Name: 네 개의 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 높은 친 화성 항체 - 항원 결합 속도론의 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: 배우세요 네 가지 바이오센서 플랫폼을 사용하여 항체-항원 결합 속도론을 측정하는 방법을. Biacore T100, ProteOn XPR36, Octet RED384, IBIS-MX96의 데이터 품질과 운영 효율성을 비교하여 신뢰할 수 있는 약물 후보 평가를 위한 최적의 플랫폼 선택을 돕습니다.

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저자는 IBIS MX96에 대한 기술 지원을 노아 디토 아담 마일 감사합니다.

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</ol>

이 비디오 기사에 대한 출판 비용은 베링거 인 겔 하임 제약 지불했다.

우리의 일대일 비교 연구는 각 바이오 센서 플랫폼은 자신의 강점과 약점을 가지고 있음을 보여준다. 항체의 결합 프로파일 (도 3 - 6) 시각 비교 유사하다하더라도, 취득 된 운동 속도 상수의 순위가 악기에 걸쳐 고도의 일치 (도 7), 우리의 결과와 악기 SPR 기반 보여 연속 흐름 유체는) 느린 해리 속도와 높은 친화력 상호 작용을 해결에서 더 낫다. 해리 단계에서 상향 드리프트는 데이터 세트에서 관찰된다 (예, 항체 2, 5 항체, 단클론 항체 및 9;도 5)의 유체 BLI없는 악기에 의해 발생. 이러한 결과는 시스템의 기본 제한되는 마이크로 플레이트, 경시 시료 증발에 상당 부분 기인 할 수있다. 이 고유 한 한계로, 실험 시간은 12 시간 이하로 제한되고; 실험 따라서 쉬로 프로그램 된배의 orter 다른 플랫폼들 (10 분 및 45 분 연관 해리)에 비해 (500 S 협회 30 분간 해리). BLI 기반기구에 의해 생성 된 속도 상수가 오프 비율의 일부 변동의 결과 (도 8의 (c)으로서 이하의 선형성을 표시하지만, 실험 시간을 단축하여 데이터 품질 / 일관성 증발의 영향을 완화하기 위해 나타나지 않았다 ). 시료 증발에 더하여, 사용되는 캡쳐 시약의 차이는 또한 얻어지는 결과의 차이에 기여 할 수있다. 단백질 A / G가 세 유체 기반 SPR 플랫폼에 사용되는 동안, AHC 센서는 비 유체의 BLI 플랫폼에서 사용되었다. 단백질 A / G가 AHC 항체 기반의 바이오 센서의 표면, 단백질 A / G 표면에서 항체 - 항원 복합체의 오프 속도 인위적보다 빨리 나타나는 않는보다 mAb에 대한 강한 친 화성을 가질 가능성이 있기 때문에 AHC 표면으로부터 얻어진. 이러한 가능성은 b를 지원설명 y BLI 플랫폼에 의해 발생 된 오프 속도 값은 다른 장치 (도 7의 적색 선)에 의한 것보다 더 지속적으로 낮았다 것을 보여주는 실험 데이터. 그럼에도 불구하고, BLI 플랫폼은 다른 플랫폼에 걸쳐 서로 다른 장점이 있습니다. 예를 들면, 즉시 사용으로 인해 다양한 사전 - 코팅 센서 센서 선택 및 분석에 관한 구성이 매우 유연하다. 우리의 실험에서 AHC 센서의 사용은 준비 시간을 줄이고, 리간드의 고정화 단계의 필요성을 제거. 또한, BLI 플랫폼은 복잡한 튜브 및 가치 스위치 구성을 특징으로 다른 유체의 SPR 플랫폼에 비해 훨씬 적은 유지 보수를 필요로한다. 이 기능은 막힘 오염 문제가 발생할 수 있습니다 원유 샘플을 포함하는 실험 장점이다. 치료 후보 증가, 효율적으로 신속하고 정확한 식별에 대한 수요, BI에 대한 요구로osensor 처리량도 증가하고있다. 네 개의 바이오 센서 플랫폼 중에서 96 리간드 어레이 인쇄 할 수있는 바이오 센서의 처리량 궁극적 증가 십자 36 리간드 포맷 및 16 채널 동시 판독과 BLI 기반 바이오 센서에 결합 된 바이오 센서, 다음으로 높은은 각각 96, 36, 16, 단일 결합 사이클에서 측정 된 상호 작용의 수. 이 처리량 기능은 하나의 일련의 흐름에 의해 연결된 네 개의 흐름 세포를 가지고에 의해 제한되는 기존의 SPR 플랫폼보다 훨씬 더 높다. 우리의 실험은 긴 해리 시간으로 다수의 표면 밀도에서 평가 10 단클론 항체의 비교적 작은 샘플 세트를 포함하기 때문에, 악기 처리량은 실험의 효율성을 결정하는 중간 역할을했다. 이 세 개의 높은 처리량 플랫폼의 실험 시간에 유의 한 차이는 없었다, 그리고 모든 경우에 실험은 하루에 완료되었습니다. 한편, 기존의 직렬 흐름 SPR 실험은 설치 후 데이터 수집의 도보 거리에 자동화에도 불구하고, 완료 삼일이 필요합니다. 오프 속도 순위 / 운동 검사 또는 에피토프 비닝 (binning)을 위해, (수백 또는 수천의 예) 샘플의 큰 숫자를 포함하는 다른 연구에서, 처리량은 중요한 요소가된다. IBIS MX96의 처리량이 다른 바이오 센서보다 수십 배 더 높다 따라서 이러한 목적을위한 최적의 선택이지만, 몇 가지 단점을 가지고있다. 특히, CFM하여 배열 인쇄 큰 표면 불일치 (도 1) 및 감소 된 데이터 재현성 (도 8D 및 8E)을 나타낸다. 정확한 동역학 측정을 위해 바이오 센서의 표면 리간드의 양은 결합 반응은 같은 보조 요소들에 의해 방해되지 않도록 제어 할 필요가 중요한 파라미터이다물질 전달 또는 입체 장애. 바이아 코어 T100 및 ProteOn XPR36 들어, 최적의 R L 레벨이 연구 제 17에서 설명한 바와 같이 설정된 R의 최대 값의 표준 계산에 기초하여 결정 하였다. 한편, 옥텟 RED384 및 IBIS MX96 플랫폼, 단클론 항체 캡쳐 레벨은 경험적 상수 배에서 2 배 희석 한 항체의 시리즈를 사용하여 달성 하였다. 기술 또는 캡처 단계의 제어의 부족은 고밀도 표면 운동 속도 상수의 정밀도를 손상 수도 높은 결합 응답 신호 (도 2)였다. 재생성 관련된 여러 바인딩 사이클 측정을 수행 할 때 또한, SPR 검출기로부터 프린터의 분리도 문제를 제시한다. 멀티 사이클 동역학 설정을 수행 할 수있는 유일한 방법은, 고정 된 단백질 A / G에서 단클론 항체를 통해 캡처 된 Fc 반대로 모노클 직접 아민 커플 링으로했다다른 세 개의 바이오 센서 플랫폼의 표면. 결과적으로, 추가로 재생 정찰 실험 최적의 재생 조건을 결정하기 위해 필요했다. 이 설정의 결과는 더 이상 실험 시간 이외에의 Fc 캡처 방법 (그림 9)에 비해 ~ 90 % 낮은 관찰 된 표면 활동과 연결되었다. 은 FC 캡처 방법을 실행하려면, 다른 하나의주기 운동 방식이 채택되었다. 이러한 접근법은 각각의 분사 (도 2) 사이에 재생하지 않고, 증가하는 농도의 분석 물질의 연속 주입을 포함한다. 이것은 매우 편리하지만, 일반적으로 덜 적용 방법뿐만 실험 시간 단축 및 시약의 소비를 줄일뿐만 아니라 다른 바이오 센서 (도 7)의 것과 매우 유사한 운동 속도 상수를 생성. 따라서,이 단일 사이클 반응 속도 접근 방식을 적용하면 악기의 고유 한 구성의 한계를 극복하고 선물높은 처리량 방식으로 고해상도의 운동 속도 상수를 얻기위한 기회를 제공합니다. 처리량이 비아 코어 T100의 주요 제한에도 불구하고, 우리의 결과는 총체적으로는 최고의 품질과 가장 일치하는 데이터를 생성 한 것으로 나타났다. 이것은 ~ 10 배 높은 처리량을 가지고 ProteOn XPR36,으로 이어졌습니다. 악기 &#39;검출 한계에 도달하면 기술적으로 어려울 수 고친 화성 항체 - 항원 상호 작용을 특성화 할 때 고품질의 데이터를 생성하는 능력이있는 장점이된다. 옥 테트 RED384의 장비의 체계적인 제한 해리 속도 상수의 정확한 측정을 방해하는 동안 (즉, 감도의 짧은 떨어지는 속도가 느린 오프 요금에 대한 충분한 신호 부패를 해결하기 위해), 모두 비아 코어 T100 및 ProteOn XPR36는 민감하고 안정적인 제공 할 수 있습니다 차별화를위한 탐지.

항체-항원 상호작용을 특성화하기 위한 신뢰할 수 있는 운동 매개변수의 획득은 약물 발견 및 개발 프로세스의 필수 구성 요소입니다1. 이러한 상호 작용의 실시간 감지를 위한 "황금 표준"인 SPR(Optical Surface Plasmon Resonance) 바이오센서는 약 20년 동안 기준을 충족하는 치료용 항체 후보를 조기에 선택할 수 있도록 하는 데 사용되어 왔습니다2,3. 미처리 상등액의 신속한 결합 스크리닝을 통해 항체 후보의 친화도 순위를 제공하는 것 외에도4 및 정제된 제제5의 엄격한 운동 상수 측정을 통해 바이오센서는 항원결정기 비닝 연구6,7을 통해 선도 후보의 기능적 활성을 더욱 차별화할 수 있습니다. 
다양한 치료 적응증에 대한 항체 기반 제품의 증가하는 수요를 충족하기 위해8, 최근 몇 년 동안 후보 물질 식별 및 특성화의 효율성을 높이는 다양하고 혁신적인 바이오센서 기기가 개발되었습니다.9,10. 이러한 기기는 미세유체 채널 구성, 설계 및/또는 생체 분자 상호 작용 감지와 관련된 광학 원리가 다릅니다. 구체적으로 Octet RED38411, ProteOn XPR3612 및 IBIS MX967은 단일 바인딩 주기에서 측정되는 상호 작용 수를 각각 16, 36 및 96으로 확장하여 기존 Biacore 플랫폼에 비해 처리량을 크게 개선했습니다. 이러한 다양한 바이오센서 플랫폼은 모두 항체-항원 상호 작용의 특성을 파악하기 위한 필수 동역학 데이터를 제공하지만, 기기 구성의 차이로 인해 실험 설정 및 운영 절차가 다릅니다. 예를 들어, IBIS MX96의 SPR 이미징 어레이 플랫폼에서 멀티플렉스 리간드 고정화 단계는 검출기와 분리된 외부 인쇄 장치에서 오프라인 모드로 수행됩니다7,13; 이와는 대조적으로, 다른 세 가지 바이오센서 플랫폼은 활성화 시약, 리간드 또는 분석물 등 센서 표면에 구성 요소를 추가하는 것이 실시간으로 사전 프로그래밍된 명령을 통해 순차적으로 기록되는 "올인원" 설정을 활용합니다. Octet RED384에서 이 BLI(BioLayer Interferometry) 기반 플랫폼의 고유한 기능은 즉각적인 "딥 앤 리드(dip-and-read)" 사용을 위한 사전 코팅된 광섬유 바이오센서를 사용할 수 있다는 것입니다14, SPR 기반 플랫폼의 센서 칩에 종종 필요한 리간드 표면 준비 및 시작/컨디셔닝 단계의 필요성을 제거합니다. 또한 이 기기의 무유체 설계는 역학을 단순화하고 미처리 샘플을 다룰 때 막힘 및 오염 문제를 방지합니다. ProteOn XPR36의 새로운 6 x 6 십자형 유체 설계를 통해 흐름 채널을 수평 방향과 수직 방향 사이에서 전환하여 36개의 상호 작용 지점을 생성함으로써 "원샷" 운동학 접근 방식을 구현할 수 있습니다15. 기존의 직렬 흐름 Biacore T100 플랫폼에서와 같이 한 번에 하나의 리간드 또는 분석물 농도를 결합하는 역학을 평가하는 대신, 이 접근 방식은 단일 결합 주기에서 최대 36개의 서로 다른 상호 작용을 동시에 모니터링할 수 있는 기능을 제공합니다. 
차이점에도 불구하고 이 네 가지 바이오센서 플랫폼은 모두 전 세계 많은 실험실에서 널리 사용됩니다. 바이오센서에 대한 실무 경험이 거의 없는 신규 사용자의 경우, 기기 설계의 차이점을 고려할 때 사용할 기기를 결정하는 것이 어려운 작업이 될 수 있습니다. 연구 목적에 가장 적합한 기기를 결정하기 위해서는 데이터 품질, 성능 일관성, 처리량, 작동 용이성 및 재료 소비와 같은 요소를 총체적으로 고려해야 합니다. 여러 벤치마크 연구에서 여러 실험실과 바이오센서에서 얻은 운동 속도 상수의 변동성을 조사했지만5,16, 최근에 발표된 일대일 비교 연구는 기기 성능 관점에서 데이터 신뢰성에 영향을 미치는 체계적인 요인을 추가로 다룹니다17,18. 이 비디오에 제공된 프로토콜은 실험 설정 및 절차에 대해 자세히 설명하고 있으며, "Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics"라는 제목의 연구 논문이 함께 제공됩니다17. 이러한 프로토콜은 새로운 바이오센서 사용자가 연구 목적으로 이러한 기기를 구현하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 현재 바이오센서 사용자에게 고친화성 항체-항원 상호 작용을 평가하기 위한 실험 설계의 기술적 과제 및 고려 사항에 대한 추가 통찰력을 제공하기 위한 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Biacore T100 시스템</td><td>GE 헬스케어</td><td>28975001</td><td>T100 시스템이 T200</td></tr><tr><td>CM5 센서 칩으로 업그레이드되었습니다&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>BR100012</td><td></td></tr><tr><td>BIA평가&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td></td><td>버전 4.1</td></tr><tr><td>바이아코어 T100 제어 소프트웨어</td><td>GE 헬스케어</td><td></td><td>T100 제어 소프트웨어가 T200</td></tr><tr><td>아민 커플링 키트</td>로 업그레이드되었습니다. <td>GE 헬스케어</td><td>BR100050&nbsp;</td><td>그것은 다음을 포함합니다: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 mL 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5&nbsp;</td></tr><tr><td>HBS-EP + 버퍼 10 회;</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100669</td><td>농축 재고 솔루션&nbsp;</td></tr><tr><td>플라스틱 바이알, o.d. 7mm</td><td>GE 헬스케어</td><td>BR100212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>고무 캡, 타입 3</td><td>GE 헬스케어</td><td>BR100502</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 바이알 및 캡, 외경 11mm</td><td>GE 헬스케어</td><td>BR100214&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ProteOn XPR36 단백질 상호 작용 어레이 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>1760100</td><td></td></tr><tr><td>ProteOn Manager 소프트웨어&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1760200</td><td>버전 3.1.0.6</td></tr><tr><td>GLM 센서 칩</td><td>Bio-Rad</td><td>1765012</td><td></td></tr><tr><td>아민 커플링 키트</td><td>Bio-Rad</td><td>1762410</td><td>그것은 EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl을 포함합니다;</td></tr><tr><td>재생 및 컨디셔닝 키트 및 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>1762210</td><td>여기에는 각 글리신 버퍼 (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0)와 NaOH, SDS, HCl, 인산, NaCl; 각 용액 50 mL가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>2 L PBS/Tween/EDTA 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>1762730</td><td>그것은 호스페이트 버퍼 식염수 (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA&nbsp를 포함합니다;</td></tr><tr><td>옥텟 RED384 시스템</td><td>포트&예보; </td><td></td><td></td>바이오</tr><tr><td>데이터 분석 소프트웨어</td><td>Fort&eacute; </td><td></td> Bio <td>버전 9.0.0.4</td></tr><tr><td>딥 앤 리드 안티-hIgG fc 캡처 (AHC) 바이오 센서</td><td>fort&eacute; Bio</td><td>18-5060</td><td>96개의 바이오센서가 포함된 한 트레이&nbsp;</td></tr><tr><td>384-웰 틸트-바닥 플레이트&nbsp;</td><td>포트&이큐트; Bio</td><td>18-5080</td><td></td></tr><tr><td>바이오센서 디스펜서</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-5016</td><td></td></tr><tr><td>Kinetics Buffer 10x</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-1092</td><td>10배 농도. ProClin 300이 포함되어 있습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>IBIS MX96 SPRi 시스템</td><td>Wasatch Microfluidics Microfluidics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFM (Continuous Flow Microspotter) 프린터</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>버전 2.0</td></tr><tr><td>SensEye COOH-G 칩</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>1-09-04-004</td></tr><tr><td>데이터 분석 소프트웨어</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>버전 6.19.3.17</td></tr><tr><td>SPRint 데이터 분석 소프트웨어</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>버전 6.15.2.1</td></tr><tr><td>Scrubber 2</td><td>BioLogic 소프트웨어</td><td></td><td>버전 2</td></tr><tr><td>Pierce 재조합 단백질 A/G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr></tbody></table>

네 개의 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 높은 친 화성 항체 - 항원 결합 속도론의 결정

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

라벨이없는 광 바이오 센서는 생체 분자 상호 작용의 특성에 대한 신약 개발에 강력한 도구입니다. 이 연구에서 우리는 결합 친화와 인간의 proprotein convertase의 서브 틸리 켁신 유형 (9)에 대한 열 높은 친화력 단일 클론 항체 (단클론 항체) (PCSK9)의 역학을 평가하기 위해 우리의 실험실에서 네 일상적으로 사용되는 바이오 센서 플랫폼의 사용을 설명합니다. 비아 코어 T100 및 ProteOn XPR36 모두 노포 표면 플라스 몬 공명 (SPR) 기술에서 유도되는 반면, 전자는 즉석에서 6 × 6 십자 통해 병렬 후자 선물 반면 36 반응 반점, 직렬 흐름 구성 형태로 연결된 네 개의 플로우 셀을 갖고 미세 유체 채널 구성. 비스 MX96은 공간 방향에서 검출을 제공하는 추가의 촬상 기능은 SPR 센서 기술을 기반으로 동작한다. 연속 흐름 Microspotter (CFM)와 결합이 검출 기술은 전자에 의해 크게 처리량을 확대동시에 반응 96 개 스포츠 다중 어레이 인쇄 및 감지 nabling. 대조적으로 옥텟 RED384는 광섬유 프로브 간섭 패턴을 검출하는 바이오 센서의 역할과 BioLayer 간섭계 (BLI) 광학 원리에 기반은 팁 표면에서 상호 결합에 바꾼다. 표면 플라즈몬 공명 기반 플랫폼과는 달리, BLI 시스템은 연속 흐름 유체에 의존하지 않는다; 그들은 오비탈 교반 중에 384- 웰 마이크로 플레이트의 분석 용액에 침지하면서 대신, 센서 팁 판독을 수집한다. 이러한 바이오 센서 플랫폼은 각각 자신의 장점과 단점이 있습니다. 1 분자 상호 작용 모델 : 상기 설명한 프로토콜은 단순한 1 맞 항체 - 항원 동력학을 특성화하기 위해 동일한 분석 포맷과 동일한 고품질의 시약을 사용하여 실험을 보여 질 운동 데이터를 제공하기 위해 이러한 기기 능력의 직접적인 비교를 제공한다 .

도 1은 두 고정화 방법에 의해 CFM 및 발견 항체 농도에서 항체 어레이 이미지를 도시하고,도 2는 이러한 항체 어레이의 다중 사이클에서 MX96에 운동 생성 대응 결합 sensorgrams 및 단일주기 운동 측정을 도시 . 6 - 바인딩 4 개 개의 바이오 센서 플랫폼에서 발생하는 다수의 항체가 코팅 된 표면으로부터 역학적으로 장착 곡선 실시간은도 3에 도시된다. 도 7은 이러한 결합 곡선의 글로벌 분석으로부터 얻어진 최종 운동 속도 및 평형 결합 상수를 비교 한 것이다. 개별 협회 (a를 K), 해리 (유전율 d), 평형 (K D) 결합 상수를 표 1에 나타내었다. 같은 기기 내에서 생성 된 데이터 세트의 변동성을 설명하기 위해, <st룽&gt;도 8은 다른 항체 표면 밀도에서 k 개의 A, K의 D 및 K D의 플롯을 도시하고,도 9에있어서, 상기 바이오 센서 플랫폼 단클론 항체 표면의 산출 결속 액티비티를 비교한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" /> 아민 결합 (A) 및 IBIS MX96에 CFM에서 출력 (B) 표면 항체를 포획 된 Fc-그림 1. 다중 리간드 어레이. 인쇄 어레이 이미지 붉은 사각형으로 둘러싸인 회색 영역은 항체의 존재를 나타내는 왼쪽 패널에 나타낸다. 활성 항체 스폿 간의 위치 진한 interspots 참조 감산에 사용된다. 각 열은 다음과 화상의 좌측 식별 적정 농도로 인쇄하는 항체를 포함한다. 디을 계산하여 정량 인쇄 된 항체의 양은활성과 기준 위치 사이의 부피 변화에 fference는 우측 패널에 도시되어있다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" /> 멀티 사이클 (A)에서 Sensorgrams 바인딩 실시간 및 단일 - 사이클 (B)를 IBIS MX96의 운동 실험 그림 2. 비교. 10 × 8 항체 어레이에 걸쳐 증가하는 농도에서 사람 PCSK9의 순차 주사는 각 해당 센서 그램 세그먼트 위에서 언급된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" /> <st바이아 코어 T100 1 운동 모델 맞추기 오버레이 : 룽&gt;도 3은 인간의 PCSK9 1과 상호 작용하는 항체의 캡쳐 Sensorgrams 바인딩. 상호 작용은 하이 (상단 패널), 중간 (중간 패널), 및 낮은 (하단 패널) 밀도면에 걸쳐 평가된다. 한 상호 작용 모델 : 포개어 부드러운 검은 선은 (1) 서로 다른 사람 PCSK9 농도 (컬러 라인)에서 바인딩 응답 신호의 운동 착용감을 나타낸다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" /> ProteOn XPR36 1 운동 모델 맞춤 오버레이 : 그림 4. 인간의 PCSK9 1과 상호 작용 캡처 항체의 Sensorgrams 바인딩. 상호 작용은 고 (상단 패널), 메디을 통해 평가각하, (중간 패널), 및 낮은 (하단 패널) 밀도면. 한 상호 작용 모델 : 포개어 부드러운 검은 선은 (1) 서로 다른 사람 PCSK9 농도 (컬러 라인)에서 바인딩 응답 신호의 운동 착용감을 나타낸다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" /> 옥 테트 RED384 1 운동 모델 맞춤 오버레이 : 그림 5. 인간의 PCSK9 1과 상호 작용 캡처 항체의 Sensorgrams 바인딩. 상호 작용은 하이 (상단 패널), 중간 (중간 패널), 및 낮은 (하단 패널) 밀도면에 걸쳐 평가된다. 포개어 적색 라인 1에 다른 사람 PCSK9 농도 (컬러 라인)에서 바인딩 응답 신호의 운동 착용감을 나타낸다 :<html> 1 개 상호 작용 모델. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" /> IBIS MX96 1 운동 모델 맞추기 오버레이 :도 6 인간 PCSK9 1과 상호 작용 아민 결합 (A)과의 Fc- 캡처 (B) 항체의 Sensorgrams 바인딩. 바인딩 정보는도 1의 배열 판지도를 따라 10 × 8 패널로 구성된다. 검은 색 선은 다른 사람 PCSK9 농도에서 기록 된 결합 응답 신호를 나타내고, 포개어 적색 라인 피팅 곡선을 나타낸다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> gure 7 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg &quot;/&gt; 도 협회 항 비교 포 바이오 센서 플랫폼에 의해 생성 된 바인딩 상수 A (A), 해리 (K)의 D (B)를 K, 평형 K D (C). 6 - 운동 파라미터는도 3의 결합 곡선 글로벌 분석으로부터 유도된다. 다음과 같은기구가 표현된다 : 비아 코어 T100 (블루) ProteOn XPR36 (녹색), 옥텟 RED384 (적색), 아민 결합 (보라색) IBIS MX96 및 IBIS MX96 (오렌지색)이 된 Fc-캡처. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" /> BIAC의 여러 항체 표면 밀도 이상 운동 속도 상수의 일관성의 그림 8. 비교<html> T100 석 (A), ProteOn XPR36 (B), 옥텟 RED384 (C) IBIS MX96 아민 결합 (D), 및 캡처 된 Fc-IBIS MX96 (E). 운동 파라미터는 (상위 서브 패널), 케이 D (중간 서브 패널) K, D 및 K (하단 서브 패널) 개별 항체 표면 밀도 그룹 분석으로부터 유도된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" /> 그림 네 개의 바이오 센서 플랫폼의 항체 표면과 그 표준 편차 (오차 막대)의 9 바인딩 활동. 값은 연구 논문 (17)에 기재된 식을 사용하여 계산된다.large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt; 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td> (KA) </td><td> K D </td><td> K D </td></tr><tr><td> (M -1 (S) -1) </td><td> (S-1) </td><td> (㎚) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (1) </td><td> (7.8) 11.7 10 5 X </td><td> (4.18) 4.89 10 X -5 </td><td> 0.052 (0.05) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 2 </td><td> (0.28) 1.53 10 5 X </td><td> (1.54) 1.30 10 X -5 </td><td> 0.092 (0.12) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 3 </td><td> (8.3) 11.4 10 5 X </td><td> (11.0) 27.6 10 X -5 </td><td> 0.333 (0.20) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 4 </td><td> (1.6) 3.61 10 5 X </td><td> (12.3) 20.1 10 X -5 </td><td> 0.659 (0.54) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (5) </td><td> (0.21) 0.59 10 5 X </td><td> (2.50) 3.46 10 X -5 </td><td> 0.663 (0.46) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (6) </td><td> (0.78) 1.19 10 5 X </td><td> (3.83) 7.21 10 X -5 </td><td> 0.894 (0.64) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (7) </td><td> (0.53) 1.29 10 5 X </td><td> (5.63) 16.4 10 X -5 </td><td> 1.57 (1.02) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (8) </td><td> (2.23) 4.02 10 5 X </td><td> (10.7) 22.8 10 X -5 </td><td> 0.768 (0.68) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (9) </td><td> (2.13) 4.20 10 5 X </td><td> (4.3) 6.67 10 X -5 </td><td> 0.197 (0.16) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (10) </td><td> (0.49) 1.20 (1) X0 5 </td><td> (7.64) 12.5 10 X -5 </td><td> 1.27 (0.80) </td></tr></tbody></table> 표 1 : 1 상호 작용 모델 : 운동 요금 및 평형이 1 개의 바이오 센서 인스트루먼트의 바인딩 곡선의 글로벌 피팅에 의해 획득 (10) 단클론 항체의 상수 바인딩.

우리는 여기에 설명 친화력 네 일반적으로 사용되는 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 반응 속도를 결합 항체 - 항원의 측정을위한 프로토콜.

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

본 바이오센서 연구의 목적은 일상적으로 사용되는 4가지 바이오센서 플랫폼의 고품질 키네틱 데이터 제공 능력을 비교하고, 고친화성 항체-항원 상호작용 평가를 위한 실험 설계 시의 기술적 과제와 고려 사항에 대한 통찰을 제공하는 것입니다. 이 연구는 치료용 항체 후보 물질을 평가할 때 가장 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있는 바이오센서 플랫폼 및 분석 포맷의 선택과 관련하여 신약 개발 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 제시합니다. 본 연구의 주요 장점은 데이터의 일관성, 품질 및 운영 효율성 측면에서 다양한 바이오센서 플랫폼에 대한 직접적이고 종합적인 비교를 제공한다는 점입니다.네 가지 프로토콜의 비디오 시연은 실습 경험이 적은 새로운 사용자가 이러한 기기에서 실험을 설정하는 방법을 배우는 데 도움이 되므로 매우 중요합니다. Biacore T100에서 속도론적 측정을 하려면 File, Open New Method를 클릭하고 메소드 파일을 엽니다. 메소드의 파라미터를 검토하십시오.Cycle Types에서 capture 1(유로 2)의 접촉 시간을 220초로, capture 2(유로 3)의 접촉 시간을 110초로, capture 3(유로 4)의 접촉 시간을 55초로 설정하십시오. 모든 capture cycle의 유속은 10 µL/min입니다. Sample 1을 선택하고 sample solution을 변수로 체크하십시오.그런 다음, 유로(flow path) 1, 2, 3, 4에 대해 접촉 시간을 600초로, 해리 시간을 2,700초로 설정합니다. 유속은 30 µL/min으로 설정합니다. 다음으로, Regeneration 1을 선택하고 용액 필드에 glycine HCl pH 1.5를 입력한 후, 유로 1, 2, 3, 4의 접촉 시간을 20초로 설정합니다.변수 설정에서, 사이클 1-3에는 100 nanomolar에서 6.25 nanomolar까지, 사이클 4-8에는 50 nanomolar에서 3.12 nanomolar까지, 사이클 9-10에는 5 nanomolar에서 0.323 nanomolar까지 2배 희석 적정 농도를 입력하십시오. 실행 설정에서 검출 흐름 경로 2-1, 3-1, 4-1을 선택한 다음, 다음을 클릭하십시오. 실행 전 프라이밍 확인란을 선택하고 다시 다음을 클릭하십시오.시료 및 시약 랙 1을 선택하고 시약의 위치를 지정하십시오. 해당되는 개별 시료 바이알에 시약을 피펫팅한 후 랙을 기기에 삽입하십시오. 랙 배출(Eject Rack)을 클릭하여 시료 트레이 구획 도어를 연 다음, 시료 랙을 기기에 삽입하십시오.그런 다음 Start를 클릭하고 저장할 실험 이름을 입력하여 런을 시작합니다. ProteOn XPR36에서의 키네틱 측정의 경우, Protocols를 선택한 후 Samples를 선택하여 고정화를 시작합니다. H1-H6 웰의 활성화제로 EDC/Sulfo-NHS를, G1-G6 웰의 리간드로 protein A/G를, F1-F6 웰의 비활성화제로 ethanolamine을, E1-E6 웰의 재생제로 glycine을, D1-D6 웰의 블랭크로 PBS-T-EDTA를, C1-C6 웰의 리간드로 monoclonal antibody X 샘플을, B1-B6 웰의 분석물로 human PCSK9를 지정합니다.Steps를 선택한 다음 프로토콜 에디터에서 Immobilization을 더블 클릭하십시오. 단계에는 EDC/Sulfo-NHS, protein A/G, 그리고 1 M ethanolamine의 세 가지 연속적인 수평 주입이 포함됩니다. 각 주입의 유량은 30 µL/min이어야 하며, 접촉 시간은 300초여야 합니다.다음으로 Regenerate를 클릭합니다. 수평 및 수직 방향 모두에 glycine을 100 microliters per minute의 속도로 18초 동안 3회 펄스 주입합니다. 이어서 PBS-T-EDTA를 25 microliters per minute의 속도로 60초 동안 2회 펄스 주입하며, 이 역시 두 방향 모두에 수행합니다.그런 다음, Ligand를 클릭하고 25 µL/min의 유속과 160초의 접촉 시간으로 단클론 항체 1, 단클론 항체 2를 수직 방향으로 주입합니다. Analyte를 클릭한 후, 공백 버퍼에 포함된 다섯 가지 농도의 human PCSK9을 6개의 수평 채널에 동시에 주입합니다. 40 µL/min의 유속으로 600초 동안 결합(association) 시간을 설정하고, 이어서 700초 동안 2회의 해리(dissociation) 시간을 설정합니다.그런 다음, Regenerate를 클릭하고 수평 및 수직 방향 모두에 100 microliters per minute의 속도로 glycine 펄스를 18초씩 두 번 주입합니다. 다음으로, 정의된 시약 위치에 따라 96-well plate 하나에 샘플과 시약을 준비합니다. 플레이트를 장비로 옮긴 후 Run 탭을 클릭하고, 프로토콜을 선택한 다음 Start를 클릭합니다.실시간 실험 데이터 기록 시 6-니들 병렬 주입 방법을 시연합니다. Octet RED384의 동역학 측정을 위해, 데이터 수집 소프트웨어에서 Experiment를 클릭한 후 New Experiment Wizard, New Kinetics Experiment, 그리고 Basic Kinetics를 차례로 클릭하여 실험 방법을 설정하십시오. 그 다음 Modify Plates를 클릭하고 Plate 1과 Plate 2 모두에서 96 Wells를 384 Wells로 변경하십시오.텍스트 프로토콜에 기술된 대로 플레이트 내의 시료 유형과 위치를 정의하십시오. 분석 정의(assay definition) 메뉴로 이동하여 실험 설정을 정의합니다. 실험 설정은 베이스라인 시간 30초, 재생 시간 30초, 평형 도달 시간 18초, 로딩 시간 200초, 결합 시간 500초, 그리고 해리 시간 1,800초로 정의합니다.교반 속도는 1, 000 RPM으로 설정합니다. 분석 단계 목록에 단계를 추가하려면, 먼저 단계를 클릭한 다음 샘플 또는 시약 플레이트에 위치한 웰을 클릭하십시오. 먼저, glycine에 15초간 담그는 과정과 1XKB에 15초간 담그는 과정을 3회 반복하여 anti-human Fc capture 센서를 전처리하기 위한 평형 재생 지침을 입력하십시오.그런 다음, 항-인간 Fc 캡처 센서에 단클론 항체 샘플을 200초 동안 캡처하도록 로딩 지침을 입력하십시오. 이어서, 결합 단계 이전에 60초 동안 바이오 레이어 간섭계 신호를 설정하기 위한 베이스라인 지침을 입력하십시오. 마지막으로, 센서를 다양한 농도의 인간 PCSK9이 포함된 웰에 담가 500초 동안 결합하도록 결합 단계를 입력하십시오.해리 단계로 진입하여 PCSK9가 결합된 센서를 1XKB가 들어 있는 새 웰에 담가 1,800초 동안 해리시킵니다. 마지막으로 재생 단계를 위해, 각 결합 주기 사이에 18초의 펄스를 두 번 가하며 단클론 항체 PCSK9 결합 센서를 글리신이 담긴 웰에 담급니다. 실험 검토(Review Experiments)로 이동하여 단계들을 살펴본 후, 녹색 열림 버튼을 클릭하여 샘플 챔버를 엽니다.샘플 플레이트를 기기에 넣습니다. 실험 실행(Run Experiments) 메뉴로 이동하여 60초의 지연 시간을 입력하고, 대기하는 동안 샘플 플레이트를 흔들어 줍니다. 플레이트 온도를 25 °C로 설정하고 실험 실행 이름을 입력한 후 Go를 누릅니다. 실시간 데이터 수집 과정이 여기에 표시됩니다.IBIS-MX96에서 다회 주기 kinetic 측정을 수행하려면, 센서 칩을 연속 흐름 마이크로스포터(continuous flow microspotter)에 장착하십시오. CFM2.0 소프트웨어를 실행한 다음, Load Settings를 클릭하고 96 Amine Couple을 선택하십시오. 샘플 플레이트와 시약 플레이트 두 개를 CFM 프린터에 넣으십시오.항체 어레이를 제작하려면, Run을 눌러 프린터를 시작하고 시약 플레이트 상단부에 있는 EDC/Sulfo-NHS를 48개의 마이크로채널을 통해 센서로 전달하여 5분 동안 센서 표면 위로 순환시킵니다. 소스 플레이트 상단부에 있는 단클론 항체 샘플을 센서로 전달하여 활성화된 표면 위로 10분 동안 순환시킵니다. 그런 다음, 50 mL 원추형 튜브에 담긴 고정화 버퍼를 항체 표면 위로 5분 동안 전달합니다.출력된 센서 칩을 기기에 장착합니다. 제어 소프트웨어에서 파일(File), 측정값 열기(Open measurement), 기존 측정값(Existing measurement)을 차례로 클릭하고 분석법 파일을 선택합니다. 출력된 센서 칩을 기기로 옮깁니다.일반 메뉴에서 Full system script 아래의 G-System Prime을 선택하십시오. 그런 다음, 1 M ethanolamine 150 µL를 주입하여 단클론 항체 표면을 비활성화하기 위해 G-Quench를 선택하십시오. Analysis Cycle에서 IBIS Scripts 아래의 A-AP Standard Run을 선택하십시오.기저선(baseline)은 1.0분, 결합(association)은 10.0분으로 설정하고, 해리(dissociation)는 초당 8 µL의 속도로 90단계를 설정하십시오. 사이클 내에서, 5회의 버퍼 주입 후 인간 PCSK9을 한 번에 한 가지 농도씩 주입하십시오. 각 결합 사이클 사이에 glycine을 사용하여 단클론 항체 표면을 재생하십시오.네 대의 기기에서 인간 PCSK9과 상호작용하는 항체들에 대해 1:1 반응속도 모델 피팅 오버레이로 기록된 결합 센소그램을 나타내었습니다. 여러 밀도에서의 항체 결합 프로필은 기기 간에 유사하게 나타났습니다. 각 항체와 관련된 속도 상수는 기기마다 차이가 있었으나, 그 순위는 대부분 동일하게 유지되었습니다.여러 항체 표면에 걸친 kinetic rate의 친화도 재현성과 일관성을 조사하였습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, Biacore T100 및 ProteOn XPR36을 사용하여 생성된 모든 속도 상수는 강한 선형성을 보였습니다. 하지만 Octet RED384에 의해 생성된 속도 상수는 일부 off rate의 변동으로 인해 선형성이 더 낮았습니다.이는 마이크로플레이트 내의 시간에 따른 시료 증발로 인해 발생했을 가능성이 있습니다. IBIS-MX96으로 생성된 속도 상수는 표면 불균일성의 변동으로 인해 선형성이 더 낮았습니다. 대부분의 시스템과 관련된 항체 결합 활성은 일정했으나, IBIS-MX96의 아민 결합 방식에서는 약 10배 낮은 활성이 관찰되었습니다.이는 항체 불활성화 또는 항원 결합에 유리하지 않은 항체 배향이 생성되었기 때문일 가능성이 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 네 가지 바이오센서 플랫폼 각각에서 실험을 설정하는 방법과 자신의 연구 목적에 적합한 바이오센서 기술을 선택하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 본 대조 비교 연구를 통해 각 바이오센서 플랫폼이 저마다의 장단점을 가지고 있음을 알 수 있습니다.기기 자체의 내재적인 계통적 제한 사항에도 불구하고, 결합 및 해리 속도 상수의 직접적인 순위는 이 기기들 간에 매우 높은 상관관계를 보였습니다. 후보군 순위 결정의 목적상, 샘플 수와 재료의 양이 제한 요인이 아니라고 가정한다면, 어떤 기기를 사용하더라도 사용된 기기와 관계없이 항체들을 유사하게 구별할 수 있으므로 이 기기들 중 어느 것이든 사용할 수 있습니다. 데이터의 신뢰도와 샘플 처리량 사이에는 상충 관계(trade-off)가 존재합니다.Biacore T100과 ProteOn XPR36R이 차례로 가장 우수한 데이터 품질과 일관성을 나타냈습니다. 반면 Octet RED384와 IBIS-MX96은 데이터 정확도와 일관성 면에서 절충이 필요하지만, 높은 유연성과 처리량을 보여주었습니다. 민감하고 신뢰할 수 있는 검출이 필요한 연구에는 Biacore T100 또는 ProteOn XPR36이 가장 적합합니다.속도가 중요한 요소이며 처리해야 할 샘플 수가 많은 연구의 경우, Octet Red384 또는 IBIS-MX96이 권장됩니다. 연속 흐름 액체 X 시스템을 갖춘 기기는 해리 속도가 느린 상호작용을 분석하는 데 있어 고품질의 데이터를 제공합니다. BRI fluid ex-a-fray 기기의 주요 한계점은 마이크로플레이트 내에서 시간이 경과함에 따라 샘플이 증발한다는 점이며, 이는 상향 드리프트를 유발하여 데이터 정확도를 떨어뜨릴 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

우리는 질량 광합성(MP)을 사용하여 항원-항체 친화성 측정에 대한 단일 분자 접근법을 기술합니다. MP 기반 프로토콜은 빠르고 정확하며 매우 적은 양의 재료를 사용하며 단백질 변형이 필요하지 않습니다.

질량 광합성에 의한 항체 항원 선호도의 신속한 결정

이 연구는 약물 펩티드 상호 작용을 식별하기위한 전략을 제시하는 것을 목표로했다. 이 전략은 석영 결정 마이크로 밸런스 (QCM) 바이오 센서에 기초한 약물 인식 짧은 펩타이드의 바이오 패닝을 포함하고, 단백질에 대한 약물 인식 및 약물 결합 부위의 음장 에 대해 얻은 정보를 정량적으로 평가하기위한 생물 정보학 분석이 뒤따릅니다.

약물 단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략

전계 효과 바이오 센싱 (FEB)은 생체 분자 상호 작용을 검출하기위한 라벨이없는 기술입니다. 결합 표적이 고정되는 그래핀 바이오센서를 통해 전류를 측정한다. FEB 기술은 Hsp90과 Cdc37 사이의 생체 분자 상호 작용을 평가하는 데 사용되었으며 두 단백질 간의 강력한 상호 작용이 검출되었습니다.

필드 이펙트 바이오센싱 기술을 이용한 분자 샤페론 Hsp90과 클라이언트 단백질 키나제 Cdc37 사이의 생체분자 상호작용 탐구

이 논문에서는 스트렙타비딘 기반 생물층 간섭계(BLI) 시스템을 사용하여 DNA-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 상호 작용의 평형 결합 친화도(KD)를 결정하기 위해 기본 또는 고급 결합 역학을 활용하기 위한 필수 단계와 고려 사항을 간략하게 설명합니다.

스트렙타비딘 기반 생물층 간섭계를 사용한 DNA-단백질 상호작용 분석

MicroScale Thermophoresis(MST)는 압타머-표적 상호 작용을 특성화하는 민감한 기술입니다. 이 원고는 압타머-소분자 상호작용을 특성화하기 위한 MST 프로토콜을 설명합니다.

마이크로 열 영동을 사용하여 ATP에 앱 타머의 결합 부위를 매핑

배우세요 네 가지 바이오센서 플랫폼을 사용하여 항체-항원 결합 속도론을 측정하는 방법을. Biacore T100, ProteOn XPR36, Octet RED384, IBIS-MX96의 데이터 품질과 운영 효율성을 비교하여 신뢰할 수 있는 약물 후보 평가를 위한 최적의 플랫폼 선택을 돕습니다.

네 개의 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 높은 친 화성 항체 - 항원 결합 속도론의 결정

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