수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용
October 1st, 2014
이 비디오 프로토콜에서는 변형된 이광자 현미경에서 궤도 추적 방법을 사용하여 살아있는 세포 내에서 형광 표지된 리소좀을 고속으로 3차원으로 추적합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포 내에서 3D로 이동하는 리소좀과 같이 빠르게 움직이는 소기관을 추적하는 방법을 설명하는 것입니다. 이는 먼저 배양된 살아있는 세포 내부의 특정 상업용 염료를 사용하여 리소좀과 미세소관을 염색함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 레이저 스캐닝 현미경을 사용하고 궤도 추적 방법을 사용하여 궤도 크기의 리소좀 이동을 고속으로 추적한 다음 시스템의 주파수 응답과 같은 기타 매개변수를 선택하여 추적 실험을 수행하는 것입니다.
궁극적으로, 결과는 빠르게 움직이는 리소좀을 3차원으로 추적하고 추적 중에 레이저 궤도를 따라 발견되는 다른 형광 염색 소기관과의 상호 작용을 감지할 수 있음을 보여줍니다. 예를 들어 난시와 같은 기초가 되는 다른 기존 방법에 비해 3D 추적 방법의 주요 장점은 3D withal 추적 방법을 통해 매우 넓은 범위의 치매를 추적할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 소포가 마이크로 튜브를 따라 어떻게 이동하는지와 같은 소포 수송 분야에서 핵심 질문을 하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 방법은 엔도솜 역학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 go 나노 입자, 막 수용체, 응집체 핵 포트 복합체 또는 유전적 유전자좌와 같은 분리 입자를 형광 라벨링할 수 있는 다른 시스템에서 사용할 수 있습니다. 세포를 채취한 후 직경 14mm에 놓습니다.
표면 두께가 0.16mm인 마이크로 웰을 사용하여 약 60-70%의 Co 유창성 이미징을 위한 최적의 밀도를 제공하고, 다음날 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 세포를 배양하고, 5%CO2를 사용하고, 세포를 Hank의 완충 식염수 또는 H-B-S-S-H-B-S-S로 3회 세척하여 배양판에서 죽은 세포 또는 파편을 제거하고 염색 단계를 위해 세포를 준비합니다. 그런 다음 배양 후 섭씨 37도에서 1시간 동안 최종 농도 50 ano molar lyo tracker와 150 ano molar of tubulin tracker green을 포함하는 HBSS 용액에서 세포를 배양합니다. HBSS에서 세포를 세 번 세척하여 결합되지 않은 염료를 제거합니다.
세포를 이미징하기 전에 새로운 DMEM 성장 배지를 추가합니다. 비디오 프로토콜에 설명된 입자 추적을 위한 현미경은 상업적으로 이용 가능한 도립 현미경의 프레임에 조립됩니다. 코히어런트 카멜레온 울트라 투 티타늄 사파이어 펨토초 레이저 여기 광원은 690나노미터에서 1040나노미터 사이의 조정 가능한 출력 파장 범위와 함께 사용됩니다.
레이저 빔이 현미경의 후면 포트에 정렬되어 있는지 확인하십시오. 적외선 코팅 미러를 사용하여 방해석 편광판 앞에 배치된 회전하는 반파장판을 사용하여 레이저 빔을 감쇠하고 샘플의 평균 출력이 0.5에서 2밀리와트 사이가 되도록 빔을 감쇠합니다. 광 경로에 높은 개구수 water objective를 배치하여 샘플에서 형광을 수집합니다.
다음으로, 샘플을 전동 스테이지에 놓고 현미경 대물렌즈의 미세한 움직임을 조정합니다. 객관적인 pizo 컨트롤러 사용. 1개 또는 2개 채널 구성에서 원하는 방출 파장에 따라 형광 필터 큐브를 선택하십시오.
방출 대역 통과 필터를 사용합니다. 방출된 형광의 스펙트럼 범위를 추가로 선택하려면 필터 큐브의 빛을 광 증배관으로 보내 신호를 증폭 및 식별한 후 디지털 입력 출력 데이터 수집 카드로 전송하여 세포를 이미지화하고 스테이지에 배치한 다음 투과광 조명을 사용하여 초점을 맞춥니다. 래스터 스캔 이미징으로 전환하여 염료가 통합된 세포를 식별하고, 기본 미세소관을 시각화하여 소포 이동이 존재하는 초기 영역을 식별합니다.
고립된 소포가 확인되면 궤도 추적을 위한 매개변수를 설정합니다. 먼저, 궤도의 반지름을 선택하여 추적되는 입자의 크기에 따라 원형 스캔의 크기를 정의합니다. 점 이미터의 경우, 궤도의 반지름을 점 확산 함수의 웨이스트 또는 여기 빔의 PSF와 동일하게 설정합니다.
감도와 반응을 극대화합니다. 축 거리를 설정하여 축 방향을 따라 입자 위치를 지역화하기 위해 수행되는 두 궤도 사이의 거리를 정의합니다. 축 거리를 PSF 폐기물의 1.5배에서 3배로 설정합니다.
입자의 밝기에 따라 체류 시간을 정의하여 궤도의 각 지점에서 소요된 시간을 설정하면 광 표백 속도도 결정됩니다. 10에서 100마이크로초 사이의 체류 시간을 사용합니다. 각 궤도의 점 수를 64 또는 128로 설정하여 4에서 32밀리초 정도의 궤도 주기를 산출하고 입자 위치를 결정하기 위한 높은 시간 해상도를 제공합니다.
래스터 스캔 이미지에서 커서 선택을 통해 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 빔의 중심을 입자의 중앙에 배치하기 위해 미러로 전송되는 DC 오프셋 신호를 변경합니다. 현미경 모드를 래스터 이미징에서 궤도 스캔으로 전환하여 추적을 시작합니다. 궤적 분석을 위해 피드백 및 데이터 수집을 활성화합니다.
이 소프트웨어를 사용하여 궤도를 따라 각 지점과 각 시점에서 수집된 형광을 강도 카펫 형태로 표시합니다. 카펫을 따라 수집된 강도는 입자와 다른 밝은 물체의 상호 작용에 대한 정보를 제공합니다. 궤적 정보와 시간이 지남에 따라 Photo Multiplier Tube에서 수집된 형광 강도를 모두 시계열 형태로 표시합니다.
시계열 표현과 강도 카펫 정보를 사용하여 궤적에서 관심 영역만 선택합니다. 그런 다음 입자 궤적에서 선택한 부분의 2D 투영을 표시합니다. 적절한 컨트롤을 선택하여 입자 형광 강도에 따라 궤적의 색상을 지정합니다.
입자 궤적을 3D로 표시하고 형광 강도에 따라 색상 코드를 지정하는 옵션을 선택합니다. 컨트롤을 사용하여 궤적을 3D로 회전하여 미세소관을 따라 리소좀 운동의 특징을 시각화합니다. 리소좀(lysosomes)과 미세소관(microtubules)의 형광 녹색 염료 염색을 사용하여 2개의 광자 레이저 스캐닝 현미경으로 미세소관을 따라 소포의 고속 움직임을 이미지
화할 수 있습니다.그러나 래스터 스캔 이미징은 궤도 추적이 사용되는 경우 더 빠른 엔도솜의 움직임을 정확하게 추적하는 데 필요한 시간 해상도를 가지고 있지 않습니다. 대신, 데이터는 32밀리초의 시간 분해능으로 x, y, Z 변위 궤적을 얻을 수 있음을 보여줍니다. 이러한 변위 대 시간 궤적에서 카펫 분석은 각 궤도를 따라 기록된 강도를 표시합니다.
시간이 지남에 따라 강도 궤적은 입자의 형광 환경에 대한 정보를 제공합니다. 박스형 영역은 두 점프 사이의 궤적 부분에 해당합니다. 박스형 영역 외부의 밝은 점은 입자와 다른 밝은 물체의 상호 작용에 해당하며 궤도가 가장 밝은 형광원의 중심을 다시 잡을 때 궤적의 점프와 관련이 있습니다.
추적하는 동안 방출된 형광의 통합 강도를 기록할 수 있습니다. 재구성된 3D 궤적은 미세소관 네트워크에서 이동하는 소포에서 예상할 수 있는 방향성 운동을 표시합니다. 또한 3D 궤적을 RA와 연관시키거나 주변 영역의 이미지를 스캔할 수 있습니다.
이것은 미세소관 다발의 방향을 따라 입자의 움직임을 확인합니다. 일단 마스터하면 이 기술은 시도하는 동안 제대로 수행되면 몇 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차는 이 프로토콜에 설명된 대로 광자 인용을 사용하는 동안 샘플에 해롭지 않은 레이저 출력 수준을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요하며, 대물렌즈 후 약 2밀리볼트의 출력 수준을 유지해야 합니다.
이 비디오를 시청한 후에는 매우 큰 Z 범위의 물체를 추적할 수 있는 3D 궤도 추적 방법을 사용하여 실험을 설정하는 방법을 매우 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 비디오 프로토콜은 수정된 이중광자 현미경을 사용하여 살아있는 세포 내 3차원에서 빠르게 움직이는 리소좀의 추적을 시연합니다. 궤도 추적 방법을 통해 리소좀의 움직임과 다른 소기관과의 상호작용을 고속으로 관찰할 수 있습니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 세포 생물학
- 현미경 기술
- 소기관 동태학
배경
- 리소좀은 세포 내 이동에 관여하는 중요한 소기관입니다.
- 소기관 움직임 추적은 세포 과정을 이해하는 데 필수적입니다.
- 기존 방법은 추적 속도와 정확성에서 제한이 있을 수 있습니다.
- 궤도 추적 방법은 기존 기술에 비해 장점이 있습니다.
연구 목적
- 살아있는 세포에서 리소좀을 추적하는 방법을 설명합니다.
- 고속 3D 추적의 가능성을 시연합니다.
- 리소좀과 다른 소기관 간의 상호작용을 탐구합니다.
사용된 방법
- 특정 염색약을 사용하여 리소좀과 미세소관을 염색합니다.
- 관찰을 위해 레이저 스캐닝 현미경을 사용합니다.
- 고속 추적을 위해 궤도 추적 방법을 적용합니다.
- 궤도 크기 및 주파수 반응 등의 매개변수를 조정합니다.
주요 결과
- 세 차원에서 리소좀의 성공적인 추적.
- 다른 형광 염색 소기관과의 상호작용 탐지.
- 넓은 범위에서의 방법 효과성 시연.
- 미세소관을 따라 소포 이동에 대한 통찰.
결론
- 궤도 추적 방법은 소기관 동태학 연구를 위한 강력한 도구입니다.
- 이 접근 방식은 소포 이동 메커니즘에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.
- 미래 연구는 이러한 발견을 바탕으로 세포 과정을 탐구할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method enables high-resolution, real-time tracking of intracellular vesicles in live cells, providing critical insights into vesicular transport mechanisms relevant to drug delivery and target validation. The ability to monitor fast-moving organelles with nanometer spatial and millisecond temporal resolution supports mechanistic de-risking in early discovery by clarifying intracellular trafficking pathways. Such predictive confidence aids in prioritizing therapeutic candidates based on subcellular localization and transport dynamics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing lysosomal movement along microtubules, clarifying intracellular transport pathways.
- Operational Value: Provides quantitative 3D displacement data with 10 nm accuracy and 50 Hz frequency response, supporting functional target validation through direct observation of organelle dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible trajectories of vesicle motion, enabling reliable comparison across experimental conditions for assay readiness.
- Operational Value: Supports scalable implementation in live-cell imaging platforms, allowing high-throughput assessment of compound effects on intracellular trafficking.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links discovery-phase observations to preclinical relevance by tracking lysosomes in disease-relevant cellular models, supporting biomarker alignment.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by correlating vesicular transport phenotypes with functional outcomes in translational models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation by providing dynamic, quantitative readouts of intracellular trafficking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of lysosomal motility along cytoskeletal networks.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (x, y, z trajectories) with high temporal resolution, enabling reliable compound screening for modulators of vesicular transport.
- Analytics: Generates time-series and intensity carpet data that allow teams to track particle interactions and detect deviations in motion patterns indicative of biological responses.
- Translational Research: Connects vesicular dynamics to preclinical continuity by enabling tracking in live cells under physiological conditions, relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for studying organelle dynamics across multiple targets and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in intracellular trafficking pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through feedback-controlled beam tracking, minimizing user-dependent variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative insights into lysosomal transport, reducing late-stage failures due to poor subcellular delivery.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of candidates based on validated intracellular delivery and organelle co-localization profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in two-photon microscopy, fluorescence labeling, and live-cell imaging techniques.
- Depends on a modified laser scanning microscope with feedback control hardware and real-time data acquisition systems.
- Necessitates standardization of staining protocols, orbit parameters, and dwell times across laboratories for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for different cell types, fluorescent labels, and subcellular targets beyond lysosomes.
- Limited by phototoxicity risks at high laser powers, requiring careful power management to maintain sample viability during extended tracking.
