세포 분화 및 견인 힘의 상관 관계 분석을위한 높은 처리량 세포 마이크로 어레이 플랫폼

본 세포 마이크로어레이 플랫폼의 전반적인 목표는 미세환경적 맥락의 함수로서 세포 분화와 견인력의 측정치를 상호 연관시키는 것입니다. 이 방법은 조직 공학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있으며, 줄기세포 생물학의 기초 연구와 분화 프로토콜의 최적화를 모두 가능하게 합니다. 이 기술의 주요 장점으로는 처리량이 높다는 점, 생화학적 및 생물물리학적 자극을 다양하게 변화시킬 수 있다는 점, 그리고 면역형광법과 견인력 현미경법(TFM) 모두를 통해 최종 결과물을 읽어낼 수 있다는 점 등이 있습니다.

이 방법은 간 전구세포 분화를 이해하는 데 사용되었으나, 다른 동맥 세포 유형 및 조직 환경에도 쉽게 적용될 수 있습니다. 실험의 성공은 어레이 프로토콜을 고품질 하이드로젤 기질 및 견인력 현미경(TFM)과 통합하는 것에 달려 있으므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. TFM을 이용하여 세포-기질 상호작용을 실시간으로 평가하기 위해, 실란화 처리된 35 mm 유리 바닥 페트리 접시에 형광 비드가 포함된 폴리아크릴아마이드 하이드로젤을 제작하려면, 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 용액 내에서 유리 기질을 준비하십시오.

실란화 처리된 35 mm 유리 바닥 페트리 접시를 유리 건조 트레이에 넣고, 각 접시의 중앙에 9:1 비율의 프리폴리머 비드 및 광개시제 용액 20 microliters를 피펫으로 분주합니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 각 접시를 12 mm 원형 커버슬립으로 부드럽게 덮습니다. 형광 비드를 하이드로젤 표면에 고르게 분포시키기 위해, 접시를 뒤집어 실온에서 20분 동안 방치합니다.

디시를 뒤집은 상태로 365 nanometer UVA에 10분 동안 노출시킵니다. 필요에 따라 중합 시간을 최적화하십시오. 그다음, 하이드로겔을 1 molar HEPES 버퍼에 담가 상온의 암소에서 하룻밤 동안 둡니다.

중합된 하이드로젤이 손상되지 않도록 주의하며 면도날로 커버 슬립을 조심스럽게 제거합니다. 핫플레이트 위에서 50 °C로 하이드로젤을 완전히 건조될 때까지 탈수시킵니다. 하이드로젤은 암소의 실온 상태에서 3개월 동안 보관할 수 있습니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 바이오 분자를 프린팅하기 위한 완충액과 소스 플레이트용 완충액을 준비합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 깨끗한 핀을 로드한 후, 마이크로어레이어를 준비하고 제조사 소프트웨어를 사용하여 프로그래밍합니다. 다음으로, 가습 장치를 켭니다.

설정값을 상대 습도 65%로 조절하고 레오미터가 설정값에 도달할 때까지 기다립니다. 소스 플레이트를 적절한 어댑터에 장착합니다. 그런 다음 탈수된 하이드로젤 기판을 적절한 어댑터에 장착합니다.

소스 플레이트의 레이아웃, 어레이 설계 및 원하는 포맷을 정확하게 반영하도록 프로그램의 파라미터를 조정하십시오. 어레이 제작을 시작하십시오. 습도가 65% 상대 습도 미만으로 떨어지지 않았는지, 그리고 핀이 막히지 않았는지를 최소 한 시간에 한 번씩 확인하십시오.

습도가 예상치 못하게 떨어졌다면, 가습기를 채우고 관련 튜브의 응결물을 제거하기 위해 어레이 작업을 일시 중단하십시오. 핀이 막힌 경우, 핀을 세척하거나 미리 세척된 핀으로 교체하기 위해 어레이 작업을 일시 중단하십시오. 프로그램이 완료되면, 제작된 어레이를 알루미늄 호일로 덮은 슬라이드 박스 또는 마이크로 플레이트에 넣으십시오.

어레이를 상대습도 65%의 실온에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 저희의 경험상, 가장 흔한 문제는 어레이 제작과 관련하여 발생합니다. 형광 표지 분자, 일반 단백질 염색 및 면역형광법을 사용하여 제작된 어레이의 기술적 품질과 견고성을 확인하는 것을 권장합니다.

제작 다음 날, 어레이가 담긴 35 mm 페트리 접시를 PVS 내 1% v/v penicillin-streptomycin 3 mL에 담급니다. 어레이 기판을 UVC에 30분 동안 노출시킵니다. 그 후 penicillin-streptomycin 용액을 세포 배양 배지로 교체합니다.

세포를 수집하고 계수한 후, 35 mm 페트리 접시당 3 mL의 비율로 세포를 어레이에 분주합니다. 어레이 배양물을 37 °C, 5% CO2 조건에서 2~24시간 동안, 또는 세포 아일랜드가 충분히 형성될 때까지 배양합니다. 분주 밀도와 배양 시간은 세포의 종류 및 특정 응용 분야에 따라 조정할 수 있습니다.

세포 아일랜드가 형성될 때까지 기다린 후, 미리 데워둔 세포 배양 배지 3 mL로 어레이 배양물을 두 번 세척하십시오. 이 시점에서 적절한 대조군과 관심 처리제를 생물학적 시스템에 추가할 수 있습니다. 처리제의 농도를 유지하기 위해 1~2일마다 어레이의 배지를 교체하십시오.

어레이 배양을 시작한 후 1~5일 이내에 TFM을 사용하여 세포-기질 상호작용의 라이브 평가를 수행합니다. 어레이 배양이 담긴 35 mm 페트리 접시를 TFM 측정을 위해 로봇 스테이지가 장착된 배양용 도립 형광 현미경으로 옮깁니다. 하나의 접시에서 위상차 현미경을 사용하여 개별 세포 섬의 위치와 초점 평면을 표시합니다.

비드들을 시각화하기 위해 원적색 형광 현미경으로 전환하십시오. 그런 다음 이전 단계에서 저장한 각 위치로 돌아가 초점 평면의 z-좌표를 수정하여, 세포 아일랜드 아래의 첫 번째 비드 층만 초점이 맞도록 설정하십시오. 새 좌표를 저장하고 모든 세포 아일랜드의 자동 이미지 촬영을 진행하여, 해리 전 단계의 위상차 및 원적색 형광 이미지를 획득하십시오.

다음으로, BSA/SDS 용액 150 µL를 디시에 조심스럽게 넣고, 세포가 기질에서 완전히 분리될 때까지 5분 동안 기다립니다. 위상차 현미경을 사용하여 세포 분리 상태를 관찰합니다. 세포 군집이 기질에서 분리된 후, 표시해 둔 위치로 돌아가 첫 번째 비드 층이 여전히 초점 내에 있는지 확인합니다.

세포가 생성한 견인력으로 인한 변형으로 인해 비드들이 초점 평면을 벗어난 경우, 비드들이 다시 초점에 맞도록 초점 평면의 z-좌표를 보정하십시오. 보정된 z-좌표를 저장하고 모든 아일랜드의 자동 이미징을 반복하여 해리 후의 원적색 형광 이미지를 캡처하십시오. 나머지 디시들에 대해서도 이 단계들을 반복하십시오.

Protein A/G가 접합된 notch 리간드 jagged one 및 delta like one은 하이드로겔 내에서 개선된 유지력을 보여주었습니다. Notch 리간드의 제시 또한 녹색 담관 세포 마커의 존재로 확인된 바와 같이, 간 전구세포가 담관 세포 운명으로 분화하도록 유도했습니다. 5가지 세포외 기질(ECM) 단백질에 대해 notch 리간드에 대한 반응을 정량화한 결과, 리간드에 대한 간 전구세포의 반응이 ECM 환경에 따라 달라짐을 보여주었습니다.

delta-like 1 및 jagged 1 리간드가 없는 전구세포를 생성하기 위해 소형 헤어핀 RNA(shRNA) 넉다운을 이용하였습니다. 이후 세포에 notch 리간드인 jagged 1, delta-like 1 및 delta-like 4를 처리하였습니다. 어레이화된 notch 리간드에 대한 반응은 각 리간드의 세포 내재적 발현 여부에 따라 다르게 나타났습니다.

이 이미지들은 간 전구세포의 분화가 기질 강성과 ECM 조성 모두에 의존함을 보여줍니다. 정량적 분석 결과, collagen four는 부드러운 기질과 딱딱한 기질 모두에서 분화를 지원하는 반면, fibronectin은 딱딱한 기질에서만 분화를 지원하는 것으로 나타났습니다. 대표적인 히트맵은 collagen four의 낮은 기질 강도에서 지속되는 견인 응력이 담관 세포로의 분화를 촉진함을 시사합니다.

이러한 결과는 견인 응력(traction stress)의 평균 제곱 평균(root mean square) 값의 정량을 통해 확인되었습니다. 본 영상과 부수되는 프로토콜에서는 어레이형 기판 위에서 세포 배양을 수행하기 위한 하이드로젤 및 어레이 제작의 주요 단계와, 견인력 현미경(traction force microscopy)을 이용한 세포-기판 상호작용 측정 방법을 제공하였습니다. 해당 기술에 익숙해진 후에는 적절히 수행할 경우 각 실험을 최소 1~2주 만에 완료할 수 있습니다.

본 방법과 병행하여, 정성적 PCR, 면역 블로팅, 표준 척도 역학 생물학 축 또는 기타 상보적인 분자 생물학적 기법을 사용하여 점수가 높은 어레이 조건을 세포 배양을 통해 검증해야 합니다. 이 다용도 플랫폼은 줄기세포 분화 및 암세포 생물학을 포함하여 광범위한 세포 및 조직 맥락에서 세포 기능을 고속 대량으로 조사하는 데 적용될 수 있습니다.