담관의 보행을 연구하기위한 Whole-mount Immunohistochemical method의 사용 Suncus murinus
2017년 6월 15일
Suncus murinus 의 외 간성 담도계에서 neurofilament 단백질 발현을 시각화하기위한 whole-mount immunohistochemical 접근법 . 여기에 제시됩니다. 이 프로토콜은 S. murinus 또는 다른 종의 모든 내장 기관의 innervation을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 Suncus murinus의 담도 내 신경 분포를 시각화하기 위해 전체 마운트 면역조직화학 염색을 사용하는 것입니다. 이 방법은 많은 종의 내장 기관, 특히 표준 방법으로 평가하기 어려운 불규칙하거나 작은 기관의 신경 분포를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조작이 간단하다는 것입니다.
복잡한 절차가 필요하지 않으며 성공률이 높습니다. 저와 함께 절차를 시연할 사람은 제 연구실의 대학원생인 Yidan Dai와 연구원인 Shuang-Qin Yi입니다. 흄 찬장에서 개별 PBS와 4% 파라포름알데히드 관류로 동물을 씻어내는 것으로 시작합니다.
그런 다음 관류 카테터를 통해 2-3밀리리터의 흰색 네오프렌 라텍스를 복부 대동맥에 주입하여 혈관에 라벨을 붙입니다. 그리고 관심 있는 모든 조직에 라벨이 붙으면 복부 장기와 관련 신경 및 혈관을 추출합니다. 그런 다음 약 0.1ml의 파란색 네오프렌 라텍스를 담낭에 주입하여 담도계를 표시하고 조직을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 4%파라포름알데히드로 사후 고정하여 전체 마운트 면역 염색을 수행합니다.
다음 날 아침, 샘플을 유리 바이알에 옮겨 너트레이터에서 증류수로 1시간 동안 실온에서 4번 세척합니다. 마지막 세척 후, 내재적 과산화효소 반응을 방지하기 위해 실온에서 20분 동안 갓 준비한 1% 직교주기산에 조직을 배양합니다. 다음으로, 샘플을 실온에서 증류수로 10분 동안 세척한 다음 갓 준비한 0.004%papillon에서 섭씨 37도의 항온 수조에서 부드럽게 흔들면서 2시간 동안 배양합니다.
배양이 끝나면 증류수로 표본을 50-60 분 동안 씻습니다. 그런 다음 조직을 섭씨 4도의 4% 파라포름알데히드에 하룻밤 동안 보관하십시오. 다음날 아침, 방금 시연한 대로 샘플을 증류수로 세척한 다음 갓 준비한 빠삐용에서 다시 2시간 동안 배양합니다.
증류수에서 샘플을 50-60분 더 씻은 다음 4%파라포름알데히드에 하룻밤 동안 고정합니다. 셋째 날 아침에는 티슈를 증류수로 4번 씻은 다음 30분씩 순차적으로 3회 상승하는 자당 배양에 담그십시오. 그런 다음 샘플을 섭씨 영하 20도에서 30-60분 동안 동결한 다음 실온에서 완전히 해동합니다.
세 번째 동결-해동 주기 후, 샘플을 2%Triton X-100으로 옮겨 섭씨 4도의 하룻밤 배양합니다. 다음 날 아침, 시료의 크기에 따라 3-6일 동안 섭씨 4도의 너트레이터에서 부드럽게 흔들리기 위해 시료를 관심 1차 항체의 용기로 옮깁니다. 적절한 라벨링 기간이 지난 후, 실온에서 PBS에서 1시간 세척 4회를 통해 결합되지 않은 1차 항체를 제거하고 섭씨 4도에서 부드럽게 흔들면서 3일 동안 적절한 2차 항체로 검체를 라벨링합니다.
2차 항체 라벨링 기간이 끝나면 PBS에서 검체를 4회 세척합니다. 그런 다음 10 마이크로 리터의 30 % 과산화수소와 100 밀리리터의 갓 준비된 0.002 % DAB 착색 용액에 조직을 섭씨 4도에서 16-72 시간 동안 부드럽게 흔들면서 배양합니다. 최적의 염색 강도에 도달하면 검체를 PBS의 0.04%아지드화나트륨으로 옮겨 착색 반응을 중지합니다.
그런 다음 새 PBS가 들어 있는 10cm 페트리 접시에 샘플을 조심스럽게 담그고 실체 현미경에 장착된 카메라를 사용하여 조직의 전체 마운트 이미지를 캡처합니다. 간외 담도의 신경 분포를 시각화하는 것 외에도 뉴로필라멘트 양성 신경 섬유에 대한 항체로 라벨링하면 식도를 따라 위장으로 들어가는 미주신경의 흐름 및 분포 밀도를 명확하게 식별할 수 있습니다. 담낭의 혈관에 흰색 네오프렌 라텍스를 표시하면 주변 조직과 대조를 이루는 얇은 신경 섬유화가 나타나며, 담낭의 목부에서 안저보다 신경 분포의 밀도가 더 높게 관찰됩니다.
상부 담관에는 두 가지 유형의 신경 다발이 표시되어 있는데, 하나는 불규칙하고 조밀한 신경 네트워크를 형성하고 담도 위와 안에 접착식으로 존재하는 미세한 신경 다발과 담도 표면에 평행하게 분포되어 있는 두꺼운 신경 다발입니다. 파란색 네오프렌 라텍스로 총담관을 표시하고 흰색 네오프렌 라텍스로 혈관을 표시하면 총담관 끝과 십이지장 유두 부위의 얇은 신경 섬유를 시각화할 수 있습니다. 이 절차를 시도하기 전에 전체 프로세스를 완료하는 데 2-3주가 필요하므로 각 실험에 대한 타임라인을 플레이하도록 주의하십시오.
용액을 교체할 때 표본이 손상되지 않도록 항상 집게로 표본을 제거하는 대신 용액을 따르십시오. 이 비디오를 시청한 후에는 다양한 내장 기관 내의 다양한 신경을 라벨링하는 데 이 기술을 적용할 수 있을 것입니다.
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개요
이 기사는 Suncus murinus의 간외 담도에서 신경필라멘트 단백질 발현을 시각화하기 위한 전체 장착 면역조직화학 접근법을 제시합니다. 이 방법은 내장 기관, 특히 작거나 불규칙한 기관의 신경 분포 분석을 가능하게 합니다.
주요 연구 요소
과학 영역
- 신경과학
- 면역조직화학
- 내장 기관 분석
배경
- 전체 장착 면역조직화학은 신경 분포를 시각화하는 데 사용되는 기술입니다.
- Suncus murinus는 내장 기관 신경 분포를 연구하기 위한 모델 생물입니다.
- 이 방법은 표준 기술로 평가하기 어려운 작거나 불규칙한 기관에 유리합니다.
- 프로토콜은 간단하며 높은 성공률을 가지고 있습니다.
연구 목적
- Suncus murinus의 담도 내 신경 분포를 시각화합니다.
- 다양한 내장 기관의 신경 분포를 분석하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 교육 목적을 위한 절차를 시연합니다.
사용된 방법
- PBS 및 4% 파라포름알데히드 순환을 통한 동물 세척.
- 전체 장착 면역조직화학 염색.
- 신경필라멘트 단백질 발현의 시각화.
- 대학원생 및 연구원에 의한 시연.
주요 결과
- 담도의 신경 분포 시각화 성공.
- 작고 불규칙한 기관에 대한 방법의 효과성 시연.
- 전체 장착 면역조직화학 기술의 높은 성공률.
결론
- 전체 장착 면역조직화학 방법은 신경 분포 분석에 효과적입니다.
- 이 기술은 Suncus murinus 이외의 다양한 종에 적용할 수 있습니다.
- 프로토콜은 연구자들에게 간단하고 접근 가능합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This whole-mount immunohistochemical method enables visualization of nerve distribution in visceral organs, supporting target validation in neurogastroenterology and autonomic nervous system research. By providing high-resolution mapping of innervation patterns in small or irregular organs, it aids mechanistic de-risking of therapeutic targets involved in biliary tract function. The approach offers predictive confidence for early discovery programs focused on neural modulation of visceral organ physiology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to vagal and visceral nerve function in biliary tract regulation.
- Operational Value: Provides a reliable method for functional target validation through direct visualization of neurofilament-positive nerve fiber distribution.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying neural pathway involvement in biliary tract homeostasis and disease models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline innervation maps in the biliary tract.
- Quantitative Output: Enables measurement of nerve fiber density and distribution patterns, supporting assay standardization and reproducibility.
- Platform Reuse: Adaptable to other neuronal antibodies, allowing scalable application across visceral organ systems after initial optimization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant system modeling by enabling consistent innervation analysis from discovery through preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by clarifying neural contributions to biliary tract function in preclinical models.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of structural innervation changes with functional readouts in translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly for neuro-modulatory approaches to biliary and visceral organ disorders.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing nerve distribution in the biliary tract and associated organs like esophagus and stomach.
- Screening: Enhances assay readiness through standardized tissue preparation and high-success-rate immunostaining, enabling reliable compound effect evaluation on neural structures.
- Analytics: Generates quantitative neuroanatomical data on nerve bundle density and distribution, aiding comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by enabling consistent innervation assessment across model systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable histology platform for visceral organ innervation studies, adaptable to multiple species and neuronal markers.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in neural control of visceral organs.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through a straightforward protocol with high success rate, minimizing technical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing clear neural anatomy data, reducing late-stage biological risk in neuro-visceral therapeutic programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated innervation patterns in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, tissue dissection, and confocal or stereo microscopy for whole-mount imaging.
- Dependent on access to primary and secondary antibodies, enzymatic inactivation reagents, and DAB substrate for colorimetric detection.
- Necessitates cross-team standardization of fixation, permeabilization (e.g., Triton X-100), and antibody incubation conditions across laboratories.
- Involves adaptation considerations when applying to different visceral organs or species, particularly regarding antibody optimization and permeabilization times.
- Limited by the two- to three-week timeline per experiment, requiring planning for longitudinal studies.
