Name: 분리 및 유동 세포 계측법에 의해 췌장 중간 엽 세포 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: 학습하세요 췌장 중간 엽 세포 분리 및 유동 세포 계측법을 이용한 유전자 발현 분석 방법. 이 기술은 췌장 발달 및 종양 형성 연구에 활용됩니다.

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저자는 기술적 도움을 준 Adi Sasson과 원고를 비판적으로 읽어준 Helen Guez에게 감사를 표합니다. 이 작업은 유럽 연구 위원회(European Research Council)의 지원을 받아 보조금 번호 336204를 시작했습니다.

실험은 텔 아비브 대학의 동물 연구위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 하였다. 마우스의 췌장 조직의 1. 분리 <ol><li> 성인 마우스의 경우 : <ol><li> 0.4 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제 P 0.1 NG / I는 행크스 &#39;균형 소금 솔루션 (HBSS)에 용해 mL의 DNase의 : 소화 버퍼를 준비합니다. 갓 15 ML 원뿔 튜브에 마우스 당 버퍼의 5 mL를 준비하고 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오. </li><li> 제도적 지침에 따라 쥐를 안락사. </li><li> 췌장을 제거하는 각 마우스 해부 (교육하기를 참조 (18)를 참조하십시오) HBSS를 포함하는 배양 접시에 넣습니다. 4 개 -이 실체 현미경 하에서이 단계를 수행하고, 소화 효율을 높일 2로 조직을 절단 할 수있다. </li><li> (1.1.1에서 준비) 소화 버퍼를 포함하는 튜브에 췌장 조직을 놓습니다. 모든 마우스를 해부하고 췌장 조직 될 때까지 얼음에 튜브를 유지모은. </li><li> 나머지 마우스와 1.1.4 - 반복 1.1.2 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 태아 및 신생아 마우스의 경우 : <ol><li> 0.4 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제 P 0.1 NG / I는 HBSS에 용해 mL의 DNase의 : 소화 버퍼를 준비합니다. 15 ML 원뿔 튜브에 마우스 당 버퍼의 2 mL의 - 출생 후 하루 7 (P7) 이하에서 배아와 새끼를 들어, 갓 1.5을 준비합니다. 15 ML 원뿔 튜브에 마우스 당 버퍼 4 mL의 - P7 이상 새끼를 들어, 3을 준비합니다. 얼음에 사용할 때까지 보관하십시오. </li><li> 제도적 지침에 따라 쥐를 안락사. 배아를 들어, 자신의 어머니의 자궁에서 모든 배아를 제거하고 PBS를 포함하는 10 mm 배양 접시에 배치합니다. 한번에 한 배아를 해부. </li><li> 머리가 떨어져 조사에서 가리키는, 그 뒷면에 마우스를 놓습니다. 미세 집게를 사용하여 마우스 다이어프램 (18)까지 복강을 노출하는 중간 선에서 복부 피부와 개방을 당깁니다. </li><li> 미세 집게를 사용하면, 간 FR를 분리다시 복부 벽을 옴. 마우스 꼬리 방향으로 연속 동작으로, (간, 위, 비장, 창자, 신장, 췌장 포함) 내부 장기를 특종과 HBSS를 포함하는 배양 접시에 배치합니다. </li><li> 실체 현미경 하에서, 간 및 췌장을 노출 신장 (그림 1)를 제거합니다. 미세 핀셋을 사용하여, 비장, 마지막 위장, 십이지장, 췌장으로부터 분리하고. </li><li> (단계 1.2.1에서 제조) 소화 버퍼를 포함하는 튜브에 췌장 조직을 놓습니다. P14 이상 새끼를 들어, 소화 효율을 높이기 위해 2 개 세트로 조직을 절단. 모든 마우스를 해부하고 췌장 조직이 수집 될 때까지 얼음에 튜브를 유지합니다. </li><li> 나머지 마우스와 1.2.6 - 반복 1.2.2 단계를 반복합니다. </li></ol></li></ol> 2. 췌장 소화 <ol><li> agitat 30 분 동안 37 ℃ 가열 블록 (분해 완충액) 췌장 조직을 포함하는 튜브를 부화700 rpm에서 이온. 15 분 후, 수동으로 3 반전 튜브를 흔들어 - 4 회 다시 가열 블록에 배치합니다. 교반 기능이없는 가열 블록을 사용하는 경우, 튜브마다 5 반전 - 10 분 : 주. 조직이 제대로 소화되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 부화하기 전에 작은 조각으로 조직을 잘라내거나 교반을 증가시킨다. </li><li> , 조직 소화를 중지 얼음에 튜브를 배치하고 각 튜브에 차가운 HBSS의 10 ㎖를 추가합니다. 4 ° C에서 튜브를 원심 분리기 5 분 동안 300 XG와 뜨는을 대기음. </li><li> 다시 서스펜션 : <ol><li> 성인 쥐 및 P14 이상 새끼를 들어, PBS 6 mL를 펠렛을 다시 일시 중지하고 새로운 15 mL의 원추형 수집 프로필렌 튜브의 상부에 배치 된 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 스트레인. 최대 세포 회복을 위해, PBS의 추가 6 mL로 일본어 튜브를 세척하고, 포집 관 상 셀 스트레이너를 통해 스트레인. </li><li> 배아와 새끼 젊은 t에 대한한족 P14는, PBS 2 mL를 펠릿을 다시 중지하고 5 ㎖의 둥근 바닥 폴리스티렌 포집 관 (FACS 튜브)의 상부에 배치 된 35 μm의 셀 스트레이너를 통해 스트레인. 최대 세포 회복을 위해, PBS를 추가로 2 ml로 일본어 튜브를 세척하고, 포집 관 상 셀 스트레이너를 통해 스트레인. </li></ol></li><li> 4 ° C에서 튜브를 원심 분리기 5 분 동안 300 XG와 뜨는을 대기음. 세포가 느슨하게 폴리스티렌 튜브에 부착 될 때, 조심스럽게 액체를 제거합니다. </li></ol> 3. 단일 셀 레이블 시스템 준비 <ol><li> 완충 제제 : FACS에 의한 세포 분리를 들어, 5 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 5 mM의 EDTA (칼슘, 염화 마그네슘)없이 PBS을 혼합하여 정렬 버퍼 준비한다. 유세포 분석을 위해, 0.05 % 아 지드 화 나트륨으로 정렬 버퍼를 보충하여 분석 버퍼를 준비한다. 두 버퍼는 최대 2 개월 동안 4-8 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 정렬 또는 아나 세포를 다시 일시 중지용해 버퍼. P8 1.5 ㎖의 이전 일개월 사이의 새끼에서 배아 및 1 ㎖의 P7 미만의 새끼에서 분리 된 각각의 췌장을 다시하면 일시 중지, 3 mL를 1 개월 이상 마우스의 나이. 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브 (FACS 튜브)의 상부에 배치 된 35 μm의 세포 여과기를 통하여 세포 스트레인. </li><li> 제어 염색 이전 단계 (총 샘플 부피의 5 % 이하)로 만든 샘플의 100 μL 분취 액을 50 꺼내 새로운 FACS 튜브로 배치; DAPI 및 형광 단백질을 포함하여 사용 된 각각의 형광을위한 튜브뿐만 아니라에 대한 흠없는 제어를 포함한다. 주 : 형광 단백질을 발현하는 세포와 트랜스 제닉 마우스를 사용하는 경우 셀 수가 제한되는 경우, 또는 염색 제어와 같은 비 - 형질 전환 된 조직을 포함한다. 형광 단백질을 발현하는 세포가 더 얼룩없이 사용하는 경우 3.8 단계로 진행합니다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 300 XG에 세포를 다운 스핀과 뜨는을 대기음. </li><li> 블록의 경우왕이 (염소 IgG를 1 μL 보충 정렬 100 μL 또는 분석 버퍼) 솔루션을 차단와 세포를 다시 일시 중지하고 얼음에 30 분 동안 품어. </li><li> 세포 표면 마커를 얼룩, 샘플 당 100 μL의 볼륨에 원하는 모든 형광 접합 된 항체를 포함하는 혼합물을 제조한다. 분류 또는 분석 완충액에 2 배 희석 된 항체를 준비 (즉, 두 필요한 농도를 얻을 수있는 항체를 희석 1의 최종 희석 경우 : 100 : 200이 바람직하고, 1 항체 희석). 블로킹 용액을 세척없이, 200 μL의 최종 염색 볼륨을 달성하기 위해 샘플 셀에 상기 혼합물을 100 μL를 추가한다. 얼음에 30 ~ 60 분 동안과 어둠 속에서 품어. </li><li> 하나의 (염색 제어)를 사용하는 항체를 포함하는 추가 튜브를 준비, 분석 또는 정렬 매개 변수를 (단계 4.3 및 5.2 참조)를 설정합니다. (단계 3.6에 설명 된대로) 분류 또는 분석 버퍼에 2 배 항체 희석을 준비합니다. 확인시를 포함해야사용 된 각각의 형광체뿐만 아니라 흠 제어 ngle 염색 제어 희석. 블로킹 용액을 세척없이, 200 μL의 최종 염색 볼륨을 달성하기 위해 (단계 3.3에서 제조)를 세포에 항체 혼합물의 100 μL를 추가한다. 얼음과 어둠 속에서 60 분 - 30 품어. </li><li> 분석 각각의 튜브를 채우거나 4 mL의의 최대 볼륨으로 버퍼를 정렬하여 씻으십시오. (단계 3.2에 설명 된대로) 선택적으로, 35 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 재 - 변형. </li><li> 4 ° C에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. </li><li> 분석 또는 버퍼를 정렬에 샘플을 다시 일시 중지합니다. 2 ㎖의 이전 3 개월 및 3가 3 개월 용액보다 오래된 마우스에서 - 1, 1 mL의 1 개월 미만의 새끼에서 500 μL의 배아에서 분리 된 세포를 다시하면 일시 중지합니다. 오염 제어 장치는 버퍼 300 μL에 재현 탁 될 수있다. </li><li> 200 ng의 추가 / DAPI mL의 죽은 세포를 식별하는 세포를 재현 탁합니다. 확인 튜브 공동을 포함해야사이토 설정에 대한 DAPI없이 흠없는 세포를 ntaining. 셀 정렬 (4 단계) 또는 분석 (5 단계)로 넘어갑니다. </li></ol> 4. 셀 정렬 <ol><li> 준비: <ol><li> 된 RNase와 RNA 추출 전에 코트 1.5 mL를 수집 튜브를 정렬 셀 억제제 즉시 정렬 전에. 이를 위하여, 멸균 1.5 ㎖의 수집 튜브에 0.01 U / ㎖의 RNase 억제제를 함유하는 완충액을 선별 1 mL를 넣어. 5 분 후, 튜브를 와동 액체를 제거한다. </li><li> 세포 배양에 앞서 정렬 셀 멸균 배양 배지 중 3 mL의 추가 멸균 15 ㎖의 수집 튜브로 (둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 20 % FBS, 1 % L 글루타민, 페니실린 - 스트렙토 마이신 1 %) . </li></ol></li><li> FACS 분류기에 튜브를 넣기 전에, 소용돌이는 간단히 세포를 다시 일시 중지합니다. 얼음에 남아있는 튜브를 유지합니다. </li><li> 예 (분류 파라미터를 결정하기 위해 염색 통제를 분석하여 시작 </em&gt; 전압 및 보상) 및 정렬 게이트 (예를 들어, 전체 세포 인구, 라이브 DAPI 음성 세포 및 세포 집단)이 분류된다. </li><li> 정렬 매개 변수 및 게이트가 설정되면, 샘플을로드하고 수집 튜브에 정렬 셀을 시작합니다. 참고 : 정렬 조건은 악기에 크게 의존한다. 우리는 100 ㎛의 노즐 폭 23.1 psi의 압력 및 5의 최대 정렬 속도를 사용한다. </li><li> RNA 추출하거나 정렬 세포의 배양을 진행합니다. 참고 : RNA 추출의 경우, 5 분 동안 2,000 XG에서 세포를 원심 분리 및 표준 추출 프로토콜을 계속하기 전에 물기를 제거합니다. 세포를 비 - 멸균 조건으로 정렬 한 경우, 세포 배양, 배양 배지로 튜브를 작성 및 오염을 최소화하기 위해 배양 이전 7 분 동안 300 XG 그것을 원심 회 씻는다. </li></ol> 유동 세포 계측법 5. 세포 분석 <ol><li> 리터 전사이토, 소용돌이에 각 튜브를 oading하면 간단히 세포를 다시 일시 중지합니다. 얼음에 남아있는 튜브를 유지합니다. </li><li> 분석 파라미터 (예를 들면, 전압 및 보상)를 결정하기 위해 염색 및 단일 염색 된 샘플을 분석하여 시작한다. </li><li> 분석 매개 변수가 설정되면, 오염 제어를 포함하여, 각 샘플을 로딩하고, 그 결과를 기록한다. 분석 소프트웨어 유세포 분석기를 사용하여 수득 된 결과를 분석한다. </li></ol>

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여기서는 분리하고 췌장 세포의 미세 환경을 분석하는 방법을 설명한다. 이 방법은 배아 및 성체 췌장 조직으로부터 간엽 세포를 분리하는데 사용될 수있다. 또한, 성공적 성인 및 신생아 췌장 5 (17)으로부터 내피 세포를 분리하기 위해 프로토콜을 사용 하였다. 그러나, (다른 프로토콜 (24)을 참조하는 (18), 23에 설명되어) 췌장 상피 세포의 재생 가능한 단일 세포 현탁액을 수득하기에 적합하지 않을 수있다. 이 방법에있어서, 형광 표지 된 세포를 사용하여, 어느 형광 단백질을 발현 또는 표면 마커에 대한 면역 염색, FACS 그래피 또는 유동 세포 계측법에 의해 분석 될 수있다. RNA는 유전자 발현 패턴 프로파일 정제 된 세포로부터 추출 될 수있다. 대안 적으로, 정제 된 세포는 후속 프로테옴 분석 세포주를 확립 배양 할 수있다. 이 방법은 요소 (E)의 특성화를 가능하게그 기관 형성, 생리학 및 병태 생리를 지배하는 췌장의 미세 환경에 의해 xpressed. 췌장 중간 엽는 전구체 및 분화 세포 5, 9의 증식을 촉진하여 조직의 기관 형성을 지원합니다. 이러한 세포는 인간 배아 줄기 세포의 확장을 지원하는 것으로 나타났다 (hESC의)는 췌장 전구 세포를 17, 25, 26 - 유래. 따라서, 배아 중배엽 요소의 ID를 서술하면 hESCs는 당뇨병에 대한 잠재적 치료제로서 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)에서 인슐린 - 생산 베타 세포를 생성하기 위해 현재의 활동을 촉진한다. 마우스 유전자 연구는 췌장 개발의 초기 단계에서 췌장 상피 확장을 촉진하는 간엽에 의해 생성되는 이러한 Fgf10 같은 성장 인자의 식별을 허용3 구. 배아 간엽 표현 추가 요소를 식별하기위한 목적으로, 우리는 레이저 캡처 미세 절제를 사용하여 이러한 세포를 격리 그들의 RNA를 추출하고, 유전자 발현 분석 (26)을 수행 하였다. 그러나, 노동 집약적 인 것에 더하여,이 방법은 종래 주변 간엽 (즉, E12.5)에 상피의 분지에 발달 단계에 사용을 제한하고 그 형태 적 특징에 기초하여 셀 식별에 의존한다. 나중 개발 단계에서 중간 엽 세포를 특성화하기 위해, 우리는 여기서 5, 17에 기재된 방법을 채용. 우리는 신생아 췌장 중간 엽 (5)에 의해 표면 마커의 발현을 분석하기 위해이 방법을 사용했다. 또한, 중간 엽 세포 Nkx3.2 -Cre의 태아 및 신생아의 췌장 조직에서 분리 하였다 R26-EYFP 쥐에 기초그 형광이 마우스 라인 라벨링 및 세포주 (17)을 설정할 배양 하였다. hESC의 유래의 췌장 전구 세포 (17)을 촉진하는 기능 간엽 췌장 분비 인자의 동정 허용 이들 세포의 프로테옴 분석. 우리는 또한 RNA 추출 및 유전자 발현 해석 17 성인 췌장 조직으로부터 간엽 세포를 정제하기 위해 세포 분리 방법을 사용 하였다. 따라서,이 방법은 췌장 세포의 개발을 지원하는 능력, 췌장 간엽 의해 발현 유전자와 단백질을 식별하기 위해 사용될 수있다. 췌장 중배엽 세포는 또한 췌장 종양 발생에 중요한 역할을하는 것으로 하였다. PDAC은 섬유 아세포, 면역 세포로 이루어진 섬유 아세포 풍부한 기질 결합 조직의 형성과 ECM (27)을 특징으로한다. 기질은 많은 발전을 촉진하는 것으로 생각 동안암 유형은 그것의 진행 PDAC (15, 16), (28)을 억제하는 것으로 하였다. 이는 췌장 기질의 구성 요소가 종양을 억제 인자를 분비하는 것이 좋습니다. 또한, 간질 세포 조성물뿐만 아니라, 세포의 표현형의 변화는 상피 세포 (15, 16), (28)에 미치는 영향을 기초 할 수있다. 여기에 기재된 방법에 따라서, 건강한 췌장 조직에 비해 PDAC 기질을 구성하는 다양한 세포 유형 특성화 지원할 수있다. 그것은 또한 다른 간질 세포 유형의 정제 PDAC 진행 중에 그 유전자 발현 프로파일의 전위의 변화를 특성화하도록 허용한다. 그러나, 종양 27 일 동안 췌장 ECM 조성의 변화 등을 포함 되어온 같은 조직 소화 파라미터 조정콜라게나하는 ional 종류 또는 배양 시간을 증가 요구 될 수있다.

에너지 항상성과 포유 동물에서 음식을 소화 적절한 췌장 기능에 따라 달라집니다. 외분비 및 내분비 : 성인 췌장은 두 가지 세포 구획으로 구성되어 있습니다. 생산 및 분비하는 소화 효소 및 소화관에 이들 효소를 운반 덕트 세포를 췌장의 총 질량 (1)의 80 % 이상을 포함 선포 세포를 포함 외분비 세포. 인슐린 - 생산 베타 세포의 제조 및 글루카곤 알파 세포를 포함하는 내분비 세포는 외분비 조직에 삽입 및 혈당이 조절 호르몬을 분비된다 랑게르한스섬이 구성된다. 췌장 세포가 고도로 규제, 다단계 과정 3을 통해 차별화 된 운명을 획득. 증거는 신경 세포, 내피 세포 및 중간 엽 세포에 의해 제공 외적 단서가 t의 췌장 세포 분화 및 증식을 유도 제안그 배아 3, 4, 5. 일 예는 이른 췌장 전구체 (6)의 사양 대동맥의 요구 사항이다. 나중에 개발, 내피 세포는 모두 췌장 내분비와 외분비 세포의 발달에서 중요한 역할을하는 베타 세포 분화 4, 6, 7을 촉진하기 위해 도시 하였다. 간엽 세포는 주로 성장 인자 Fgf10 (8, 9)의 분비를 통해 생존과 공통 췌장 전구 세포의 확장을 지원하기 위해 도시 하였다. 우리는 또한이 세포는 배아 췌장 5 내분비와 외분비 전구체의 증식뿐 아니라의 (소엽 및 베타 세포 포함)에 분화 세포를 지원하는 것을 보여준다. 최근, 중간 엽 세포는 더 있었다내분비 세포 분화 (10)를 규제하는 도시. 성인에있어서, 베타 세포 기능 및 질량 면역 신경 세포, 내피 세포,뿐만 아니라 혈관 주위 세포 11,12,13 포함한 미세 세포에 의존하는 것으로 나타났다. 부상하는 동안, 내피 세포는 베타 세포 복제 (13)을 촉진하기 위해 췌장에 면역 세포를 모집 것으로 나타났다. 내피 세포는 또한 인슐린 발현과 베타 세포 기능 (14)을지지하는 세포 외 기질 (ECM) 성분을 생성하기 위해 도시 하였다. 우리는 최근 베타 세포 기능 11 섬 혈관 주위 세포의 요구 사항을 보여 주었다. 마지막으로, 췌장 실질 세포는 췌장 선암 도관 (PDAC) (15, 16)의 진행을 조절하는 것으로 나타났다. 그러나, 아이디췌장 개발, 기능 및 종양 안내 외인성 큐 엔티티는 대부분 알려져 있지 않다. 췌장 미세 세포에 의해 제공되는 신호를 식별하는 것은 이들 세포에서 발현되는 유전자와 단백질의 특성을 필요로한다. 이러한 및 / 또는 세포주를 확립에서 유전자 발현 및 단백질 체학 분석을 수행하기 위해, 췌장에서 이들 세포를 분리에 달려있다. 여기서는 형광 단백질을 발현 immunofluorescently 표지 된 세포 또는 세포 중의 정렬 조직 효소 분해 형광 - 활성화 된 세포 (FACS)를 사용하여 췌장 미세의 중간 엽 세포를 분리하는 방법을 제안한다. 이 프로토콜은 성공적 배아 신생아 및 성인 췌장 (5), (17)의 중간 엽 세포를 분리 및 옐로우 형광 단백질 (YFP) 발현을 분석 하였다.

<table><tbody><tr><td>콜라겐 분해 효소 P</td><td>Roche</td><td>11213865001</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td>유효 단위는 최소 2,000 unitz/mL 단백질이어야 합니다</td></tr><tr><td>. 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)</td><td>시그마-알드리치</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>생물 산업</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>생물학 산업</td><td>01-862-1A</td><td></td></tr><tr><td>아지드 나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>염소 IgG 혈청</td><td>시그마 -알드리치</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마 알드리치</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>RNAse 억제제</td><td>Invitrogen</td><td>N8080119</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 변형 독수리 배지 (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>염화칼슘 및 염화마그네슘</td></tr><tr><td>없음 1.5 mL 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>72 690</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>둥근 바닥 폴리스티렌 5 mL 튜브</td><td>Corning</td><td>352008</td><td>FACS 튜브. 튜브가 사용할 플로우 사이톰터와 호환되는지 확인하십시오, 브랜드 간에 필요한 튜브에 약간의 차이가 있으므로</td></tr><tr><td>5 mL 튜브와 35 &mu; m 세포 여과기 스냅 캡</td><td>코닝</td><td>352235</td><td>FACS 튜브</td></tr><tr><td>70 &mu; M 세포 스트레이너&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>교반이 있는 가열 블록&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>ThermoMixer C</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>ThermoFisher</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td></td></tr><tr><td>스테로현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td></td></tr><tr><td>세포 분류기</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria IIu</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Gallios&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

분리 및 유동 세포 계측법에 의해 췌장 중간 엽 세포 분석

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

췌장은 음식물 소화와 혈당 조절에 필요한 상피 세포로 구성되어 있습니다. 내피 세포, 신경 세포, 중간엽 세포를 포함한 췌장 미세환경의 세포는 배아 췌장에서 세포 분화와 증식을 조절하는 것으로 나타났습니다. 성인의 경우, 인슐린 생산 세포의 기능과 질량은 주피세포(pericyte), 면역세포(immune), 내피세포(endothelial), 신경세포(neuronal) 세포를 포함한 미세환경의 세포에 의존하는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 췌장 미세환경의 변화가 췌장 종양 형성을 조절하는 것으로 나타났습니다. 그러나 이러한 프로세스의 기저에 있는 단서는 완전히 정의되지 않았습니다. 따라서 췌장 미세환경을 구성하는 다양한 세포 유형을 특성화하고 유전자 발현을 프로파일링하는 것은 정상 상태와 질병 상태에서 조직의 발달과 기능을 설명하는 데 중요합니다. 여기에서는 배아, 신생아 및 성체 마우스의 췌장에서 중간엽 세포를 분리할 수 있는 방법을 설명합니다. 이 방법은 마우스 췌장 조직의 효소 분해 및 후속 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 표지된 세포의 유세포 분석을 활용합니다. 세포는 표면 마커에 대한 면역 염색 또는 형광 단백질의 발현으로 표지할 수 있습니다. 세포 분리는 췌장 중간엽(pancreas mesenchyme)의 세포에서 발현되는 유전자 및 단백질의 특성화를 촉진할 수 있습니다. 이 프로토콜은 배아, 신생아 및 성체 마우스 췌장에서 고도로 농축된 중간엽 세포 집단을 분리하고 배양하는 데 성공했습니다.

췌장 중간 엽는 개발 및 성인기 필요합니다. 여기에 기재된 방법은 배아 신생아 및 성인 췌장에서 중간 엽 세포를 분리 할 수있다. 중간 엽 세포,하지만 다른 종류의 세포는 Nkx3.2 -Cre의 췌장에서 노란색 형광 단백질 (YFP)을 표현; R26R -YFP 마우스 5, 11, 17, 19. 개발하는 동안, (또한 BapX1라고도 함) Nkx3.2 배아 췌장, 위, 창자 및 간엽뿐만 아니라, 골격 somites 19, 20, 21의 서브 세트에 의해 표현된다. 이 유전자는, E9.5을 5 Nkx3.2 -Cre의 제어에 의해 유전자 발현을 허용 E11.5까지 E9.5에서 췌장에서 발현되었다 간엽 </sup&gt; 19, 20. 이 표시에 기초하여, 세포를 유동 세포 계측법을 사용하여 벌크 췌장 조직으로부터 정제 될 수있다. 그림 2는 여기에 설명 된대로 절연, 배아 신생아, 성인 췌장 조직에서 단일 세포의 유동 세포 계측법 분석을 보여줍니다. 비 형질 전환 췌장 조직 형광 세포를 포함하지 않은 반면, Nkx3.2 -Cre; R26R는 -YFP 분석 된 모든 연령대에서 췌장 조직은 별개의 YFP 표지 세포 인구 (; 게이트로 표시된 그림 2)가 포함되어 있습니다. 여기에 설명 된 방법에 따라서, 형광 단백질을 발현하는 세포는 정제되거나 또는 추가적인 면역없이 유동 세포 계측법에 의해 분석 될 수있다. 도 3a에 도시 된 바와 같이 예를 들어, 형광 표지에 기초하여 분류 한 후, 중간 엽 세포, (적어도 다섯 계대) 세포주를 확립 배양 할 수있다. 참고 t<html> 그는 중간 엽 세포에 전형적인 배양 된 세포의 형태를 fibrocytic. 또한,이 시스템은 정렬 된 세포의 유전자 발현을 분석 하였다. 이를 위해, RNA는 cDNA를 합성하기 위해 정렬 된 중간 엽 세포로부터 추출하고, 유전자 발현 수준은 qPCR에 의해 분석 하였다. 이러한 분석은 정렬 된 세포가 팬 - 중간 엽 마커 멘틴 (그림 3B)를 표현하는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 췌장 세포의 표면 마커의 발현은 유동 세포 계측법으로 분석 될 수있다. 예를 들어, 우리는 Nkx3.2 -Cre의 췌장 조직으로부터 세포를 격리; R26R -YFP 여기서 설명 및 섬유 아세포 (22)에 의해 표현되는 것으로보고되었다 CD9 당 단백질 세포 표면로 염색 방법을 사용하여 성인 마우스. 도 3c에 도시 된 바와 같이, 모든 Nkx3.2 -Cre 세포를 형광 표지; R26R -YFP 췌장은 CD9을 표현한다. tp_upload / 55344 / 55344fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 : 배아 및 신생아 췌장 조직. E15.5 태아 (A) 및 P4 강아지 (B)의 위, 비장, 소장, 췌장, 포함한 절연 전체 위장관. 췌장 조직이 청색 선으로 경계가된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig2.jpg" /> 그림 2 : 중간 엽 세포를 형광 Nkx3.2 -Cre에 표시되어 있습니다; R26R -YFP 췌장 조직. 비 형질 전환 (패널 왼쪽)와 Nkx3.2 -Cre에서 분리 된 췌장 세포의 유동 세포 계측법 분석; R26R -YFP 다양한 연령대에서 유전자 변형 (오른쪽 패널) 마우스 : 배아 (A), 신생아 (B), 및 광고ULT (C). 세포는 측면 분산 (y 축)과 노란색 형광 (x 축)에 대해 분석 하였다. ( &quot;D&quot;로 표시) 게이트는 비 - 트랜스 제닉 대조군 트랜스 제닉 마우스에서 YFP + 세포 집단의 존재하지만을 나타냈다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig3.jpg" /> 그림 3 : 격리 된 췌장 세포의 분석. Nkx3.2 -Cre의 췌장 조직에서 분류 (A) 셀; R26R -YFP (도 2b에 설명 된 바와 같이) 신생아 마우스 세포주를 확립 배양 하였다. (우측과 좌측 패널 녹색)과 위상차 배양 된 세포는 형광을 위해 몇 군데 있었다 (회색, 오른쪽 패널). (B) Vimentin1 (Vim1)를 보여주는 바도Nkx3.2 -Cre의 췌장 조직에서 YFP + -sorted 세포의 발현 수준; 정렬되지 않은 췌장 조직 (블랙)에 비해, R26R -YFP 성인 쥐 (녹색도 1C에 기술 된 바와 같이). RNA를 추출하고, 유전자 발현을 qPCR에 의해 분석 하였다; 표현은 시클로 필린에 정상화되었다. N = 4 *** P &lt;0.001. 데이터는 SD ± 평균을 나타냅니다. (C) Nkx3.2 -Cre에서 분산 된 췌장 세포의 흐름 - 세포 계측법 분석; R26R -YFP 성인 쥐의 면역 염색 된 알로 피코시 아닌 (APC)와 안티 CD9 항체를 π 공역 계와 APC (y 축)과 노란색 형광 (x 축)에 대해 분석 하였다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기서, 우리는 중간 엽 세포의 분리에 초점 배아 신생아 및 성인 마우스 조직에서 췌장 미세 세포의 분리 방법을 설명한다. 이 방법은 췌장 개발, 기능 및 종양 형성을 조절하는 외부 신호를 명료하게하기 위하여 세포 유전자 발현 및 단백질 분비를 프로파일 링 할 수있다.

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

본 절차의 전반적인 목표는 유전자 및 표면 마커 발현 분석을 위해 췌장 중간엽 세포를 분리하는 것입니다. 이 방법은 중간엽 세포에서 어떤 신호가 발현되는지, 그리고 그것들이 상피 발달에 어떻게 영향을 미치는지와 같은 췌장 발달 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비교적 간단하고 빠르며, 분리된 세포의 수율이 좋다는 점입니다.HBSS가 담긴 배양 접시에 내장 기관을 옮기고 접시를 실체 현미경 아래에 놓는 것으로 시작합니다. 미세 핀셋을 사용하여 위, 십이지장 및 비장에서 췌장을 분리하여 췌장을 노출시킨 후 간과 신장을 떼어냅니다. 췌장을 수집할 때마다 신선하게 준비된 소화 완충액이 담긴 원추형 튜브에 조직을 옮기고 튜브를 얼음 위에 둡니다.모든 췌장 조직의 채취가 완료되면, 조직을 37 °C 가열 블록으로 옮겨 700 RPM으로 교반하며 30분 동안 처리하고, 15분 후에 튜브를 수동으로 3~4회 반전시킵니다. 소화 과정의 전반부가 지난 후에도 큰 췌장 조직 조각이 남아 있는 경우, 마지막 15분 동안 5분마다 튜브를 반전시키고 필요한 경우 조직을 5~10분 더 배양합니다. 소화가 끝나면 튜브를 얼음 위에 놓고 각 샘플에 차가운 HBSS 10 mL를 첨가합니다.원심분리를 통해 세포를 수집하고 펠렛을 2 mL의 신선한 PBS에 재현탁합니다. 다음으로, 세포를 35 µm 스트레이너로 걸러 5 mL 원형 바닥 폴리스티렌 수집 튜브에 넣고, 소화 튜브를 2 mL의 신선한 PBS로 세척하여 세척액을 해당 수집 튜브에 걸러 넣습니다. 그런 다음 세포를 다시 원심분리하고 펠렛이 흐트러지지 않게 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.동물의 연령에 따라 셀팅 버퍼(sorting buffer)로 세포를 재현탁하고, 새로운 35 micron 세포 스트레이너를 통해 새로운 5 mL 수집 튜브에 여과합니다. 각 형광색소, 생존 염색약, 형광 단백질 및 비염색 대조군을 포함한 염색 대조군용 새로운 FACS 튜브에 세포를 50~100 µL씩 분주합니다. 각 튜브를 최대 4 mL의 셀팅 버퍼로 세척한 후 원심분리합니다.다음으로, 동물의 연령에 따라 펠렛을 신선한 분리 버퍼(sorting buffer)에 재현탁합니다. 그 후 생존 염색약(viability dye)으로 세포를 염색합니다. RNA 추출 전 세포 분리를 위해, 분리 시작 직전에 RNAse 억제제가 포함된 분리 버퍼 1 mL로 멸균된 1.5 mL 수집 튜브를 코팅합니다.5분 후, 수집 튜브를 볼텍싱하고 액체를 제거합니다. 첫 번째 염색 대조군을 볼텍싱한 후 유세포 분석기에 로드하여 소팅 파라미터를 결정하기 시작합니다. 모든 소팅 파라미터가 설정되면, 샘플을 로드하고 세포를 1.5 milliliter 수집 튜브로 소팅합니다.그 후 원심분리를 통해 분류된 세포를 수집합니다. 펠렛 상단의 상층액을 흡입하여 제거하고 표준 RNA 추출 프로토콜에 따라 RNA를 추출합니다. 여기에서는 배아 15.5일차 배아와 생후 4일차 새끼의 위, 비장, 장, 췌장을 포함하여 분리된 위장관 전체가 표시되어 있습니다.방금 시연한 것과 같이 분리한 배아, 신생아 및 성체 췌장 조직의 단일 세포를 유세포 분석기로 분석한 결과, 분석된 모든 연령대의 형질전환 췌장 조직에서 뚜렷한 YFP 표지 세포군이 나타남을 알 수 있습니다. 분리 후, 이 중간엽 세포들은 배양하여 최소 5세대까지 세포주를 구축할 수 있습니다. 배양된 세포에서 중간엽 세포의 전형적인 특징인 섬유성 형태에 주목하십시오.RNA 추출 및 cDNA 합성 후 qPCR로 분석한 결과, 분리된 세포들은 범중배엽 마커인 vimentin을 발현하는 것으로 나타났습니다. 또한, 분리된 췌장 세포 표면 마커 발현 분석 결과, 형광 표지된 transgenic YFP 췌장의 모든 세포가 섬유아세포에서 발현되는 것으로 보고된 세포 표면 당단백질인 CD9를 발현하고 있음을 확인하였습니다. 이 절차 이후에 RNA sequencing과 같은 다른 방법들을 수행하여 중배엽 세포의 유전자 발현에 관한 추가적인 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

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Research

연구

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