동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

이 절차의 전반적인 목표는 생물층 간섭계를 사용하여 다양한 pH 환경에서 단백질 복합체의 동적 조립을 관찰하고 전자 현미경 및 질량 분석법을 사용하여 구성 요소를 확인하는 것입니다. 단백질 복합체의 형성과 조립을 지배하는 특이성을 확인하고 이해하는 것은 생화학 연구자들에게 매우 흥미로운 일입니다. 오늘날 우리가 이야기하고 있는 방법론을 통해 연구자들은 예측된 고분자 복합체를 조립, 시각화 및 검증할 수 있습니다.

그런 다음 바이오센서 표면의 복잡한 특성으로 인해 연구원들은 전자 현미경 및 질량 분석 분석을 위해 조립된 복합체를 작은 마이크로볼륨으로 쉽게 방출할 수 있습니다. 이 시연에서는 탄저균 독소 복합체의 pH 유도 구조 재배열의 동역학을 따르고 응집을 피하면서 전자 현미경 및 질량 분석 방법으로 이러한 재배열을 확인했습니다. BLI 바이오센서 표면의 탄저균 독소 어셈블리, 매크로 샘플 방출 및 EM 음성 염색 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 대학원생인 Alexandra Machen과 Pierce O'Neil이 맡을 것입니다.

Antonio Artigues 박사는 Orbitrap Fusion Lumos 질량분석기를 사용하여 BLI에서 방출된 미량 시료를 분석하고 식별하는 데 중요한 역할을 합니다. 먼저 아민 반응성 2세대 BLI 바이오센서 팁을 250마이크로리터의 물에 담가 수화하고 10분 동안 배양합니다. Blitz 소프트웨어에서 이 표에 나열된 대로 단계 시간을 프로그래밍합니다.

바이오센서 팁을 250마이크로리터의 물에 30초 동안 담그고 바이오센서 두께와 밀도의 초기 기준선을 측정하여 BLI 실행을 시작합니다. 다음으로, 팁을 250ml의 50mmolar NHS 및 200millimolar EDC에 7분 동안 담궈 바이오센서를 활성화합니다. 그런 다음 활성화된 바이오센서를 0.1몰 붕산염 완충액(pH 8.5)에 용해된 50밀리몰 PDEA에 5분 동안 담궈 활성 생체 반응성 표면을 생성합니다.

이제 활성화된 생체 반응성 바이오센서를 100 나노몰 E126C LFn을 함유한 용액 250 마이크로리터에 100 밀리몰 아세테이트 pH 5, 100 밀리몰 염화나트륨 완충액에 5분 동안 담그십시오. LFn 팁을 50 밀리몰의 L-시스테인, 1 몰의 염화나트륨, 0.1 몰의 아세트산 나트륨 pH 5에 4분 동안 담그어 남아 있는 유리 티올 반응기를 냉각합니다. 담금질된 LFn 팁을 50 millimolar Tris, 50 millimolar 염화나트륨에 담궈 완충액 기준선을 설정한 후, 팁을 0.5 마이크로몰 보호 항원 prepore, 50 millimolar Tris, 50 millimolar 염화나트륨에 5분 동안 담궈 LFn PA-prepore complex를 생성합니다.

PA-prepore가 연결되면 PA-prepore 용액에서 팁을 제거하고 팁을 50mmolar Tris, 50millimolar sodium chloride에 30초 동안 담궈 특이적으로 결합되지 않은 PA-prepore를 씻어냅니다. LFn PA-prepore 복합체를 50 millimolar Tris, 50 millimolar sodium chloride의 0.5 micromolar CMG2에 5분 동안 담급니다. LFn PA-prepore CMG2 복합체를 50 millimolar Tris, 50 millimolar sodium chloride에 30초 동안 담그고 결합되지 않은 CMG2를 씻어내어 pre-endosomal complex를 형성합니다.

EM 분석의 경우, 50 millimolar DTT, 50 millimolar Tris 및 50 millimolar sodium chloride의 5 마이크로 리터가 들어있는 PCR 튜브에 팁을 담궈 바이오 센서 팁에서 LFn PA-prepore CMG2 복합체를 방출합니다. 복합체의 펩타이드에 대한 탠덤 MS 분석을 위해 5마이크로리터의 50 밀리몰 DTT, 6몰 케라틴이 없는 구아니딘 염산염 및 25 밀리몰 중탄산염, pH 8이 들어 있는 PCR 튜브에 바이오센서를 담가 바이오센서 팁에서 LFn PA-prepore CMG2 복합체를 방출합니다. pH 전이 후 복합체를 보려면 방금 설명한 것처럼 바이오센서에서 LFn PA-prepore CMG2 복합체를 조립합니다.

바이오센서 팁을 10밀리몰 아세테이트 pH 5에 5분 동안 담그면 PA-prepore가 PA-pore로 전환되기 시작합니다. 이 전이는 진폭이 증가한 후 더 큰 진폭 감소로 표시되며, 이는 결합 친화도 감소로 인해 완전한 수용체 해리에 상당한 것으로 가정됩니다. EM 분석의 경우, 이황화물 방출 후 용액 내 응집을 방지하기 위해 1.25 밀리몰 미셀이 포함된 용액에 바이오센서 팁을 5분 동안 담그십시오.

음성 염색 전자 현미경을 수행하려면 먼저 0.38mbar의 안정적인 대기압에서 탄소 코팅된 구리 300그리드를 20초 동안 마이너스 15밀리암페어로 방전한 다음 장치를 공기로 배출합니다. 한 쌍의 깨끗한 핀셋 사이에 그리드를 고정합니다. 그런 다음 방출된 복합 시료 4마이크로리터를 그리드에 피펫팅하고 60초 동안 흡착을 허용합니다.

여과지 쐐기로 남아 있는 액체를 흡수합니다. 그런 다음 0.75% 포인트 0 2 미크론 여과 포름산 우라닐 5마이크로리터를 피펫으로 그리드를 염색하고 5초 후에 과도한 얼룩을 제거합니다. 덮개를 씌운 상태에서 그리드를 실온에서 건조시키십시오.

그런 다음 투과 전자 현미경을 사용하여 샘플을 봅니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 질량 분석을 위한 샘플을 준비한 후 자동 제어 하에 CID와 정규화된 충돌 에너지 35를 사용하여 질량 분석기를 작동하여 1회의 MS 스캔을 지속적으로 수행한 후 3초 동안 가능한 한 많은 직렬 MS-MS 스캔을 수행합니다. BLI 센소그램 트레이스는 탄저균 독소 성분의 특정 추가로 인한 진폭 변화를 실시간으로 판독

첫 번째 상승은 팁에 LFn 로딩입니다. 담금질 및 기준선 후 PA-prepore는 LFn에 결합한 다음 용해성 CMG2를 추가하여 조립된 pre-endosomal complex를 생성합니다. 그런 다음 복합체는 수용체 결합을 약화시키고 미셀의 첨가에 의해 확인되는 확장된 공극 확인으로 전공이 전환되는 낮은 pH에 노출됩니다.

여기에 표시된 것은 바이오센서에서 방출될 때 복합체의 negative stain EM 이미지입니다. 사전 엔도솜 샘플 그리드는 LFn PA-prepore CMG2로 구성된 온전한 삼원 복합체와 일치하는 밀도를 보여주었습니다. 산성화 후 복합 그리드는 PA가 공극으로 전환되고 명백한 CMG2 밀도 없이 미셀 함유에 의해 용해되었음을 보여줍니다.

단백질 복합체를 확인한 MS에서 볼 수 있듯이, 엔도솜 이전 MS 샘플에는 LFn, PA 및 CMG2에 대해 각각 60.46, 67.97 및 54.15%의 커버리지를 가진 세 가지 독소 성분 모두의 펩타이드가 포함되어 있습니다. 엔도솜 후 샘플에는 LFn 및 PA의 펩타이드만 포함되어 있습니다. CMG2의 부족은 공극 형성 중 관찰된 BLI 나노미터 감소와 일치합니다. 대형 고분자 복합체의 조립을 모니터링하고 검증하는 능력은 대형 생체 분자 어셈블리의 특이성과 기능을 이해하기 위한 중요한 단계입니다.

전자 현미경 시각화를 위해 바이오센서에서 사전 조립된 고분자 복합체를 마이크로볼륨으로 방출하는 능력은 구조 분석에 매우 유용할 것입니다. 바이오센서 어셈블리 복합체 조성에 대한 우리의 분석은 동화된 엔도솜 산성화 전후의 구성 요소를 식별하기 위해 방출 복합체의 0.04 펨토몰만 사용했습니다. 바이오센서 어셈블리 방출 프로토콜은 바이러스 단백질 구조에서 다른 박테리아 독소의 자연적이지만 파악하기 어려운 pH에 의한 엔도솜 전이를 따르도록 조정할 수 있으며, 단백질 응집을 피할 수 있는 추가 보너스가 있습니다.