 50mL의 폴리카보네이트 원추형 튜브 상단에서 2인치 섹션을 자르고 PDMS는 상단 가장자리를 35mm 플레이트에 접착하여 링 스태킹을 위한 긴 플레이트를 만듭니다. 60mm 및 100mm 용기의 경우 높이 링 스태킹 플레이트는 1.75인치 직경의 폴리카보네이트 튜브를 세로 2.5인치 섹션으로 절단하여 높은 플레이트 벽 역할을 합니다.

키가 큰 판 바닥의 경우 0.125인치 두께의 폴리카보네이트 시트를 2인치 직경의 원형 조각으로 자릅니다. 아크릴 솔벤트 시멘트를 사용하여 폴리카보네이트 튜브 섹션을 원형 절단 조각에 바인딩합니다. 50mm 길이의 5, 10 및 20mm 직경 포스트를 3D 프린팅합니다.

그런 다음 PDMS가 완전히 경화되기 전에 각 35, 60 및 100mm 용기에 각 3D 프린팅 포스트를 중앙에 배치하여 각 용기에 경화되지 않은 실리콘 10mL를 추가합니다. 그리고 접시를 섭씨 60도의 핫플레이트에 2-3시간 동안 놓습니다. PDMS가 경화되면 방금 설명한 대로 70% 에탄올로 플레이트를 살균한 다음 건조된 에탄올 멸균 용기를 자외선에 30분 동안 노출시킵니다.

이제 두 쌍의 매우 미세한 집게를 사용하여 단단히 감긴 평활근 하이드로겔 링의 한쪽 면을 조심스럽게 들어 올린 다음 다른 쪽을 포스트에서 조심스럽게 들어 올립니다. 그런 다음 링의 한쪽을 조심스럽게 밀어 넣은 다음 다른 쪽을 해당 다음 크기의 더 큰 용기의 높은 기둥에 밀어 넣습니다. 부드럽고 점진적인 움직임으로 원주방향으로 작업하면서 링을 포스트 아래로 천천히 밀어 넣은 다음 원하는 혈관 길이를 얻을 때까지 추가 조직 링을 쌓습니다.

모든 링이 쌓이면 플레이트를 돌려 포스트가 작업 표면과 평행이 되도록 하고 플레이트를 천천히 회전시키면서 각 35, 60 및 100mm 용기의 외부 표면에 각각 40, 80 및 160마이크로리터의 트롬빈을 부드럽게 추가합니다. 다음으로, 40, 80 및 160 마이크로리터의 피브리노겐을 각각 35, 60 및 100mm 구조체에 각각 주입하면서 구조체를 활발하게 회전시키면서 가능한 한 빠르고 균일하게 첨가합니다. 트롬빈과 피브리노겐은 혼합시 단단한 젤로 빠르게 굳습니다.

그런 다음 각 구성 용기에 20mL의 분화 배지를 추가하고 필요할 때까지 용기를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 조직학적 분석은 모든 고리 크기에서 높은 세포성을 보여주며, 작은 고리의 바깥쪽 가장자리에서 소량의 잔류 피브린 겔이 관찰됩니다. 더 큰 고리에서 일부 피브린 겔은 세포 내용물과 함께 산재되어 있으며, 중간 고리와 큰 고리 모두에서 콜라겐 생성의 징후가 분명합니다.

알파 평활근 Actin 및 Tropomyosin 발현에 대한 조직 고리 분석은 모든 고리 크기가 두 항체에 대해 양성임을 밝혀 평활근 표현형이 유지되었음을 확인합니다. 인장 시험은 세 가지 크기의 링 모두에서 링 및 용기 크기 증가와 관련된 강도 증가 추세를 나타냅니다. 다양한 고리 크기를 만들기 위한 셀 시딩 번호도 시딩 표면적과 상관관계가 있습니다.

이러한 용기 구조는 또한 분당 100에서 417ml의 유속으로 최대 5분 동안 흐름을 견딜 수 있으며 용기가 풍성 시스템에 연결되는 곳에서 경미한 누출만 관찰됩니다. 일단 마스터하면 기술이 제대로 수행되면 1시간 안에 링을 만들 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 겔의 응고와 적절한 고리 형성을 보장하기 위해 하이드로겔 성분을 철저히 혼합하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 다른 유형의 조직을 엔지니어링하기 위해 다른 세포 유형의 고리를 만드는 것과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 고리 쌓기 방법을 사용하여 다양한 크기의 혈관 조직을 엔지니어링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.