Name: 세포 분화 및 견인 힘의 상관 관계 분석을위한 높은 처리량 세포 마이크로 어레이 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 배우세요 세포 분화와 견인 힘의 상관 관계를 분석하는 고처리량 세포 마이크로 어레이 플랫폼을 활용한 줄기세포 생물학 연구 방법입니다. 이 기술은 조직 공학 및 세포 생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

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우리는 인정 오스틴 Cyphersmith 및 Mayandi Sivaguru (게놈 생물학에 대한 칼 R. Woese 연구소, 어 바나 - 샴페인 일리노이 대학) 현미경에 대한 지원과 관대 현미경의 핵심 화면과 비디오 캡처를 수용.

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

실험에서는 가장 일반적인 실패가 제조 어레이의 품질과 관련된 불완전하게 관심있는 생물학적 시스템에서의 반응을 특징으로하는 것을 발견 하였다. 우리는 세포 마이크로 어레이 실험의 일반적인 고장 모드 및 관련 문제 해결 단계 표 1에 독자를 참조하십시오. 특히 배열의 품질에 관해서는, 우리는 다음을 추천합니다. 이러한 로다 민 - 복합 덱스 트란과 같은 형광 표지 된 분자를 사용하는 프로그램, 매개 변수 및 버퍼으로 배열의 기술적 품질과 견고성을 확인합니다. 전이나 더 시각적으로 제조업체의 지침에 따라에 배열 이후 어느 철저히 핀은 핀 채널을 광학 현미경을 이용하여 이물질이 명확 있는지 확인합니다. 일반적으로 단백질 얼룩 또는 immunolabeling를 사용하여 배열 된 생체 분자의 보유를 확인합니다. 70 kDa의 아래 분자량 생체 분자가 자주 하이드로 겔 (23)에 유지되지 않습니다, </<html> SUP&gt; 31. 여러 종류의 세포를 사용하여 배열 된 생체 분자 세포 기능을 확인합니다. 만 부착 세포 배열과 호환합니다; 또한, 배열에 접착 두 세포 고유의 특성 (예를 들어, 인테그린 발현 프로파일) 및 선택한 ECM 단백질에 따라 달라집니다. 때문에 제한된 공간에, 우리는 여기에 배열 디자인, 레이아웃, 및 제조의 광범위한 치료를 제공하지 않은 이전 23 일에, 25 독자를 참조하십시오. 우리는 일반적으로 10 ~ 20 고유 한 생체 분자 조건 (즉, 5 ~ 10 점 / 상태)로 구성된 100 자리 서브 어레이 (150 μm의 스폿 직경 450 μm의 중심 간 거리)를 사용합니다. 하나의 배열의 서브 어레이의 수는 편안하게 한 25 × 75mm 현미경 슬라이드에 1,280 개까지 확장 할 수 있습니다 관심의 생체 분자 상태의 수에 따라 달라집니다 (~ 64 서브 어레이에서 6,400 점)외부 참조 &quot;&gt; 25, 31 파라미터는 상기 추가의 관심의 패턴의 크기에 따라 달라질 수는]. (75)로부터 패턴을 발생하는 핀 - 450 ㎛의 용이하게 이용할 수있다. 어레이 실험은 가장 다른 문화 형식을 사용하여 관심의 높은 점수를 배열 조건, 분석 판독 및 생물학적 모델 시스템의 유효성 검사에 의해 보완된다. 특히, 우리는 또한 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, QRT-PCR, 면역 블) 또는 표준 TFM와 함께 대량 배양을 사용하여 선택 배열 조건의 효과를 검증하는 것이 좋습니다. 유전자 조작 할 수도 어레이에서 관찰 된 효과를 확인하는 역할을 적절한 생물학적 모델 시스템에 대한 관심의 인자 (예를 들어, 최저 또는 과발현). 생체 내 동물 모델이 검증의 또 다른 방법을 나타내는 최근의 galectin-3 galectin-8의 중심 역할을 확인하기 위해, 예를 들어, 사용 된폐암 전이 틈새는 등의 초기 셀 마이크로 어레이 (31), (49)을 통해 확인했다. 다른 방법의 수는 2 차원 미세 시스템 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 및 3 차원 설계 생체 시스템 (56)의 종류, 57, 58을 포함한 세포 기능의 미세 환경 규제를 조사하는데 사용되어왔다 59, 60, 61. 다른 방법과 비교하여, 여기에 설명 된 셀 마이크로 어레이 플랫폼의 특별한 장점은 다음과 같이 구성한다 : (1) 최대 스루풋수백 또는 상호 작용 효과의 분석을 가능 요소의 다른 조합의 수천; (2) 액세스 자동화 영상 분석; (3) 배열 요소의 제어 프리젠 테이션을 모두 생화학 및 생물 물리학 판독의 통합; (4) 기판의 재료 특성을 변경하는 능력; 세포 운명 기능 (5)가 높은 콘텐츠 단일 세포 분석. 요약하면, 가변 기판 강성의 기판 상에있는 셀 TFM 마이크로 어레이의 조합 모두 생화학 및 생물 물리학 적 큐 완전한 특성화를 가능하게한다. 여기에 제시된 바와 같이,이 플랫폼은 일반화하고 용이 세포 분화 및 mechanotransduction의 조합 미세 환경 조절의 개선 된 이해를 향해 부착 세포 유형 및 조직 다양한 상황에 적용될 수있다.

세포와 주변의 미세 환경 요인 사이의 상호 작용은 개발, 항상성 및 질병 병인 1, 2, 3, 4에 걸쳐 생물학적 과정의 많은 다양한 중재. 이러한 미세 환경의 상호 작용은 결합 리간드 - 수용체를 통해 세포 용해 인자의 전달, 바인딩 셀 매트릭스 및 세포 - 세포 상호 작용을 포함한다. 상기 생화학 적 고려 사항에 더하여, 예컨대, 기판의 기계적 성질 등의 생물 리 학적 매개 변수 (예, 영률, 기공율)과 셀 형상 및 관련 하류 mechanotransduction 점점 세포 분화 5, 6, 7, 8의 중요한 매개체로서 인식을 얻고, 9 <sup&gt; 10. 이러한 미세 환경의 상호 작용으로 인한 신호는 유전자 네트워크 및 신호 경로에 대한 입력으로서 역할을한다. 또한, 이러한 세포 고유의 구성 요소는 세포 고유의 유전 적 프로그램과 세포 외부 미세 환경 요인 5, 11, 12 사이의 복잡한 공동 규제 루프를 완료 분비 요인과 행렬 분해 효소를 통해 미세 환경에 대한 피드백을 제공합니다. 미세 환경 요소의 조절 프레젠테이션 설계 시스템의 사용은 다른 컨텍스트 13, 14, 15의 범위에 유용한 입증되었다. 특히 미세 가공 시스템은, 소형화 (13)을 통해 단백질 및 세포뿐만 아니라 고도의 병렬화 분석 정확한 공간적 패턴을 용이 한 <sup클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. 세포 마이크로 어레이는 생체 분자의 조합은 접촉 인쇄 탄성 폴리 아크릴 아미드 겔 기판 23, 24, 25로되어있는 하나의 미세 가공 시스템을 나타낸다. 세포 접착 성분 (즉, 기질 단백질)의 포함은 자주 면역 세포 형광 기자를 통해 다운 스트림 분석 뒤에 마이크로 어레이에 지속적인 세포 부착과 문화를 가능하게한다. 세포 마이크로 어레이 생산적 간세포 표현형 23, 26, 신경 전구 분화 27 mammar의 개선 된 이해를 달성 지향 된Y 전구 세포 운명 결정 (28), 배아 줄기 세포의 유지 / 분화 23, 29, 30, 폐암의 전이 (31) 및 흑색 종 (32)의 치료 반응. 최근 내배엽 스펙 33 간 선조 분화 34, 35, 폐 종양 세포의 약물 반응 (36)의 세포 외 기질 (ECM) 단백질 조성물의 역할을 규정하는 셀 마이크로 어레이의 사용을 증명하고있다. 이러한 작업에서는 어레이 플랫폼의 조합 기능을 확장 및 세포 외 기질 성분과 세포와 생체 역학 극한 신호의 교점을 탐구에 초점을 맞추고있다. 또, 능력 정량적 charac에 제공하기 위해 배열 플랫폼 생물 물리학 판독을 구현분화 세포의 수축력의 terize 역할은 (35)을 처리합니다. 이를 위해, 우리는 세포에서 생성 된 견인의 높은 처리량 평가를 가능하게 세포 마이크로 어레이와 견인 힘 현미경 (TFM)를 통합. TFM 세포에서 생성 된 견인력을 측정하기 위해 널리 이용되는 방법 및 조성물 및 로컬 미세 37, 38, 39, 40의 역학과 단일 세포 및 조직 수준 함수의 조정에 관한 중요한 통찰력을 제공했다. 따라서, 셀과 마이크로 어레이 TFM을 결합하는 중요한 생리 학적 관련성 생 물리적 파라미터를 측정하기위한 고 처리량 시스템을 제공한다. 여기에 설명 된 셀 마이크로 어레이 플랫폼은 네 개의 섹션으로 구성되어 폴리 아크릴 기판, 어레이, 세포 배양 분석법 및 판독의 가공 및 데이터 분석의 제조. 만나다처음 세 개의 실험 구역의 개략적 인 요약 그림 1; 면역 형광 데이터의 분석에 초점을 맞춘 마지막 부분의 개략적 인 요약 그림 2를 참조하십시오. 역학적 세포 - 기질 상호 작용의 연구에 세포 마이크로 어레이 플랫폼에 적응하기 위해, 우리는 웬 동부 알 당 동조 영률이지만 유사한 다공성 폴리 아크릴 기판을 사용했다. 41. 자신의 기판에 세포에 의해 가해지는 힘의 TFM 측정을 가능하게하기 위해, 우리는 자주 다른 그룹에 의해 이용 슬라이드 두꺼운 유리 현미경 이외에 유리 바닥 페트리 접시 형식을 구현했습니다. 따라서,이 세포 마이크로 어레이 플랫폼은 별도의 유리 - 바닥 접시에 TFM 통해 현미경 슬라이드 및 셀에서 생성 된 힘에 대한 면역 세포 분화를 통해 병렬 측정 할 수있다. 우리는 또한 일반적으로 세포 마이크로 어레이에 사용 된 분석 방법에 몇 가지 개선 사항을 적용했습니다. SpecificalLY 대신 전체 섬 강도의 파라 메트릭 Z 점수를, 우리는 단일 셀의 강도를 측정 및 비 정규 분포를 설명하고 더 정확하게 세포의 동작을 설명하기 위해 분위수 정상화를 적용합니다. 우리는 이러한 개선은 생화학 및 생물 물리학 모두 단서가 중요한, 교차 역할을하는 생물학적 과정의 조사에 대한 특정 유틸리티를 제공 믿습니다. 또한, 우리의 분석 개선은 단일 셀과 인구 수준의 문제가 발산되는 세포 기능의 범위의 연구와 세포 마이크로 어레이의 적용을 가능하게한다.

<table><tbody><tr><td>0.2 & 마이크로; m 주사기 필터</td><td>Pall Corporation</td><td>4433</td><td>적절한 크기의 Luer Lock 플라스틱 주사기와 일치합니다.</td></tr><tr><td>100 &times; 페니실린&ndash; 스트렙토마이신 용액</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>22 &times; 60 mm</td><td>coverglasses Electron Microscopy Sciences</td><td>63765</td><td></td></tr><tr><td>3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트(3-TPM)</td><td>시그마-알드리치</td><td>440159</td><td>제조업체의 지침에 따라 불활성 가스에 보관하십시오. 3-TPM이 공기에 노출되면 유리 기판의 실란화가 손상될 수 있습니다. 주의: 3-TPM은 가연성 액체입니다. 열, 스파크, 화염 및 뜨거운 표면에서 멀리 유지하고 화학 흄 후드에만 사용하십시오.</td></tr><tr><td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 페트리 접시</td><td>Cell E& G</td><td>GBD00002-200</td><td>#1.5 커버글라스로 구성된 13mm 웰. TFM 및 라이브 셀 이미징을 가능하게 합니다.</td></tr><tr><td>384웰 폴리프로필렌 V-바닥 마이크로플레이트, 비멸균</td><td>USA Scientific</td><td>1823-8400</td><td></td></tr><tr><td>6웰 폴리스티렌 마이크로플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>35mm 유리 바닥 페트리 접시는 마이크로플레이트의 웰에 맞아 어레이 제작이 용이합니다.</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>시그마-알드리치</td><td>179973</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>A3553</td><td>주의: 아크릴아마이드에 노출되면 급성 독성과 자극을 유발할 수 있습니다. 보호 장갑, 의복 및 보안경을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>콜라겐 I, 쥐 꼬리</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115MI</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 III, 인간</td><td>EMD Millipore</td><td>CC054</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 IV, 인간</td><td>EMD Millipore</td><td>CC076</td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker, 365 nm</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1841</td><td>어레이 위치의 마커로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Fisher Scientific(HyClone)</td><td>SH3001302</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Fc-재조합 DLL1, 마우스</td><td>R& D 시스템</td><td>5026-DL-050</td><td></td></tr><tr><td>Fc 재조합 DLL4, 마우스</td><td>AdipoGen</td><td>AG-40A-0145-C050</td><td></td></tr><tr><td>FC 재조합 JAG1, 쥐</td><td>R & D Systems</td><td>599-JG-100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin, human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경, 도립</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td>Ensure 현미경에는 자동 형광 이미징 및 TFM을 위한 로봇 스테이지가 장착되어 있습니다. 환경 제어 (i.e., 37 &deg; C 및 5% CO2)는 TFM에 매우 권장됩니다.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>빙초산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td>주의: 아세트산은 가연성이며 부식성이 있습니다. 보호 장갑, 의복 및 보안경을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF Corporation</td><td>55047962</td><td></td></tr><tr><td>라미닌, 마우스</td><td>EMD 밀리포어</td><td>CC095</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>179957</td><td></td></tr><tr><td>마이크로어레이 스캐너</td><td>GenePix</td><td>4000B</td><td>형광단은 Cy3 또는 Cy5와 호환되어야 합니다.</td></tr><tr><td>Microarrayer</td><td>Digilab</td><td>OmniGrid Micro</td><td>유사하거나 더 큰 용량의 다른 microarrayer를 즉시 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드, 25 &times; 75 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294775X25</td><td>~0.9 &ndash; 1.1 mm 두께.</td></tr><tr><td>N,N&prime; -Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td>주의: 아크릴아미드에 노출되면 급성 독성 및 자극을 유발할 수 있습니다. 보호 장갑, 의복 및 보안경을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA), 16% v/v</td><td>전자 현미경 과학</td><td>RT15710</td><td>최적의 고정을 위해 PFA를 신선하게(보관하지 않음) 준비합니다. 주의: PFA에 노출되면 급성 독성이 발생할 수 있으며 접촉 시 피부를 자극하거나 부식시킬 수도 있습니다. 보호 장갑, 의복 및 보안경을 착용하고 화학 흄 후드에서만 사용하십시오.</td></tr><tr><td>단백질 A/G, 재조합</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 건조 트레이, 2,000&nbsp; mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-242B</td><td></td></tr><tr><td>직사각형 4챔버 배양 접시</td><td>Fisher Scientific (Nunc)</td><td>12-565-495</td><td>어레이 현미경 슬라이드의 세포 배양용.</td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>415413</td><td>주의: NaOH는 부식성이 높으며 심각한 피부 화상과 눈 손상을 유발할 수 있습니다. 보호 장갑, 의복 및 보안경을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>ArrayIt</td><td>SMP3</td> <td>어레이를 위한 스텔스 핀</td><td>제조업체의 지침에 따라 각 어레이 실행 후 핀을 정리합니다. 150미크론 도메인을 생성합니다. 다른 핀 크기를 구입하십시오 (75&ndash; 450 미크론)을 특정 응용 분야에 적합합니다.</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 분화 및 견인 힘의 상관 관계 분석을위한 높은 처리량 세포 마이크로 어레이 플랫폼

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

탄성 하이드로 겔 표면에 생체 분자의 접촉 인쇄 조합으로 구성 미세 세포 마이크로 어레이, 세포 분화에 배열 생화학 적 신호의 영향을 측정하기 위해 엄격하게 제어되는 높은 처리량 설계 시스템을 제공한다. 세포 마이크로 어레이를 사용하는 최근의 노력은 많은 미세 환경 요인이 병렬로 제공되는 조합 연구에 대한 자신의 유틸리티를 증명하고있다. 그러나, 이러한 노력은 세포 반응의 생화학 적 큐의 효과를 조사에 주로 초점을 맞추고있다. 여기서는 견인력 현미경 면역 및 생체 역학적 세포 기질 상호 작용에 의해 두 세포 분화를 평가하기 위해 가변 파장 재료 특성을 갖는 세포 마이크로 어레이 플랫폼을 제시한다. 이를 위해, 우리는 하나 현미경 슬라이드 또는 유리 바닥 배양 접시에 제작 된 탄성 계수 변화의 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔을 이용하여 두 개의 서로 다른 형식을 개발했습니다. 우리는 BES를 제공이러한 하이드로 겔 기판에 마이크로 어레이의 제조, 마이크로 어레이에 후속 세포 배양 및 데이터의 수집을위한 t 관행 및 문제 해결. 이 플랫폼이되는 생화학 적 (예, 세포 외 매트릭스 성분) 모두 및 생물 물리학에 대한 (예를 들면, 기판의 강성) 큐 역할 교차 상당한 재생할 수 생물학적 과정 연구에 사용하기 위해 적합하다.

이 플랫폼을 사용하여, 우리는 간 선조 34, 35의 운명 사양 모두 생화학 및 생물 물리학 적 큐의 역할을 조사 하였다. 단백질 A / G 공역 노치 리간드가 폴리 아크릴 아미드 겔 (도 3A)에서 향상된 보존 및 클러스터링을 보여 담관 세포의 운명 (도 3b)를 향해 간 전구 세포의 분화를 구동 더욱이 능력이었다. 단일 세포 분석을 이용하여, 우리는 리간드 간 전구 세포의 반응은에 또한 의존한다는 것을 발견은 ECM 단백질 콜라겐 I, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 피브로넥틴 및 라미닌 (도 3C)에 대한 노치 리간드에 대한 반응을 정량화 ECM 컨텍스트. 마지막으로, 우리는 리간드 DLL1과 Jag1없이 간 전구 세포를 생성하는 shRNA를 최저를 이용했다. 배열 된 노치 리간드에 대한 반응은 PR에 따라 변하며어느 esence 리간드는 세포 - 외인성 리간드에 반응성이 세포 리간드 극한 표현 (도 3d)의 함수이기도 것을 확인. 또한, 우리는 이중 양성의 고유 한 하위 집단을 관찰 (ALB + / OPN +)를 DLL1 최저 (그림 3D) 세포. 함께, 이러한 대표적인 결과를 표시한다 : (1) 개인 리간드 최저 여러 배열 ECM 단백질 노치 리간드의 페어링에 의해 예시 된 바와 같이 어레이 형태의 조합 기능; (2)뿐만 아니라의 기능은 ECM 단백질 배열뿐만 아니라, 단백질 A / G 매개 결합을 통해 세포 - 세포 리간드 배열; 및 (3) 우리 단세포 분석하고 독특한 개체군을 식별 할 수있는 기능의 구현. 우리는 또한 간 전구 세포의 분화가 기판 강성 및 ECM 성분 (그림 4A 모두에 의존하는 것을 관찰 </str<html> 피브로넥틴은 딱딱한 기판 (그림 4B)의 분화를 지원하는 반면 옹&gt;), 특히 그 콜라겐 IV를 찾는 것은 모두 부드럽고 딱딱한 기판에 분화 지원합니다. TFM 측정의 대표적인 히트 맵은 콜라겐 IV에 낮은 기판 강성에 지속적인 견인 스트레스 담관 세포 (그림 4C), 평균 제곱 평균 제곱근 값 (그림 4D)에 의해 확인 발견로의 분화를 촉진하는 것이 좋습니다. 함께, 이러한 대표적인 결과는 표시 (1) 가변 강성 기판 상에 마이크로 어레이와 셀 TFM의 성공적인 통합 세포 표현형 및 트랙션 응력 모두를 평가하는 단계; (2) 매트릭스 조성물과 기판 강성 모두 간 전구 세포 운명의 조정; (3) 세포 마이크로 어레이 우리의 TFM 분석 및 일반적인 견인 스트레스 프로파일의 구현입니다. 전자 1 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 : 첫 번째 세 가지 실험 섹션보기 개요 도식. 제 1 절에서, 유리 기판 청소 및 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔의 제조를 용이하게하기 위해 실란 화된다. 섹션 2에서, 관심의 생체 분자의 조합은 384도 원 마이크로 제조된다. 로봇 Arrayer에 다음에 하이드로 어레이를 제조 깨끗 핀, 소스 마이크로 및 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔에 로딩되고 초기화된다. 제 3 항에있어서, 세포가 배열 된 영역에 시드와 명소 배양 프로토콜이 수행 된 후 부착 할 수있다. 엔드 포인트에서 세포 중 하나 TFM를 사용하여 면역 세포 / 면역 고정 또는 분석된다. 스케일 바는 75 μm의 수 있습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> = &quot;1&quot;&gt; 페이지 내에서 <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> 그림 2 : 처리 및 배열에서 면역 형광 데이터의 분석. (A) 기와는 복합 32 비트 RGB 이미지는 제 비닝 후 개별 8 비트 채널로 분할된다. 배열 형광 마커와 세포 섬의 조합을 사용하여, 상기 어레이의 세 모서리가 자동 배향 및 배열 리딩 있도록 식별된다. (B) 단일 셀의 데이터는 입력 된 어레이의 각 채널에 대해 생성된다. 실험적 편차를 고려하기 위해 정규화 분위수 모든 복제에 걸쳐 단일 공유 분포를 생산 생물 복제에 적용된다. 분위수 정규화 된 데이터는 연속적으로 또는 단일 셀 분포를 직접 분석 (라벨 백분율 양성 세포의 강도를 의미하는, 예를 들면, 셀 / 섬) 플롯 앙상블 측정의 계산을 통해 해석된다.m / 파일 / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> 그림 3 : 노치 리간드 프리젠 테이션에서 중재 간 전구 차별화. (A)는 노치 된 Fc 재조합 리간드 가변 -1- (JAG1) 델타 형 1 (DLL1)의 단백질 A / G로 배열 향상된 보존 및 클러스터링을 나타냈다. 스케일 바는 50 μm의입니다. (B) 간 선조는 노치 리간드을 제시 담관 세포를 분화. 4 &#39;, 6- Diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)을 핵 라벨 알부민 (ALB)는 간세포 마커이며, 오스테 오 폰틴은 (OPN)는 담관 세포 마커이다. 스케일 바는 150 μm의입니다. (C)이 ECM 단백질의 노치 리간드 JAG1, DLL1, 델타 같은 4 (DLL4)를위한 OPN 양성 세포의 비율의 정량은 I를 콜라겐, Collagen III, 콜라겐 IV, 피브로넥틴 및 라미닌. 학생의 t의 -tests은 P &lt;0.05 (*)에 대한 표시 P-값으로 각 ECM 단백질 내의 각 배열 노치 리간드에 대한 제어 IgG에 대해 수행되었다. 노치 리간드 JAG1, DLL1 및 DLL4되게 콜라겐 III에 셀 ALB 및 OPN의 (D) 영상 세포 계측법. 노치없이 간 전구 세포는 DLL1과 Jag1 (즉, shDll1 및 shJag1가)의 shRNA 최저를 사용하여 생성 된 리간드. 평균은 ± SEM이 그림은 Kaylan 등에서 수정 된로 (C)의 데이터는 제시했다. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> 그림 4 : 매트릭스 구성 및 기판 강성 쿠간 전구 차별화를 rdinate. 덕트 세포를 담즙 (A) 간 전구 차별화 ECM 조성과 기판 강성 모두에 따라 달라집니다. DAPI는 ALB는 간 세포 마커이며, OPN은 담관 세포 마커 인 핵 라벨이다. (B) 탄성 계수의 기판 30 kPa로, 13 kPa로, 콜라겐 4 kPa의 I (C1), 콜라겐 IV (C4), 피브로넥틴 (FN), 그리고 모든 양방향 조합에 OPN 양성 세포의 비율의 정량 그 ECM 단백질. (C) 셀 견인 스트레스는 기판 강성과 ECM 성분 모두에 따라 달라집니다. (D)의 영률의 기판을 30 kPa로 콜라겐 4 kPa의 I (C1), 콜라겐 IV (C4), 피브로넥틴 (FN), 이들 모두 양방향 조합을 견인 응력 평균 제곱근 값 정량 ECM 단백질. (B) 및 (D)에서, 데이터는 SEM 및 스튜던트 t의 -tests 평균 ±로 표현 된P &lt;0.05 (*), P &lt;0.01 (**)에 대해 지시 된 P 값과 ECM 각 조합에 대해 30 kPa로 수행 하였다 P &lt;0.001 (***). 스케일 바는 50 μm의 수 있습니다. 이 그림은 Kourouklis 등에서 수정되었습니다. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> 섹션 </td><td fo:width="1.5in"> 문제 </td><td fo:width="1.5in"> 잠재적 원인 </td><td> 해결책 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 폴리 아크릴 아미드 기판의 1. 제작. </td><td> 커브 글라스는 하이드로 겔에서 제거 할 수 없습니다. </td><td> Overpolymerization. </td><td> &lt;십분 (4 승 /의 평방 미터)에 중합 시간을 줄일 수 있습니다. 그 자외선 crossli 확인nker 출력이 기대 범위 내에있다. </td></tr><tr><td> 불량 폴리 아크릴 아미드 겔 중합. </td><td> Underpolymerization. </td><td> 중합 시간&gt; 십분 (4 승 /의 평방 미터)에을 늘립니다. 그 UV 가교제 출력이 예상 범위 내에 확인하십시오. </td></tr><tr><td> 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔은 커브 글라스의 제거 후 손상됩니다. </td><td> 소프트 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔은 손상하기 쉽다. </td><td> 우리는 특히 (즉, 4 kPa의) 하이드로 겔 가장 부드러운위한 하이드로 겔 제조 수율 (~ 50 %) 감소 관찰합니다. 부드럽게 하이드로 겔을 처리하고 원하는 수율을 달성하기 위해 시작 번호를 증가시킨다. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 배열의 2. 제조. </td><td rowspan="2"> 불량 또는 일치하지 않는 지점 형태. </td><td> 일관성 가습기 기능. </td><td> 그 가습기를 확인하고 각 인쇄 실행을 통해 기능을 레오 미터 및 65 % RH을 유지한다. </td></tr><tr><td> 프린트 헤드 또는 막힘에 붙어 핀검정 고시. </td><td> 무료 핀 운동을 허용하도록 프린트 헤드를 청소합니다. 완전히 전에 각 인쇄 실행 후 청소 핀은 핀 채널에서 집계를 제거합니다. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. 세포 배양 및 분석 실행. </td><td rowspan="2"> 초기 부착 후 배열에 세포 분리 또는 사망. </td><td> Overseeding 과도한 증식. </td><td> 초기 시딩 밀도와 시간을 줄일 수 있습니다. 세포 증식을 감소시키기 위해 배열 문화 동안 &quot;유지 보수&quot;또는 &quot;차별화&quot;용지를 사용하십시오. </td></tr><tr><td> 하이드로 겔에서 독성 아크릴 모노머의 릴리스. </td><td> 아크릴 모노머의 확산 / 해제를 허용 세포 독성을 줄이기 위해 최소 3 일 동안 DH 2 O에서 하이드로 겔을 만끽 해보세요. </td></tr><tr><td rowspan="4"> 세포 배열에 연결하지 않습니다. </td><td> Underseeding. </td><td> 초기 시딩 밀도와 시간을 늘립니다. 더 강하게 부착 세포 유형을 사용합니다. </td></tr><tr><td> 가난한 증착매트릭스 또는 생체 분자 상태. </td><td> 입자 및 집계의 청소 핀, 인쇄 매개 변수를 확인하고, 형광 마커, 예를 들면, 로다 민 - 복합 덱스 트란의 얼룩을 평가한다. </td></tr><tr><td> 세포 - 기질 상호 작용의 특이성. </td><td> 다른 세포 유형의 일부가 아닌 다른 ECM 단백질에 특이 적 부착. 당신의 세포와 여러 다른 ECM 단백질을 테스트합니다. </td></tr><tr><td> 제작 후 최적 어레이 스토리지. </td><td> 우리는 동결 중에 상 변화를 방지하기 위해 부분적으로 65 % RH, 실온에서 밤새도록 제조 된 어레이를 저장 추천한다. 세포 접착 모두 습도, 온도, 저장 시간에 민감하다; 이러한 매개 변수는 실험을 위해 최적화 / 일치해야합니다. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 세포 배양 동안 유리 기판으로부터 박리 하이드로 겔. </td><td> 가난한 슬라이드 청소 및 실란 화. </td><td> 슬라이드 청소 작업 솔루션을 교체하고실란 화. </td></tr><tr><td> Overdehydrated 하이드로 겔. </td><td> 이상 15 ~ 30 분 동안 핫 플레이트에 탈수 하이드로 겔을 두지 마십시오. </td></tr><tr><td> 데이터 4. 분석. </td><td> 복제 관광 명소와 슬라이드 사이의 높은 변동성. </td><td> 어레이 제조의 가변성. </td><td> 핀과 프린트 헤드가 깨끗한 지 확인합니다. 가습기 기능을 확인합니다. 시각화 및 형광 마커를 사용하여 장소와 배열 품질을 정량화. 같은 저장소 배열은 위의 추천. </td></tr></tbody></table> 표 1 : 문제 해결.

세포 분화를 모두 매트릭스 조성물과 기판의 재료 특성을 포함한 미세 환경 요인의 호스트에 의해 조절된다. 우리는 여기에 세포 분화 및 미세 환경 콘텍스트의 함수로서 생체 역학적 세포 기질 상호 작용 모두를 평가 견인력 현미경과 함께 세포의 마이크로 어레이를 이용하는 방법을 설명한다.

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

본 세포 마이크로어레이 플랫폼의 전반적인 목표는 미세환경적 맥락의 함수로서 세포 분화와 견인력의 측정치를 상호 연관시키는 것입니다. 이 방법은 조직 공학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있으며, 줄기세포 생물학의 기초 연구와 분화 프로토콜의 최적화를 모두 가능하게 합니다. 이 기술의 주요 장점으로는 처리량이 높다는 점, 생화학적 및 생물물리학적 자극을 다양하게 변화시킬 수 있다는 점, 그리고 면역형광법과 견인력 현미경법(TFM) 모두를 통해 최종 결과물을 읽어낼 수 있다는 점 등이 있습니다.이 방법은 간 전구세포 분화를 이해하는 데 사용되었으나, 다른 동맥 세포 유형 및 조직 환경에도 쉽게 적용될 수 있습니다. 실험의 성공은 어레이 프로토콜을 고품질 하이드로젤 기질 및 견인력 현미경(TFM)과 통합하는 것에 달려 있으므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. TFM을 이용하여 세포-기질 상호작용을 실시간으로 평가하기 위해, 실란화 처리된 35 mm 유리 바닥 페트리 접시에 형광 비드가 포함된 폴리아크릴아마이드 하이드로젤을 제작하려면, 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 용액 내에서 유리 기질을 준비하십시오.실란화 처리된 35 mm 유리 바닥 페트리 접시를 유리 건조 트레이에 넣고, 각 접시의 중앙에 9:1 비율의 프리폴리머 비드 및 광개시제 용액 20 microliters를 피펫으로 분주합니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 각 접시를 12 mm 원형 커버슬립으로 부드럽게 덮습니다. 형광 비드를 하이드로젤 표면에 고르게 분포시키기 위해, 접시를 뒤집어 실온에서 20분 동안 방치합니다.디시를 뒤집은 상태로 365 nanometer UVA에 10분 동안 노출시킵니다. 필요에 따라 중합 시간을 최적화하십시오. 그다음, 하이드로겔을 1 molar HEPES 버퍼에 담가 상온의 암소에서 하룻밤 동안 둡니다.중합된 하이드로젤이 손상되지 않도록 주의하며 면도날로 커버 슬립을 조심스럽게 제거합니다. 핫플레이트 위에서 50 °C로 하이드로젤을 완전히 건조될 때까지 탈수시킵니다. 하이드로젤은 암소의 실온 상태에서 3개월 동안 보관할 수 있습니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 바이오 분자를 프린팅하기 위한 완충액과 소스 플레이트용 완충액을 준비합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 깨끗한 핀을 로드한 후, 마이크로어레이어를 준비하고 제조사 소프트웨어를 사용하여 프로그래밍합니다. 다음으로, 가습 장치를 켭니다.설정값을 상대 습도 65%로 조절하고 레오미터가 설정값에 도달할 때까지 기다립니다. 소스 플레이트를 적절한 어댑터에 장착합니다. 그런 다음 탈수된 하이드로젤 기판을 적절한 어댑터에 장착합니다.소스 플레이트의 레이아웃, 어레이 설계 및 원하는 포맷을 정확하게 반영하도록 프로그램의 파라미터를 조정하십시오. 어레이 제작을 시작하십시오. 습도가 65% 상대 습도 미만으로 떨어지지 않았는지, 그리고 핀이 막히지 않았는지를 최소 한 시간에 한 번씩 확인하십시오.습도가 예상치 못하게 떨어졌다면, 가습기를 채우고 관련 튜브의 응결물을 제거하기 위해 어레이 작업을 일시 중단하십시오. 핀이 막힌 경우, 핀을 세척하거나 미리 세척된 핀으로 교체하기 위해 어레이 작업을 일시 중단하십시오. 프로그램이 완료되면, 제작된 어레이를 알루미늄 호일로 덮은 슬라이드 박스 또는 마이크로 플레이트에 넣으십시오.어레이를 상대습도 65%의 실온에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 저희의 경험상, 가장 흔한 문제는 어레이 제작과 관련하여 발생합니다. 형광 표지 분자, 일반 단백질 염색 및 면역형광법을 사용하여 제작된 어레이의 기술적 품질과 견고성을 확인하는 것을 권장합니다.제작 다음 날, 어레이가 담긴 35 mm 페트리 접시를 PVS 내 1% v/v penicillin-streptomycin 3 mL에 담급니다. 어레이 기판을 UVC에 30분 동안 노출시킵니다. 그 후 penicillin-streptomycin 용액을 세포 배양 배지로 교체합니다.세포를 수집하고 계수한 후, 35 mm 페트리 접시당 3 mL의 비율로 세포를 어레이에 분주합니다. 어레이 배양물을 37 °C, 5% CO2 조건에서 2~24시간 동안, 또는 세포 아일랜드가 충분히 형성될 때까지 배양합니다. 분주 밀도와 배양 시간은 세포의 종류 및 특정 응용 분야에 따라 조정할 수 있습니다.세포 아일랜드가 형성될 때까지 기다린 후, 미리 데워둔 세포 배양 배지 3 mL로 어레이 배양물을 두 번 세척하십시오. 이 시점에서 적절한 대조군과 관심 처리제를 생물학적 시스템에 추가할 수 있습니다. 처리제의 농도를 유지하기 위해 1~2일마다 어레이의 배지를 교체하십시오.어레이 배양을 시작한 후 1~5일 이내에 TFM을 사용하여 세포-기질 상호작용의 라이브 평가를 수행합니다. 어레이 배양이 담긴 35 mm 페트리 접시를 TFM 측정을 위해 로봇 스테이지가 장착된 배양용 도립 형광 현미경으로 옮깁니다. 하나의 접시에서 위상차 현미경을 사용하여 개별 세포 섬의 위치와 초점 평면을 표시합니다.비드들을 시각화하기 위해 원적색 형광 현미경으로 전환하십시오. 그런 다음 이전 단계에서 저장한 각 위치로 돌아가 초점 평면의 z-좌표를 수정하여, 세포 아일랜드 아래의 첫 번째 비드 층만 초점이 맞도록 설정하십시오. 새 좌표를 저장하고 모든 세포 아일랜드의 자동 이미지 촬영을 진행하여, 해리 전 단계의 위상차 및 원적색 형광 이미지를 획득하십시오.다음으로, BSA/SDS 용액 150 µL를 디시에 조심스럽게 넣고, 세포가 기질에서 완전히 분리될 때까지 5분 동안 기다립니다. 위상차 현미경을 사용하여 세포 분리 상태를 관찰합니다. 세포 군집이 기질에서 분리된 후, 표시해 둔 위치로 돌아가 첫 번째 비드 층이 여전히 초점 내에 있는지 확인합니다.세포가 생성한 견인력으로 인한 변형으로 인해 비드들이 초점 평면을 벗어난 경우, 비드들이 다시 초점에 맞도록 초점 평면의 z-좌표를 보정하십시오. 보정된 z-좌표를 저장하고 모든 아일랜드의 자동 이미징을 반복하여 해리 후의 원적색 형광 이미지를 캡처하십시오. 나머지 디시들에 대해서도 이 단계들을 반복하십시오.Protein A/G가 접합된 notch 리간드 jagged one 및 delta like one은 하이드로겔 내에서 개선된 유지력을 보여주었습니다. Notch 리간드의 제시 또한 녹색 담관 세포 마커의 존재로 확인된 바와 같이, 간 전구세포가 담관 세포 운명으로 분화하도록 유도했습니다. 5가지 세포외 기질(ECM) 단백질에 대해 notch 리간드에 대한 반응을 정량화한 결과, 리간드에 대한 간 전구세포의 반응이 ECM 환경에 따라 달라짐을 보여주었습니다.delta-like 1 및 jagged 1 리간드가 없는 전구세포를 생성하기 위해 소형 헤어핀 RNA(shRNA) 넉다운을 이용하였습니다. 이후 세포에 notch 리간드인 jagged 1, delta-like 1 및 delta-like 4를 처리하였습니다. 어레이화된 notch 리간드에 대한 반응은 각 리간드의 세포 내재적 발현 여부에 따라 다르게 나타났습니다.이 이미지들은 간 전구세포의 분화가 기질 강성과 ECM 조성 모두에 의존함을 보여줍니다. 정량적 분석 결과, collagen four는 부드러운 기질과 딱딱한 기질 모두에서 분화를 지원하는 반면, fibronectin은 딱딱한 기질에서만 분화를 지원하는 것으로 나타났습니다. 대표적인 히트맵은 collagen four의 낮은 기질 강도에서 지속되는 견인 응력이 담관 세포로의 분화를 촉진함을 시사합니다.이러한 결과는 견인 응력(traction stress)의 평균 제곱 평균(root mean square) 값의 정량을 통해 확인되었습니다. 본 영상과 부수되는 프로토콜에서는 어레이형 기판 위에서 세포 배양을 수행하기 위한 하이드로젤 및 어레이 제작의 주요 단계와, 견인력 현미경(traction force microscopy)을 이용한 세포-기판 상호작용 측정 방법을 제공하였습니다. 해당 기술에 익숙해진 후에는 적절히 수행할 경우 각 실험을 최소 1~2주 만에 완료할 수 있습니다.본 방법과 병행하여, 정성적 PCR, 면역 블로팅, 표준 척도 역학 생물학 축 또는 기타 상보적인 분자 생물학적 기법을 사용하여 점수가 높은 어레이 조건을 세포 배양을 통해 검증해야 합니다. 이 다용도 플랫폼은 줄기세포 분화 및 암세포 생물학을 포함하여 광범위한 세포 및 조직 맥락에서 세포 기능을 고속 대량으로 조사하는 데 적용될 수 있습니다.

a-high-throughput-cell-microarray-platform-for-correlative-analysis

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

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