Name: 수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 배우세요 수정된 두 광자 현미경을 이용한 3D 궤도 추적 기법으로 살아있는 세포 내 리소좀과 같은 소포를 고속으로 추적하는 방법을. 이 기술은 세포 내 소포 운동 및 세포소기관 상호작용 연구에 활용됩니다.

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이 프로젝트는 NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 및 P50-GM076516 보조금의 지원을 받았습니다.

1 샘플 준비 <ol><li> 10 % 소 태아 혈청 및 페니실린 스트렙토 마이신 50 ㎍ / ml의 100 IU / ㎖로 보충 된 DMEM을 사용하여 조직 배양 플라스크에 CHOK1 세포를 유지한다. 37 ° C에서 5 % CO 2 가습 인큐베이터에있는 세포를 품어. </li><li> 수확 후 0.16 mm의면 두께 14mm 직경 마이크로 웰에 CHOK1 세포를 플레이트. 60~70% 자랄 때 주변의 이미징을위한 최적의 밀도에 대한 종자 세포. </li><li> 37 ° C에서 하룻밤 세포를 품어, 5 % CO 2. 녹색과 튜 불린 추적기 녹색의 150 nm의 Lysotracker DND26의 50 nm의를 포함하는 용액에 세포를 HBSS (행크 버퍼 식염수)의 셀을 세 번 세척하고, 부화. 37 ° C에서 1 시간 동안 세포를 품어. 선택 단계 : 부화하기 전에, 미토콘드리아 매트릭스 염색 염료 (25 nM의)와 추가로 얼룩을 수행합니다. </li><li> 어떤 언 바운드 염료를 제거 HBSS에있는 세포를 세 번 씻으십시오. IMAG 이전에 신선한 DMEM 성장 매체를 추가세포를 보내고. </li></ol> 2 현미경 구성 비디오 프로토콜에 기재된 입자 추적 현미경 시판 도립 현미경 (도 4)의 프레임에 조립된다. 3D 궤도 입자 추적을위한 그러나 상용 모듈을 사용할 수 있습니다. <ol><li> 690 nm의 1,040 nm의 사이에 조정 가능한 출력 파장 범위, 사 펨토초 레이저의 여기 광원 : 코 히어 런트 카멜레온 - 울트라 II 티를 사용합니다. </li><li> 레이저 빔이 IR 코팅 거울을 사용하여 현미경의 후면 포트에 정렬되어 있는지 확인합니다. 레이저 빔은 방해석 선형 편광자 다음 회전 반 파장 판을 이용하여 감쇠된다. 샘플에서의 평균 전력은 0.5과 2 mW의 사이가되도록, 빔을 감쇠. 주 : 레이저 빔이 시료면에 집속 빔의 위치 및 궤적의 제어를 허용 검류계 미러 구동 모터의 쌍에 의해 반사된다. 에서짧은 패스 다이크로 익 미러에 반사 한 후 현미경 대물의 후방에 들어가기 전에, 빔 익스팬더 통과 갈바 노 미러의 출사 평행 레이저 빔 확장 전형적인 구성 (10X). </li><li> 광로에 높은 개구 물 대물 (60X, NA 1.2)를 배치하여 샘플에서 형광 광을 수집한다. 하나 또는 두 개의 채널 구성에 원하는 발광 파장에 의한 형광 필터 큐브를 선택. 상기 방출 된 형광 스펙트럼의 범위를 선택하는 발광 대역 통과 필터를 사용한다. </li><li> 전동 무대에 샘플을 놓고 객관적 압전 컨트롤러를 사용하여 현미경 목표의 미세한 움직임을 조정합니다. </li><li> 신호 판별 및 디지털 I / O 데이터 수집 카드로 전송되는 광전자 증 배관 튜브에 필터 정육면체로부터의 광을 직접. NOTE : 컴퓨터 파형은 I / O 카드의 아날로그 출력 및 제공하기 아르 생성스캐너에 에드는 전자를 제어 할 수 있습니다. 광전자 증 배관 및 스캐너로 출력 신호에서 광자의 카운트 입력은 측정 된 형광 SimFCS 역학 소프트웨어를위한 실험실에 의해 I / O 카드를 통해 제어된다. </li></ol> 3 이미징 <ol><li> 무대에서 세포를 놓고 투과광 조명을 사용하여 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 염료를 혼입 한 세포를 식별하고 기본 미세 소관을 시각화하는 래스터 스캔 영상으로 전환. 소포 운동이 존재하는 초기 영역을 식별합니다. </li><li> 고립 된 소포가 확인되면, 궤도 추적에 대해 다음 매개 변수를 설정합니다 : <ol><li> 입자의 크기에 따른 추적되는 원형 주사의 크기를 정의하기 위해 궤도 반경을 선택한다. 포인트 이미 터, 감도 및 응답을 최적화 여기 빔의 점 확산 함수 (PSF)의 허리 동일한 궤도의 반경을 설정한다. </li><li> 축 설정축 방향을 따라 파티클 위치 국산화 수행이 궤도 사이의 거리를 정의하는 거리. 1.5-3 배 PSF 허리에 축 방향의 거리를 설정합니다. </li><li> 또한 광 표백 속도를 결정할 것이다 궤도의 각 시점에 소비되는 시간을 설정하는 입자의 밝기에 따라 체류 시간을 정의한다. 10 ~ 100 마이크로 초 사이의 체류 시간을 사용합니다. </li><li> 4-32 밀리의 순서 궤도주기를 산출하고, 입자의 위치를​​ 결정하기위한 높은 시간 해상도를 제공하기 위해 64 또는 128로 각각의 궤도에있는 포인트의 수를 설정한다. </li></ol></li><li> DC보기 래스터 스캔 이미지에서 커서 선택을 통해 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 입자에 빔 중앙 위해 거울에 전달 상쇄 신호를 변경한다. </li><li> 궤도 검사에 래스터 이미지에서 현미경 모드를 전환하여 추적을 시작합니다. </li><li> 피드백 및 데이터 수집을 활성화합니다. </li></ol> 4 Traject모리 분석 <ol><li> 궤도와 함께 &#39;강도 카펫&#39;의 형태로 각 시점의 각 시점에서 수집 된 형광을 표시하도록 소프트웨어를 사용한다. 카펫을 따라 수집 된 강도는 다른 밝은 물체로 입자의 상호 작용에 대한 정보를 제공합니다. 물론 시계열의 형태로 시간에 걸쳐 광전자 증 배관으로부터 수집 형광 강도 (x, y 스캐너 및 Z의 -piezo의 시간 동안 DC 변위 즉) 궤적 정보를 모두 표시하도록 소프트웨어를 사용한다. </li><li> 궤도에 대한 관심 만 지역을 선택하는 시계열 표현하고 &#39;강도 카펫의 정보를 사용합니다. </li><li> 입자 궤적의 선택된 부분의 2D 투영을 표시 할 소프트웨어를 사용합니다. 입자의 형광 강도에 따라 색상 코드로 궤도를 적절한 컨트롤을 선택합니다. </li><li> 페이지를 표시하는 옵션을 선택합니다형광 강도에 따라 3D로 문서 궤도, 색상 코드 그것. 미세 소관을 따라 리소좀 운동의 특징을 시각화하기 위해 컨트롤을 사용하여 3D의 궤도를 돌립니다. </li></ol>

<ol><li>So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+photon+excitation+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Two photon excitation fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).</li>
<li>Dupont, A., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+three+dimensional+single+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale three dimensional single particle tracking.</a> Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).</li>
<li>Estrada, L. C., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+nanometer+images+of+biological+fibers+by+directed+motion+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles.</a> Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).</li>
<li>Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurement+by+circular+scanning+of+the+excitation+beam+in+the+two+photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope.</a> Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).</li>
<li>Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3+D+particle+tracking+in+a+two+photon+microscope+application+to+the+study+of+molecular+dynamics+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells.</a> Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).</li>
<li>Lund, F. W., Wustner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+single+particle+tracking+and+temporal+image+correlation+spectroscopy+for+quantitative+analysis+of+endosome+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility.</a> Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).</li>
<li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+Neurodegenerative+Pathology+via+Neuron+to+Neuron+Transmission+of+beta+Amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).</li>
<li>Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+live+cell+and+superresolution+microscopy+reveals+cargo+transport+dynamics+at+microtubule+intersections%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).</li>
<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).</li>
<li>Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+particle+tracking+on+the+two+photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Multiphoton+Microscopy+in+the+Biomedical+Sciences%22%5BJournal%5D)">3D particle tracking on the two photon microscope.</a> Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).</li>
<li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two+photon+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li>
<li>Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+motors+at+the+intersection+of+trafficking+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport.</a> Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).</li>
<li>Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+directed+molecular+motion+in+the+nuclear+pore+complex+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).</li>
</ol>

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높은 시간 분해능으로 3 차원 형광 입자의 궤적을 달성 지난 년 동안 형광 현미경 기술과 계장의 엄청난 진행됨에도​​ 불구 분야에서 도전을 유지하고있다. 높은 시간 해상도가 이차원 추적 입자를 달성 한 경우, 축 방향에 확장은 전형적으로 시스템 (10)의 주파수 응답에서의 급격한 감소를 가져온다. 이 동영상 프로토콜에서는 이광자 현미경을 사용하여 높은 시간 해상도 (이 실험에서는 32 밀리 초)으로 살아있는 세포 내에 입체적 개별 입자의 추적의 실증 애플리케이션에 초점을 맞추었다. 이러한 실험을 수행하기 위해 필요한 설정은 레이저 주사 현미경 검사를 수행하는 실험실 전형적 가능하다. 3D 궤도 추적을위한 두 악기 추가 기능뿐만 아니라 제어 소프트웨어 Commercia에 대 한 시장에서 사용할 수있는이러한 올림푸스 사제 것과 리터 레이저 주사 현미경. 그것이 발광 형광 디 주사를 필요로하지 않기 때문에, 실험 장치의 설계에 유리하다 가능한 펄스 고전력 적외선...

방법 중 다수의 현미경을 사용 입체적으로 형광 발색 입자를 추적하는 날짜로 개발되어왔다. 대부분의 접근은 일반적으로 이상적인 축 방향으로 트래킹을 달성하기 위해 현미경 출사 광학계의 정의 수정과 조합이 차원에서 추적하기 적합한 고속 카메라의 사용에 의존한다. 이 프로세스가 적절한 시간 해상도 (10Hz의)는 일반적으로 시간 소모적이며, 얻을 수 있지만, 종래의 입자가있다 추적되는 경우에만, Z-스택의 시계열을 수행하여 형광체 입자를 추적 할 수있다 (촛점 또는 두 개의 광자 중) 레이저 주사 현미경 액티브 피드백 메커니즘 (2)에 의해 작은 래스터 촬상 영역의 중심에 있었다. 록킹에서 입자로의 개념은 궤도 추적 방법의 기초이다. 대신 래스터의 원형 궤도가 형광 입자의 주위에 수행되는 검사합니다. 따라서 형광의 강도궤도 정확하게 입자의 총수 4 편재. 입자의 국부적 위치는 현미경 스캐너 재 중심 위치에 입자 궤도를 작동하는 데 사용될 수있다. 현미경의 갈바 노 스캐너는 아날로그 전압에 의해 구동된다. 이 전압의 AC 성분은 사인 및 원 궤도를 수행 할 수 있도록 X 및 Y 스캐닝 미러에 적용 코사인 파 즉, 집속 레이저 빔의 궤도를 수행 할 수 있습니다. 신호의 DC 오프셋은 궤도의 중심 위치를 변경하는 것을 용이. 궤도주기가 결정되며, AC 신호 파형이 구성되면, 피드백 시스템은 신호의 단지 DC 성분을 업데이트 할 필요가있다. 검출기로부터 수집 된 형광 신호를 판독 할 수 소프트웨어는 DC 전원을, 스캐너 및 검출기를 제어하기 위해 입자의 위치를​​ 계산하고 갱신 할 필요설정합니다. 궤도 파라미터 (크기 및 타이밍)의 신중한 선택을 묘화 성공적인 피드백에 필요한 이들 파라미터는 추적 할 필요가 형광 물질의 특성에 기초하여 조절 될 필요가있다. 기술의 물리적 및 수학적 기초는 2D 및 3D 애플리케이션 모두에 대해 과거 4,5에 기재 하였다. 이 프로토콜에서는 간단히 셋업의 주요 하드웨어 구성 요소를 설명하고, 더욱 구체적으로 파라미터의 선택과 시료 전처리는 살아있는 세포 내의 높은 시간적 해상도 리소좀의 변위 다음 우릴 있도록 일반적인 실험에 필요한.

<table><tbody><tr><td>Lysotracker DND 26</td><td>Life Technologies</td><td>L-7526</td><td></td></tr><tr><td>Tubuline 추적기 Green</td><td>Life Technologies</td><td>T34075</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker RED</td><td>Life Technologies</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Coherent Chamelon- ultra II TI</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glan Taylor 방해석 편광자</td><td>Melles Griot</td><td>03PTA001</td><td></td></tr><tr><td>갈바노미터-모터 미러</td><td>Cambridge Technologies</td><td>M 6350</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic 미러</td><td>Chroma Technologies</td><td>700 DCSPXR</td><td></td></tr><tr><td>모터화된 스테이지</td><td>ASI</td><td>MS2000</td><td></td></tr><tr><td>Piezo&nbsp;</td><td>PI</td><td>P721-LLQ</td><td></td></tr><tr><td>광전자 증배관</td><td>Hamamatsu</td><td>H7422P-40</td><td></td></tr><tr><td>데이터 수집 카드</td><td>IO 기술</td><td>PCI 1128-4000</td><td></td></tr><tr><td>이미지용 이미징 소프트웨어</td><td>LFD</td><td>글로벌 -SimFCS</td><td></td></tr></tbody></table>

수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3d 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

이 동영상 프로토콜의 목적은 변형 된 이광자 현미경을 사용하여 1 입체 형광 입자 궤도 추적 실험을 수행하고 분석하는 방법을 설명하는 것이다. 종래의 접근 방식 (래스터 스캔 또는 프레임들의 스택에 기초하여 넓은 시야)에 대향 된 바와 같이, 3D 궤도 추적 지역화 및 높은 공간 (10 nm의 정확도) 및 시간 해상도 (50 Hz에서의 주파수 응답)의 3 차원 변위에 따라 허용 마이크론이 수백의 길이 비늘에 이동 형광 입자. 이 방법은 추적 된 대상물 주위에 원형 궤도를 수행하기 위해 두 개의 광자 레이저 스캐닝 현미경의 하드웨어를 제어하는​​ 피드백 알고리즘을 기반으로한다 : 피드백기구의 변위를 제어하여 중심에 형광 물체를 유지 주사 빔 3-5. 이 기술의 장점을 설명하기 위해, 우리는 알 내에서 빠르게 움직이는 세포 기관, 리소좀을 따라iving 셀 6,7. 세포는 표준 프로토콜에 따른 도금 및 상업적 리소좀 염료를 사용하여 염색 하였다. 우리는 살아있는 세포의 내부 3D 궤도 추적 실험을 수행하기 위해, 간단히 하드웨어 구성과보다 상세히 제어 소프트웨어를 논의한다. 우리는 상세히 주사 현미경을 제어하고 입자 주위 닫힌 궤도 빔의 움직임을 사용하기 위해 필요한 파라미터들을 논의한다. 우리는이 방법이 효과적으로 생균 내에 3 차원 미세 소관을 따라 표시된 리소좀의 빠른 움직임을 추적 할 수있는 방법을 보여줌으로써 결론. 리소좀은 일반적으로 미세 소관 네트워크 8 따라 모션을 지시 표시, 0.4-0.5 μM / 초 범위의 속도로 이동할 수있다.

이 프로토콜에 따라 고속 3D 단일 입자 추적은 형광 표지 리소좀의 변위를 추적하는 개질 이광자 현미경을 이용하여 살아있는 세포 내부에서 수행 될 수있다. 실험 수행 엔도 좀의 성숙 과정 9 후 셀 내부 이동 절연 리소좀 추적 이루어져있다. 리소좀은 녹색 형광 염료를 사용하여 염색하고 2 광자 여기 악용 930 nm에서 여기시켰다. 우리의 데이타는 32 밀리 초 (도 1A)의 시간 해상도와 X, Y, Z 변위 궤도를 얻을 수 있음을 보여준다. 카펫 분석 시간 (그림 1b)를 통해 각각의 궤도를 따라 기록 강도를 표시합니다. 방출 된 형광의 통합 강도가 기록 될 수있는 추적 (도 2a) 중. 미세 소관 네트워크에서 이동 소포로부터 예상 될 수있는, 재구성 된 3 차원 궤적은, 동작 지시를 표시한다.dditionally, 상기 주변 영역 (도 2b)의 래스터 스캔 이미지에 3...

이 비디오 프로토콜에서는 변형된 이광자 현미경에서 궤도 추적 방법을 사용하여 살아있는 세포 내에서 형광 표지된 리소좀을 고속으로 3차원으로 추적합니다.

수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포 내에서 3D로 이동하는 리소좀과 같이 빠르게 움직이는 소기관을 추적하는 방법을 설명하는 것입니다. 이는 먼저 배양된 살아있는 세포 내부의 특정 상업용 염료를 사용하여 리소좀과 미세소관을 염색함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 레이저 스캐닝 현미경을 사용하고 궤도 추적 방법을 사용하여 궤도 크기의 리소좀 이동을 고속으로 추적한 다음 시스템의 주파수 응답과 같은 기타 매개변수를 선택하여 추적 실험을 수행하는 것입니다.궁극적으로, 결과는 빠르게 움직이는 리소좀을 3차원으로 추적하고 추적 중에 레이저 궤도를 따라 발견되는 다른 형광 염색 소기관과의 상호 작용을 감지할 수 있음을 보여줍니다. 예를 들어 난시와 같은 기초가 되는 다른 기존 방법에 비해 3D 추적 방법의 주요 장점은 3D withal 추적 방법을 통해 매우 넓은 범위의 치매를 추적할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 소포가 마이크로 튜브를 따라 어떻게 이동하는지와 같은 소포 수송 분야에서 핵심 질문을 하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 방법은 엔도솜 역학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 go 나노 입자, 막 수용체, 응집체 핵 포트 복합체 또는 유전적 유전자좌와 같은 분리 입자를 형광 라벨링할 수 있는 다른 시스템에서 사용할 수 있습니다. 세포를 채취한 후 직경 14mm에 놓습니다.표면 두께가 0.16mm인 마이크로 웰을 사용하여 약 60-70%의 Co 유창성 이미징을 위한 최적의 밀도를 제공하고, 다음날 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 세포를 배양하고, 5%CO2를 사용하고, 세포를 Hank의 완충 식염수 또는 H-B-S-S-H-B-S-S로 3회 세척하여 배양판에서 죽은 세포 또는 파편을 제거하고 염색 단계를 위해 세포를 준비합니다. 그런 다음 배양 후 섭씨 37도에서 1시간 동안 최종 농도 50 ano molar lyo tracker와 150 ano molar of tubulin tracker green을 포함하는 HBSS 용액에서 세포를 배양합니다. HBSS에서 세포를 세 번 세척하여 결합되지 않은 염료를 제거합니다.세포를 이미징하기 전에 새로운 DMEM 성장 배지를 추가합니다. 비디오 프로토콜에 설명된 입자 추적을 위한 현미경은 상업적으로 이용 가능한 도립 현미경의 프레임에 조립됩니다. 코히어런트 카멜레온 울트라 투 티타늄 사파이어 펨토초 레이저 여기 광원은 690나노미터에서 1040나노미터 사이의 조정 가능한 출력 파장 범위와 함께 사용됩니다.레이저 빔이 현미경의 후면 포트에 정렬되어 있는지 확인하십시오. 적외선 코팅 미러를 사용하여 방해석 편광판 앞에 배치된 회전하는 반파장판을 사용하여 레이저 빔을 감쇠하고 샘플의 평균 출력이 0.5에서 2밀리와트 사이가 되도록 빔을 감쇠합니다. 광 경로에 높은 개구수 water objective를 배치하여 샘플에서 형광을 수집합니다.다음으로, 샘플을 전동 스테이지에 놓고 현미경 대물렌즈의 미세한 움직임을 조정합니다. 객관적인 pizo 컨트롤러 사용. 1개 또는 2개 채널 구성에서 원하는 방출 파장에 따라 형광 필터 큐브를 선택하십시오.방출 대역 통과 필터를 사용합니다. 방출된 형광의 스펙트럼 범위를 추가로 선택하려면 필터 큐브의 빛을 광 증배관으로 보내 신호를 증폭 및 식별한 후 디지털 입력 출력 데이터 수집 카드로 전송하여 세포를 이미지화하고 스테이지에 배치한 다음 투과광 조명을 사용하여 초점을 맞춥니다. 래스터 스캔 이미징으로 전환하여 염료가 통합된 세포를 식별하고, 기본 미세소관을 시각화하여 소포 이동이 존재하는 초기 영역을 식별합니다.고립된 소포가 확인되면 궤도 추적을 위한 매개변수를 설정합니다. 먼저, 궤도의 반지름을 선택하여 추적되는 입자의 크기에 따라 원형 스캔의 크기를 정의합니다. 점 이미터의 경우, 궤도의 반지름을 점 확산 함수의 웨이스트 또는 여기 빔의 PSF와 동일하게 설정합니다.감도와 반응을 극대화합니다. 축 거리를 설정하여 축 방향을 따라 입자 위치를 지역화하기 위해 수행되는 두 궤도 사이의 거리를 정의합니다. 축 거리를 PSF 폐기물의 1.5배에서 3배로 설정합니다.입자의 밝기에 따라 체류 시간을 정의하여 궤도의 각 지점에서 소요된 시간을 설정하면 광 표백 속도도 결정됩니다. 10에서 100마이크로초 사이의 체류 시간을 사용합니다. 각 궤도의 점 수를 64 또는 128로 설정하여 4에서 32밀리초 정도의 궤도 주기를 산출하고 입자 위치를 결정하기 위한 높은 시간 해상도를 제공합니다.래스터 스캔 이미지에서 커서 선택을 통해 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 빔의 중심을 입자의 중앙에 배치하기 위해 미러로 전송되는 DC 오프셋 신호를 변경합니다. 현미경 모드를 래스터 이미징에서 궤도 스캔으로 전환하여 추적을 시작합니다. 궤적 분석을 위해 피드백 및 데이터 수집을 활성화합니다.이 소프트웨어를 사용하여 궤도를 따라 각 지점과 각 시점에서 수집된 형광을 강도 카펫 형태로 표시합니다. 카펫을 따라 수집된 강도는 입자와 다른 밝은 물체의 상호 작용에 대한 정보를 제공합니다. 궤적 정보와 시간이 지남에 따라 Photo Multiplier Tube에서 수집된 형광 강도를 모두 시계열 형태로 표시합니다.시계열 표현과 강도 카펫 정보를 사용하여 궤적에서 관심 영역만 선택합니다. 그런 다음 입자 궤적에서 선택한 부분의 2D 투영을 표시합니다. 적절한 컨트롤을 선택하여 입자 형광 강도에 따라 궤적의 색상을 지정합니다.입자 궤적을 3D로 표시하고 형광 강도에 따라 색상 코드를 지정하는 옵션을 선택합니다. 컨트롤을 사용하여 궤적을 3D로 회전하여 미세소관을 따라 리소좀 운동의 특징을 시각화합니다. 리소좀(lysosomes)과 미세소관(microtubules)의 형광 녹색 염료 염색을 사용하여 2개의 광자 레이저 스캐닝 현미경으로 미세소관을 따라 소포의 고속 움직임을 이미지화할 수 있습니다.그러나 래스터 스캔 이미징은 궤도 추적이 사용되는 경우 더 빠른 엔도솜의 움직임을 정확하게 추적하는 데 필요한 시간 해상도를 가지고 있지 않습니다. 대신, 데이터는 32밀리초의 시간 분해능으로 x, y, Z 변위 궤적을 얻을 수 있음을 보여줍니다. 이러한 변위 대 시간 궤적에서 카펫 분석은 각 궤도를 따라 기록된 강도를 표시합니다.시간이 지남에 따라 강도 궤적은 입자의 형광 환경에 대한 정보를 제공합니다. 박스형 영역은 두 점프 사이의 궤적 부분에 해당합니다. 박스형 영역 외부의 밝은 점은 입자와 다른 밝은 물체의 상호 작용에 해당하며 궤도가 가장 밝은 형광원의 중심을 다시 잡을 때 궤적의 점프와 관련이 있습니다.추적하는 동안 방출된 형광의 통합 강도를 기록할 수 있습니다. 재구성된 3D 궤적은 미세소관 네트워크에서 이동하는 소포에서 예상할 수 있는 방향성 운동을 표시합니다. 또한 3D 궤적을 RA와 연관시키거나 주변 영역의 이미지를 스캔할 수 있습니다.이것은 미세소관 다발의 방향을 따라 입자의 움직임을 확인합니다. 일단 마스터하면 이 기술은 시도하는 동안 제대로 수행되면 몇 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차는 이 프로토콜에 설명된 대로 광자 인용을 사용하는 동안 샘플에 해롭지 않은 레이저 출력 수준을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요하며, 대물렌즈 후 약 2밀리볼트의 출력 수준을 유지해야 합니다.이 비디오를 시청한 후에는 매우 큰 Z 범위의 물체를 추적할 수 있는 3D 궤도 추적 방법을 사용하여 실험을 설정하는 방법을 매우 잘 이해하게 될 것입니다.

3d-orbital-tracking-modified-two-photon-microscope-an-application-to

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 동영상은 신경 소포의 움직임을 시각화하기 위해 특정 형광 단백질로 표지하는 방법을 보여줍니다. 먼저, 형광 단백질에 대한 플라스미드 코딩을 형질주입(transfection)제와 함께 배양한 다음 뉴런 배양액에 도입합니다. 그 후, 뉴런의 이미지를 획득하고 분석하여 소포의 움직임을 추적합니다.

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging(형광 이미징을 사용한 뉴런의 소포 운동성 시각화)

사차원 (4D) 영상은 척추 신경 터미널을 살고있는 엔도 좀의 두 가지 유형 사이의 행동과 상호 작용을 연구하기 위해 사용된다. 이 작은 구조의 이동은 같은 엔도 좀의 융합과 세포 외 유출 등의 이벤트의 확인을 허용, 세 가지 차원을 특징으로한다.

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

막 인신 매매에 대한 조사는 신경 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 뉴런에서 소포 운동성을 정량화하는 방법을 소개합니다. 이것은 신경계에서 막 인신 매매의 정량화에 적용 할 수있는 편리한 방법입니다.

형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화

건설 및 운영의 실시간 3D 단일 입자 추적 현미경 추적 나노 형광의 높은 방산 속도 낮은 광자 수 요금에서 프로브이 프로토콜 세부 사항.

실시간 3D 단일 입자 추적에 대 한 프로토콜

여기에 우리가 설명 단일 분자 사진 활성화 지역화 현미경 라이브 초파리 melanogaster 의 모터 신경 맨끝에 실시 될 수 있습니다 하는 방법 3 유 충 탈피.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

이 프로토콜은 다중 색상 4D (타임 랩스 3D) 공초점 현미경을 사용하여 신진 효모에서 형광 표지 된 세포 내 구획의 분석을 설명합니다. 이미징 매개 변수는 광손상을 제한하면서 적절한 신호를 캡처하도록 선택됩니다. 사용자 정의 ImageJ 플러그인은 레이블이 지정된 구조를 추적하고 정량적으로 분석할 수 있도록 합니다.

효모의 4D 현미경 검사법

3D 단일 분자 국소화 현미경 검사법은 살아있는 세균 세포에서 형광표지된 단백질의 공간 위치 및 운동 궤적을 조사하는 데 사용됩니다. 본원에 기재된 실험 및 데이터 분석 프로토콜은 풀화된 단일 분자 궤적에 기초하여 세포성 단백질의 널리 퍼진 확산 거동을 결정한다.

단일 분자 추적 현미경 검사법 - 세포화 분자의 확산 상태를 결정하는 도구

이미징 유래 평균 제곱 변위 (iMSD) 분석은 구조 및 동적 특성 측면에서 고유 한 시간 진화 특성을 강조하기 위해 매크로 피노솜에 적용됩니다. 그런 다음 Macropinosomes는 시간 불변의 평균 구조 / 동적 특성을 가진 세포 하부 구조에 대한 참조로서 인슐린 분비 과립 (ISGs)과 비교됩니다.

시공간 변동 분광법에 의한 밀매된 세포하 나노구조체의 구조적 및 동적 특성 조사

초기 초파리 배아에서는 많은 소기관이 운동성입니다. 원칙적으로, 그들은 특정 형광 프로브를 통해 실시간으로 이미징 될 수 있지만, 달걀 껍질은 배아에 직접 적용하는 것을 방지합니다. 이 프로토콜은 미세주입을 통해 이러한 프로브  를 도입한 다음 입자 이미지 속도측정법을 통해 벌크 소기관 움직임을 분석하는 방법을 설명합니다.

초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화

이 글은 고체 지지 지질 이중층에서 단일 단백질 추적용 샘플을 만드는 방법에 대해 상세히 설명합니다. 또한 단일 분자 감도와 빠른 프레임 속도를 가진 단순한 형광 현미경을 설명해 줍니다. 마지막으로, 단일 단백질 궤적을 추출하는 절차를 개괄합니다.

형광현미경을 이용한 지질 이중층 내 단일 단백질 추적

배우세요 수정된 두 광자 현미경을 이용한 3D 궤도 추적 기법으로 살아있는 세포 내 리소좀과 같은 소포를 고속으로 추적하는 방법을. 이 기술은 세포 내 소포 운동 및 세포소기관 상호작용 연구에 활용됩니다.

수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용

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