네 개의 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 높은 친 화성 항체 - 항원 결합 속도론의 결정

이 바이오센서 연구의 목표는 일상적으로 사용되는 4가지 바이오센서 플랫폼의 능력을 비교하여 고품질 동역학 데이터를 제공하고 고친화성 항체-항원 상호 작용을 평가하기 위한 실험 설계에서 기술적 과제 및 고려 사항에 대한 통찰력을 제공하는 것입니다. 이 연구는 치료용 항체 후보를 평가할 때 가장 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있는 바이오센서 플랫폼 및 분석 형식을 선택하기 위한 약물 발견 분야의 주요 질문에 답합니다. 이 연구의 주요 장점은 데이터 일관성, 품질 및 운영 효율성과 관련하여 다양한 바이오센서 플랫폼에 대한 직접적이고 포괄적인 비교를 제공한다는 것입니다.

4가지 프로토콜에 대한 비디오 데모는 실습 경험이 거의 없는 새로운 사용자가 이러한 기기에 대한 실험을 설정하는 방법을 배우는 데 도움이 되기 때문에 매우 중요합니다. Biacore T100에서 kinetic 측정을 수행하려면 File(파일), Open New Method(새 Method를 열기)를 차례로 클릭하고 Method 파일을 엽니다. 메서드의 매개 변수를 검토합니다.

Cycle Types(주기 유형)에서 흐름 경로 2를 통한 캡처 1에 대해 접촉 시간을 220초, 흐름 경로 3에 대한 캡처 2에 대해 110초, 흐름 경로 4를 통한 캡처 3에 대해 55초로 설정합니다. 유속은 모든 포획 주기에 대해 분당 10마이크로리터입니다. Sample 1을 선택하고 Sample Solution을 변수로 확인합니다.

그런 다음 흐름 경로 1, 2, 3, 4에서 접촉 시간을 600초로 설정하고 해리 시간을 2, 700초로 설정합니다. 유속은 분당 30마이크로리터로 설정됩니다. 다음으로, 재생 1을 선택하고 용액 필드에 글리신 HCl pH 1.5를 입력한 다음 유로 1, 2, 3, 4에서 접촉 시간을 20초로 설정합니다.

변수 설정에서 사이클 1-3에 대해 100나노몰에서 6.25나노몰, 사이클 4-8에 대해 50나노몰에서 3.12나노몰, 사이클 9-10에 대해 5나노몰에서 0.323나노몰의 이중 적정 농도를 입력합니다. Setup Run(실행 설정)에서 감지 흐름 경로 2-1, 3-1, 4-1을 선택하고 Next(다음)를 클릭합니다. 실행하기 전에 프라임을 확인하고 다음을 다시 클릭합니다.

Sample and Reagent Rack 1을 선택하고 시약의 위치를 정의합니다. 그에 따라 시약을 개별 샘플 바이알에 피펫팅하고 랙을 기기에 삽입합니다. Eject Rack을 클릭하여 샘플 트레이 격실 도어를 연 다음 샘플 랙을 기기에 삽입합니다.

그런 다음, 시작을 클릭하고 실행을 시작하기 위해 저장할 실험 이름을 입력합니다. ProteOn XPR36의 kinetic 측정을 위해 Protocols를 선택한 다음 Samples를 선택하여 고정을 시작합니다. EDC/Sulfo-NHS를 웰 H1-H6의 활성화제로, 단백질 A/G를 G1-G6의 리간드로, 에탄올아민을 F1-F6의 비활성화제로, 글리신을 E1-E6의 재생제로, PBS-T-EDTA를 D1-D6의 블랭크로, 단클론 항체 X 시료를 C1-C6의 리간드로, 인간 PCSK9를 웰 B1-B6의 분석물로 정의합니다.

Steps(단계)를 선택한 다음 프로토콜 편집기에서 Immobilization(고정)을 두 번 클릭합니다. 이 단계에는 EDC/Sulfo-NHS, 단백질 A/G 및 1개의 몰 에탄올아민의 후속 수평 주입이 포함됩니다. 각 주입은 분당 30마이크로리터의 유속과 300초의 접촉 시간을 가져야 합니다.

그런 다음 재생성(Regenerate)을 클릭합니다. 분당 100마이크로리터의 속도로 18초 펄스의 글리신을 수평 및 수직 방향으로 3회 주입합니다. 이어서 분당 25마이크로리터의 속도로 PBS-T-EDTA의 60초 펄스를 두 번 양방향으로 반복합니다.

그런 다음 리간드를 클릭하고 분당 25마이크로리터의 유속과 160초의 접촉 시간을 사용하여 수직 방향으로 단클론 항체 1, 단클론 항체 2를 주입합니다. Analyte를 클릭한 후 6개의 수평 채널에 걸쳐 5개 농도의 human PCSK9를 blank buffer에 동시에 주입합니다. 600초의 연관 시간 동안 분당 40마이크로리터를 사용한 다음 2, 700초의 해리 시간을 사용합니다.

그런 다음 Regenerate(재생)를 클릭하고 수평 및 수직 방향 모두에서 분당 100마이크로리터의 속도로 두 개의 18초 글리신 펄스를 주입합니다. 다음으로, 정의된 시약 위치에 따라 하나의 96웰 플레이트에서 샘플과 시약을 준비합니다. 플레이트를 기기로 옮긴 다음 Run(실행) 탭을 클릭하고 프로토콜을 선택한 다음 Start(시작)를 클릭합니다.

실시간 실험 데이터 기록에서 6개의 바늘 병렬 주입이 시연됩니다. Octet RED384의 역학 측정을 위해 먼저 실험을 클릭한 다음 데이터 수집 소프트웨어에서 새 실험 마법사, 새 역학 실험, 기본 역학을 차례로 클릭하여 실험 방법을 설정합니다. 그런 다음 Modify Plates(플레이트 수정)를 클릭하고 Plate 1과 Plate 2 모두에서 96 Wells를 384 Wells로 변경합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플레이트의 샘플 유형과 위치를 정의합니다. Assay definition(분석 정의)으로 이동하여 실험 설정을 정의합니다. 실험 설정은 기준선 시간 30초, 재생 시간 30초, 평형 시간 18초, 로딩 시간 200초, 연관 시간 500초, 해리 시간 1, 800초로 정의됩니다.

흔들기 속도는 1, 000RPM으로 설정됩니다. 분석 단계 목록에 단계를 추가하려면 먼저 단계를 클릭한 다음 샘플 또는 시약 플레이트에 있는 웰을 클릭합니다. 먼저, 평형 재생 지침을 입력하여 1XKB에서 15초 딥과 15초 딥을 번갈아 가며 글리신의 15초 딥을 3회 사이클하여 반human Fc 캡처 센서를 프리컨디셔닝합니다.

그런 다음 로딩 지침을 입력하여 200초 동안 항인간 Fc 포획 센서에 단클론 항체 샘플을 캡처합니다. 다음으로, 기준선 지침을 입력하여 association step 전에 60초 동안 bio-layer interferometry signal을 설정합니다. 연관 단계를 입력하여 500초 동안 다양한 농도의 인간 PCSK9가 포함된 웰에 센서를 담그십시오.

해리 단계로 들어가 PCSK9 바인딩 센서를 1, 800초 해리 기간 동안 1XKB의 새 웰에 담그십시오. 마지막으로, 재생 단계를 위해 단클론 항체 PCSK9 결합 센서를 각 결합 주기 사이에 두 개의 18초 펄스를 사용하여 글리신 웰에 담그십시오. Review Experiments(실험 검토)로 이동하여 단계를 진행한 다음 녹색 열기(open) 버튼을 클릭하여 샘플 격실을 엽니다.

샘플 플레이트를 기기로 옮깁니다. Run Experiments(실험 실행)로 이동하여 60초 지연 시간을 입력하고 대기하는 동안 샘플 플레이트를 흔듭니다. 플레이트 온도를 섭씨 25도로 설정하고 실험 실행 이름을 입력한 다음 데이터 수집이 여기에 표시되면 Go.Live 누릅니다.

IBIS-MX96의 다중 사이클 동역학 측정을 위해 센서 칩을 연속 흐름 마이크로 스포터에 설치하십시오. CFM2.0 소프트웨어를 연 다음 Load Settings(로드 설정) 및 96 Amine Couple(96 아민 커플)을 클릭합니다. 두 개의 샘플과 시약 플레이트를 CFM 프린터에 넣습니다.

항체 어레이를 생성하려면 Run을 눌러 프린터를 시작하고 48개의 마이크로 채널을 사용하여 시약 플레이트의 상단 절반에 있는 EDC/Sulfo-NHS를 센서에 전달하고 5분 동안 센서 표면에서 순환합니다. 소스 플레이트의 위쪽 절반에 있는 단클론 항체 샘플을 센서에 전달하고 10분 동안 활성화된 표면에서 순환합니다. 그런 다음 50ml 원뿔형 튜브의 고정 완충액을 항체 표면 위로 5분 동안 전달합니다.

인쇄된 센서 칩을 기기에 도킹합니다. 제어 소프트웨어에서 파일, 측정 열기, 기존 측정을 클릭하고 방법 파일을 선택합니다. 인쇄된 센서 칩을 기기로 옮깁니다.

일반 메뉴의 전체 시스템 스크립트에서 G-System Prime을 선택합니다. 그런 다음 G-Quench를 선택하여 150마이크로리터의 1몰 에탄올아민을 주입하여 단클론 항체 표면을 비활성화합니다. Analysis Cycle(분석 주기)에서 IBIS Scripts(IBIS 스크립트)에서 A-AP Standard Run(A-AP 표준 실행)을 선택합니다.

기준선에 1.0분, 연결에 10.0분, 해리에 90단계를 초당 8마이크로리터 속도로 설정합니다. 사이클 내에서 5번의 완충액 주입 후 인간 PCSK9를 한 번에 한 농도씩 주입합니다. 각 결합 주기 사이에 글리신으로 단클론 항체 표면을 재생합니다.

4개의 기기에서 인간 PCSK9와 상호 작용하는 항체에 대해 일대일 운동 모델 핏 오버레이에 기록된 결합 센서그램이 표시됩니다. 여러 밀도에서 항체의 결합 프로파일은 기기 전반에 걸쳐 유사합니다. 각 항체와 관련된 속도 상수는 기기에 따라 달랐지만 등급 순서는 대부분 동일하게 유지되었습니다.

여러 항체 표면에 대한 운동 속도의 친화도의 재현성 및 일관성을 조사했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 Biacore T100 및 ProteOn XPR36을 사용하여 생성된 모든 속도 상수에 대해 강한 선형성이 관찰되었습니다. 그러나 Octet RED384에 의해 생성된 속도 상수는 일부 오프 속도의 변동으로 인해 덜 선형적이었습니다.

이는 마이크로플레이트에서 시간이 지남에 따라 샘플이 증발하기 때문일 수 있습니다. IBIS-MX96에 의해 생성된 속도 상수는 표면 이질성의 변동으로 인해 선형성이 떨어졌습니다. 대부분의 시스템과 관련된 항체 결합 활성은 일관된 반면, IBIS-MX96의 아민 결합 방법에서는 약 10배 낮은 활성이 관찰되었습니다.

이는 항체 불활성화 또는 항원 결합에 전도성이 없는 항체 배향의 생성 때문일 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 4개의 바이오센서 플랫폼 각각에서 실험을 설정하는 방법과 자신의 연구 목적에 적합한 바이오센서 기술을 선택하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 우리의 일대일 비교 연구는 각 바이오센서 플랫폼마다 고유한 장점과 단점이 있음을 보여줍니다.

계측에 내재된 특정 시스템적 한계에도 불구하고 연관 및 해리율 상수의 직접 순서는 이러한 도구 간에 높은 상관관계가 있었습니다. 후보 물질 순위를 매기기 위해, 샘플의 수와 물질의 양이 제한 요인이 아니라고 가정할 때, 이러한 기기는 수입 기기에 관계없이 항체를 비교적으로 구별할 수 있기 때문에 이러한 기기 중 어느 것이라도 사용될 수 있습니다. 데이터 신뢰성과 시료 처리량 사이에는 절충

Biacore T100과 ProteOn XPR36R이 최고의 데이터 품질과 일관성을 보여주었습니다. 반면 Octet RED384 및 IBIS-MX96은 데이터 정확성과 일관성이 저하되어 높은 유연성과 처리량을 보여줍니다. 민감하고 신뢰할 수 있는 검출이 필요한 연구의 경우 Biacore T100 또는 ProteOn XPR36이 가장 적합합니다.

속도가 중요한 요소이고 많은 수의 샘플이 관련된 연구의 경우 Octet Red384 또는 IBIS-MX96이 선호됩니다. 연속 유동 유체 X가 있는 기기는 느린 해리 속도와의 상호 작용을 해결하기 위한 고품질 데이터를 제공합니다. BRI 유체 ex-a-fray 기기의 주요 제한 사항은 마이크로플레이트에서 시간이 지남에 따라 샘플이 증발하여 상향 드리프트가 발생하여 데이터 정확도가 저하될 수 있다는 것입니다.