Name: 동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 배우세요 바이오레이어 간섭계를 활용한 동적 단백질 복합체 조립 및 해체 모니터링 방법을 전자현미경과 질량분석으로 검증하는 기술입니다. 이 프로토콜은 생화학 연구에서 단백질 상호작용을 실시간으로 관찰하고 구조적 무결성을 확인하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 매디슨과 라일라 자기 대학원 친교 (AJM), NIH 5T32GM008359에 의해 지원 되었다 (PTO), KUMC 생물 의학 연구 훈련 프로그램 (PTO), NIH R01AI090085 (MTF), 구 브리징 자금 및 Biomolecule 상호 작용 기술 센터 (BITC) 부여 ( 코네티컷 그리고 MTF)입니다. 저자는 바바라 Fegley KUMC 전자 현미경 검사 법 핵심 편 이미지 수집 지원 감사 하 고 싶습니다.

1. 어셈블리 Biolayer 간섭계 (BLI) 바이오 센서 표면에 정의 된 고분자 복합물의
<ol><li>
Prepore 탄 저 균 독 소 PDEA 수정 아민 반응 바이오 센서 표면에 복잡 한 조립
	<ol>
<li>수 화는 아민 반응 물 10 분 동안 250 µ L에 2 세대 (AR2G) 씨 바이오 센서 팁.</li>
		<li>단계 시간, BLI 단위를 제어 하는 소프트웨어에 표 1에 나열 된 프로그램 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>바이오 센서 팁 30 250 µ L 물에 immersing 하 여 실행 하는 라스 시작 바이오 센서 두께 밀도의 초기 기준선을 측정 하는 s.</li>
		<li>50mm NHS (N hydroxysuccinimide)와 200mm EDC (7 분 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) 250 µ L로 팁을 immersing 하 여는 바이오 센서를 활성화.</li>
		<li>50mm PDEA (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) 0.1 M borate 버퍼 (pH 8.5) 활성화 thiol 반응 표면 생성 하 5 분에 용 해 활성화 된 바이오 센서를 담가.</li>
		<li>100를 포함 하는 솔루션의 250 µ L로 활성화 thiol 반응 바이오 센서를 담가 5 nM E126C LFN 10 m m 나트륨 아세테이트 ph 5.0, 100 mM NaCl, 버퍼.</li>
		<li>담가 LFN 팁 50 m L-시스테인, 1 m에서 M NaCl, 0.1 M 나트륨 아세테이트, pH 5.0, 4 분, 나머지 반응 무료 thiol 반응 그룹을 끄다.</li>
		<li>50mm 트리 스, 50mm 버퍼 기준선을 설정 하는 2 분 동안 NaCl 침묵과 LFN 팁을 담가.</li>
		<li>50 mM Tris, 50mm LFN-펜 실바 니 아prepore 복잡 한 만드는 데 5 분 NaCl 0.5 µ M 보호 항 원 prepore (PAprepore)으로 침묵과 LFN 팁을 담가.</li>
		<li>PAprepore 연결 된 한 번, PAprepore 솔루션에서 끝을 제거 하 고 50 mM Tris, 50 mM NaCl 어떤 비 특히 바인딩된 PAprepore씻어 30 초 동안에 끝을 담가.</li>
		<li>젖어 복잡 한 LFN-펜 실바 니 아prepore (없이 막 횡단 도메인), 0.5 µ M CMG2 수용 체로 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 분 동안.</li>
		<li>담가는 LFN-PAprepore-복잡 한 CMG2 50 mM Tris, 30 초 동안 50 m m NaCl로를 양식 사전 endosomal 단지 어떤 언바운드 CMG2 씻어.</li>
		<li>EM 분석에 대 한 릴리스 LFN-펜 실바 니 아prepore-CMG2 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50 m m NaCl, PCR 튜브 안쪽의 5 µ L로 팁을 immersing 하 여 바이오 센서 팁에서 복잡 한.</li>
		<li>복잡 한에서 펩 티 드의 협동 석사 분석, 릴리스 LFN-펜 실바 니 아prepore-CMG2 5 µ L 50mm DTT, 6 M에는 바이오 센서를 immersing 하 여 바이오 센서 팁에서 복잡 한 GuHCl (각 질 없는) 25 m m 염화 중 탄산염 pH 8.0 PCR 내부 튜브 . 이 EM 분석을 위해 사용 되는 것 보다 다른 바이오 센서에서 수행 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PDEA 수정 아민 반응 바이오 센서 표면에 복잡 한 기 공 탄 저 균 독 소의 조립
	<ol>
<li>복잡 한 pH 전환 후를 보려면 LFN-펜 실바 니 아prepore를 생성 하는 이전 섹션에서 단계 1.1.1-1.1.12 수행-CMG2 복잡 한.</li>
		<li>10 m m 초 산 pH 5.0 5 분기 공 전환 PA PAprepore 의 전환을 시작으로 바이오 센서 팁을 담가. 이 변화는 진폭을 증가 표시 (약 0.2 nm)로 인해 상당한 또는 완전 한 수용 체 분리 되도록 가설는 큰 진폭 감소 다음 바인딩 선호도 감소.</li>
		<li>담가 50 mm Tris, 50 mM NaCl, pH 8.0, 산 성 버퍼를 씻어 30 초 동안 LFN-펜 실바 니 아기 공 팁.</li>
		<li>EM 분석 샘플 이황화 출시 후 솔루션에서 집계를 방지 하기 위해 5 분 동안 사용 micelles 1.25 m m (2.5 m m MSP1D1, 25 m m 나-cholate, 162.5 m POPC m)을 포함 하는 솔루션으로 바이오 센서 팁을 담가.</li>
		<li>EM 분석에 대 한 해제는 LFN-펜 실바 니 아공-바이오 센서 팁에서 복잡 한 Micelle 50mm DTT, 50 mM Tris, PCR 튜브 안에 50 m m NaCl의 5 µ L로 팁을 immersing 하 여.</li>
		<li>복잡 한에서 펩 티 드의 협동 석사 분석 출시 LF에 대 한N-PApoore 복잡 한 (micelle)는 바이오 센서에서 5 µ L 50mm DTT, 6 M GuHCl (각 질 없는) 25 m m 염화 중 탄산염 pH 8.0 PCR 내부에 바이오 센서를 immersing 하 여 팁 튜브입니다. 이 EM 분석을 위해 사용 되는 것 보다 다른 바이오 센서에서 수행 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 시각화 하 고 검증 발표 부정적인 얼룩 전자 현미경 검사 법에 의해 씨 바이오 센서에서 고분자 어셈블리
<ol><li>글로우 방전 탄소 코팅 Cu 300 표. 전형적인 형광 방전 설정은 0.38 mBar 안정적인 분위기 압력, 부정적인 15 mAmps, 공기 방출 다음 20 초입니다.</li>
	<li>깨끗 한 핀셋의 쌍 사이 그리드 보안.</li>
	<li>플라스틱 격자에 PCR 튜브에 출시 된 복잡 한 샘플의 4 µ L 고 60에 대 한 흡착.</li>
	<li>액체 필터 종이 쐐기 남아 멀리 심지.</li>
	<li>5 초 후 눈금 0.75% 필터링 0.02 미크론 uranyl 편대의 wicking 멀리 초과 얼룩 pipetting 5 µ L에 의해 얼룩. 그리드를 실 온에서 건조를 허용 합니다.</li>
	<li>전송 전자 현미경을 사용 하 여 얼룩진된 샘플 격자를 볼 수 있습니다.</li>
</ol>3. 식별의 완전 한 사전 endosomal 탄 저 균 독 소 (LFN-펜 실바 니 아prepore-CMG2) 및 전환 복잡 한 (LFN-펜 실바 니 아기 공 CMG2 없이) 사용 하 여 질량 분석.
<ol><li>20 µ L에 나온된 샘플을 희석 하 고 1 시간 동안 품 어.</li>
	<li>55 m m iodoacetamide, 25 m m 염화 중 탄산염, pH 8.0, 2 µ L을 추가 하 고 (알루미늄 호 일로 덮여) 어둠 속에서 실 온에서 1 시간 동안 품 어.</li>
	<li>25 m m 염화 중 탄산염의, pH 8.0, 1 m guanidine 염 산 염 농도 줄이기 위해 100 µ L로 샘플을 희석.</li>
	<li>20 ng / µ L에서 학년 수정 trypsin 시퀀싱의 5 µ L을 추가 하 고 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>빙 초 산에 산도 줄이기 위해 5%의 최종 농도에 추가 < 3, 진공 집중 장치에 10 µ L를 볼륨 줄일.</li>
	<li>NLC 1200 uHPLC의 autosampler에 펩 티 드 솔루션 샘플 접시에 전송.</li>
	<li>5 µ L uHPLC 반전된 단계 열에 펩 티 드 솔루션 탑재 MS의 이온화 단계에 로드 합니다.</li>
	<li>5 μL/min의 최대 속도에서 0.1% 개미 산의 15 µ L 열 또는 800 psi의 최대 압력 세척.</li>
	<li>A + b (용 매 a: 0.1% 포 름 산, 0.1% 개미 산 성 용 매 b: 95% 이기)의 5% ~ 40% 용 매 B의 직계 그라디언트를 사용 하 여 90 분 동안 350 nL/min 흐름 속도로 반전 단계 C18 열에서 펩 티 드를 elute.</li>
	<li>방출 선 협동 MS를 사용 하 여 펩 티 드를 분석 합니다.<ol>
<li>2500 볼트 및 이온 전송 온도 250 ° c로 이온화 소스 설정</li>
		<li>3 s 기간에 최대한 많은 협동 MSM 뒤 지속적으로 한 MS 검색을 수행 하는 자동 제어에서 질량 분석기를 작동 CID 및 35의 정규화 된 충돌 에너지를 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>표준 방법을 사용 하 여 펩 티 드 및 단백질 구성 요소를 식별 합니다. 이 작품에 대 한 펩 티 드 및 단백질 분석의 두 세트를 수행 했다.</li>
</ol>

<ol><li>Bellon, S., Buchmann, W., Gonnet, F., Jarroux, N., Anger-Leroy, M., Guillonneau, F., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyphenation+of+surface+plasmon+resonance+imaging+to+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+by+on-chip+mass+spectrometry+and+tandem+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hyphenation of surface plasmon resonance imaging to matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry by on-chip mass spectrometry and tandem mass spectrometry analysis.</a> Analytical Chemistry. 81, 7695-7702 (2009).</li>
<li>Kim, Y. E., Yi, S. Y., Lee, C. S., Jung, Y., Chung, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+patterned+biochips+for+on-chip+immuno-MALDI-TOF+MS%3A+SPR+imaging+coupled+multi-protein+MS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Gold patterned biochips for on-chip immuno-MALDI-TOF MS: SPR imaging coupled multi-protein MS analysis.</a> The Analyst. 137, 386-392 (2012).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor%2C+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Analytical Biochemistry. 377, 209-217 (2008).</li>
<li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+blocking+assays+using+Octet%2C+ProteOn%2C+and+Biacore+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Analytical Biochemistry. , 172-180 (2009).</li>
<li>Pall. BLI Technology. , Available from:
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<li>Naik, S., Brock, S., Akkaladevi, N., Tally, J., McGinn-Straub, W., Zhang, N., Gao, P., Gogol, E. P., Pentelute, B. L., Collier, R. J., Fisher, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+kinetics+of+the+pH-driven+transition+of+the+anthrax+toxin+prepore+to+the+pore+by+biolayer+interferometry+and+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Monitoring the kinetics of the pH-driven transition of the anthrax toxin prepore to the pore by biolayer interferometry and surface plasmon resonance.</a> Biochemistry. , (2013).</li>
<li>Akkaladevi, N., Hinton-Chollet, L., Katayama, H., Mitchell, J., Szerszen, L., Mukherjee, S., Gogol, E., Pentelute, B., Collier, R., Fisher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+anthrax+toxin+pore%3A+Lethal-factor+complexes+into+lipid+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Assembly of anthrax toxin pore: Lethal-factor complexes into lipid nanodiscs.</a> Protein Science. 22, 492-501 (2013).</li>
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<li>Yamniuk, A. P., Edavettal, S. C., Bergqvist, S., Yadav, S. P., Doyle, M. L., Calabrese, K., Parsons, J. F., Eisenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABRF-MIRG+benchmark+study%3A+Molecular+interactions+in+a+three-component+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">ABRF-MIRG benchmark study: Molecular interactions in a three-component system.</a> Journal of Biomolecular Techniques. , 101-114 (2012).</li>
<li>Moore, J. D., Perez-Pardo, M. A., Popplewell, J. F., Spencer, S. J., Ray, S., Swann, M. J., Shard, A. G., Jones, W., Hills, A., Bracewell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+biological+characterisation+of+a+sensor+surface+for+bioprocess+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Chemical and biological characterisation of a sensor surface for bioprocess monitoring.</a> Biosensors & Bioelectronics. 26, 2940-2947 (2011).</li>
<li>Feld, G. K., Thoren, K. L., Kintzer, A. F., Sterling, H. J., Tang, I. I., Greenberg, S. G., Williams, E. R., Krantz, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+unfolding+of+anthrax+lethal+factor+by+protective+antigen+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the unfolding of anthrax lethal factor by protective antigen oligomers.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17, 1383-1390 (2010).</li>
<li>Fairhead, M., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+biotinylation+of+purified+proteins+using+BirA%5BTitle%5D)+AND+%22Site-Specific+Protein+Labeling%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA.</a> Site-Specific Protein Labeling: Methods and Protocols. , 171-184 (2015).</li>
<li>Naik, S., Kumru, O. S., Cullom, M., Telikepalli, S. N., Lindboe, E., Roop, T. L., Joshi, S. B., Amin, D., Gao, P., Middaugh, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+structurally+altered+and+aggregated+states+of+therapeutically+relevant+proteins+using+GroEL+coupled+to+bio-layer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Probing structurally altered and aggregated states of therapeutically relevant proteins using GroEL coupled to bio-layer interferometry.</a> Protein Science. 23, 1461-1478 (2014).</li>
<li>Bandyopadhyay, A., Gao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iminoboronate-based+peptide+cyclization+that+responds+to+pH%2C+oxidation%2C+and+small+molecule+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Iminoboronate-based peptide cyclization that responds to pH, oxidation, and small molecule modulators.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 2098-2101 (2016).</li>
<li>Grantham, J., Llorca, O., Valpuesta, J. M., Willison, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+occlusion+of+both+cavities+of+the+eukaryotic+chaperonin+with+antibody+has+no+effect+upon+the+rates+of+beta-actin+or+alpha-tubulin+folding%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Partial occlusion of both cavities of the eukaryotic chaperonin with antibody has no effect upon the rates of beta-actin or alpha-tubulin folding.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 4587-4591 (2000).</li>
<li>Ercius, P., Alaidi, O., Rames, M. J., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Tomography%3A+A+Three-Dimensional+Analytic+Tool+for+Hard+and+Soft+Materials+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Electron Tomography: A Three-Dimensional Analytic Tool for Hard and Soft Materials Research.</a> Advanced Materials. 27, 5638-5663 (2015).</li>
</ol>

이 이번에 아무 공개입니다.

이 데모에서는 고분자 복잡 한 형성은 biolayer 간섭계를 사용 하 여 쉽게 모니터링할 수 있는, 어떻게 EM을 사용 하 여 시각화 하 고 MS, 모두 짧은 기간에 microvolumes와 함께 확인. 구조 부품 및 생물학 관련 예측, 추가 확인이 결합 된 방법론에 따라 관찰 된 단지. 결과 섹션에서 설명 했 듯이 어셈블리 성공 위한 핵심 요소 인터페이스는 복잡 한 단백질-단백질 바이오 센서 표면에서 제대로 방향이 되도록 합리적으로 설계 된 시스테인 mutagenesis를 필요 합니다.
이전 시스템 2 및 3 구성 요소 시스템의 단백질 바인딩 뿐만 아니라 표현한 단백질의 수용 체 바인딩의 무결성을 평가 하 씨와 MS 기술을 사용 하지만, 두 경우에는 방법 탠덤 EM/MS의 활용 개발 되지 않은 8,9에 접근. 만 다른 간섭계 시스템 특성 상호 작용 수 있도록 MS 분석을 결합 하는 이중 분극 간섭계10했다. 불행히도,이 시스템은 더 이상 일반적인 용도로 사용할 수 있는. 소개에서 설명 했 듯이, 다양 한 연구 샘플 같은 SPR 바이오 센서 표면에 형성 했다 및 MS 분석에서 제거 완료 되었습니다. 그 예의 없음 단지 그들을 사용 하 여 시각화 결과.
이 순차적 방법의 한계 다 수 있지만 풀 수 있습니다. 초기 immobilization, 따라서 어셈블리의 기초 단계에 대 한 구조 상호 작용 표면의 지식 부족 모니터링 초기 어셈블리 단계와 관련 된 진행을 방해 확실히 것 이다. 구조 정보 부족 한 엔지니어링 설계 하 여 해결할 수 있습니다 재단 구성 어디 첨부 화학 (예: sulfhydryl moiety 이황화 결합 / 그의 태그 위치)는 코어 내에서 다양 한 영역을 이동할 수 있습니다 어셈블리 시스템입니다. 복잡 한 탄 저 균 독 소의 경우 PAprepore 에 바인딩된 LFN 의 구조는 사용할 수 있는11행운 이었다. 조작된 시스테인의 합리적인 배치 PAprepore 바인딩 얼굴에서 지역에 지역화 되었습니다. 시스테인 결합 화학, 그것은 다른 반응 시스테인 단백질 표면에 존재 하는 것이 좋습니다.
단백질의 표면에 특정 첨부 파일 사이트를 사용할 수 있는 다양 한 첨부 파일 화학이 있다. 가장 인기 있는 특정 첨부 파일 중 하나는 단백질 표면12에 구체적으로 정의 된 위치에 biotin moiety 위치 포함 됩니다. 불행히도, avidin 또는 streptavidin biotin 바인딩 표면 코팅은 매우 빡 빡. 바인딩 상호 작용의 간단 하지 않습니다. 설계 그의 태그에는 N-또는 C-말단의 사용 및 Ni NTA 표면에 첨부 파일의 후속 용이성 선호도 동원 정지의 더 많은 보편적인 응용 프로그램입니다. 물론, 그의 태그 시스템 엔지니어링 조립 첨부 파일 사이트에 대 한 주의 사항 중 하나는 핵심 어셈블리 단백질 N와 C 테르미니 남아 노출 및 첨부 파일은 쉽게 분리 요구 사항입니다. 로 모든 어셈블리 프로세스와 핵심 어셈블리 단백질의 상호 작용 인터페이스 있어야 합니다 복잡 한 어셈블리 진행으로 사용할 수 있습니다.
아마도 바이오 센서 표면 화학을 사용 하 여 가장 일반적인 관심사는 비 특정 바인딩. Streptavidin 팁은 종종 중요 한 일반적인 바인딩 효과의 소스입니다. 연결 된 이황화 biotin 단단히 고정된 streptavidin 바이오 센서13에 바인딩된 감소 S biotin 링크 뒤에 남겨두고 매우 구체적인 단지 릴리스 사용할 수 있습니다. 다른 가역 화학 iminoboronates 등와 낮은 범위 ketoamide14에 제공 되 고 있다. 이 필드는 현재 저 개발, 하지만 일반적으로 공유 대상된 약물 개발의 사용을 동반 하는 대상에서 약물 독성 효과 피하기 위해 가역 공유 프로토콜 개발에 높은 관심.
EM을 사용 하 여 단지 시각화의 제한 해석, 조립된 단지의 구조 처음 알려져 있지 않습니다 경우에 특히 이다. 특정 운동 및 구조상 감 적으로 단일 클론 항 체 (mAb)를 사용 하 여 구성 요소 내에 정의 되지 않은 조립 고분자의 공간 위치를 확인할 수 있습니다. 예를 들어 복잡 한 형성 되 면 단일 클론 항 체 추가할 수 있습니다는 특정 구성 요소에 바인딩합니다. 이 방법은 큰 어셈블리15내의 특정 구성 요소를 식별 하는 그들에 자주 사용 됩니다. 또 다른 한계는 복잡 한의 크기에 관련, 어디 70 kDa (숙소 heptamer)는 쉽게 작은 정의 된 대칭 어셈블리를 사용 하 여 해결 하는 경우 부정적인 얼룩 EM 되었습니다 있지만. 조립된 단지 그들에 의해 분석 되는 ~ 100 Å 이상 직경에서의 크기 범위에서 일반적 으로입니다. 그러나 최근에, 작은 20 kDa 단백질 해결 되 고 낮은 해상도 구조 우수한 방법론16얼룩을 사용할 때 얻은.
MS 분석을 위해 femtomolar (attomoles) 수준의 현재 MS 계측의 증가 감도 높일 수 있습니다 어떤 경우에 라스 검출의 감도. 그것은 높은 단백질 신호 진폭에 최소 하지만 반복 상승을 나타내는 문제의 단백질의 id 발생 합니다 생각할 수 있는. 또한, 단백질 단백질 상호 작용에는 바이오 센서 및 셀룰러 환경에서 다른 파트너 중 하나를 검색 효과 정화와 새로 형성 된 복잡 한 이후에 쉽게 탐지에 발생 합니다. 현재 매우 민감한 MS 시스템으로 관찰 될 수 있는 한 가지 한계는 관심사의 단백질 데이터베이스에 되지 않을 수도 있습니다 하지만이 관측은 드문 (드문 종에서예: proteomes). 관심사의 단백질의 시퀀스는 알려진 경우,이 문제는 배경 단백질 데이터베이스 (프로토콜 섹션에서이 작업에서와 같이)에 protein(s) 아미노산 시퀀스를 포함 하 여 쉽게 해결 된다. Trypsinolysis 단백질의 저항에서 방법론 결과의 또 다른 잠재적인 제한. 트립 신 소화는 일반적으로 상향식 단백질 식별의 기본 방법입니다. 그러나, 단백질 Arg 및 리스 잔류물 부족 또는 이러한 잔류물에 대 한 액세스는 접힌된 구조에 의해 제한 하는 경우 trypsin에 저항력이 있을 수 있습니다. 이러한 제한은 대안 또는 프로 테아의 조합을 사용 하 여 또는 효소 소화 전에 전개 시 약 (우 레 아 또는 guanidine HCl, 1.1.14와 1.2.6에 표시 된 대로)를 포함 하 여, 각각, 해결 됩니다.
이 방법론의 가능한 확장을 따라 원유 세포 lysates에서 셀룰러 어셈블리 단지 식별 사용자 포함 됩니다. 그것은 밝혀 테스트 위한 집중된 세포 추출 구성 요소 어셈블리 biolayer 간섭계 절차를 사용 하 여 수행 하기 쉽습니다. 막힘을 하는 경향이 하 고 집계에 민감한 더 일반적으로 사용 된 미세 기반 방법론 달리 씨 방법은 직접 biolayer 센서 팁 잠재적으로 특정 단지를 직접 조립 하 원유 추출 물에 젖어 사용할 수 있습니다. 이러한 불순 한 샘플을 집중. 일단 조립, 그것은을 사용 하 여 특정 항 체 프로브 씨 시스템 후속으로 식별 하 고 심지어 MS microvolume 메서드를 사용 하 여 파악 된 세포 추출 물에 의심 스러운된 구성 요소를 quantitate 전적으로 가능 합니다. 다시, 여기 키 특정 선호도 조사로 정의 된, 제대로 지향적인 핵심 단백질을 사용 하는.
기 공 씨와 운동 전환 프로세스 prepore를 볼 수 있는 능력 특히 늦은 endosomal, 낮은 pH (5.0)에서 작동 하는 단백질 전환의 잠재적인 "항 독 소" 작은 분자 억제제를 식별에 매우 도움이 될 것입니다. 조건입니다. 이 유도 하는 pH prepore 전환 기 공 글리세롤 등 자당, 안정제 (osmolytes)를 접는 존재 저해 하 고 따라서 대출해 PA를 방지 하는 특정 타겟된 접는 안정기 개발을 위한 강력한 지원기 공 형성. 이 특정 접근 방지 하 고 원유 집계 기반 분석 실험 pH 단백질 강 수에 리드를 삭제 하는 어디를 대체. 이 후자의 방법을 주 해 방법에 대 한 좋은 있지만 종종 끈다 거짓 긍정적인 결과 특정 화합물 보다는 실제 분자 전환 집계를 억제.
다운스트림 구조 관찰 및 작은 microvolume 샘플 내에서 개별 조립된 부품의 식별 유용할 수 있습니다 또한 잠재적인 리드 화합물을 유효성 검사에. 이 경우 특정 어셈블리 안정화 또는 불안이 대상 결과에 적용할 수 있습니다. 운동/구조/식별 병렬 이렇게 직접 어셈블리의 의심된 리드 복합 이펙터의 유효성을 확인 하는 데 유용 하 고 합리적인 보조 심사 단계 또는 중간 처리량 접근 역할.
Cryo-EM 어셈블리의 다양 한 국가에서 고분자 복합물의 원자 세부 사항 공부 하는 유용한 기술입니다. 곳을 알아내는-EM 샘플 준비, 전에 먼저 준비를 들어 부정적인 얼룩 EM과 합리적으로 순수 동종 단지 확인 하기 중요 하다. 여기에 소개 하는 작업 어셈블리 씨 바이오 센서 표면에 단백질 복합물의 EM 시각화에 대 한이 단지의 출시와 MS를 사용 하 여 이러한 구성 요소 식별 방법을 보여 줍니다. 제어 부품 및 자료의이 특정 방법론 부정적인 얼룩 EM에 전진 하기 전에 증명 해야 하는 필요한 단계에 대 한 동질적인 순차적 샘플 준비를 강화 하는 매우 구체적인 프로토콜을 생성에 유용할 수 있습니다. 곳을 알아내는-EM. 낮은 해상도 3 차원 구조를 얻으려면 복잡 한만 30-50 입자는 필요할 방향 다양성 (여러 개의 다른 전망) 제공 원뿔 기울기 시리즈 (입자 당 70 다른 2D 이미지 조회)을 수행 하.
MS 방법 강화, 관련 감도 발전과 샘플 볼륨 감소 개선 하기 위해 계속 합니다. 나노 흐름과 빠른 의무와 질량 분석기의 개발 함께 초 고압 액체 크로마토그래피 주기, 증가 된 감도 및 분해능. Orbitrap 질량 분석기의 최근 도입, 특히 검색 알고리즘 뿐만 아니라 최신 버전 (orbitrap 퓨전 Lumos 예상된 후속 Orbitrap 퓨전 Lumos 1 M) 크게 용이 하 게이 과정.
현재 방법론 키네틱 조립과 해체 탄 저 균 독 소 구성 요소 레이블 없는 라스 방법론을 사용 하 여 모니터링 하 고 평가 구조와 각각 EM와 MS를 사용 하 여 이러한 구성 요소의 id. 간단한 단일 채널 씨 시스템의 사용 루틴 EM 분석 얼룩 네거티브와 결합 되며 초등 MS 기술을 조립 공정 특성에 적절 한 이상.

식별 하 고 이해 하는 특이성 단백질 복잡 한 어셈블리에 vivo에서 통치 생화학 연구자에 대 한 극단적인 관심입니다. 큰 이종 단백질 어셈블리는 예외 보다는 규범. 이 개념은 비보 어셈블리, gentler 셀 중단 기법을 사용 하 여 선호도 기반 정화 방법에서 제품을 평가 하 고 그들을 시각화 하는 것은 단지 분리의 광 모니터링 지원 높은 해상도 사용 하 여 극저온 전자 현미경 (cryo-EM)입니다. 셀 내에 어셈블리 특이성의 제어를 이해 하려면 연구자 고 해야 합니다 정기적으로 격리, 식별, 궁극적으로 이러한 동적 조립/분해 구조를 특징. 자주 이러한 어셈블리의 구성 요소를 식별 하기 위해 가장 많이 사용된 분자 도구 셀 중단 동안 복잡 한 안정성 유지에 의존 하는 항 체 기반 immunoprecipitation이 필요 합니다. 다양 한 분석 기법을 결합된 단지 표면 플라스몬 공명 (SPR) 등 미세 기반 방법을 사용 하 여 셀 샘플에서 캡처 최근 개발 되었다. SPR 표면에서 제거, 다음이 샘플 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 (TOF MALDI)1,2에 의해 분석 되었다. 쉽게 프로토콜을 사용 하 여이 방법론을 발전 하는 것은 연구원을 시각화 하 고 셀룰러 환경에서 발생 하는 예측된 단지 허용할 것 이다. SPR 마이크로 시스템 이기 때문에, 문제는 종종 집계 형성에서 발생 한다. 이 문제를 우회 샘플 희석을, 차례 차례로, 농도 책임 생물 단지의 무결성을 줄일 수 있습니다 필요 합니다.
레이블 없는 기술에 비교적 최근의 발전 biolayer 간섭계 (BLI) 시스템3의 개발 이다. 이러한 특정 빛 기반 반사율 복제, 또는 최고의 시스템 에뮬레이션, SPR 바인딩 및 비용3,4 채널 단위를 사용 하는 경우에 특히의 일부분에서 운동 결과. 씨 참조 레이어 (제어)와 (실험) biolayer 표면 사이 반영된 빛 간섭 패턴의 변화를 측정합니다. 단계에서 결과 변경 운동 및 양적 판독5로 실시간으로 측정 됩니다. 포함 된 특정 immobilization 화학, 바이오 센서 표면 솔루션, 측정 파장 위상 심한 통해 SPR, 미세 접근에 의해 버퍼 변경 반대 사이 물리적으로 전송 됩니다. 대량 전송 효과 해결책을 교 반 하 여 수 없습니다. SPR, 달리 이러한 시스템은 원유 생물학 견본에서 단지 평가에 매우 유용 합니다. 씨 실험 동안 주로 측정 실제 매개 변수는 질량 또는 단백질 복잡 한 어셈블리 또는 해체에서 유래 하는 바이오 센서 표면에 두께 변화에 따라 달라 집니다.
이러한 섬유 광섬유 바이오 센서는 사용 하기 쉽고 상대적으로 저렴 한. 씨의 새로운 유용한 측면 중 하나는 표면에서 새로 조립된 단백질 복합물의 손쉬운 제거 이다. Prepore (PAprepore) 전환으로 탄 저 균 독 소 보호 항 (PA) 구성 요소의 단백질 구조 재배치를 유도 하는 대규모 pH의 실시간으로 활동을 관찰 하기 위해 우리의 실험실을 허용 하는이 방법의 최근 응용 프로그램의 기 공 (PA기 공) 형태입니다. 바이오 센서 팁에이 전환 전자 현미경 (EM)6을 사용 하 여 확인 했습니다. 단지 바이오 센서 표면에서의 제거 마이크로 시스템을 사용 하 여 칩 표면에서 단지 발표 때 자주 발생 하는 큰 볼륨 희석 효과 방지 합니다.
현재 작업에서 탄 저 균 독 소 단지는 조립 및 분해 바이오 센서 표면에 그리고 발표 microliter 볼륨으로. 결과 복잡 한 구성 요소는 기가 EM 및 질량 분석 (MS)를 사용 하 여 유효성이 검사 됩니다.

<table><tbody><tr><td>(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드)) (EDC)</td><td>써모 사이언티픽</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>(2-(2-피리디닐디티오)에탄아민) (PDEA)</td><td>GE Lifesciences</td><td>BR100058</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 블랙 마이크로튜브</td><td>시그마-알드리치</td><td>Z688304-500EA</td><td></td></tr><tr><td>1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)</td><td>아반티</td><td>850457C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>찬사 PepMap 50 &mu; m x 150mm, C18, 2 & m, 100 &Aring;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>164561</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 빙하</td><td>Fisher</td><td>A38SL-212</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>Fisher</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>아민 반응성 2세대(AR2G) 팁</td><td>Forte Bio</td><td>18-5092</td><td></td></tr><tr><td>중탄산암모늄</td><td>Fisher</td><td>A643-500</td><td></td></tr><tr><td>Anotop 10 주사기 필터, 0.02um</td><td>GE Lifesciences</td><td>6809-1002</td><td></td></tr><tr><td>BLItz 시스템</td><td>Pall Forte Bio</td><td>45-5000</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>Fisher Scientific</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>모세관 형태 생성 유전자 -2</td><td></td><td></td><td>단백질 사내 생산 및 정제</td></tr><tr><td>탄소 코팅 Cu 300 그리드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>CF300-CU-50</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨(DTT)</td><td>GoldBio</td><td>DTT25</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>JT Baker</td><td>0129-01</td><td></td></tr><tr><td>구아니딘 염산염(GuHCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505-100G</td><td></td></tr><tr><td>요오도아세트아미드</td><td>MP-BioMedicals,LLC</td><td>100-351</td><td></td></tr><tr><td>JEM-1400 투과 전자 현미경</td><td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-시스티엔 염산염 수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C121800-5G</td><td></td></tr><tr><td>Lethal Factor N-terminal domain</td><td></td><td></td><td>사내 생산 및 정제된</td></tr><tr><td>단백질 MS 소프트웨어 버전 2.2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>090M14531V</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>Pelco easiGlow 글로우 방전 세척 시스템</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>91000</td><td></td></tr><tr><td>보호 항원 사전 공극</td><td></td><td></td><td>단백질 생산 및 정제</td></tr><tr><td>사내 정성 여과지 서클</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-795C 5</td><td></td></tr><tr><td>시퀀싱 등급 수정 트립신</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Sequest HT 검색 엔진</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨 삼수화물</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP334-500</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>소듐 콜레이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>C1254-100G</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>포름산 우라닐(UF)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>OPTON-30487</td><td></td></tr></tbody></table> (영문)

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Vivo에서 단백질은 종종 어디 바인딩 특이성 및 역학에는 궁극적으로 기능 출력 지시 하는 큰 고분자 복합물의 부분. 이 일 pre-endosomal 탄 저 균 독 소 조립 이며 복잡 한 endosomal로 전환. 첫째, 시스테인 돌연변이 치명적인 요소 (LFN)의 N 맨끝 도메인은 이황화 보호 항 (PA) prepore (Kd 1 nM)에 바인딩할 수 있도록 최적의 방향으로 커플링을 통해 biolayer 간섭계 (BLI) 바이오 센서에 첨부 됩니다. 최적의 지향된 LFN-펜 실바 니 아prepore 복잡 한 다음 성 모 세관 morphogenic 유전자-2 (CMG2) 세포 표면 수용 체에 바인딩 (Kd 170 오후), 대표적인 균 중 endosomal 복잡 한, pH 7.5에 안정적인 결과. 이 조립된 복잡 한 다음 PAprepore 삽입 막 공 상태로 전환 후반 endosome 환경의 산성화 (pH 5.0) 대표를 거쳐야 합니다. 이 PA기 공 주 CMG2 수용 체와기 공 LFN-펜 실바 니 아와 전환 기 공에서 CMG2의 상당한 분리 사이의 약화 바인딩을 발생합니다. 바이오 센서 표면에 LFN thio 첨부 파일 dithiothreitol에 의해 쉽게 반대입니다. 씨 바이오 센서 표면에 감소 해제 LFN-펜 실바 니 아prepore-CMG2 삼항 복잡 하거나 산 LFN-펜 실바 니 아기 공 단지 microliter 볼륨으로 전환. 출시 된 단지 다음 시각 이며 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석을 사용 하 여 식별. 이러한 실험 레이블 없는 라스 방법론을 사용 하 여 특정 단백질 복합물의 키네틱 조립/분해를 모니터링 하 고 구조를 평가 하는 방법을 보여 하 고이 씨의 신원을 전자 현미경 검사 법 및 질량에 의해 단지 조립 분석, 각각, 쉽게 복제 순차적 절차를 사용 하 여.

모니터링 하 고 큰 고분자 복합물의 조립 능력 특이성 및 대형 바이오 어셈블리의 기능을 이해를 향한 중요 한 단계입니다. 여기에 소개 하는 방법의 결과 큰 단백질 복합물으로 쉽게 설명 (&gt; 150 kDa 대량) 모든 활동 및 어셈블리의 진폭을 모니터링 하면서 biolayer 간섭계를 사용 하 여 조립 될 수 있다. 바이오 센서 표면의 독특한 소형 자연 어셈블리 분석이 조립된 단지 작은 microvolumes에 공개 하 여 확장할 수 있습니다. 이 microvolumes는 그들을 사용 하 여 단지의 초기 물리적 구조를 시각화 하 고 MS를 사용 하 여 복잡 한 구성의 id를 확인할 사용할 수 있습니다. 이 전체 프로세스에 대 한 도식 개요는 그림 1에 표시 됩니다.
성공적인 어셈블리 및 바이오 센서 표면에 고분자 복합물의 확인에 대 한 핵심 요소 포함 초기 시드 단백질의 적절 한 방향. 그러면, 단백질 단백질 상호 작용 사이트 액세스할 수, sterically 차단, 그리고 바이오 센서 표면에서 최적의 위치는. 그림 2에서 같이, 복잡 한 탄 저 균 독 소의 올바른 방향 치명적인 요소 (LFN)의 특별히 설계 된 N 맨끝 파편을 사용 하 여 이루어집니다 그래서 LFN-펜 실바 니 아prepore 바인딩 사이트는 항상 위치 바이오 센서 공유 첨부 파일 사이트6,7의 반대 야. 다음에 수용 성 CMG2 바인딩 PA LFN 씨 바이오 센서에 펜 실바 니 아의 바인딩과 함께 복잡 한의 후속 증강 궁극적으로 전 유능한 탄 저 균 독 소를 복잡 한 만듭니다.
씨 sensogram 추적은 탄 저 균 독 소 부품의 특정 추가 인해 진폭 변화에서 실시간 읽기는 바이오 센서에 추가 됩니다. 그림 3 대표 추적 대응 과정에서 그 단계에서 형태를 예측 하는 복잡 한 모델을 보여 줍니다. 첫 번째 상승 LFN 끝에 로드 이다. 냉각 및 기준선, 후 다음 펜 실바 니 아prepore LFN LFN-펜 실바 니 아prepore의 조립된 전 endosomal 복잡 한 결과 수용 성 CMG2 수용 체의 추가 의해 다음 바인딩-CMG2. 늦은 endosome 환경으로 진행, 단지 약화 수용 체 바인딩, prepore 그것의 삽입 확장된 막 기 공 구조를 전환 허용 하는 낮은 pH 펄스 (pH 5.0) 복종 된다. 6 단계는 산성화의 Sensogram 흔적 그림 4에 나와 있습니다. 초기 증가 또는 진폭에 ' 스파이크' 기 공 확장6 CMG2 수용 체 바인딩의 감소 하기 전에 발생 해야 하는 가능성이 높습니다. 더 큰 진폭 감소 감소 바인딩 선호도 때문에 가장 가능성이 상당한 또는 완전 한 수용 체 분리 이다. 이 실험실에서 이전 작품 표시 완전히 확장 PA기 공 에 대 한 CMG2 바인딩을 무시할 수 CMG2 PAprepore 상호 작용6에 비해. 또한, sensogram 운동 추적 관찰 LFN-펜 실바 니 아prepore의 모든 sensograms-LFN-PA pH 드롭기 공 CMG2 전환 끝났습니다 재현할 수 여러 번 실행.
이전에 그리고 후에 산성화, 바이오 센서 연결 단지 쉽게 부정적인 얼룩 EM에 의해 시각화 및 MS (그림 5)에 의해 식별에 대 한 해제 됩니다. EM 결과에서 대표적인 단지는 그림 6에 나와 있습니다. 사전-endosomal 샘플 격자 표시 밀도 LFN-펜 실바 니 아prepore구성 된 그대로 삼항 단지와 일치-CMG2. 후 산성화 복잡 한 격자 표시 펜 실바 니 아 기 공에 전환 하 고 아무 명백한 CMG2 밀도 micelle 포함에 의해 solubilized.
Id는 사전 및 사후 산성화 단지 MS에 의해 확인 되었다. 데이터베이스 어디 펜 실바 니 아, P13423;의 시퀀스 LFN, P15917; 그리고 CMG2, P58335 NCBInr 저장소에서 파생 된 마우스 단백질 데이터베이스의 백그라운드에 포함 됐다. 관심사의 단백질만이 첫 번째 데이터베이스 검색, 삼진 및 이진 단지에 대 한 다음 아미노산 보도에서 가져온: 54% 및 PA에 대 한 22%, 36%와 LF에 대 한 6%, 43 %CMG2, 각각 (CMG2 인식 되지 이진 복잡 한에). 단백질 아미노산 범위를 최대화 하기 위해 두 번째 펩타이드/단백질 식별 관심의 3 개의 단백질만을 포함 하는 단백질 데이터베이스를 사용 하 여 수행 되었다. 사전-endosomal MS 샘플 60.46%, 67.97% 54.15% 범위와 모든 3 개의 독 구성 요소에서 펩 티 드를 위해 포함 된 LFN, PA, 및 CMG2, 각각 (그림 7). 포스트 endosomal 결과 그림 8에 포함 된 LFN 및 PA에서 펩 티 드 (57.41% 67.79% 적용, 각각). 게시물 endosomal 샘플에서 CMG2의 부족은 기 공 형성 동안 관찰된 라스 nm 감소와 일치 하는.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig1.jpg"> 그림 1. 단백질 복합물의 분석에 대 한 도식 개요에 조립 및 양 및 그들을 사용 하 여 씨 바이오 센서에서 고립 된 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig1large.jpg" target="_blank">를이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig2.jpg"> 그림 2. 바이오 센서 활성화: 첫 번째 단계는 오리엔테이션 특정 어셈블리에 씨 바이오 센서에. E126C 치명적인 요소 N 맨끝 도메인 (LFN) thio 연계 제대로 방향의 PAprepore 바인딩 인터페이스 만들기를 통해 연결 된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig3.jpg"> 그림 3. 탄 저 균 독 소 조립과 해체 씨와 모니터링:에서 sensogram 진폭 변화 시간 때문에 탄 저 균의 특정 추가 기능으로 독 소 구성 요소 보여 줍니다 LFN 로드 (단계 4에서 시작 하는 바이오 센서에 추가 표 1)입니다. PAprepore 수용 성 CMG2 수용 체의 뒤 표면에 다음 로드 됩니다. LF-펜 실바 니 아prepore-CMG2 조립된 전 endosomal 복합물에 의하여 이루어져 있다. 늦은 endosome 환경으로 진행, 전체 조립 기능 탄 저 균 독 소 수용 체 바인딩, 전환의 삽입 확장된 막 기 공 구조를 prepore 수 있도록 약화는 낮은 pH 펄스 (pH 5.0) 복종 된다. 기 공에 걸친 막의 노출 확인 이며 solubilized micelles의 추가 의해. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig4.jpg"> 그림 4. CMG2 릴리스 씨 sensogram: 산성화 단계의 흔적 보기 초기 증가 또는 진폭에 ' 스파이크' 가능성이 더 큰 진폭 감소 다음 기 공 형성 및 수용 체 분리, 각각. 수직 점선된 레드 라인 새로운 단계의 시작을 나타냅니다. Sensograms 레드 라인을 점선 굵게에 정렬 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig5.jpg"> 그림 5. 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 EM 및 MS를 사용 하 여 씨 바이오 센서에서 격리: 연결 된 단지 쉽게 부정적인 얼룩 EM에 의해 시각화 및 양 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig5large.jpg" target="_blank">에 의해 식별 여기를 클릭 하십시오를 위한 DTT를 포함 하는 버퍼의 5 µ L로 출시 하는 바이오 센서 이 그림의 확대 이미지 보기.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig6.jpg"> 그림 6. EM와 단백질 복합물의 시각화: Pre-endosomal 샘플 격자 표시 밀도 LFN-펜 실바 니 아prepore구성 된 그대로 삼항 단지와 일치-CMG2. 포스트 endosomal 복잡 한 격자 표시 펜 실바 니 아 기 공에 전환 하 고 아무 명백한 CMG2 밀도 micelle에 의해 solubilized. 모델 예측된 단지 (왼쪽)의 개별 입자 표시와 동일한 축척에 있습니다. (EM 밀도의 크기에 따라) 예측 단백질 colorized 입자는 각 입자 아래와 같습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig7.jpg"> 그림 7. MS와 단백질 복합물의 확인: 사전 endosomal MS 샘플 60.46%, 67.97% 54.15% 범위와 모든 3 개의 독 구성 요소에서 펩 티 드를 위해 포함 된 LFN, PA, 및 CMG2, 각각. 틀린 발견 비율 (루즈벨트) 동등 또는 노란색, 루즈벨트 동등 또는 녹색으로 표시 하는 1% 이상에서 5% 보다에서 펩 티 드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig8.jpg"> 그림 8. MS와 단백질 복합물의 확인: LFN 및 PA에서 게시물 endosomal 샘플에 포함 된 펩 티 드 (57.41% 67.79% 적용, 각각), CMG2 하지 하지만. 루즈벨트 같거나 에서처럼 노란색, 루즈벨트 동등 또는 녹색으로 표시 하는 1% 이상 5% 보다 더 높은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>시간 (s)</td>
			<td>설명</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>30</td>
			<td>초기 기준선</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>420</td>
			<td>정품 인증</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>300</td>
			<td>정품 인증</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>300</td>
			<td>LFN 로드</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>240</td>
			<td>시스테인 끄다</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>120</td>
			<td>초기 계획</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>300</td>
			<td>PAprepore 협회</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>30</td>
			<td>초기 계획</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>300</td>
			<td>CMG2 협회</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>30</td>
			<td>초기 계획</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>300</td>
			<td>산 성 전환</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>30</td>
			<td>초기 계획</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>300</td>
			<td>Micelle 협회</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1. 단일 단계 시간 씨는 복잡 한 어셈블리 탄 저 균 독 소를 실행 하 고. Note 베이스 라인 이전 단계에서 언바운드 단백질을 멀리 세척 하 고는 그리고/또한 새로운 버퍼 기준을 설정 하는 데 사용 됩니다.

여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

이 절차의 전반적인 목표는 생물층 간섭계를 사용하여 다양한 pH 환경에서 단백질 복합체의 동적 조립을 관찰하고 전자 현미경 및 질량 분석법을 사용하여 구성 요소를 확인하는 것입니다. 단백질 복합체의 형성과 조립을 지배하는 특이성을 확인하고 이해하는 것은 생화학 연구자들에게 매우 흥미로운 일입니다. 오늘날 우리가 이야기하고 있는 방법론을 통해 연구자들은 예측된 고분자 복합체를 조립, 시각화 및 검증할 수 있습니다.그런 다음 바이오센서 표면의 복잡한 특성으로 인해 연구원들은 전자 현미경 및 질량 분석 분석을 위해 조립된 복합체를 작은 마이크로볼륨으로 쉽게 방출할 수 있습니다. 이 시연에서는 탄저균 독소 복합체의 pH 유도 구조 재배열의 동역학을 따르고 응집을 피하면서 전자 현미경 및 질량 분석 방법으로 이러한 재배열을 확인했습니다. BLI 바이오센서 표면의 탄저균 독소 어셈블리, 매크로 샘플 방출 및 EM 음성 염색 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 대학원생인 Alexandra Machen과 Pierce O'Neil이 맡을 것입니다.Antonio Artigues 박사는 Orbitrap Fusion Lumos 질량분석기를 사용하여 BLI에서 방출된 미량 시료를 분석하고 식별하는 데 중요한 역할을 합니다. 먼저 아민 반응성 2세대 BLI 바이오센서 팁을 250마이크로리터의 물에 담가 수화하고 10분 동안 배양합니다. Blitz 소프트웨어에서 이 표에 나열된 대로 단계 시간을 프로그래밍합니다.바이오센서 팁을 250마이크로리터의 물에 30초 동안 담그고 바이오센서 두께와 밀도의 초기 기준선을 측정하여 BLI 실행을 시작합니다. 다음으로, 팁을 250ml의 50mmolar NHS 및 200millimolar EDC에 7분 동안 담궈 바이오센서를 활성화합니다. 그런 다음 활성화된 바이오센서를 0.1몰 붕산염 완충액(pH 8.5)에 용해된 50밀리몰 PDEA에 5분 동안 담궈 활성 생체 반응성 표면을 생성합니다.이제 활성화된 생체 반응성 바이오센서를 100 나노몰 E126C LFn을 함유한 용액 250 마이크로리터에 100 밀리몰 아세테이트 pH 5, 100 밀리몰 염화나트륨 완충액에 5분 동안 담그십시오. LFn 팁을 50 밀리몰의 L-시스테인, 1 몰의 염화나트륨, 0.1 몰의 아세트산 나트륨 pH 5에 4분 동안 담그어 남아 있는 유리 티올 반응기를 냉각합니다. 담금질된 LFn 팁을 50 millimolar Tris, 50 millimolar 염화나트륨에 담궈 완충액 기준선을 설정한 후, 팁을 0.5 마이크로몰 보호 항원 prepore, 50 millimolar Tris, 50 millimolar 염화나트륨에 5분 동안 담궈 LFn PA-prepore complex를 생성합니다.PA-prepore가 연결되면 PA-prepore 용액에서 팁을 제거하고 팁을 50mmolar Tris, 50millimolar sodium chloride에 30초 동안 담궈 특이적으로 결합되지 않은 PA-prepore를 씻어냅니다. LFn PA-prepore 복합체를 50 millimolar Tris, 50 millimolar sodium chloride의 0.5 micromolar CMG2에 5분 동안 담급니다. LFn PA-prepore CMG2 복합체를 50 millimolar Tris, 50 millimolar sodium chloride에 30초 동안 담그고 결합되지 않은 CMG2를 씻어내어 pre-endosomal complex를 형성합니다.EM 분석의 경우, 50 millimolar DTT, 50 millimolar Tris 및 50 millimolar sodium chloride의 5 마이크로 리터가 들어있는 PCR 튜브에 팁을 담궈 바이오 센서 팁에서 LFn PA-prepore CMG2 복합체를 방출합니다. 복합체의 펩타이드에 대한 탠덤 MS 분석을 위해 5마이크로리터의 50 밀리몰 DTT, 6몰 케라틴이 없는 구아니딘 염산염 및 25 밀리몰 중탄산염, pH 8이 들어 있는 PCR 튜브에 바이오센서를 담가 바이오센서 팁에서 LFn PA-prepore CMG2 복합체를 방출합니다. pH 전이 후 복합체를 보려면 방금 설명한 것처럼 바이오센서에서 LFn PA-prepore CMG2 복합체를 조립합니다.바이오센서 팁을 10밀리몰 아세테이트 pH 5에 5분 동안 담그면 PA-prepore가 PA-pore로 전환되기 시작합니다. 이 전이는 진폭이 증가한 후 더 큰 진폭 감소로 표시되며, 이는 결합 친화도 감소로 인해 완전한 수용체 해리에 상당한 것으로 가정됩니다. EM 분석의 경우, 이황화물 방출 후 용액 내 응집을 방지하기 위해 1.25 밀리몰 미셀이 포함된 용액에 바이오센서 팁을 5분 동안 담그십시오.음성 염색 전자 현미경을 수행하려면 먼저 0.38mbar의 안정적인 대기압에서 탄소 코팅된 구리 300그리드를 20초 동안 마이너스 15밀리암페어로 방전한 다음 장치를 공기로 배출합니다. 한 쌍의 깨끗한 핀셋 사이에 그리드를 고정합니다. 그런 다음 방출된 복합 시료 4마이크로리터를 그리드에 피펫팅하고 60초 동안 흡착을 허용합니다.여과지 쐐기로 남아 있는 액체를 흡수합니다. 그런 다음 0.75% 포인트 0 2 미크론 여과 포름산 우라닐 5마이크로리터를 피펫으로 그리드를 염색하고 5초 후에 과도한 얼룩을 제거합니다. 덮개를 씌운 상태에서 그리드를 실온에서 건조시키십시오.그런 다음 투과 전자 현미경을 사용하여 샘플을 봅니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 질량 분석을 위한 샘플을 준비한 후 자동 제어 하에 CID와 정규화된 충돌 에너지 35를 사용하여 질량 분석기를 작동하여 1회의 MS 스캔을 지속적으로 수행한 후 3초 동안 가능한 한 많은 직렬 MS-MS 스캔을 수행합니다. BLI 센소그램 트레이스는 탄저균 독소 성분의 특정 추가로 인한 진폭 변화를 실시간으로 판독하는 것입니다.첫 번째 상승은 팁에 LFn 로딩입니다. 담금질 및 기준선 후 PA-prepore는 LFn에 결합한 다음 용해성 CMG2를 추가하여 조립된 pre-endosomal complex를 생성합니다. 그런 다음 복합체는 수용체 결합을 약화시키고 미셀의 첨가에 의해 확인되는 확장된 공극 확인으로 전공이 전환되는 낮은 pH에 노출됩니다.여기에 표시된 것은 바이오센서에서 방출될 때 복합체의 negative stain EM 이미지입니다. 사전 엔도솜 샘플 그리드는 LFn PA-prepore CMG2로 구성된 온전한 삼원 복합체와 일치하는 밀도를 보여주었습니다. 산성화 후 복합 그리드는 PA가 공극으로 전환되고 명백한 CMG2 밀도 없이 미셀 함유에 의해 용해되었음을 보여줍니다.단백질 복합체를 확인한 MS에서 볼 수 있듯이, 엔도솜 이전 MS 샘플에는 LFn, PA 및 CMG2에 대해 각각 60.46, 67.97 및 54.15%의 커버리지를 가진 세 가지 독소 성분 모두의 펩타이드가 포함되어 있습니다. 엔도솜 후 샘플에는 LFn 및 PA의 펩타이드만 포함되어 있습니다. CMG2의 부족은 공극 형성 중 관찰된 BLI 나노미터 감소와 일치합니다. 대형 고분자 복합체의 조립을 모니터링하고 검증하는 능력은 대형 생체 분자 어셈블리의 특이성과 기능을 이해하기 위한 중요한 단계입니다.전자 현미경 시각화를 위해 바이오센서에서 사전 조립된 고분자 복합체를 마이크로볼륨으로 방출하는 능력은 구조 분석에 매우 유용할 것입니다. 바이오센서 어셈블리 복합체 조성에 대한 우리의 분석은 동화된 엔도솜 산성화 전후의 구성 요소를 식별하기 위해 방출 복합체의 0.04 펨토몰만 사용했습니다. 바이오센서 어셈블리 방출 프로토콜은 바이러스 단백질 구조에서 다른 박테리아 독소의 자연적이지만 파악하기 어려운 pH에 의한 엔도솜 전이를 따르도록 조정할 수 있으며, 단백질 응집을 피할 수 있는 추가 보너스가 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

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