확산 내장 뇌교 신경 교종의 신속한 사후 세포 배양을위한 프로토콜 (DIPG)

이 신속한 사후 세포 배양 프로토콜의 전반적인 목표는 미만성 내인성 폰틴 신경교종의 내구성 있는 환자 유래 세포 배양을 생성하여 DIPG에 대한 효과적인 치료법을 이해하고 궁극적으로 개발하는 데 필요한 실험을 촉진하는 것입니다. 이 방법은 미만성 내인성 폰틴 신경교종의 근본적인 생물학 및 치료 전략에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다(예: 특정 약물이 다른 환자 유래 배양에서 작용하는지 여부). 이 기술의 주요 장점은 환자 유래 세포의 생물학을 직접 연구 할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 질병의 다양한 유전적 하위 유형에 걸쳐 다양한 치료 전략을 테스트할 수 있기 때문에 DIPG 치료로 확장됩니다. 이 방법은 DIPG에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 소아 고급 신경교종, 성인 교모세포종 또는 기타 중추신경계 종양과 같은 다른 질병에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 효율적인 방식으로 부검 샘플을 확보하고 신속하게 처리하는 것이 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

시료 전처리 전에 면도날, 곡선형 지혈기 및 기타 비멸균 도구와 함께 조직 배양 후드를 자외선 아래에서 1시간 동안 멸균하고 멸균 조건에서 다음 단계를 모두 수행합니다. 다음으로, 조직을 100mm x 20mm의 높은 벽으로 된 세포 배양 접시에 옮깁니다. 배송에서 남은 배지를 제거하고 10-15ml의 저온 배양 배지로 교체하십시오.

그런 다음 구부러진 지혈기를 사용하여 면도날을 잡고 혈관이나 수막을 제거하면서 조직을 잘게 다집니다. 최종 조직 조각은 1mm 미만이어야 합니다. 그런 다음 조직을 깨끗한 50ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

추가로 5ml의 저온 배양 배지로 세포 배양 접시를 세척하고 샘플을 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 남은 조직을 옮기기 위해 필요에 따라 이 세척 단계를 반복합니다. 10ml 혈청학 피펫을 사용하여 검체를 4-5회 부드럽게 분쇄합니다.

더 큰 조직 조각이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 필요한 경우 1분 동안 샘플을 잠시 원심분리합니다. 해리된 분획을 수집하려면 상층액을 제거하고 100미크론 필터를 통해 기계적 분해라고 표시된 새로운 50ml 원추형 튜브에 여과합니다.

원래의 원뿔형 튜브 위에 필터를 뒤집고 배양 배지로 세척하여 조직 조각을 회수합니다. 그 후, 기계적 해리 분율을 5분 동안 원심분리합니다. 그 후, 펠릿 형태의 기계적 해리 분획에서 상등액을 제거하고 조직을 저온 배양 배지에 다시 현탁시킵니다.

기계적 해리 원뿔형 튜브에 5ml 이상의 조직이 있는 경우 조직을 다른 50ml 원뿔형 튜브로 분할하여 튜브에 5ml 이상의 조직이 없도록 합니다. 그런 다음 기계적으로 해리된 분획을 자당 구배 원심분리 단계까지 얼음 위에 보관합니다. 이 절차에서는 나머지 조직 조각이 들어 있는 원뿔형 튜브를 5분 동안 원심분리합니다.

그런 다음 상등액을 제거하고 예열된 효소 분해 용액을 추가하여 조직 1ml당 5ml의 소화 용액이 있도록 합니다. 그런 다음 원뿔형 튜브 뚜껑을 실험실 필름으로 밀봉하고 섭씨 37도의 회전체에서 30분 동안 반응을 배양합니다. 배양 후 샘플을 부드럽게 분쇄합니다.

10ml 혈청학 피펫을 사용하여 샘플을 6-8회 위아래로 피펫팅하고 과도한 기포가 생성되지 않도록 합니다. 다음으로, 1, 000 마이크로리터 피펫 팁을 피펫 끝에 추가하고 샘플을 추가로 6-8회 분쇄합니다. 남은 덩어리가 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다.

그런 다음 100미크론 필터를 통해 세포가 여전히 부유한 상층액을 제거하고 여과하여 Enzymatic Dissociation이라는 새로운 50ml 원추형 튜브에 넣고 얼음 위에 보관합니다. 그런 다음 효소 해리 튜브를 5분 동안 원심분리하고 자당 구배 원심분리를 계속합니다. 샘플이 여전히 용액에 부유되어 있으면 5분 동안 원심분리합니다.

다음으로, 상층액을 제거하고 칼슘과 마그네슘이 없는 20ml의 차가운 HBSS에 조직을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 차가운 HBSS로 볼륨을 최대 25ml까지 가져옵니다. 25ml의 1.8 몰 자당 용액을 천천히 넣고 튜브를 뒤집어 섞습니다.

그 결과 0.9 몰 자당 구배가 생성됩니다. 그 후, 10분 동안 쉬지 않고 샘플을 원심분리합니다. 가능한 한 많은 자당 자당 용액에서 미엘린 파편을 조심스럽게 흡인합니다.

그런 다음 칼슘과 마그네슘이 없는 차가운 HBSS 30ml를 넣고 부드럽게 혼합하여 샘플을 세척합니다. 그런 다음 5분 동안 원심분리합니다. 이 절차에서는 세척 상층액을 제거합니다.

ACK 용해 완충액 5ml를 추가하고 세포 펠릿을 부드럽게 다시 현탁시켜 실온에서 1분 동안 튜브를 소용돌이칩니다. 그런 다음 칼슘과 마그네슘이 없는 차가운 HBSS 30ml를 첨가하여 용해를 끕니다. 그런 다음 5분 동안 원심분리합니다.

성장 인자와 함께 10-15 밀리리터의 따뜻한 완전 TSM에 최종 세포 펠릿을 다시 현탁시키고 Trypan blue exclusion을 사용하여 혈구계에서 생존 가능한 세포 밀도를 정량화합니다. 그런 다음 최종 세포 현탁액을 새로운 T75 배양 플라스크로 옮깁니다. 전반적인 성장 인자 수준을 유지하기 위해 격일로 추가 성장 인자를 추가하고 종양 세포 신경구의 발달을 모니터링합니다.

다음은 배양의 초기 단계부터 내구성 있는 배양에 이르기까지 샘플이 어떻게 나타날 수 있는지에 대한 다양한 예입니다. 초기에는 도금 배양과 초기 배양액이 많이 남아 있지 않은 것으로 보이는 경우가 많습니다. 더욱이, 초기 세포 클러스터는 종종 일반적으로 신경구와 관련된 대비의 정도를 나타내지 않습니다.

그러나 이러한 세포 클러스터의 초기 통과와 세포 클러스터의 역 필터링을 결합하면 구를 형성할 수 있는 건강한 종양 세포를 분리할 수 있습니다. 여과액에는 일반적으로 남은 파편이 포함되어 있습니다. 그런 다음 이러한 환자 유래 샘플은 여러 계대에 대해 배양에서 유지될 수 있습니다.

일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행하면 3-4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 효소 해리를 제외한 모든 단계에서 샘플이 저온으로 유지되도록 하고 샘플의 외상성 취급을 최소화하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 DIPG 병리생물학에 대한 후속 질문에 답하기 위해 체외 약물 스크리닝 또는 orthotopic 이종이식과 같은 추가 연구를 수행할 수 있습니다.

개발 후 이 배양 기술은 소아 신경 종양학 분야의 연구자들이 DIPG를 앓고 있는 어린이를 위한 새로운 치료 방법을 모색할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 뇌종양 샘플에 대해 신속한 사후 세포 배양 프로토콜을 수행하는 방법에 대해 잘 알게 될 것입니다. 인체 조직으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 개인 보호 장비 및 멸균 기술 착용과 같은 예방 조치를 항상 사용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.