담관의 보행을 연구하기위한 Whole-mount Immunohistochemical method의 사용 Suncus murinus

이 절차의 전반적인 목표는 Suncus murinus의 담도 내 신경 분포를 시각화하기 위해 전체 마운트 면역조직화학 염색을 사용하는 것입니다. 이 방법은 많은 종의 내장 기관, 특히 표준 방법으로 평가하기 어려운 불규칙하거나 작은 기관의 신경 분포를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조작이 간단하다는 것입니다.

복잡한 절차가 필요하지 않으며 성공률이 높습니다. 저와 함께 절차를 시연할 사람은 제 연구실의 대학원생인 Yidan Dai와 연구원인 Shuang-Qin Yi입니다. 흄 찬장에서 개별 PBS와 4% 파라포름알데히드 관류로 동물을 씻어내는 것으로 시작합니다.

그런 다음 관류 카테터를 통해 2-3밀리리터의 흰색 네오프렌 라텍스를 복부 대동맥에 주입하여 혈관에 라벨을 붙입니다. 그리고 관심 있는 모든 조직에 라벨이 붙으면 복부 장기와 관련 신경 및 혈관을 추출합니다. 그런 다음 약 0.1ml의 파란색 네오프렌 라텍스를 담낭에 주입하여 담도계를 표시하고 조직을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 4%파라포름알데히드로 사후 고정하여 전체 마운트 면역 염색을 수행합니다.

다음 날 아침, 샘플을 유리 바이알에 옮겨 너트레이터에서 증류수로 1시간 동안 실온에서 4번 세척합니다. 마지막 세척 후, 내재적 과산화효소 반응을 방지하기 위해 실온에서 20분 동안 갓 준비한 1% 직교주기산에 조직을 배양합니다. 다음으로, 샘플을 실온에서 증류수로 10분 동안 세척한 다음 갓 준비한 0.004%papillon에서 섭씨 37도의 항온 수조에서 부드럽게 흔들면서 2시간 동안 배양합니다.

배양이 끝나면 증류수로 표본을 50-60 분 동안 씻습니다. 그런 다음 조직을 섭씨 4도의 4% 파라포름알데히드에 하룻밤 동안 보관하십시오. 다음날 아침, 방금 시연한 대로 샘플을 증류수로 세척한 다음 갓 준비한 빠삐용에서 다시 2시간 동안 배양합니다.

증류수에서 샘플을 50-60분 더 씻은 다음 4%파라포름알데히드에 하룻밤 동안 고정합니다. 셋째 날 아침에는 티슈를 증류수로 4번 씻은 다음 30분씩 순차적으로 3회 상승하는 자당 배양에 담그십시오. 그런 다음 샘플을 섭씨 영하 20도에서 30-60분 동안 동결한 다음 실온에서 완전히 해동합니다.

세 번째 동결-해동 주기 후, 샘플을 2%Triton X-100으로 옮겨 섭씨 4도의 하룻밤 배양합니다. 다음 날 아침, 시료의 크기에 따라 3-6일 동안 섭씨 4도의 너트레이터에서 부드럽게 흔들리기 위해 시료를 관심 1차 항체의 용기로 옮깁니다. 적절한 라벨링 기간이 지난 후, 실온에서 PBS에서 1시간 세척 4회를 통해 결합되지 않은 1차 항체를 제거하고 섭씨 4도에서 부드럽게 흔들면서 3일 동안 적절한 2차 항체로 검체를 라벨링합니다.

2차 항체 라벨링 기간이 끝나면 PBS에서 검체를 4회 세척합니다. 그런 다음 10 마이크로 리터의 30 % 과산화수소와 100 밀리리터의 갓 준비된 0.002 % DAB 착색 용액에 조직을 섭씨 4도에서 16-72 시간 동안 부드럽게 흔들면서 배양합니다. 최적의 염색 강도에 도달하면 검체를 PBS의 0.04%아지드화나트륨으로 옮겨 착색 반응을 중지합니다.

그런 다음 새 PBS가 들어 있는 10cm 페트리 접시에 샘플을 조심스럽게 담그고 실체 현미경에 장착된 카메라를 사용하여 조직의 전체 마운트 이미지를 캡처합니다. 간외 담도의 신경 분포를 시각화하는 것 외에도 뉴로필라멘트 양성 신경 섬유에 대한 항체로 라벨링하면 식도를 따라 위장으로 들어가는 미주신경의 흐름 및 분포 밀도를 명확하게 식별할 수 있습니다. 담낭의 혈관에 흰색 네오프렌 라텍스를 표시하면 주변 조직과 대조를 이루는 얇은 신경 섬유화가 나타나며, 담낭의 목부에서 안저보다 신경 분포의 밀도가 더 높게 관찰됩니다.

상부 담관에는 두 가지 유형의 신경 다발이 표시되어 있는데, 하나는 불규칙하고 조밀한 신경 네트워크를 형성하고 담도 위와 안에 접착식으로 존재하는 미세한 신경 다발과 담도 표면에 평행하게 분포되어 있는 두꺼운 신경 다발입니다. 파란색 네오프렌 라텍스로 총담관을 표시하고 흰색 네오프렌 라텍스로 혈관을 표시하면 총담관 끝과 십이지장 유두 부위의 얇은 신경 섬유를 시각화할 수 있습니다. 이 절차를 시도하기 전에 전체 프로세스를 완료하는 데 2-3주가 필요하므로 각 실험에 대한 타임라인을 플레이하도록 주의하십시오.

용액을 교체할 때 표본이 손상되지 않도록 항상 집게로 표본을 제거하는 대신 용액을 따르십시오. 이 비디오를 시청한 후에는 다양한 내장 기관 내의 다양한 신경을 라벨링하는 데 이 기술을 적용할 수 있을 것입니다.