Name: 단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 13 s
Description: 학습하세요 단일 분자 형광 현미경을 활용한 수용체 역학 분석 방법을. 살아있는 세포 표면에서 개별 수용체의 이동성과 복합체 크기를 정밀하게 측정하여 세포 신호 전달 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

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이 프로토콜의 개발은 유럽 연구 위원회(Advanced Grant TOPAS to M.J.L.)와 Deutsche Forschungsgemeinschaft(D.C.에 CA 1014/1-1 보조금, M.J.L.에 SFB487 보조금)의 보조금으로 지원되었습니다. T.S.는 Alexander von Humboldt Foundation의 지원을 받았습니다.

1. 샘플 준비 <ol><li> 커버 슬립 청소 참고 : 흄 후드에서 작업 할 수 있습니다. <ol><li> 개별 커버 슬립을 분리하는 커버 슬립 홀더에 유리 커버 슬립 (24mm 직경)를 배치하는 깨끗한 핀셋을 사용합니다. </li><li> 비이커에 커버 슬립으로 홀더를 넣고, 커버 슬립이 덮여 때까지 클로로포름을 추가합니다. RT에서 1 시간 동안 욕조 초음파 처리기에서 증발 및 초음파 처리를 줄이기 위하여 알루미늄 호일로 비이커 커버. 비커 밖으로 커버 슬립 홀더를 가지고 coverslips를 건조 할 수 있습니다. </li><li> 대신 클로로포름 5M NaOH 용액으로 단계 1.1.2를 반복합니다. </li><li> 새로운 비커에 커버 슬립 홀더를 가지고 증류수로 3 회 세척한다. 100 % 에탄올로 가득 유리 세포 배양 접시에서 청소 커버 슬립을 넣어. </li></ol></li><li> 교정 샘플의 제조 <ol><li> 적당한 용매에 형광 염료를 녹여. </li><li> 까지 형광 염료의 1:10 시리얼 희석을 준비부터 1 pm 1 nm의 필터 (0.22 μm의) 물을 살균. </li><li> 100 % 에탄올에 저장 청소 커버 슬립을 가지고 필터 멸균 수로 세척. 별도의 청소 커버 슬립의 각 형광 염료 희석 자리 20 μL. 커버 슬립이 멸균 후드 건조시킵니다. 사용할 때까지 빛과 먼지 커버 슬립을 보호합니다. 단일 형광 분자의 강도 (3 단계 참조)을 추정하기 위해이 샘플을 사용합니다. </li></ol></li><li> 형질 <ol><li> 1시 1분 둘 베코 변형 이글 배지 / 영양 혼합물 문화 CHO 세포 F-12 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 100 U / ㎖ 페니실린, 37 ° C에서 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신,에 보충 (DMEM/F12) . 5 % CO 2 주 : 형광도를 최소화하기 위해 실험을하는 동안 페놀 레드 무료 용지를 사용하십시오. </li><li> , 100 % 에탄올 용액에서 청소 커버 슬립을 멸균 인산 완충 생리 식염수 (PBS)로 세척하고, 6 웰 세포 배양 (PL)의 각 웰에 한 커버 슬립을 배치먹었다. </li><li> 를 Trypsinize는 세고 3 × 105 세포 / 웰 커버 슬립을 함유하는 6 - 웰 세포 배양 접시의 밀도로 시드 CHO 세포. 세포가 약 달성하기 위해 24 시간 동안 (37 ° C에서 5 % CO 2) 배양기에서 성장하자. 형질 전환을위한 최적의 세포 밀도 80 % 자랄. </li><li> 각 웰의 경우, (예를 들면., 2 - 아드레날린 수용체 β SNAP-태그) 원하는 플라스미드 DNA의 2 μg을 희석 500 μL의 티멤 매체를 포함하는 두 개의 튜브에서 6 μL의 리포 펙 타민 2000. 실온에서 5 분 동안 품어. </li><li> 하나의 튜브에 단계 1.3.4에서 솔루션을 결합하고 형질 전환 혼합물을 얻기 위해 혼합한다. 20 분 동안 RT에서 형질 감염 혼합물을 배양한다. </li><li> 배양 (1.3.5) 동안, CHO 세포를 가지고 예열 (37 ℃) PBS로 두 번 세척한다. 1 ㎖ / 10 % FBS와 보충 페놀 레드 무료 DMEM/F12 매체의 잘하지만 항생제로 PBS를 교체합니다. </li><li> 전체 형질 추가부드럽게 이온 혼합물 아니라 각 단계 1.3.5 적하에서 (1 ㎖), 그리고 완전한 혼합을 보장하기 위해 앞뒤 판 바위. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 2 ~ 4 시간 동안 배양하고 다음 단계로, 그 후 즉시 진행 참고 :.이 형질 전환 조건에 대한 단일 적합한 수용체 밀도 &lt;0.45 입자 / μm의 2를 달성하기 위해 최적화 된 분자 영상. 다른 세포 구조 나 시약을 사용하는 경우 조정이 필요할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 단백질 라벨 <ol><li> 1 μM의 최종 농도를 얻기 위해 10 % FBS로 보충 된 1 ㎖ DMEM/F12 배지에서 형광 물질 BG 스톡 용액의 1 ㎕의 희석. 인큐베이터에서 형질 전환 세포를 가지고 예비 가온 (37 ° C) PBS로 두 번 세척한다. 1 μM 형광-BG 용액 1 ㎖의 PBS를 교체하고 인큐베이터에서 37 ° C 5 % CO 2에서 20 분 동안 품어. </li><li> 배양 후, 세포를 세 씻어10 % FBS와 보충 DMEM/F12 매체와 시간마다 37 ℃에서 5 분 인큐베이션 핀셋 (표시 셀) 커버 슬립을 가지고 이미징 챔버에 배치합니다. </li><li> 300 ㎕의 영상 버퍼로 두 번 씻으십시오. 신선한 영상 버퍼 300 μl를 추가하고 영상 (2 부)로 바로 이동합니다. </li></ol></li></ol> 2. 이미지 획득 NOTE : 전반사 형광 오일 침지 높은 개구 수 대물 (. 예 100X magnification/1.46 개구), 최적의 레이저 (예를 들어, 405 나노 미터, 488 나노 미터, 561 ㎚, 645 탑재 (TIRF) 현미경을 사용 nm의 다이오드 레이저), 전자 곱한 전하 결합 소자 (EMCCD) 카메라, 인큐베이터 및 단일 형광 분자를 시각화하는 온도 제어. <ol><li> 원하는 현미경 매개 변수, 예를 설정합니다., 레이저 라인, TIRF 각도 (이 매개 변수에 침투를 제어사라져가는 필드의 기의 깊이), 노출 시간, 프레임 속도 및 영화 (10) 당 이미지 수. 온도 감도는 수분 응축을 방지하기 위해 항상 히터 / 보육 및 온도 제어를 유지합니다. </li><li> 현미경의 100X 목적에 침지 기름 한 방울을 넣어. 현미경의 시편 홀더에 표시된 세포 이미징 챔버를 배치하고 시야 조명을 사용하여 초점 세포를 가져옵니다. </li><li> TIRF 조명으로 전환합니다. 그러나 동시에, 원하는 셀에 대한 검색 광표백을 최소화하도록 가능한 한 낮은 레이저 출력을 유지한다. </li><li> 원하는 셀을 선택하고 정밀한 초점을 조정합니다. 단일 형광의 시각화를 허용 레벨로 레이저 파워를 설정한다. 이미지 시퀀스를 획득. TIFF로 RAW 이미지 시퀀스 파일을 저장합니다. </li></ol> 3. 교정 (유리 및 단량체 / 이량 체 수용체 컨트롤에 단일 형광) <ol><li> 각 교정 SAMPL 조립촬상 챔버에서 1.2에 설명 된대로 전자 제조. 현미경으로 각 샘플을 놓고 한 단계 참고로 표백 잘 분리 회절 제한 장소를 포함하는 샘플을 선택합니다.이 반점은 형광 염료의 분자 하나를 나타냅니다. </li><li> 2 단계 설명 TIRF 이미지 시퀀스를 획득 중요. 동일한 촬상 파라미터 보정 것들을 포함한 모든 실험에 사용되어야한다. </li><li> 4.2 - 검색 및 4.1에 설명 된대로 추적 분석을 수행합니다. 4.2.6에 설명 된대로 각 입자의 강도를 추출합니다. 이 데이터에서 평균 (μ)와 하나의 형광 강도의 표준 편차 (σ)를 계산합니다. </li><li> 선택적 : 단량체 세포 표면 수용체 (. 예, CD86)로 형질 감염된 세포에서 동일한 분석을 수행, N-말단은 SNAP (10)의 하나 또는 두 개의 카피로 태그 및 형광 BG-유도체로 표지. FOLLO유리에 하나의 형광 위에서 설명한 절차 w. Calebiro, D. 등의 설명에 따라 라벨 효율을 예상하고있다. 10 </li></ol> 4. 이미지 분석 <ol><li> 이미지 시퀀스 준비 <ol><li> 이미지를 자르려면 이미지 처리 소프트웨어 (예., ImageJ에)를 사용합니다. </li><li> 별도의 개별 프레임을 저장합니다. TIFF 이미지를 새 폴더에, 각 이미지 프레임 번호를 나타낸다. </li><li> 셀의 형상을 따라 그 (ROI)의 영역을 드로잉하고 ImageJ에있는 공구 측정 또는 다른 소프트웨어에서 유사한 공구를 사용하여 셀 면적을 측정한다. 세포 표면 영역에 의해 동영상의 시작 부분에 입자의 총 개수로 나눔으로써 입자 밀도를 계산하기 위해이 값을 사용한다. </li></ol></li><li> 입자 검출 및 추적 참고 : 매트랩 작업 등 U-추적 13로 비 상업용 소프트웨어를 사용하여자동으로 감지하고 하나의 수용체 입자를 추적 할 수있는 환경. 참고 : U-트랙 알고리즘은 다중 가설 추적 방식을 기반으로합니다. 이 방법은 한 프레임에 주어진 입자, 다음 프레임에 주어진 입자에 해당하는 표시, 사라 / 또는 다른 입자 /로 분할 병합 개별 확률이 할당되는 비용 행렬을 구축하여 프레임 사이의 입자를 연결합니다. 전 세계적으로 비용을 최소화하는 솔루션은, 즉., 확률이 가장 높은 사람은 마지막으로 선택됩니다. 이는 또한 일시적으로 사라지는 입자, 형광 깜박임 기인 전형적인 현상을 추적한다. U-트랙 (2.1.0)의 최신 버전은 이러한 분석의 실행을 촉진 그래픽 사용자 인터페이스를 가지고 있습니다. <ol><li> 영화 선택 인터페이스를 열기 위해 Matlab을 명령 프롬프트에서 다음을 입력합니다 "movieSelectorGUI". 을 만드는 지침에 따라이전에 저장 한 별도의 이미지부터 새 영화 데이터베이스 (4.1.2 참조). </li><li> 입자 검출 및 추적에 필요한 화소 크기에서 나노 초 시간 간격, 개구, 카메라 비트 깊이와 형광 물질의 발광 파장을 제공한다. 영화 데이터베이스를 저장합니다. </li><li> 영화 선택 인터페이스에서 객체의 유형으로 "단일 입자"를 선택, 분석을 실행합니다. 입자 탐지 및 추적에 사용되는 매개 변수를 정의 할 수있는 새 창이 나타납니다. 기본 매개 변수로 시작합니다. . 감지 및 / 또는 추적의 품질이 선택 (예를 들어, 일부 입자가 검출이나 트랙이 단편화되지 않습니다) 만족하지 않은 경우 나중에 이러한 매개 변수를 조정합니다 추적 설정에서 저장하는 "매트릭스 형식으로 내보낼 추적 결과를"확인 "trackedFeaturedInfo라는 단일 매트릭스 (필드의 좌표와 모든 입자의 진폭"). 이러한 매개 변수에 대한 자세한 내용은 U-트랙 문서를 참조하십시오. </li><li> 검출 알고리즘을 실행합니다. 이 알고리즘은 자동으로 각 회절 한정 스폿 로컬 강도 맥시마 주위 현미경의 점 분포 함수와 동일한 표준 편차 이차원 가우스 함수 피팅에 의해 (즉. 단일 수용체 / 수용체 복합체)의 배경 위에 위치 및 세기를 결정 . 그 후, 추적 알고리즘을 실행. . 매트 파일의 분석 결과를 저장합니다. </li><li> 트랙을 시각화하고 탐지 및 추적의 품질을 확인하기 위해 U-트랙 패키지에 포함 된 "movieViewer"루틴, 또는 유사한 사용자 지정 것들을 사용합니다. </li><li> 각 프레임에서 추적 입자의 위치와 진폭 (예., 강도)을 볼 수 있도록. 매트 파일을 엽니 다. 4.2.4 단계에서 생성 된 데이터는 tracksFinal 아칸소의 tracksCoordAmpCG 필드에 포함되어 있습니다선 및 / 또는 trackedFeaturedInfo합니다. 입자의 총 개수에서 4.1.3에서 측정 셀 표면적으로 나눈 값이 입자 밀도를 산출 검출. </li><li> 선택적 : 입자가 수용체 입자의 움직임을 분석하는 (4.2.6 참조) 시간의 경과에 위치 사용. Matlab을 유사한 소프트웨어를 사용하여 평균 제곱 변위 (MSD) 및 확산 계수 (D)를 계산한다. 각 입자마다 시간 간격 (Δ의 t)를 고려, 다음과 같은 공식을 사용하여 평균 제곱 변위 (MSD)를 계산 : <img align="middle" alt="식 (1)" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq1.jpg"> Δ의 t 프레임의 시간 간격이고, N 분석 단계의 수이고, x 및 y는 입자의 X 및 Y는 인덱스에 의해 지시 된 프레임에 위치한다. 선형 관계 : 주어진 입자의 운동 종류를 평가하는 시간 플롯 위에 MSD를 사용자유 확산 (예., 브라운 운동), 양의 곡률을 나타냅니다 (즉., 곡선이 포물선 모양) 감독 운동을 제안, 음의 곡률이 제한 운동 (14)을 나타낸다. 자유롭게 확산 입자의 경우, 다음의 식으로 얻어 MSD 데이터 피트에 의해 각 입자의 확산 계수 (D)를 계산한다 : <img align="middle" alt="식 2" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq2.jpg"></li></ol></li><li> 가우스 피팅 방법으로 입자 크기의 계산 NOTE : 보정 샘플 (유리 및 / 또는 형광 표지 된 단량체 성 수용체에 단일 형광체)의 강도 분포를 알면, 수용체 복합체의 크기를 결정하기 위해 이미지 시퀀스의 시작 부분에서의 입자 농도의 분포에 혼합 가우스 피팅을 수행 (예. 입자 당 수용체의 수) 10. Matlab을 또는 s를 사용하여 이러한 분석을 수행imilar 소프트웨어. <ol><li> 강도의 변화가 제 (photobleaching에 의한 대부분의 경우에 저하)가 발생하기 전에 프레임의 첫 번째 프레임에서의 입자의 강도를 평균하여 각 입자의 강도를 계산한다. </li><li> 다음 식에 따라 혼합 가우시안 피팅을 수행합니다 : <img align="middle" alt="식 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq3.jpg"> φ (i)는 입자가 나는 강도를 갖는 주파수이고, n은 구성 요소의 수입니다, α N 구성 요소 n의 높이에 기여하는 매개 변수이고, μ와 σ는 평균과 참조 하나의 형광 강도의 표준 편차입니다 . (3 단계에서 설명 된대로 계산) 주 : T를 결정F-검정에 의해 판단으로 그는 점차 구성 요소를 추가 할 때까지 N 최대 증가하여 각 이미지 시퀀스에 대한 구성 요소 (N 최대)의 최대 수는 더 이상 통계적으로 더 나은 피팅을 생산하지 않습니다. </li><li> 선택 사항 : (. 예를 들면, 400 프레임 시퀀스의 마지막 60 프레임) 동영상의 마지막 프레임에서 얻어진 강도 분포에 혼합 가우시안 적합을 수행합니다. 이러한 매개 변수에 대한 정교한 예측을 제공하는이 피팅 후의 값, 단계를 반복 4.3.2와 μ와 σ를 교체합니다. </li><li> 혼합 가우스 적당한 각 성분의 곡선 (AUC) 아래의 면적을 계산한다. 다른 크기 분포 전체의 AUC에 의해 각 구성 요소의 AUC 값을 나눔으로써 (즉, 단량체, 이량 체, 삼량 체 등)의 수용체 입자의 상대적인 풍부함을 계산한다. </li><li>선택 사항 : 다른 세포와 다른 크기와 입자의 분포는 입자 밀도 (10)와 상관 관계 플롯을 생성하는 (4.2.6에 설명 된대로 계산) 해당 입자 밀도에서 사용 데이터. </li></ol></li><li> 단계 피팅 방법으로 입자 크기의 계산 NOTE : 수용체 복합체 (10)의 크기를 결정하기 위해 다른 방법으로 스텝 - 피팅 분석을 사용한다. N의 형광을 포함하여 입자 점진적으로 표백제 N 단계를 강도 프로파일을 생성 할 것으로 예상된다 -이 분석의 기초는 순간 실종에 하나의 형광 결과의 빛에 의한 파괴 (photobleaching에)가 있다는 것입니다. <ol><li> U-트랙 또는 유사한 탐지 / 추적 소프트웨어 (4.2.6 참조)에 의해 생성 된. 매트 파일에서 각 입자의 강도 프로파일을 추출합니다. </li><li> 이러한 제시된 하나로서, 스텝 피팅 알고리즘을 사용심판의. 10, 각 입자에 대한 표백 단계의 수를 계산. </li><li> 선택적 : (4.3 참조) 다른 크기의 수용체 입자의 상대적인 풍부함을 나타내는 분포를 생성하고 이전에 혼합 가우스 피팅의 결과에 대하여 기술 된 바와 같이 입자 밀도로 그들을 연관시키는 결과를 사용한다. </li></ol></li></ol>

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

설명 프로토콜은 단일 분자 수준에서 공간 배열, 이동성과 세포 표면 수용체 복합체의 크기를 분석 할 수 있습니다. 형광 단백질의 사용에 비해 더 밝고 광 안정성이다 작은 유기 형광체와 라벨은 단일 수용체 입자의 확장 된 시각화를 허용하는 장점을 갖는다. 매우 낮은 발현 수준이 달성되기 때문에 (&lt;0.45 수용체 입자 / 2 ㎛)을, 수용체 및 기타 막 단백질의 생리 학적 특성은 사람을 초과하지 않는 밀도에서 분석 될 수있다. 또한, 효능 제 (10) 또는 다른 조작과 수용체 자극의 효과는, 예를 들어 병리학 적 상황을 재현을 목표로 분석 할 수있다. 또한, 때문에 SNAP / CLIP 태그 (11, 12)와 라벨 전략의 유연성, 다른 형광체는 하나의 특정 요구에 따라 사용할 수 있습니다 - 눈에 띄게, SNAP의 조합및 CLIP 태그는 두 색 실험 예를 수행하는데 사용될 수있다.,이 상호 작용하는 단백질 사이 colocalization을 관찰하기....

세포 표면에있는 수용체는 세포 외 환경을 감지하고 취기 제, 이온, 작은 신경 전달 물질 및 대형 단백질 호르몬 자극 등 다양한 반응한다. 세포막의 유체 특성은 수용체와 다른 막 단백질의 운동을 할 수 있습니다. 이것은 단백질 복합체와 같은 기능 유닛으로 조립하고 세포 내부에 신호를 형질 도입하는 수용체에 의해 사용되는 것과 같은 과도 단백질 - 단백질 상호 작용의 발생의 형성에 필수적이다. 예를 들어, 세포 표면 수용체 1의 가장 큰 가족을 구성하는 G-단백질 결합 수용체 (GPCR에)는, 신호 전달의 미세 조정 조절에 관여하는 것으로 나타나고 di-/oligomers를 형성하기 위해 제안되었다 중요한 생리 및 약리학 적 결과 2-5가있을 수 있습니다. 단일 분자 현미경 직접 높은 spatiotemp과 시각화의 큰 잠재력을 가지고경구 해상도 그들의 조합을 포함하여 살아있는 세포의 표면에 위치한 각각의 수용체의 동적 거동은 다이머 및 고차 분자 복합체 6-10을 형성한다. 이것은 일반적으로 분자의 수천 또는 수백만의 평균 행동을보고 표준 생화학 적 및 현미경 방법에 비해 여러 가지 장점을 제공합니다. 충분히 밝고 광 안정성과 형광 단백질 라벨은 단일 분자 현미경을 위해 필수적이다. 이 프로토콜은 공유 세포 표면의 수용체에 작고 밝은 유기 형광 물질을 부착 최근에 도입 된 SNAP 태그 (11)을 이용합니다. SNAP는 돌이킬 형광 - 복합 benzylguanine (형광-BG) 파생 상품으로 표시 할 수있는 인간의 DNA 수리 효소 O 6 alkylguanine-DNA의 alkyltransferase에서 파생 된 20 kD의 단백질 태그입니다. CLIP, SNAP에서 파생 된 추가 설계 태그 대신 형광-C로 표시 할 수 있습니다onjugated benzylcytosine 유도체 12. 이 논문에보고 된 프로토콜은 형질 및 레이블 작은 유기 형광 11 수용체를 SNAP-태그와 살아있는 세포 (10)의 표면에 하나의 수용체 나 수용체 복합체를 시각화하기 위해 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경을 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 세포 외 SNAP-태그 세포 표면 단백질 10&gt; 90 %의 표지 효율이보고 된 프로토콜 결과. 수용체 복합체의 크기와 이동성을 분석 할뿐만 아니라 과도 수용체 - 수용체 상호 작용을 캡쳐하는 단일 분자 데이터를 사용하는 방법에 대한 추가 정보가 제공된다. 전체 프로토콜의 개략적 인 흐름은도 1에 제시되어있다. 예로 중국 햄스터 난소 SNAP-태그 된 G-단백질 결합 수용체 (GPCR에)와 (CHO) 세포의 형질 감염이 같은 형광 물질 BG 유도체로 라벨링 하였다 잘 자사의 응용 프로그램이 quantif하기Y와 모니터 수용체 di-/oligomerization가 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 다른 세포 표면 단백질 및 형광 태그 (예., CLIP), 등 형질 및 표지 방법으로 확장 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>클로로폼</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1585</td><td>주의: 독성 및 자극성 물질 및 가능한 발암 물질</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>주의: 강한 염기와 고부식성 시약</td></tr><tr><td>절대 에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립&nbsp;</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>111640</td><td>24 mm 직경, 0.13-0.16 mm 두께</td></tr><tr><td>0.2 mm 멸균 필터</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>CHO 세포</td><td>ATCC, USA</td><td>ATCC CCL-61</td><td>중국 햄스터 난소 세포주</td></tr><tr><td>6-웰 세포 배양 플레이트</td><td>Nunc</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 배지</td><td>GIBCO, Life Technologies</td><td>11039-021</td><td>페놀-레드 유리 배지</td></tr><tr><td>태아 소 혈청&nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>S 0115</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 - 스트렙토마이신&nbsp;</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P06-07 100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P10-23100</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Fluorophore-conjugated benzylguanine&nbsp;</td><td>뉴잉글랜드 BioLabs</td><td>S9136S</td><td>SNAP-Surface Alexa Fluor 647. DMSO에서 1mM 스톡 용액을 만듭니다. -20°C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>이미징 버퍼:</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, 멸균 필터링</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; NaCl</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1371</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; KCl</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3582</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; CaCl2</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A2303</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; MgCl2</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3618</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; HEPES</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>이미징 챔버</td><td>분자 프로브, Life Technologies</td><td>A-7816</td><td>Attofluor 세포 챔버, 현미경 검사용</td></tr><tr><td>TIRF-M</td><td>Leica</td><td></td><td>모델: DMI6000B</td></tr><tr><td>TIRF 대물렌즈</td><td>Leica</td><td>11 506 249&nbsp;</td><td>HCX PL Apo 100x/1.46 오일 코어&nbsp;</td></tr><tr><td>EM-CCD 카메라&nbsp;</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td>Photometrics Cascade 512B</td></tr><tr><td>온도 컨트롤러</td><td>Pecon</td><td></td><td>Tempcontrol 37-2 디지털</td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>NIH, 미국</td><td></td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij</td></tr><tr><td>u-track 소프트웨어</td><td>컴퓨터 세포 생물학 연구소, 세포 생물학과, 하버드 의과 대학, 미국</td><td></td><td>http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</td></tr><tr><td>Matlab 소프트웨어</td><td>: The MathWorks, 미국</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

단일 분자 현미경은 그 부분 (예를 들면., 역학, 다른 주와 인구, 과도 상호 작용의 공존) 일반적으로 앙상블 측정에 숨겨진,, 등에 관한 특히, 신호 분자의 행동을 분석 할 수있는 강력한 방법으로 대두되고 표준 생화학 적 또는 현미경 방법으로 얻은. 따라서, 이러한 수용체 - 수용체 상호 작용과 같은 동적 이벤트는, 높은 시공간 해상도를 가진 살아있는 세포에서 실시간으로 따라야 할 수있다. 이 프로토콜은 작고 밝은 유기 형광체와 직접 살아있는 세포의 표면에 단일 수용체를 시각화하는 전반사 형광 (TIRF) 현미경으로 라벨에 기반 방법을 설명한다. 이러한 접근 방식은 하나가 정확하게 수용체를 지역화 수용체 복합체의 크기를 측정하고, 이러한 과도 수용체 - 수용체 상호 작용과 같은 동적 이벤트를 캡처 할 수있다. 이 프로토콜은 퍼가기하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공샘플 준비, 이미지 수집 및 이미지 분석을 포함하는 단일 분자 실험을 rform. 예로서, 본 방법의 애플리케이션이 G-단백질 결합 수용체를 분석하기 위해, 즉., 2 - 아드레날린 및 γ-아미노 낙산 타입 B (GABA의 B) 수용체 β,보고된다. 프로토콜은 다른 막 단백질 및 다양한 셀 모델, 형질 감염 방법 및 표지 전략을 적용 할 수있다.

기술 된 프로토콜은 서로 다른 막 단백질의 다양한 적용 할 수있다. 예로서, β-2 아드레날린 성 및 GABA B 수용체로 얻어진 대표적인 결과 (10)를보고한다. 하나의 분자에서 형광 신호가 미약하기 때문에, 배경 형광의 최소화는 성공적인 결과에 대한 첫 번째 중요한 단계입니다. 따라서, 광범위하게 세정 커버 슬립 (도 2A)를 사용하는 것뿐만 아니라, 시료의 autofluorescence (예., 페놀 레드없는 배지를 사용하여)을 최소화하는 것이 중요하다. 다음 단계는 단일 형광 분자의 형광 강도를 결정하는 것이다. 이것은 깨끗한 커버 슬립 (그림 2B)에서 발견 한 형광 이미징하여 수행 할 수 있습니다. 일반적으로 형광의 직렬 희석, 분석을위한 최적의 조건을 선택하는 데 사용됩니다 즉., 잘 분리하고 균일하게 분포 하나의 형광 물질을 생산 농도. 추가 (계속)rols 모노...

이 프로토콜은 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 표면의 단일 수용체를 시각화 및 추적하여 수용체 측면 이동성, 수용체 복합체의 크기를 분석하고 일시적인 수용체-수용체 상호 작용을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질로 확장될 수 있습니다.

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

다음 실험의 전반적인 목표는 살아있는 세포의 표면에서 단일 수용체를 시각화하고 세포의 위치, 운동 및 초분자 복합체에 대한 동적 연관성을 분석하는 것입니다. 이는 살아있는 세포의 표면에서 매우 낮은 수준으로 스냅 태그가 지정된 수용체를 발현하고 밝은 유기 형광단으로 표지하여 단일 분자 검출을 허용함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 전반사 형광 현미경으로 세포를 시각화하여 세포 표면에서 움직이는 개별 수용체 입자의 빠른 이미지 염기서열을 획득할 수 있습니다.다음으로, 자동 검출 및 추적 알고리즘이 이미지 시퀀스에 적용되어 시간 경과에 따른 각 수용체 입자의 위치와 강도를 얻습니다. 이 예에서 수용체 복합체의 크기에 대한 정확한 분석을 보여주는 결과를 얻을 수 있으며, 이미지 시퀀스의 시작 부분에서 입자의 강도 분포의 혼합 가우스 피팅을 기반으로 두 개의 아드레날린성 수용체를 베타합니다. 이 방법은 우리의 수용체가 살아있는 세포 표면의 od 도메인에서 어떻게 조직되는지와 같은 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이들이 어떻게 서로 상호 작용하여 이량체와 올리고머를 형성하는지, 그리고 수용체 신호전달의 기초에서 역동적인 사건이 실제로 어떻게 일어나고 있는지. 표준 생화학 및 현미경 검사 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 자연 환경에서 단일 수용체의 거동을 조사할 수 있으므로 일반적으로 앙상블 측정에 숨겨져 있는 중요한 측면을 연구할 수 있다는 것입니다. 샘플의 커버 슬립은 배경 형광을 최소화하기 위해 광범위하게 세척해야 합니다.이미징하는 동안 깨끗한 핀셋을 사용하여 직경 24mm를 배치합니다.유리 커버는 개별 커버 슬립을 분리하는 커버 슬립 홀더에 끼워집니다. 커버 슬립이 있는 홀더를 비커에 넣고 커버 슬립이 덮일 때까지 클로로포름을 추가합니다. 비커를 알루미늄 호일로 덮어 증발을 줄이고 욕조에서 초음파 처리합니다.실온에서 1시간 동안 초음파 처리합니다. 1시간 후 비커에서 커버 슬립 홀더를 꺼내 커버를 말리십시오. 다음으로, 덮개 슬립이 있는 홀더를 다른 비커에 놓고 덮개 슬립이 덮일 때까지 5몰 수산화나트륨 용액을 추가합니다.이전과 마찬가지로 비커를 호일로 덮고 실온에서 1시간 동안 초음파 처리한 후 커버 슬립 홀더를 새 비커에 옮기고 증류수로 세 번 씻습니다. 마지막으로 청소한 커버 슬립을 100% 에탄올로 채워진 유리 세포 배양 접시에 넣습니다. 여기에 표시된 것은 청소 전후의 커버 슬립으로, 전반사 형광 또는 잔디 현미경으로 이미지화한 것입니다.Cal calibration samples는 잔디 현미경 검사 중 단일 형광 분자의 강도를 추정하는 데 사용됩니다. 샘플을 준비하려면 형광 염료를 적절한 용매에 용해시킵니다. 1 picaMolar에서 1 ano molar에 이르는 형광 염료의 1-10 연속 희석을 준비합니다.필터 살균 물에서. 이전에 청소한 커버 슬립을 필터 멸균수로 채워진 세포 배양 접시에 옮겨 세척합니다. 그런 다음 각 덮개를 6웰 세포 배양 플레이트의 웰에 넣고 마를 때까지 기다렸다가 각 형광 염료 희석 20마이크로리터를 별도의 세척된 커버 슬립에 묻힙니다.멸균 후드 아래에서 덮개를 말리십시오. transfection하기 전에 사용할 때까지 덮개가 빛과 먼지로부터 미끄러지지 않도록 보호하십시오. 6웰 세포 배양 플레이트 준비: 세척된 커버 슬립을 멸균 PBS로 세척하고 6웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 커버 슬립 1개를 넣습니다.이 연구를 위해 형질주입될 CHO 세포는 섭씨 37도에서 5%CO2를 1개, 일대일 ECCOs 변형 이글 배지 영양 혼합물 F12에 배양하고, 트립신 후 10% 소 태아 혈청 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 표준 방법에 따라 세포를 계수하고, 웰당 10 내지 5번째 세포의 3배 밀도로 세포를 계수합니다. 커버 슬립을 포함하는 여섯 번째 웰 세포 배양 플레이트에서 최적의 세포 밀도인 약 80%co fluency를 달성하기 위해 인큐베이터에서 세포를 24시간 동안 성장시킵니다. 형질주입용.이 프로토콜의 가장 어려운 측면은 성공을 보장하기 위해 세포 표면에서 막 수용체의 발현 수준을 매우 낮게 유지하는 것입니다. transfection 조건. 예를 들어, plus media NA의 양과 transfection 후 시간은 transfection 당일에 최적화되어야 합니다.각각에 대한 transfection 시약을 준비하면 다른 튜브에서 500 microlit의 최적 배지에 원하는 plaid DNA의 2 마이크로 그램이 희석됩니다. 각 웰에 대해 6마이크로리터의 Lipectomy 2000을 500마이크로리터의 Optum 배지에 희석합니다. 두 튜브를 실온에서 5분 동안 배양합니다.5분 후 두 용액을 하나의 튜브에 결합하고 혼합하여 형질주입 혼합물을 얻습니다. transfection 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양합니다. 그 동안 CHO 세포를 준비합니다.사전 경고된 PBS로 세포를 두 번 세척 두 번째 세척 후 PBS를 10% FBS가 보충된 페놀 레드 프리 D-M-E-M-F 12 배지당 1밀리리터로 교체하지만 항생제는 사용하지 않습니다. 트랜스펙션 혼합물 1ml를 각 웰에 적가하고 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 완전한 혼합을 보장합니다. 섭씨 37도에서 5%CO2를 넣고 2-4시간 동안 배양한 후 단백질 라벨링을 즉시 진행하십시오.이 절차를 시작하려면 10% FBS가 보충된 D-M-E-M-F 12 배지 1밀리리터에 플루오로 4 공액 벤조 귄 유도체 또는 플루오로 4 BG 원액 1마이크로리터를 희석하여 1마이크로몰의 최종 농도를 얻습니다. 인큐베이터에서 형질주입된 세포를 회수하고 예열 PBS로 두 번 세척합니다. PBS를 1 밀리리터의 1 마이크로 몰 플루오로 4 BG 용액으로 대체하고 섭씨 37도에서 5 % CO2에서 20 분 동안 배양합니다.다음으로, 매번 10%FBS가 보충된 D-M-E-M-F 12 배지로 세포를 3회 세척한 다음 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 핀셋을 사용하여 라벨링된 세포가 있는 커버 슬립을 이미징 챔버로 옮겼습니다. 300마이크로리터의 이미징 버퍼로 두 번 세척합니다.300마이크로리터의 새로운 이미징 버퍼를 추가하고 이미징 이미지를 획득하는 즉시 진행합니다. 오일 이멀젼, 높은 개구수 대물렌즈, 적절한 레이저, 전자 증식 전하 결합 장치, 카메라 및 인큐베이터, 온도 제어 장치가 장착된 잔디 현미경을 사용합니다. 원하는 현미경 매개변수(예: 레이저 라인, 잔디 각도, 노출, 시간, 프레임 속도 및 영화당 이미지 수)를 설정합니다.현미경의 100 x 대물렌즈에 침지 오일 한 방울을 떨어뜨립니다. 라벨링된 세포가 있는 이미징 챔버를 현미경의 표본 홀더에 놓고 세포에 초점을 맞춥니다. 명시야 조명을 사용합니다.잔디 조명으로 전환합니다. 원하는 세포를 검색할 수 있도록 레이저 출력을 가능한 한 낮게 유지하되 동시에 광 표백을 최소화합니다. 원하는 셀을 선택하고 벌금을 부과합니다.초점을 조정합니다. 단일 플로라 4를 시각화할 수 있는 수준까지 레이저 출력을 높입니다. 이미지 시퀀스를 획득하고 보정을 위해 원시 이미지 시퀀스를 tiff 파일로 저장합니다.이미징 챔버에서 각 보정 샘플을 조립하고 현미경에 놓습니다. 잘 분리된 회절이 포함된 샘플을 선택하십시오. 한 번에 표백하는 한정 스팟.잔디 이미지 염기서열은 표지된 세포에 대해 입증된 것과 동일한 방식으로 이후에 획득됩니다. 이미지 시퀀스를 준비하려면 Image J와 같은 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 자릅니다. 개별 프레임을 새 폴더에 별도의 TIFF 이미지로 저장하여 각 이미지의 프레임 번호를 표시합니다.입자 검출 및 추적은 MATLAB 환경에서 U Track과 같은 비상용 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. MATLAB 명령 프롬프트에서 movie selector, GUI. 영화 선택 인터페이스를 열려면 지침에 따라 이전에 저장한 별도의 이미지부터 새 영화 데이터베이스를 만듭니다.픽셀 크기(나노미터), 시간 간격(초), 개구수, 카메라, 비트, 깊이 및 입자 검출 및 추적에 필요한 형광단의 방출 파장을 제공합니다. 영화 선택 인터페이스에서 영화 데이터베이스를 저장합니다. 단일 입자를 객체 유형으로 선택하여 해석을 실행합니다.감지 알고리즘을 실행한 다음 추적 알고리즘을 실행합니다. URAC 패키지에 포함된 동영상 뷰어 루틴을 사용하여 트랙을 시각화하고 감지 및 추적의 품질을 확인합니다. 점 MAT 파일을 열어 각 프레임에서 추적된 입자의 위치와 진폭을 확인합니다.입자의 크기는 수집된 데이터에서도 계산할 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 snap 태그가 지정된 beta two 아드레날린 수용체로 형질 주입되고 fluoro 4 conjugated benzyl guine derivative로 표지된 세포의 전형적인 잔디 이미지 시퀀스의 첫 번째 프레임입니다. 반점은 단일 수용체 또는 수용체 복합체를 나타냅니다.검출 알고리즘이 동일한 이미지 시퀀스에 적용되고 감지된 각 입자는 추적 알고리즘의 파란색 원 적용으로 표시됩니다. 동일한 이미지 시퀀스에 대해 파란색으로 표시된 개별 입자의 궤적이 나타납니다. 녹색 세그먼트는 병합 이벤트를 나타내고 빨간색 세그먼트는 분할 이벤트를 나타냅니다.이 방법은 동적 이벤트도 캡처합니다. 이 예에서는 두 입자가 과도 상호 작용을 거쳐 여러 프레임 동안 함께 이동한 후 다시 분할됩니다. 개별 입자의 궤적은 확산 계수를 계산하는 데 사용됩니다.이 대표적인 결과는 베타 2 아드레날린성 수용체가 높은 이동성을 가지고 있음을 보여줍니다. gaba B 수용체는 이동성이 제한되어 있지만, 수용체 복합체의 크기는 입자 강도의 분포를 혼합 가우스 모델로 피팅하여 정확하게 추정할 수 있습니다. 이 분석은 또한 단량체와 이량체의 공존을 밝힐 수 있습니다.여기에 표시된 것은 한 단계로 표백하는 단량체 수용체 입자와 두 단계로 표백하는 지름 수용체 입자의 예입니다. 이러한 절차는 다른 세포 표면 단백질, 레벨링 방법 및 세포 모델과 함께 작동하도록 확장 및 조정할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 깨끗한 덮개 수면을 생성하는 방법, 밝은 유기 불소로 낮은 발현 수준과 효율적인 표지를 얻는 방법, 성공적인 단일 분자.T를 위한 모든 핵심 단계를 나타내는 잔디 이미지를 획득하고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

다중 표적 추적은 살아있는 세포의 플라즈마 멤브레인 내에 개별적으로 분류된 분자를 추적용으로 개발된 수제 알고리즘입니다. 효율적으로 검출 nanoscale 멤브레인 역학을 조사하기 위해 사용자 친화적인, 포괄적인 도구를 제공하는 고밀도에서 시간에 따른 분자를 추정하고 추적.

다중 타겟 추적 (MTT)에 의해 플라즈마 막의 분자 확산을 매핑

태그를 추가하여 superecliptic pHluorin와 막 수용체의 세포 외 도메인, 및 이미징에 의해 배양 된 마우스 뉴런에서 이러한 퓨전 수용체, 우리는 직접 플라즈마 막에 수용체의 개별 기공을 갖는 삽입 이벤트를 시각화 할 수 있습니다. 이 기술은 플라즈마 막에 수용체 삽입에 관한 분자 메커니즘을 elucidating에 도움 될 것입니다.

이미징은 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 수용체 삽입을 pHluorin 태그

원형질막 단백질과 지질의 공간 분포와 시간 역학은 생물학에서 뜨거운 주제입니다. 여기서 이 문제는 개념적으로 동일한 단일 입자 추적의 물리량을 제공하지만 작은 분자 레이블과 표준 현미경 설정을 사용하는 시공간 이미지 변동 분석을 통해 해결됩니다.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

우리는 단일 T 림프구에서 힘 조절 단일 수용체-리간드 결합 역학과 칼슘 신호의 실시간 이미징을 동시에 측정하는 기술을 설명합니다.

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

pH가 민감한 형광으로 막 단백질의 세포 외 도메인에 레이블, superecliptic pHluorin (-9 월), 세포 내 현지화, 표현, 인신 매매를 결정할 수 있습니다. 촬상 전반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 단백질을 -9 월 표지 주연 ER 및 세포막에서 단백질 농도의 정량 분석을 가능하게한다.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

여기에 우리가 현재 기존의 피 형광 이미징, 단일 분자 검출 기반 슈퍼 해상도 이미징, 및 다중 색상 단일 분자 검출 병합, 통합된 현미경 시스템 구축의 실용적인 가이드 포함 단일 분자 형광 공명 에너지 비용 효율적인 방법으로 하나의 설정으로 이미지를 전송 합니다.

실시 한 형광 현미경으로 여러 영상 모드

여기, 우리는 확산 계수, 형광 현미경 검사 법에 의해 감지 하는 단일 입자의 모션 및 클러스터 크기의 종류의 정량적 인 평가 허용 하는 이미지 분석을 추적 하는 단일 입자에 대 한 프로토콜을 제시.

확산의 분석 및 형광 현미경 검사 법에 의해 수용 체 막의 클러스터 크기에 대 한 프로토콜을 처리 하는 이미지

3D 단일 분자 국소화 현미경 검사법은 살아있는 세균 세포에서 형광표지된 단백질의 공간 위치 및 운동 궤적을 조사하는 데 사용됩니다. 본원에 기재된 실험 및 데이터 분석 프로토콜은 풀화된 단일 분자 궤적에 기초하여 세포성 단백질의 널리 퍼진 확산 거동을 결정한다.

단일 분자 추적 현미경 검사법 - 세포화 분자의 확산 상태를 결정하는 도구

이 문서는 와이드필드 형광 현미경 검사를 사용하여 모바일, 단일 분자 Förster 공명 에너지 전송 (smFRET) 기반 프로브의 현면 분석을위한 방법을 제시한다. 새로 개발된 소프트웨어 툴킷을 사용하면 정확한 FRET 효율과 분자 위치를 포함한 움직이는 프로브의 smFRET 시간 추적을 시간의 함수로 판단할 수 있습니다.

모바일 단일 분자 FRET 프로브의 자동화된 2차원 스파티오 측량 분석

이 연구는 비천연 아미노산(UAA) 통합을 통한 부위 특이적 표지를 사용하여 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에 대한 단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET) 실험을 수행하는 자세한 절차를 제시합니다. 이 프로토콜은 smFRET 샘플 준비, 실험 및 데이터 분석을 위한 단계별 가이드를 제공합니다.

단일 분자 FRET를 사용한 막 수용체의 구조적 역학 시각화

이 글은 고체 지지 지질 이중층에서 단일 단백질 추적용 샘플을 만드는 방법에 대해 상세히 설명합니다. 또한 단일 분자 감도와 빠른 프레임 속도를 가진 단순한 형광 현미경을 설명해 줍니다. 마지막으로, 단일 단백질 궤적을 추출하는 절차를 개괄합니다.

형광현미경을 이용한 지질 이중층 내 단일 단백질 추적

학습하세요 단일 분자 형광 현미경을 활용한 수용체 역학 분석 방법을. 살아있는 세포 표면에서 개별 수용체의 이동성과 복합체 크기를 정밀하게 측정하여 세포 신호 전달 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

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