VirusMapper 슈퍼 해상도 현미경을위한 오픈 소스 단일 입자 분석

이 절차의 전반적인 목표는 형광 표지된 구성 요소가 있는 구조의 초해상도 이미지에 단일 입자 분석을 적용하여 바이러스 또는 거대 분자 복합체의 고정밀 분자 모델을 생성하는 것입니다. 이 방법은 복잡한 바이러스의 단백질 구조와 감염 과정에서 이것이 어떻게 변화하는지 포함하여 바이러스학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동일한 구조의 여러 이미지를 수집하여 구성 요소의 고정밀 맵을 생성할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 바이러스의 구조에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 포유류 세포 내의 다른 병원체 및 거대분자 복합체와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 먼저, 초고해상도 형광 현미경으로 샘플을 이미지화합니다. 원치 않는 형광 구조 없이 수백에서 수천 개의 잘 분리된 입자를 포함하는 여러 시야의 이미지를 획득합니다.

이미지를 얻고 처리한 후에는 이미지를 가져와서 삽입된 채널이 있는 스택으로 연결합니다. 필요한 경우 연결된 이미지를 하이퍼 스택에서 스택으로 변환합니다. 그런 다음 VirusMapper 하위 메뉴에서 "Extract Viral Structures"를 선택하고 추출된 입자의 파일 경로를 설정합니다.

이미징된 형광 채널의 수를 입력합니다. 참조 채널을 입자가 가장 일관된 모양을 갖는 형광 채널로 설정합니다. 이러한 입자에 중앙 최대값이 없는 경우 사전 감지 가우시안 블러링을 적용하여 입자가 나타나도록 유도합니다.

다음으로, 가장 큰 입자의 직경을 픽셀 단위로 추정합니다. ROI 반경을 해당 값의 절반보다 약간 더 크게 설정합니다. 프레임당 필요한 ROI 수를 추정합니다.

초기에 100개 이하의 ROI를 사용합니다. 입자 분리를 기준으로 최대 ROI 오버랩을 설정합니다. 해당 프레임에 대한 ROI를 미리 봅니다.

반경, ROI 수, 최대 겹침을 조정하여 프레임의 각 입자가 단일 ROI로 포함되도록 합니다. ROI가 가장 큰 입자보다 몇 픽셀 이상 넓은지 확인합니다. 그런 다음 확인"을 클릭하여 세분화를 실행합니다.

추출 후 ROI 관리자에서 샘플 이미지를 닫습니다. 추출된 파티클 세트의 이름을 바꾸지 마십시오. Generate Seeds"를 선택하고 추출된 입자 데이터가 포함된 폴더를 엽니다.

참조 채널을 설정하고 시드를 생성해야 하는 모든 채널을 선택합니다. 이전 모델과 일치시키기 위해 필요한 경우 시드를 90도 회전합니다. 파티클에 중앙 최대값이 없는 채널의 경우 이전과 같이 사전 정렬 가우시안 블러 값을 높입니다.

채널이 밀접하게 정렬되지 않은 경우 비참조 채널에 대한 시프트 보정을 활성화합니다. 입자 시퀀스에서 일관되게 나타나는 구조를 검색합니다. 대표 입자를 식별하고 Frames to use" 필드에 해당 프레임 번호를 입력합니다.

결과 시드를 검토합니다. 시드 선택은 이 절차의 중요한 단계입니다. 원시 데이터를 주의 깊게 보고 모델링할 하나 또는 여러 구조를 식별합니다.

모델 품질은 이러한 구조를 정확하게 반영하는 시드를 선택하는 데 크게 좌우됩니다. 참조 채널, 가우스 흐림 반경 및 이동 보정을 필요에 따라 조정하여 유사한 시드를 가진 추가 프레임의 식별을 최적화합니다. 평균 구조가 데이터에서 관찰된 구조를 가장 잘 나타낼 때까지 프레임을 계속 추가하고 생성 파라미터를 조정합니다.

시드의 폴더 이름과 파일 접두사를 입력합니다. 딸깍 하는 소리 OK"나중에 모델링할 수 있도록 시드 이미지를 저장합니다. Generate Models Based On Seeds"를 선택하고 추출된 입자 폴더를 엽니다.

각 채널에 대한 시드 평균을 로드합니다. 참조 기반 구조 검색을 수행하는 경우 정렬을 위한 참조 채널을 선택합니다. 한 채널의 알려진 입자 구조는 두 번째 알려지지 않은 채널을 정렬하기 위한 참조로 사용할 수 있습니다.

이를 통해 알려지지 않은 구조를 편향되지 않은 매핑할 수 있습니다. 채널 간의 색채 이동은 미리 수정해야 합니다. 해석이 모델에서 작은 차이 또는 미묘한 피쳐를 찾는 경우 템플릿 일치 중 정사각형 이미지 강도를 선택합니다.

최소 유사성을 60%에서 80% 사이로 설정하고 반복 횟수를 1로 설정합니다. 계산 중에 표시할 모델과 파티클을 선택하고 미리보기 모델을 생성합니다. 미리보기 모델을 검사합니다.

원하는 형태를 가진 입자만 포함하도록 최소 유사성을 높입니다. 필요에 따라 다른 모델 계산 매개변수를 최적화하고 원하는 경우 모델 생성 프로세스에서 표시할 추가 요소를 선택합니다. 미리보기 모델이 만족스러우면 반복 횟수를 10회로 늘립니다.

폴더 이름과 파일 접두사를 설정합니다. "확인"을 클릭하여 최종 모델의 모든 반복을 포함하는 모델 진화 스택을 저장합니다. 녹색과 적색 형광 단백질로 태그된 두 개의 단백질을 가진 재조합 백시니아 바이러스를 구조화 조명 현미경으로 이미지화하고 VirusMapper 플러그인으로 모델링했습니다.

씨앗은 정면 방향과 시상 방향에 대해 별도로 생성되었으며, 각각은 5개의 대표 입자로부터 평균을 냈습니다. 바이러스의 방향에 따라 하나 또는 두 개의 측면 몸체를 구별할 수 있습니다. 따라서 두 방향에 대해 별도의 모델을 생성할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 모델의 품질은 주로 수집된 원시 데이터의 품질에 따라 달라진다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 단일 입자 분석은 정밀도를 높일 수 있지만 낮은 품질의 이미지를 보정할 수는 없습니다. 이 절차에 따라 이러한 모델에 대해 추가 정량화 또는 모델 피팅을 수행할 수 있습니다.

이는 특히 감염 중 바이러스 아키텍처의 나노 스케일 변화와 관련된 추가 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 단일 입자 분석 소프트웨어인 VirusMapper를 사용하여 초고해상도 이미지에서 분자 구조 모델을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.