분리 및 유동 세포 계측법에 의해 췌장 중간 엽 세포 분석

이 절차의 전반적인 목표는 유전자 및 표면 마커 발현 분석을 위해 췌장 중간엽 세포를 분리하는 것입니다. 이 방법은 중간엽 세포가 어떤 신호를 발현하는지, 상피 발달에 어떤 영향을 미치는지와 같은 췌장 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비교적 간단하고 빠르며 정렬 된 셀을 잘 얻을 수 있다는 것입니다.

HBSS가 함유된 배양 접시에 내부 장기를 넣고 접시를 실체 현미경 아래에 놓는 것으로 시작합니다. 간과 신장을 분리하여 췌장을 드러내고 가는 집게를 사용하여 위, 십이지장, 비장에서 췌장을 제거합니다. 각 췌장이 채취되면 조직을 새로 준비한 소화 완충액이 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.

모든 췌장을 채취한 후 조직을 섭씨 37도의 가열 블록에 넣고 700RPM으로 교반하면서 30분 동안 진행하고 15분 후에 튜브를 3-4회 수동으로 뒤집습니다. 전반전 소화 후에도 큰 췌장 조각이 남아 있으면 마지막 15분 동안 5분마다 튜브를 뒤집고 필요에 따라 추가로 5-10분 동안 조직을 배양합니다. 분해가 끝나면 튜브를 얼음 위에 놓고 각 샘플에 차가운 HBSS 10ml를 추가합니다.

원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 2밀리리터의 신선한 PBS에 재현탁합니다. 다음으로, 35미크론 스트레이너를 통해 세포를 5밀리리터의 둥근 바닥 폴리스티렌 수집 튜브로 여과하고 2ml의 새 PBS로 소화 튜브를 세척하여 세척액을 해당 수집 튜브로 변형시킵니다. 그런 다음 세포를 다시 원심분리하고 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 흡인합니다.

동물의 나이에 따라 분류 완충액에 세포를 재현탁시키고 새로운 35미크론 세포 여과기를 통해 새로운 5ml 수집 튜브로 여과합니다. 염색 대조군을 위해 50-100마이크로리터 부피의 세포를 각 형광단에 대한 튜브, 생존력 염료, 형광 단백질 및 염색되지 않은 대조군을 포함한 새로운 FACS 튜브에 분취합니다. 각 튜브를 최대 4ml의 분류 버퍼로 세척한 다음 원심분리기로 세척합니다.

다음으로, 펠릿을 동물의 나이에 따라 신선한 분류 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 생존 염료로 세포를 염색합니다. RNA 추출 전 세포 분류의 경우, 분류 시작 직전에 멸균 1.5ml 수집 튜브에 RNAse 억제제가 포함된 1ml의 분류 버퍼를 코팅합니다.

5분 후 수집 튜브를 와류로 만들고 액체를 제거합니다. 첫 번째 염색 제어 및 튜브를 유세포 분석기에 로드하여 분류 매개변수를 결정하기 시작합니다. 모든 분류 매개변수가 설정되면 샘플을 로드하고 세포를 1.5ml 수집 튜브로 분류합니다.

그런 다음 원심분리를 통해 분류된 세포를 수집합니다. 상층액을 펠렛까지 흡인하고 표준 RNA 추출 프로토콜에 따라 RNA를 추출합니다. 여기에서는 배아 15.5일차 배아와 출생 후 4일차 새끼의 위, 비장, 장 및 췌장을 포함한 고립된 전체 위장관을 보여줍니다.

방금 시연된 바와 같이 분리된 배아, 신생아 및 성인 췌장 조직의 단일 세포에 대한 유세포 분석은 분석된 모든 연령의 형질전환 췌장 조직에 고유한 YFP 표지 세포 집단을 포함하고 있음을 보여줍니다. 분류 후, 이러한 중간엽 세포를 배양하여 최소 5개의 계대에 대한 세포주를 확립할 수 있습니다. 중간엽 세포의 전형적인 배양된 세포의 섬유화 형태에 주목하십시오.

분류된 세포는 RNA 추출 및 cDNA 합성 후 qPCR로 분석한 바와 같이 범중간엽 마커 vementin을 발현합니다. 또한, 분리된 췌장 세포 표면 마커 발현은 형질전환 YFP 췌장에서 형광 표지된 모든 세포가 섬유아세포에 의해 발현되는 것으로 알려진 세포 표면 당단백질인 CD9를 발현한다는 것을 나타냅니다. 이 절차에 따라 RNA 염기서열분석과 같은 다른 방법을 수행하여 중간엽 세포 유전자 발현에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.