액체와 얼음에서 바이러스 어셈블리의 고해상도 이미징 향상

여기에서는 투과 전자 현미경을 사용하여 나노 스케일에서 액체-EM 및 Cryo-EM 분석에 적합한 바이러스 어셈블리를 준비하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

액체 전자 현미경에 대한 관심은 이제 나노 스케일 실시간 프로세스를 시각화 할 수 있기 때문에 최근 몇 년 동안 급증했습니다. 이러한 유연한 구조에 대한 향상된 지식은 SARS-CoV-2와 같은 새로운 병원체와 싸우기 위한 새로운 시약을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 유체 환경에서 단백질을 보는 것은 생물학적 시스템을 모방하는 데 도움이되며 단백질을보다 역동적으로 볼 수있는 기회를 제공합니다.

그리고 이 실험은 유리질 얼음과 액체 환경 모두에서 단백질을 사용하고 시각화하는 방법에 대한 새로운 기술을 보여줄 것입니다. 최근 결과에는 액체로 이미지화된 항체 기반 요법에서 백신 후보에 대한 역동적인 통찰력이 포함됩니다. 상관 액체 및 Cryo-EM 애플리케이션은 분자 역학을 시각화하는 능력을 향상시켜 인간의 건강과 질병에 대한 고유한 컨텍스트를 제공합니다.

기존 TEM 또는 Cryo-EM 기술을 사용하는 독자는 액체 EM 워크플로우를 구현하여 현재 전략을 보완하는 방식으로 샘플에 대한 새로운 동적 관찰을 제공하는 것을 고려할 수 있습니다. 상용 액체-EM 시스템은 많은 실시간 이미징 애플리케이션에 필수적인 흐름, 혼합, 전기화학적 자극 및 온도 제어를 제공할 수 있습니다. 여기에 제시된 마이크로칩 샌드위치 방법은 현장 실험을 위해 보다 복잡한 상용 시스템으로 도약하기 전에 먼저 액체에 있는 표본을 보는 간단한 엔트리 레벨 방법을 설명합니다.

시작하기 위해, 각 칩을 150 밀리리터의 아세톤에서 2 분 동안 인큐베이션하고, 이어서 150 밀리리터의 메탄올에서 2 분 동안 인큐베이션함으로써 실리콘 질화물 마이크로 칩을 세척한다. 층류 기류에서 칩을 건조시킵니다. 플라즈마 건조된 칩을 아르곤 가스를 사용하여 45초 동안 표준 조건에서 작동하는 글로우 방전 기기를 사용하여 청소합니다.

다음으로, 건조 베이스 마이크로칩을 시편 홀더의 팁에 로드하고 약 0.2마이크로리터의 샘플을 베이스 칩에 추가합니다. 1 내지 2분 동안 인큐베이션한 후, 샘플을 함유하는 습윤 베이스 칩 위에 상단 칩을 놓는다. 어셈블리를 함께 설치하여 3개의 황동 나사로 기계적으로 제자리에 고정된 밀폐된 인클로저를 형성합니다.

터보 펌핑 건식 펌핑 스테이션을 사용하여 팁을 10에서 마이너스 6torr로 펌핑합니다. 이제 홀더를 TEM에 삽입할 준비가 되었습니다. 플라즈마는 45초 동안 글로우 방전 장비를 사용하여 마이크로칩과 탄소 그리드를 청소합니다.

그리고 약 2 마이크로리터의 샘플을 겔 팩 위에 놓인 글로우 방전 마이크로칩에 첨가한다. 여과지 또는 피펫을 사용하여 초과 용액을 제거하고 1-2 분 동안 배양하십시오. 이어서 글로우 배출된 탄소 그리드를 샘플을 함유하는 습윤 마이크로칩에 첨가한다.

실온에서 단일 틸트 시편 홀더를 사용하여 어셈블리를 함께 설치하여 밀폐된 인클로저를 형성합니다. 또는 자동 로더 그리드 클립을 사용하고 샌드위치 어셈블리를 하단 C 클립에 놓습니다. 상단 클립을 어셈블리 위에 놓고 표준 클램핑 도구를 사용하여 어셈블리를 함께 밀봉합니다.

이제 시편을 TEM에 삽입할 준비가 되었습니다. 극저온 조건 또는 실온에서 자동 로더에 놓인 샘플을 검사합니다. 액체-EM 이미징의 경우 시편 홀더를 전계 방출 건이 장착된 TEM에 로드하고 200킬로볼트에서 작동합니다.

건을 켜고 워블러 기능을 사용하여 표본에 대한 현미경 스테이지의 유심 높이를 조정하고 컬럼에서 샘플을 영하 15도에서 플러스 15도로 기울입니다. 이 절차는 샘플 두께를 수용하기 위해 Z 방향으로 스테이지를 조정하고 이미지 기록 중에 정확한 배율을 보장하는 데 도움이 됩니다. 직렬 데이터 수집 소프트웨어 패키지를 사용하여 긴 프레임의 동영상 또는 개별 이미지로 이미지를 기록하고 자동화된 이미징 루틴을 구현합니다.

저선량 조건에서 초당 28, 000X에서 92, 000X 및 40프레임 범위의 배율로 이미지를 획득합니다. 노출 시간을 조정하여 시편에 대한 빔 손상을 최소화하고 지정된 배율에서 마이너스 1-4마이크로미터의 디포커스 범위를 사용합니다. 두꺼운 솔루션이 발견되면 더 높은 디포커스 값을 사용하거나 다른 관심 영역을 선택합니다.

기포가 형성될 때까지 데이터 수집에 사용되지 않는 희생 영역에 전자빔을 집중시켜 이미징 세션 전반에 걸쳐 용액이 샘플에 존재하는지 확인합니다. RELION-3.0.8 프로그램 또는 기타 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 동영상에서 SARS-CoV-2 입자를 분석합니다. MotionCor2 프로그램을 사용하여 모션 보정을 수행합니다.

수정되면 프로그램 소프트웨어 패키지의 자동 선택 도구를 사용하여 입자를 추출합니다. 일반적인 상자 크기는 액체 표본의 경우 330픽셀이고 얼음 표본의 경우 350픽셀입니다. 프로그램의 3D 초기 모델 루틴 및 데이터 처리 소프트웨어 패키지의 ab initio 모델 옵션과 함께 C1 대칭을 사용하여 초기 재구성을 계산합니다.

그런 다음 데이터 처리 소프트웨어에서 구체화 프로토콜을 수행합니다. 분자 구조 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 결과를 검사하는 동시에 동적 변화를 평가합니다. 아데노 관련 바이러스 아형 3 또는 AAV에서 액체-EM 및 Cryo-EM 구조의 비교가 여기에 나와 있습니다.

대표 이미지는 용액과 얼음에서 AAV의 구조를 보여줍니다. 액체 및 얼음 구조에서 추출한 AAV VP1 서브유닛의 회전 보기가 여기에 표시됩니다. 이 이미지는 분자 구조 분석 소프트웨어에서 morph map 함수를 사용하여 생성된 액체 구조의 동적 값을 나타냅니다.

여러 바이러스 어셈블리의 평균 구조는 EM 데이터를 사용하여 측정한 거의 5%의 직경 변화로 구조적 변화를 보여줍니다. COVID-19 환자의 혈청 분획에서 분리된 SARS-CoV-2 하위 바이러스 어셈블리의 이미지가 여기에 표시됩니다. 이 흰색 기포는 샘플에 액체가 있음을 나타냅니다.

이러한 하위 바이러스 어셈블리의 EM 재구성은지도를 통해 5 나노 미터 슬라이스에서 컬러 방사형 밀도로 여기에 표시됩니다. 대표 이미지는 마이크로 칩 샌드위치 기술을 사용하여 유리체 얼음에서 제조 된 로타 바이러스 이중층 입자의 분석을 설명합니다. 액체-EM 이미징을 위해 세제, 글리세롤, 폴리에틸렌, 글리콜 및 높은 수준의 설탕의 사용을 최소화하거나 피해야 합니다.

이러한 시약은 인공물을 도입하고 과도한 버블링, 가수분해 생성물 및 빔 손상으로 인한 자유 라디칼을 생성할 수 있습니다. 이러한 프로토콜을 사용하면 과학자들은 원자 세부 사항에서 동적 프로세스를 연구 할 수 있습니다. 그리고 이것은 의학, 생명 과학 및 재료 연구를 포함한 여러 과학 분야에 걸쳐 있습니다.

여기에 제시된 프로토콜은 최첨단 도구가 새로운 눈을 통해 생물학적 거대 분자를 시각화하는 흥미로운 수단을 제공 할 수있는 방법을 설명합니다. 액체 전자 현미경 분야는 인간의 건강에 위협이 되는 이러한 새로운 바이러스를 연구하는 방법을 향상시킬 수 있으며 아마도 전염병 대비 조치에 기여할 수도 있습니다.