단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

이 프로토콜은 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 표면의 단일 수용체를 시각화 및 추적하여 수용체 측면 이동성, 수용체 복합체의 크기를 분석하고 일시적인 수용체-수용체 상호 작용을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질로 확장될 수 있습니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 살아있는 세포의 표면에서 단일 수용체를 시각화하고 세포의 위치, 운동 및 초분자 복합체에 대한 동적 연관성을 분석하는 것입니다. 이는 살아있는 세포의 표면에서 매우 낮은 수준으로 스냅 태그가 지정된 수용체를 발현하고 밝은 유기 형광단으로 표지하여 단일 분자 검출을 허용함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 전반사 형광 현미경으로 세포를 시각화하여 세포 표면에서 움직이는 개별 수용체 입자의 빠른 이미지 염기서열을 획득할 수 있습니다.

다음으로, 자동 검출 및 추적 알고리즘이 이미지 시퀀스에 적용되어 시간 경과에 따른 각 수용체 입자의 위치와 강도를 얻습니다. 이 예에서 수용체 복합체의 크기에 대한 정확한 분석을 보여주는 결과를 얻을 수 있으며, 이미지 시퀀스의 시작 부분에서 입자의 강도 분포의 혼합 가우스 피팅을 기반으로 두 개의 아드레날린성 수용체를 베타합니다. 이 방법은 우리의 수용체가 살아있는 세포 표면의 od 도메인에서 어떻게 조직되는지와 같은 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이들이 어떻게 서로 상호 작용하여 이량체와 올리고머를 형성하는지, 그리고 수용체 신호전달의 기초에서 역동적인 사건이 실제로 어떻게 일어나고 있는지. 표준 생화학 및 현미경 검사 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 자연 환경에서 단일 수용체의 거동을 조사할 수 있으므로 일반적으로 앙상블 측정에 숨겨져 있는 중요한 측면을 연구할 수 있다는 것입니다. 샘플의 커버 슬립은 배경 형광을 최소화하기 위해 광범위하게 세척해야 합니다.이미징하는 동안 깨끗한 핀셋을 사용하여 직경 24mm를 배치합니다.

유리 커버는 개별 커버 슬립을 분리하는 커버 슬립 홀더에 끼워집니다. 커버 슬립이 있는 홀더를 비커에 넣고 커버 슬립이 덮일 때까지 클로로포름을 추가합니다. 비커를 알루미늄 호일로 덮어 증발을 줄이고 욕조에서 초음파 처리합니다.

실온에서 1시간 동안 초음파 처리합니다. 1시간 후 비커에서 커버 슬립 홀더를 꺼내 커버를 말리십시오. 다음으로, 덮개 슬립이 있는 홀더를 다른 비커에 놓고 덮개 슬립이 덮일 때까지 5몰 수산화나트륨 용액을 추가합니다.

이전과 마찬가지로 비커를 호일로 덮고 실온에서 1시간 동안 초음파 처리한 후 커버 슬립 홀더를 새 비커에 옮기고 증류수로 세 번 씻습니다. 마지막으로 청소한 커버 슬립을 100% 에탄올로 채워진 유리 세포 배양 접시에 넣습니다. 여기에 표시된 것은 청소 전후의 커버 슬립으로, 전반사 형광 또는 잔디 현미경으로 이미지화한 것입니다.

Cal calibration samples는 잔디 현미경 검사 중 단일 형광 분자의 강도를 추정하는 데 사용됩니다. 샘플을 준비하려면 형광 염료를 적절한 용매에 용해시킵니다. 1 picaMolar에서 1 ano molar에 이르는 형광 염료의 1-10 연속 희석을 준비합니다.

필터 살균 물에서. 이전에 청소한 커버 슬립을 필터 멸균수로 채워진 세포 배양 접시에 옮겨 세척합니다. 그런 다음 각 덮개를 6웰 세포 배양 플레이트의 웰에 넣고 마를 때까지 기다렸다가 각 형광 염료 희석 20마이크로리터를 별도의 세척된 커버 슬립에 묻힙니다.

멸균 후드 아래에서 덮개를 말리십시오. transfection하기 전에 사용할 때까지 덮개가 빛과 먼지로부터 미끄러지지 않도록 보호하십시오. 6웰 세포 배양 플레이트 준비: 세척된 커버 슬립을 멸균 PBS로 세척하고 6웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 커버 슬립 1개를 넣습니다.

이 연구를 위해 형질주입될 CHO 세포는 섭씨 37도에서 5%CO2를 1개, 일대일 ECCOs 변형 이글 배지 영양 혼합물 F12에 배양하고, 트립신 후 10% 소 태아 혈청 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 표준 방법에 따라 세포를 계수하고, 웰당 10 내지 5번째 세포의 3배 밀도로 세포를 계수합니다. 커버 슬립을 포함하는 여섯 번째 웰 세포 배양 플레이트에서 최적의 세포 밀도인 약 80%co fluency를 달성하기 위해 인큐베이터에서 세포를 24시간 동안 성장시킵니다. 형질주입용.

이 프로토콜의 가장 어려운 측면은 성공을 보장하기 위해 세포 표면에서 막 수용체의 발현 수준을 매우 낮게 유지하는 것입니다. transfection 조건. 예를 들어, plus media NA의 양과 transfection 후 시간은 transfection 당일에 최적화되어야 합니다.

각각에 대한 transfection 시약을 준비하면 다른 튜브에서 500 microlit의 최적 배지에 원하는 plaid DNA의 2 마이크로 그램이 희석됩니다. 각 웰에 대해 6마이크로리터의 Lipectomy 2000을 500마이크로리터의 Optum 배지에 희석합니다. 두 튜브를 실온에서 5분 동안 배양합니다.

5분 후 두 용액을 하나의 튜브에 결합하고 혼합하여 형질주입 혼합물을 얻습니다. transfection 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양합니다. 그 동안 CHO 세포를 준비합니다.

사전 경고된 PBS로 세포를 두 번 세척 두 번째 세척 후 PBS를 10% FBS가 보충된 페놀 레드 프리 D-M-E-M-F 12 배지당 1밀리리터로 교체하지만 항생제는 사용하지 않습니다. 트랜스펙션 혼합물 1ml를 각 웰에 적가하고 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 완전한 혼합을 보장합니다. 섭씨 37도에서 5%CO2를 넣고 2-4시간 동안 배양한 후 단백질 라벨링을 즉시 진행하십시오.

이 절차를 시작하려면 10% FBS가 보충된 D-M-E-M-F 12 배지 1밀리리터에 플루오로 4 공액 벤조 귄 유도체 또는 플루오로 4 BG 원액 1마이크로리터를 희석하여 1마이크로몰의 최종 농도를 얻습니다. 인큐베이터에서 형질주입된 세포를 회수하고 예열 PBS로 두 번 세척합니다. PBS를 1 밀리리터의 1 마이크로 몰 플루오로 4 BG 용액으로 대체하고 섭씨 37도에서 5 % CO2에서 20 분 동안 배양합니다.

다음으로, 매번 10%FBS가 보충된 D-M-E-M-F 12 배지로 세포를 3회 세척한 다음 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 핀셋을 사용하여 라벨링된 세포가 있는 커버 슬립을 이미징 챔버로 옮겼습니다. 300마이크로리터의 이미징 버퍼로 두 번 세척합니다.

300마이크로리터의 새로운 이미징 버퍼를 추가하고 이미징 이미지를 획득하는 즉시 진행합니다. 오일 이멀젼, 높은 개구수 대물렌즈, 적절한 레이저, 전자 증식 전하 결합 장치, 카메라 및 인큐베이터, 온도 제어 장치가 장착된 잔디 현미경을 사용합니다. 원하는 현미경 매개변수(예: 레이저 라인, 잔디 각도, 노출, 시간, 프레임 속도 및 영화당 이미지 수)를 설정합니다.

현미경의 100 x 대물렌즈에 침지 오일 한 방울을 떨어뜨립니다. 라벨링된 세포가 있는 이미징 챔버를 현미경의 표본 홀더에 놓고 세포에 초점을 맞춥니다. 명시야 조명을 사용합니다.

잔디 조명으로 전환합니다. 원하는 세포를 검색할 수 있도록 레이저 출력을 가능한 한 낮게 유지하되 동시에 광 표백을 최소화합니다. 원하는 셀을 선택하고 벌금을 부과합니다.

초점을 조정합니다. 단일 플로라 4를 시각화할 수 있는 수준까지 레이저 출력을 높입니다. 이미지 시퀀스를 획득하고 보정을 위해 원시 이미지 시퀀스를 tiff 파일로 저장합니다.

이미징 챔버에서 각 보정 샘플을 조립하고 현미경에 놓습니다. 잘 분리된 회절이 포함된 샘플을 선택하십시오. 한 번에 표백하는 한정 스팟.

잔디 이미지 염기서열은 표지된 세포에 대해 입증된 것과 동일한 방식으로 이후에 획득됩니다. 이미지 시퀀스를 준비하려면 Image J와 같은 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 자릅니다. 개별 프레임을 새 폴더에 별도의 TIFF 이미지로 저장하여 각 이미지의 프레임 번호를 표시합니다.

입자 검출 및 추적은 MATLAB 환경에서 U Track과 같은 비상용 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. MATLAB 명령 프롬프트에서 movie selector, GUI. 영화 선택 인터페이스를 열려면 지침에 따라 이전에 저장한 별도의 이미지부터 새 영화 데이터베이스를 만듭니다.

픽셀 크기(나노미터), 시간 간격(초), 개구수, 카메라, 비트, 깊이 및 입자 검출 및 추적에 필요한 형광단의 방출 파장을 제공합니다. 영화 선택 인터페이스에서 영화 데이터베이스를 저장합니다. 단일 입자를 객체 유형으로 선택하여 해석을 실행합니다.

감지 알고리즘을 실행한 다음 추적 알고리즘을 실행합니다. URAC 패키지에 포함된 동영상 뷰어 루틴을 사용하여 트랙을 시각화하고 감지 및 추적의 품질을 확인합니다. 점 MAT 파일을 열어 각 프레임에서 추적된 입자의 위치와 진폭을 확인합니다.

입자의 크기는 수집된 데이터에서도 계산할 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 snap 태그가 지정된 beta two 아드레날린 수용체로 형질 주입되고 fluoro 4 conjugated benzyl guine derivative로 표지된 세포의 전형적인 잔디 이미지 시퀀스의 첫 번째 프레임입니다. 반점은 단일 수용체 또는 수용체 복합체를 나타냅니다.

검출 알고리즘이 동일한 이미지 시퀀스에 적용되고 감지된 각 입자는 추적 알고리즘의 파란색 원 적용으로 표시됩니다. 동일한 이미지 시퀀스에 대해 파란색으로 표시된 개별 입자의 궤적이 나타납니다. 녹색 세그먼트는 병합 이벤트를 나타내고 빨간색 세그먼트는 분할 이벤트를 나타냅니다.

이 방법은 동적 이벤트도 캡처합니다. 이 예에서는 두 입자가 과도 상호 작용을 거쳐 여러 프레임 동안 함께 이동한 후 다시 분할됩니다. 개별 입자의 궤적은 확산 계수를 계산하는 데 사용됩니다.

이 대표적인 결과는 베타 2 아드레날린성 수용체가 높은 이동성을 가지고 있음을 보여줍니다. gaba B 수용체는 이동성이 제한되어 있지만, 수용체 복합체의 크기는 입자 강도의 분포를 혼합 가우스 모델로 피팅하여 정확하게 추정할 수 있습니다. 이 분석은 또한 단량체와 이량체의 공존을 밝힐 수 있습니다.

여기에 표시된 것은 한 단계로 표백하는 단량체 수용체 입자와 두 단계로 표백하는 지름 수용체 입자의 예입니다. 이러한 절차는 다른 세포 표면 단백질, 레벨링 방법 및 세포 모델과 함께 작동하도록 확장 및 조정할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 깨끗한 덮개 수면을 생성하는 방법, 밝은 유기 불소로 낮은 발현 수준과 효율적인 표지를 얻는 방법, 성공적인 단일 분자.T를 위한 모든 핵심 단계를 나타내는 잔디 이미지를 획득하고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.