Name: 인간 독성 Pluripotent 줄기 세포의 신경 독성 테스트를위한 뉴런과 Glia의 혼합 문화로의 분화를위한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 학습하세요 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSCs)를 뉴런과 신경교세포 혼합 배양으로 분화시키는 방법을. 이 체외 모델은 신경독성 평가 및 약물 독성 선별에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 IMR90-hiPSC를 제공 한 Dr. Marc Peschanski (I-Stem, 프랑스, ​​에리)에게 감사 드리고 싶습니다. Dr. Giovanna Lazzari와 Dr. Silvia Colleoni (Avantea srl, Cremona, Italy); Dr. Simone Haupt (독일 본 (Bonn) 대학교); Tiziana Santini 박사 (이탈리아 기술 연구소, 로마), 면역 형광 염색 평가에 대한 조언 제공. RPPA 분석 및 항체 검증에 대한 공헌으로 Benedetta Accordi 박사, Elena Rampazzo 박사 및 Luca Persano 박사 (University of Padua, 이탈리아) 자금 조달 :이 작업은 EU가 지원하는 &quot;SCR &amp; Tox&quot;프로젝트 (보조금 협약 N ° 266753)에 의해 지원되었습니다.

<ol><li>NRC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Toxicity+Testing+in+the+21st+Century%3A+A+Vision+and+a+Strategy%22">Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy</a>. , National Academy Press. Washington, DC. (2007).</li>
<li>Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells--from+mechanisms+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications.</a> J Mol Med (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).</li>
<li>Ho, P. J., Yen, M. L., Yet, S. F., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+applications+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+possibilities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Current applications of human pluripotent stem cells: possibilities and challenges.</a> Cell Transplant. 21 (5), 801-814 (2012).</li>
<li>Krueger, W. H., Swanson, L. C., Tanasijevic, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+artificial+routes+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Natural and artificial routes to pluripotency.</a> Int J Dev Biol. 54 (11-12), 1545-1564 (2010).</li>
<li>Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+pluripotent+stem+cell+cultures+for+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).</li>
<li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+pluripotent+stem+cell+derived+neuronal+model+to+identify+chemically+induced+pathway+perturbations+in+relation+to+neurotoxicity%3A+effects+of+CREB+pathway+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a pluripotent stem cell derived neuronal model to identify chemically induced pathway perturbations in relation to neurotoxicity: effects of CREB pathway inhibition.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 280 (2), 378-388 (2014).</li>
<li>Zagoura, D., Canovas-Jorda, D., Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Bal-Price, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+rotenone-induced+activation+of+the+Nrf2+pathway+in+a+neuronal+model+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the rotenone-induced activation of the Nrf2 pathway in a neuronal model derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Neurochem Int. , (2016).</li>
<li>Standard operating procedure for differentiation of human induced pluripotent stem cells into post-mitotic neurons and glial cells. EURL ECVAM. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570</a> (2016).</li>
<li>Standard operating procedure for expansion of rosette-derived neural stem cells. EURL ECVAM. , Available from:
	 <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571</a> (2016).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Brien, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+concordance+of+drug-induced+human+hepatotoxicity+with+in+vitro+cytotoxicity+measured+in+a+novel+cell-based+model+using+high+content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">High concordance of drug-induced human hepatotoxicity with in vitro cytotoxicity measured in a novel cell-based model using high content screening.</a> Arch Toxicol. 80 (9), 580-604 (2006).</li>
<li>Accordi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+protein+network+activation+mapping+reveals+new+potential+molecular+drug+targets+for+poor+prognosis+pediatric+BCP-ALL%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Functional protein network activation mapping reveals new potential molecular drug targets for poor prognosis pediatric BCP-ALL.</a> PLoS One. 5 (10), e13552(2010).</li>
<li>Vassallo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-laboratory+evaluation+of+microelectrode+array-based+measurements+of+neural+network+activity+for+acute+neurotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">A multi-laboratory evaluation of microelectrode array-based measurements of neural network activity for acute neurotoxicity testing.</a> Neurotoxicology. , (2016).</li>
<li>Shamblott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+germ+cell+derivatives+express+a+broad+range+of+developmentally+distinct+markers+and+proliferate+extensively+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (1), 113-118 (2001).</li>
<li>Bryan, H. K., Olayanju, A., Goldring, C. E., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrf2+cell+defence+pathway%3A+Keap1-dependent+and+-independent+mechanisms+of+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The Nrf2 cell defence pathway: Keap1-dependent and -independent mechanisms of regulation.</a> Biochem Pharmacol. 85 (6), 705-717 (2013).</li>
<li>Tufekci, K. U., Civi Bayin, E., Genc, S., Genc, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrf2%2FARE+Pathway%3A+A+Promising+Target+to+Counteract+Mitochondrial+Dysfunction+in+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">The Nrf2/ARE Pathway: A Promising Target to Counteract Mitochondrial Dysfunction in Parkinson's Disease.</a> Parkinsons Dis. , 314082(2011).</li>
<li>Kovac, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+regulates+ROS+production+by+mitochondria+and+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Nrf2 regulates ROS production by mitochondria and NADPH oxidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1850 (4), 794-801 (2015).</li>
<li>Lee, J. M., Shih, A. Y., Murphy, T. H., Johnson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-E2-related+factor-2+mediates+neuroprotection+against+mitochondrial+complex+I+inhibitors+and+increased+concentrations+of+intracellular+calcium+in+primary+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NF-E2-related factor-2 mediates neuroprotection against mitochondrial complex I inhibitors and increased concentrations of intracellular calcium in primary cortical neurons.</a> J Biol Chem. 278 (39), 37948-37956 (2003).</li>
<li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Nrf2%2Fsmall+Maf+heterodimer+mediates+the+induction+of+phase+II+detoxifying+enzyme+genes+through+antioxidant+response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements.</a> Biochem Biophys Res Commun. 236 (2), 313-322 (1997).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2%2FARE+pathway+activation%2C+HO-1+and+NQO1+induction+by+polychlorinated+biphenyl+quinone+is+associated+with+reactive+oxygen+species+and+PI3K%2FAKT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Interact%22%5BJournal%5D)">Nrf2/ARE pathway activation, HO-1 and NQO1 induction by polychlorinated biphenyl quinone is associated with reactive oxygen species and PI3K/AKT signaling.</a> Chem Biol Interact. , 56-67 (2014).</li>
<li>Cannon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+reproducible+rotenone+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 34 (2), 279-290 (2009).</li>
<li>Sherer, T. B., Kim, J. H., Betarbet, R., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+rotenone+exposure+causes+highly+selective+dopaminergic+degeneration+and+alpha-synuclein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous rotenone exposure causes highly selective dopaminergic degeneration and alpha-synuclein aggregation.</a> Exp Neurol. 179 (1), 9-16 (2003).</li>
<li>Testa, C. M., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotenone+induces+oxidative+stress+and+dopaminergic+neuron+damage+in+organotypic+substantia+nigra+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rotenone induces oxidative stress and dopaminergic neuron damage in organotypic substantia nigra cultures.</a> Brain Res Mol Brain Res. 134 (1), 109-118 (2005).</li>
<li>Tukey and Dunnett methods. GraphPad. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.graphpad.com/guides/prism/7/statistics/index.htm?stat_the_methods_of_tukey_and_dunne.htm">http://www.graphpad.com/guides/prism/7/statistics/index.htm?stat_the_methods_of_tukey_and_dunne.htm</a> (2017).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+induction+of+neural+conversion+in+human+ESCs+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+a+single+chemical+inhibitor+of+transforming+growth+factor+beta+superfamily+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors.</a> Stem Cells. 28 (10), 1741-1750 (2010).</li>
<li>Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Guide+to+Generating+and+Using+hiPSC+Derived+NPCs+for+the+Study+of+Neurological+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases.</a> J Vis Exp. (96), e52495(2015).</li>
<li>Jiang, Y., Zhang, M. J., Hu, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+functional+neurons+and+glia+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Specification of functional neurons and glia from human pluripotent stem cells.</a> Protein Cell. 3 (11), 818-825 (2012).</li>
<li>Parsons, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+human+neuronal+progenitors+and+neurons+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells+with+small+molecule+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction.</a> J Vis Exp. (56), e3273(2011).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li>
<li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+region-specific+neurons+including+forebrain+glutamatergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 5 (7), e11853(2010).</li>
<li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+human+dopaminergic+neurons+derived+from+embryonic+stem+cells%3A+MPP%2B+toxicity+and+GDNF+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of human dopaminergic neurons derived from embryonic stem cells: MPP+ toxicity and GDNF neuroprotection.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2708-2715 (2006).</li>
<li>Paşca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li>
<li>Almeida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+key+pathological+features+of+frontotemporal+dementia+with+C9ORF72+repeat+expansion+in+iPSC-derived+human+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Modeling key pathological features of frontotemporal dementia with C9ORF72 repeat expansion in iPSC-derived human neurons.</a> Acta Neuropathol. 126 (3), 385-399 (2013).</li>
<li>Urbán, N., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+embryonic+and+adult+brain%3A+same+regulators%2C+different+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the embryonic and adult brain: same regulators, different roles.</a> Front Cell Neurosci. 8, 396(2014).</li>
<li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (6), 528-534 (2011).</li>
<li>Krencik, R., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li>
<li>Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrf2-antioxidant+response+element+signaling+pathway+and+its+activation+by+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress.</a> J Biol Chem. 284 (20), 13291-13295 (2009).</li>
<li>Bal-Price, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+adverse+outcome+pathways+relevant+to+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Putative adverse outcome pathways relevant to neurotoxicity.</a> Crit Rev Toxicol. 45 (1), 83-91 (2015).</li>
<li>Cabezas, R., El-Bacha, R. S., Gonzalez, J., Barreto, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functions+in+astrocytes%3A+neuroprotective+implications+from+oxidative+damage+by+rotenone%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functions in astrocytes: neuroprotective implications from oxidative damage by rotenone.</a> Neurosci Res. 74 (2), 80-90 (2012).</li>
<li>Swarnkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+activation%3A+a+key+step+in+rotenone+induced+cytotoxicity+and+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Astrocyte activation: a key step in rotenone induced cytotoxicity and DNA damage.</a> Neurochem Res. 37 (10), 2178-2189 (2012).</li>
<li>Canovas-Jorda, D., Louisse, J., Pistollato, F., Zagoura, D., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+toxicology%3A+the+role+of+stem+cells+in+the+development+of+chronic+toxicities%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Regenerative toxicology: the role of stem cells in the development of chronic toxicities.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10 (1), 39-55 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 연구는 IMR90-hiPSC를 사후 유사 분열 뉴런 및 신경 교세포로 분화시키기위한 견고하고 비교적 빠른 프로토콜을 기술한다. hESCs와 hiPSCs를 기반으로 이전에 발표 된 신경 세포 분화 프로토콜은 일반적으로 높은 비율의 신경 전구체 25 , 26 과 상당한 숫자의 연결 대상 세포 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33을 생산 합니다. 유사하게, 여기에 설명 된 분화 프로토콜은 glia와 nestin + 세포의 이산 비율과 함께 GABA 성, glutamatergic 및 dopaminergic 신경 세포의 이종 배양을 생성하는 데 적합합니다. glutamatergic (~ 35-42 %) 및 GABA (~ 15-20 %) 신경 세포의 존재는이 문화는 forebrain, 피질과 같은 기능을 보유하고 dopaminergic 뉴런 (~ 13-20 %)의 이산 번호의 존재는 또한 midbrain 특이성을 나타낼 수 있습니다. 또한, neestrogen + 세포의 겸손한 비율의 영속성은 neurogenesis의 연구와 NSC에 대한 화학 물질의 가능한 영향을 입증 할 수 있으며, NSC는 주로 해마와 뇌의 뇌실 영역 (SVZ) 모두에 국한되어있다. 추가 면역 세포 화학 및 유전자 발현 분석은 분화 된 세포 유도체의 지역 특이성을보다 잘 정의하는 데 도움이됩니다. 이 문서에서 설명하는 분화 프로토콜의 가장 중요한 두 단계는 다음과 같습니다 : (i) 균질 한 조각으로 hiPSC 콜로니를 절단하는 것 (균일 한 크기의 EB 생성에 중요합니다) 및 (ii) 신경 외배엽 구조 절단 ) NSC 차별화에는 상당한 수작업 기술이 필요합니다.분화시 얻은 뉴런 및 신경 교세포의 비율을 감소시킬 수있는 중배엽 및 내배엽 세포를 수집하는 것을 피하기위한 정밀성을 제공한다. 팽창하는 동안 (미분화 된 식민지 또는 NSCs와 같은) 모든 분화 단계에서 세포의 표현형을 특성화하는 것이 중요합니다. 특히, 신경 세포 / 신경 교세포 유도체의 유전자 및 단백질 발현 프로파일은 뉴런 관련 신호 경로의 상향 조절 및 활성화를 보여야하지만, 다 능성 마커의 발현은 감소되어야한다. EBs와 neuroectodermal 유도체 (rosettes)의 생성은 수동으로 도전하고 가변성이 있습니다. 이러한 이유로 우리는 로제트 유도 NSC의 확장 및 신경 세포 / 신경 교세포로의 추가 분화를위한 프로토콜을 개발했습니다. 이 분화 프로토콜의 가능한 한계는 주로 (i) 상대적으로 낮은 비율의 d(ii) 성숙한 신경 네트워크 기능의 결핍 (파열의 부족으로 나타남)과 관련이있다. 또한, 성상 세포의 특정 subpopulations은 기본 progenitors 또는 NSCs 35 로 기능 할 수 있습니다. 이 분화 된 세포 배양에서 nestin / GFAP 이중 양성 세포가 관찰되지 않았지만 (데이터는 표시되지 않음), 이러한 혼합 배양 물에서 GFAP + 세포는 성상 세포 전구 세포 및 성상 세포 인 것으로 가정합니다. 분화 시간을 연장함으로써 성 장군의 숫자가 증가하고 그 형태가보다 성숙해질 가능성이있다 (Zhang의 36 , 37) . 새로운 독성 시험 패러다임에서는 화학적 역경을 평가할 때 생물학적 경로의 화학적 섭동에 대한 지식이 가장 중요합니다. 따라서 체외 시험 시스템은불리한 결과 경로 (AOP)의 개념에 따라 신호 경로의 교란에 부작용을 연관시킨다. 개념 증명으로 로테 논은 Nrf2 경로의 활성화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.이 경로는 산화성 또는 친 전자 성 스트레스에 대한 세포 방어에 관여합니다. 38 산화 스트레스는 다음과 관련된 다양한 AOP에서 중요하고 공통적 인 핵심 이벤트입니다. 발달 및 성충 신경 독성 39 . 로 테논은 Nrf2 단백질의 핵 전좌와 NQO1과 SRXN1을 포함한 Nrf2 표적 효소의 발현 증가에 의해 증명 될 수있는 Nrf2 경로의 활성화를 이끌어 내야한다. 로테 논은 성상 세포 활성화 40 , 41 을 나타내는 GFAP 단백질 수준의 용량 ​​의존적 인 증가를 유도한다는 것이 밝혀졌습니다. Rotenone은 또한 dopaminergic (TH + ) 세포의 수를 감소 시키며, 이는 previ와 일치한다이 유형의 뉴런은 특히 산화 적 스트레스에 민감하기 때문에, 로테 논 의존성 도파민 성 세포 사멸을 보여주는 시험관 내 및 생체 내 연구 21 , 22 , 23 . 결론적으로이 hiPSC 유래 신경 세포 및 신경교 세포 배양 모델은 Nrf2 경로 활성화를 초래하는 산화 스트레스를 유발하는 화학 물질의 신경 독성 효과를 평가하는 데 유용한 도구입니다. 이 분화 프로토콜은 신경 세포 (GABA 성, 도파민 성 및 글루탐산 작용 성 뉴런) 및 성상 교세포의 혼합 배양 물의 생성을 허용하기 때문에 신경 퇴행성 질환과 같은 생리적 및 병리학 적 조건에서 뉴런과 글 리아 사이의 크로스 토크를 연구하는 데 적합 할 수 있습니다 예 : 파킨슨 병). 또한 상당량의 NSC가 존재하면 신경계에 화학 물질이 미치는 영향을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다화학적으로 유도 된 돌연변이 또는 바이러스 감염의 주요 표적이 될 수있는 것으로 알려져있다.

미국 국립 연구위원회 보고서 1 은 규제 독성 시험이 동물에서 관찰 된 표현형 변화에 의존하는 접근법 에서 인간 세포를 이용한 역학 시험 법에 초점을 맞춘 접근법으로 바뀌는 새로운 독성 시험 패러다임을 구상했습니다. 다 능성 줄기 세포 (PSC) 유도체는 얻은 세포가 인간 조직의 생리 조건과 더 유사 할 수 있고 화학 유발 유해 영향을 연구하기 위해보다 관련성이 높은 도구를 제공하기 때문에 암 세포 모델의 대안이 될 수 있습니다. 독성 시험에 가장 유망한 두 가지 유형의 PSC 배양은 인간 배아 줄기 세포 (human embryonic stem cell, hESCs)와 인간 유도 다 능성 줄기 세포 (human induced pluripotent stem cell, hiPSCs)로 현재 기초 연구 및 재생 의학 분야에서 널리 사용되고있다. 이 전문 지식은 이제 새로운 종류의 toxicolo 개발에 활용 될 수 있습니다.생체 내 부작용의 발병과 관련된 섭동 한 생리 학적 경로를 확인하기위한 생체 외 시험. 그러나 hESC에 기초한 규제 안전성 평가 시험 방법은 가능한 모든 윤리적 문제와 배아 유래 세포의 사용을 규제하는 다양한 국가 입법 정책으로 인해 모든 EU 회원국과 전 세계 국가에서 받아 들여지지 않을 것입니다. hiPSCs는 hESCs 4 , 5 와 유사한 특성을 공유하며, 안전성 평가뿐만 아니라 치료 표적 을 확인 하기위한 시험관 내 방법에 대한 큰 가능성을 가지고 있습니다. 또한, hiPSC 기술은 제한된 기증자 집단의 제약과 배아 유래 세포와 관련된 윤리적 우려를 완화합니다. hiPSC에 대한 주요 도전 과제는 이러한 세포가 독성 학적으로 관련된 세포 유도체의 상당 부분을 재현 가능하게 만들 수 있다는 데모이다.인간의 조직에 전형적으로 나타나는 특성과 반응을 보입니다. 선택된 마커의 미리 정의 된 수준은 일반적으로 차별화 프로세스 이후 세포 집단을 특성화하고 차별화 프로세스의 안정성에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용됩니다. 이전의 연구는 hiPSC가 신경 및 신경 교세포의 혼합 배양 물을 생성하고 미토콘드리아 호흡 복합체 I의 억제제 인 로테 논이 항산화 제 방어 기전의 핵심 조절 인자 인 Nrf2 경로의 활성화에 미치는 영향을 평가했다. 많은 세포 유형 6 , 7 . 이 작품은 연결 / glial 차별화시 활성화 신호 경로 (유전자 및 단백질 수준)에 대한 자세한 내용을 제공, 혼합 신경 및 glial 문화로 hiPSCs의 차별을 위해 사용되는 프로토콜을 설명합니다. 또한,이 작업을 통해hiPSC에서 유래 한 신경 세포 및 신경 교세포 모델은 로테 논으로 급성 (24 시간) 치료에 의해 유발 된 Nrf2 신호 전달 활성화를 평가하는 데 사용할 수있어 산화 스트레스 유도 평가가 가능합니다. IMR90 섬유 아세포는 pMIG 벡터를 사용하여 2 개의 전사 인자 (Oct4 및 Sox2)의 바이러스 성 전달에 의해 I-Stem (프랑스)에서 hiPSCs로 재 프로그램되었다. 유사한 hiPSC 모델도 적용 할 수 있습니다. 아래에 설명 된 프로토콜은 신경 줄기 세포 (NSCs)로 hiPSCs의 차별화의 모든 단계를 요약하고 사후 mitotic 뉴런과 glial 세포의 혼합 문화 (단계 1과 2, 또한 자세한 내용은 EURL ECVAM DBALM 웹 사이트를 참조하십시오 프로토콜) 8 . NSC의 혼합 뉴런 및 신경 교세포로의 분리, 확장, 저온 보존 및 추가 분화에 대한 추가 프로토콜은 단계 3 및 4에서 상세히 설명된다 (EURL ECVAM DBALM이 프로토콜에 대한 자세한 설명은 bsite를 참조 하십시오.) 9 . 5 단계는 헌신과 분화의 여러 단계 동안 세포의 표현형 정체성을 평가하기 위해 수행 할 수있는 분석을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>완전한 hiPSC 매체 : </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 기초 배지</td><td>줄기 세포 기술</td><td>05851</td> <td>(1.2.6 단계). 완전한 mTeSR1은 2 - 8°C에서 보관할 때 안정적입니다. C를 최대 2주 동안 사용할 수 있습니다. 5x 보충제는 작동하는 부분 표본에 분배하여 -20°C에서 보관할 수 있습니다. 냉동 부분 표본은 3개월 이내에 사용하십시오.</td></tr><tr><td>mTeSR1 5x 보충제</td><td>줄기세포 기술</td><td>05852</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel hESC 인증 매트릭스</td><td>코닝</td><td>354277</td><td>1:100 (1.1단계). 얼음에 Matrigel을 해동하고 200 &mu를 준비하십시오. L 분취량은 -80 &deg;C에 저장합니다. 코팅의 경우 200 &mu를 희석하십시오. L DMEM/F12 배지 20mL의 분취량.</td></tr><tr><td>CryoStem 냉동 매체</td><td>스템젠</td>트 <td>01-0013-50</td><td>동결 ~ 100 조각/250 &mu; L/바이알 (단계 1.2.1)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>hiPSC EB medium:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10829-018</td><td>(Step 2.1.7)</td></tr><tr><td>녹아웃 세럼 대체품 ( KOSR)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10828-028</td><td>20% 최종 농도(단계 2.1.7)</td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11140-035</td><td>(단계 2.1.7)</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140-122</td><td>50 U/mL 최종 농도(단계 2.1.7)</td></tr><tr><td>L-글루타민 200mM 용액</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25030-081</td><td>2mM 최종 농도(단계 2.1.7)</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>31350-010</td><td>50 &마이크로; M 최종 농도 (단계 2.1.7)</td></tr> <tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Complete neuroepithelial induction medium (NRI) : </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Thermo-Fisher</td><td>3133-038</td> <td>(Step 2.3.1)</td></tr><tr><td>비 필수 아미노산</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11140-035</td> <td>(단계 2.3.1)</td></tr> <tr><td>N2 보충</td><td>Thermo-Fisher</td><td>17502-048</td> <td>(단계 2.3.1)</td></tr> <tr><td>페니실린 / 스트렙토 마이신</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140-122</td><td>50 U / mL 최종 농도 (단계 2.3.1)</td></tr> <tr><td>헤파린 등급 I-A, &ge; 180 USP 단위/mg</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3149-100KU</td><td>2 &마이크로; g/mL 최종 농도(단계 2.3.1)</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Thermo-Fisher</td><td>13256-029</td><td>사용 전 20ng/mL 최종 농도 추가(단계 2.3.1)</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>1:100(단계 2.2). 얼음에 Matrigel을 해동하고 200 &mu를 준비하십시오. L 분취량은 -80 &deg;C에 저장합니다. 코팅의 경우 200 &mu를 희석하십시오. L 20mL의 차가운 DMEM/F12 배지에 분취액.</td></tr><tr><td>라미닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>L2020</td><td>1:100 (2.2단계). PBS 1x에 희석합니다.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Complete Neuronal Differentiation Medium (ND):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Thermo-Fisher</td><td>21103049</td><td>(Step 2.4.11)</td></tr><tr><td>B-27 Supplements (50x)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>17504044</td><td>(단계 2.4.11)</td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Thermo-Fisher</td><td>17502-048</td><td>(단계 2.4.11)</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140-122</td><td>50 U/mL 최종 농도(단계 2.4.11)</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td>PHC7045 1ng/mL 최종 농도. 사용 전에 첨가합니다. (단계 2.4.11)</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Thermo-Fisher</td><td>PHC7074</td><td>2.5ng/mL 최종 농도. 사용 전에 첨가합니다. (단계 2.4.11)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Neural induction Medium (NI):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo-Fisher</td><td>3133-038</td><td>(Step 3.3)</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11140-035</td> <td>(단계 3.3)</td></tr> <tr><td>N2 보충</td>교재 <td>Thermo-Fisher</td><td>17502-048</td> <td>(단계 3.3)</td></tr> <tr><td>페니실린 / 스트렙토 마이신</td><td>열 피셔</td><td>15140-122</td><td>50 U / mL 최종 농도 (단계 3.3)</td></tr> <tr><td>헤파린 학년 I-A, &ge; 180 USP 단위/mg</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3149-100KU</td><td>2 &마이크로; g/mL 최종 농도(3.3단계)</td></tr><tr><td>B-27 보충제(50x), 비타민 A 뺀</td><td>값 Thermo-Fisher</td><td>12587010</td><td>(3.3단계)</td></tr><tr><td>L-글루타민 200mM 용액</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25030-081</td><td>2mM 최종 농도(3.3단계)</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Thermo-Fisher</td><td>13256-029</td><td>10ng/mL 최종 농도. 사용 전 첨가(Step 3.3)</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Thermo-Fisher</td><td>PHG6045</td><td>10ng/mL 최종 농도. 사용 전 첨가(Step 3.3)</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Thermo-Fisher</td><td>PHC7074</td><td>2.5ng/mL 최종 농도. 사용 전 추가(3.3단계)</td></tr><tr><td>정의된 트립신 억제제(DTI)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R007-100</td><td>37°C에서 예열. 트립신-EDTA에 동일한 양의 DTI를 추가합니다(3.10단계)</td></tr><tr><td>트립신-EDTA(0.5%), 페놀 레드</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15400054</td><td>없음 1:10. PBS 1x(칼슘 및 마그네슘 제외)에 Trypsin-EDTA를 희석하고 용액을 37°C에서 예열합니다. C (3.8 단계)</td></tr> <tr><td>CryoStor 세포 동결 보존 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2874-100ML</td> <td>(4.2 단계)</td></tr> <tr><td>Trypan Blue (0.4 %)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td>여러 제조 업체 / 공급 업체</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>유전자 발현 분석을 위한 TaqMan 프로브셋 및 시약:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous-Micro kit</td><td>Thermo-Fisher</td><td>AM1931</td><td>(Step 5.1.6)</td></tr><tr><td>고용량 cDNA 역전사 키트</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00909233_m1</td><td></td></tr><tr><td>MAP2</td>, <td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00258900_m1</td><td></td></tr>, <tr><td>NQO1</td>, <td>Thermo-Fisher</td><td>Hs02512143_s1</td><td></td></tr><tr><td>SRXN1</td>, <td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00607800_m1</td><td></td></tr><tr><td>HMOX1</td>, <td>Thermo-Fisher</td><td>Hs01110250_m1</td><td></td></tr><tr><td>GSR</td><td>, Thermo-Fisher</td><td>Hs00167317_m1</td><td></td></tr><tr><td>PAX6</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs01088112_m1</td><td></td></tr><tr><td>NES</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00707120_s1</td><td></td></tr><tr><td>GRIA1</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00181348_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAP43</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00967138_m1</td><td></td></tr><tr><td>GABRA3</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00968132_m1</td><td></td></tr><tr><td>GABRA1</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00168058_m1</td><td></td></tr><tr><td>NR4A2</td>, <td>써모-피셔</td><td>Hs00428691_m1</td><td></td></tr>, <tr><td>TH</td>, <td>써모-피셔</td><td>Hs00165941_m1</td><td></td></tr>, <tr><td>GAPDH</td>, <td>써모-피셔</td><td>Hs02758991_g1</td><td></td></tr>, <tr><td>ACTB</td>, <td>써모-피셔</td><td>Hs99999903_m1</td><td></td></tr>, <tr><td>MAPT</td><td>써모-피셔</td><td>Hs00902194_m1</td><td></td></tr><tr><td>SYP</td><td>써모-피셔</td><td>Hs00300531_m1</td><td></td></tr><tr><td>NANOG</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs04260366_g1</td><td></td></tr><tr><td>POU5F1 (OCT4)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs04195369_s1</td><td></td></tr><tr><td>SOX1</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs01057642_s1</td><td></td></tr><tr><td>AFP</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00173490_m1</td><td></td></tr><tr><td>KRT18</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs01941416_g1</td><td></td></tr><tr><td>NPPA</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00383230_g1</td><td></td></tr><tr><td>T</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00610080_m1</td><td></td></tr><tr><td>NCAM1</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00941821_m1</td><td></td></tr><tr><td>NR4A1</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00374226_m1</td><td></td></tr><tr><td>PHOX2A</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00605931_mH</td><td></td></tr><tr><td>PHOX2B</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00243679_m1</td><td></td></tr><tr><td>NARG2</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00973298_g1</td><td></td></tr><tr><td>SLC18A3</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00268179_s1</td><td></td></tr><tr><td>SLC5A7</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00222367_m1</td><td></td></tr><tr><td>ISL1</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00158126_m1</td><td></td></tr><tr><td>LHX3</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs01033412_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Human Protein Kinase Array</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4418721</td><td></td></tr><tr><td>Name </td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>immunostaining를 위한 항체 및 시약:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-III-tubulin (Tuj1)</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>1:500 (단계 5.2.5). 다른 항체도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>시그마 알드리치</td><td>M4403</td><td>1:500</td></tr><tr><td>NF200</td><td>시그마 알드리치</td><td>N4142</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Acris 항체 GmbH</td><td>AP02002SU-N</td><td>1:500</td></tr><tr><td>네스틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>N5413</td><td>1:200</td></tr><tr><td>시냅토피신 (SYN)</td><td>Abcam</td><td>AB14692</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Tau</td><td>Thermo-Fisher</td><td>MA5-12808</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Nrf2</td><td>Abcam</td><td>AB62352</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Keap1</td><td>Abcam</td><td>AB66620</td><td>1:200</td></tr><tr><td>sulfiredoxin1 (SRXN1)</td><td>Abcam</td><td>AB92298</td><td>1:200</td></tr><tr><td>NAD(P)H 퀴논 산화환원효소 1 (NQO1)</td><td>Abcam</td><td>AB2346</td><td>1:200</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>Millipore</td><td>MAB4401</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SSEA3</td><td>Millipore</td><td>MAB4303</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Tra1-60</td><td>밀리포어</td><td>MAB4360</td><td>1:250</td></tr><tr><td>티로신 하이드록실라제(TH)</td><td>밀리포어</td><td>AB152</td><td>1:200</td></tr><tr><td>감마-아미노부티르산(GABA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>A0310</td><td>1:100</td></tr><tr><td>소포형 글루타메이트 수송체 1(VGlut1)</td><td>Abcam</td><td>AB72311</td><td>1:500</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6148-500G</td><td>4%(4% 포름알데히드도 사용할 수 있습니다)</td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>BSA 35%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7979-50ML</td><td>3.5%</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Cross Adsosbed Secondary Antibody, DyLight 594 conjugate</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SA5-10040</td><td>1:500. (단계 5.2.7) 다른 형광색소 접합 2차 항체도 사용할 수 있습니다. 이 경우 최종 사용자가 적절한 희석을 테스트해야 합니다.</td></tr><tr><td>당나귀 anti-Mouse IgG (H+L) Cross 흡착된 2차 항체, DyLight 488 conjugate</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SA5-10166</td><td>1:500</td></tr><tr><td>당나귀 anti-Goat IgG (H+L) Cross 흡착된 2차 항체, DyLight 488 conjugate</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SA5-10086</td><td>1:500</td></tr><tr><td>DAPI 용액 (1 mg/mL)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>62248</td><td>1:1000 (단계 5.2.7)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>역상 단백질 어레이 (RPPA)에 대한 항체 : </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4E-BP1 (S65)</td> <td>Abcam</td><td>AB81297</td><td>1 : 250 (5.2.8 단계 후 참고)</td></tr><tr><td>Akt (T308)</td> <td>세포 신호</td><td>9275</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Akt (S473)</td><td>Cell Signaling</td><td>9271</td><td>1:100</td></tr><tr><td>AMPKalpha (T172)</td><td>Cell Signaling</td><td>2531</td><td>1:100</td></tr><tr><td>AMPKbeta1 (S108)</td><td>Cell Signaling</td><td>4181</td><td>1:100</td></tr><tr><td>ATF-2 (T71)</td><td>Cell Signaling</td><td>9221</td><td>1:100</td></tr><tr><td>c-Jun (S63)</td><td>Cell Signaling</td><td>9261</td><td>1:200</td></tr><tr><td>c-Jun (S73)</td><td>Cell Signaling</td><td>9164</td><td>1:200</td></tr><tr><td>c-Kit (Y719)</td><td>셀 신호</td><td>3391</td><td>1:250</td></tr><tr><td>CREB (S133)</td><td>셀 신호</td><td>9191</td><td>1:100</td></tr><tr><td>EGFR (Y1068)</td><td>셀 신호</td><td>2234</td><td>1:50</td></tr><tr><td>ErbB2/HER2 (Y1248)</td><td>셀 신호</td><td>2247</td><td>1:100</td></tr><tr><td>ERK 1/2, p44/42 (T202/Y204)</td><td>셀 신호</td><td>9101</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>GSK-3alpha (S21)</td><td>셀 신호</td><td>9337</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Jak1 (Y1022/1023)</td><td>셀 신호</td><td>3331</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Lck (Y505)</td><td>셀 신호</td><td>2751</td><td>1:500</td></tr><tr><td>LKB1 (S428)</td><td>셀 신호</td><td>3051</td><td>1:100</td></tr><tr><td>mTOR (S2448)</td><td>셀 신호</td><td>5536</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NFkB p65 (S536)</td><td>셀 신호</td><td>3031</td><td>1:50</td></tr><tr><td>p70 S6 Kinase (T389)</td><td>Cell Signaling</td><td>9205</td><td>1:200</td></tr><tr><td>PDK1 (S241)</td><td>Cell Signaling</td><td>3061</td><td>1:100</td></tr><tr><td>PKA C (T197)</td><td>Cell Signaling</td><td>4781</td><td>1:250</td></tr><tr><td>PRAS40 (T246)</td><td>BioSource</td><td>44-1100</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>PTEN (S380)</td><td>Cell Signaling</td><td>9551</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Smad1 (S463/465), Smad5 (S463/465), Smad8 (S426/428)</td><td>세포 신호</td><td>9511</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Src (Y527)</td><td>Cell Signaling</td><td>2105</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Src Family (Y416)</td><td>Cell Signaling</td><td>2101</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Stat1 (Y701)</td><td>Cell Signaling</td><td>9171</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Stat3 (S727)</td><td>Cell Signaling</td><td>9134</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Zap-70 (Y319)</td><td>Enogene</td><td>E011159</td><td>1:100</td></tr><tr><td>&베타; Catenin (S33/37/T41)</td><td>Cell Signaling</td><td>9561</td><td>1:250</td></tr><tr><td>CREB</td><td>Upstate Biotechnologies</td><td>06-863</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Fos B</td><td>세포 신호</td><td>2251</td><td>1:200</td></tr><tr><td>GRB2</td><td>Cell Signaling</td><td>3972</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>HSP70</td><td>Stressgen</td><td>SPA-810</td><td>1:100</td></tr><tr><td>c-Jun</td><td>Cell Signaling</td><td>9165</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Kip1/p27</td><td>BD</td><td>610241</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Lck</td><td>셀 신호</td><td>2984</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Mcl-1</td><td>셀 신호</td><td>4572</td><td>1:80</td></tr><tr><td>Musashi</td><td>셀 신호</td><td>2154</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NOTCH1</td><td>셀 신호</td><td>3439</td><td>1:100</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>셀 신호</td><td>9552</td><td>1:500</td></tr><tr><td>SGK1</td><td>Abnova</td><td>PAB4590</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Zap-70</td><td>세포 신호</td><td>2705</td><td>1:250</td></tr><tr><td>&beta;-Catenin</td><td>Abcam</td><td>AB32572</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>dll4</td><td>Abcam</td><td>AB7280</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Shh</td><td>Abcam</td><td>AB53281</td><td>1:250</td></tr><tr><td>HIF-1&alpha;</td><td>BD</td><td>610958</td><td>1:50</td></tr><tr><td>NUMB PAN-ISO</td><td>북부 생명 공학</td><td>07-207</td><td>1:400</td></tr><tr><td>NUMB-L</td><td>Chemicon</td><td>AB15145</td><td>1:750</td></tr><tr><td>Cyclin B</td><td>BD</td><td>610220</td><td>1:75</td></tr><tr><td>c-Myc</td><td>Calbiochem</td><td>OP-10</td><td>1:100</td></tr><tr><td>BCIP/NBT 키트</td><td>Thermo-Fisher</td><td>002209</td><td>(5.2.8 단계 이후 참고). 알칼리성 포스파타제 활성을 측정하는 데 사용되는 키트, 유사한 키트를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>유세포분석을 위한 항체:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSEA1 항체, Pacific Blue conjugate</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td>MHCD1528 1:100 (5.2.8단계 이후 참고)</td></tr><tr><td>SSEA4 항체 (MC813-70), Alexa Fluor 647</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SSEA421</td><td>1:100</td></tr><tr><td>이름</td><td>회사</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>특정 기기, 도구 및 소프트웨어 :</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Thermo-Fisher</td><td>C10227</td><td>Neubauer 챔버 또는 기타 적합한 유리 혈구계를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>MEA1060-Inv-BC</td><td>멀티채널 시스템</td><td>MEA1060-Inv-BC</td><td>(5.3단계)</td></tr><tr><td>MEA1060-BC 제어 소프트웨어</td><td>멀티채널 시스템</td><td>MEA1060-BC(</td><td>5.3단계)</td></tr><tr><td>NeuroExplorer</td><td>멀티채널 시스템</td><td>NeuroExplorer(NE)(</td><td>5.3단계) MEA 데이터 후처리용</td></tr><tr><td>다전극 어레이(MEA)</td><td>다채널 시스템</td><td>60MEA100/10iR-Ti-gr</td><td>(5.3단계) Single-well MEA chip</td></tr><tr><td>ArrayScan XTI High Content Platform</td><td>Thermo-Fisher</td><td>ASN00002P</td><td>(Step 5.2.8) 특정 ArrayScan 알고리즘(예: Cytotoxicity V.4 및 NucTrans V.4 bioapplications)을 사용하여 평균 형광을 정량화할 수 있습니다. 최소 20장의 사진을 찍고 조건당 7-8번의 내부 복제를 하는 것이 좋습니다</td></tr><tr><td>7900HT Fast Real-Time PCR System</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4351405</td><td>(5.1.6단계)</td></tr><tr><td>BD 초미세 바늘 인슐린 주사기(30G 바늘 포함)</td><td>BD</td><td>328280</td><td>(1.3.1, 2.1.2 및 2.4.1단계)</td></tr><tr><td>StemPro EZPassage 일회용 줄기세포 계23181010</td><td></td><td></td> <td>도구이 콜로니 절단 도구는 30G 바늘 1mL 주사기 사용의 대안으로 사용할 수 있습니다 (1.3.1 단계),</td></tr> <tr><td>초저 부착 페트리 접시 (60mm),</td> <td>코닝</td><td>10010582</td> <td>(2.1.8 단계) 다른 브랜드도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Mr. Frosty 냉동 용기</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 독성 pluripotent 줄기 세포의 신경 독성 테스트를위한 뉴런과 glia의 혼합 문화로의 분화를위한 프로토콜

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

인간의 다 능성 줄기 세포는 인체 시험관 독성 시험 에 적용 할 수있는 다양한 세포 유형으로 분화 할 수 있습니다. 인간의 배아 줄기 세포 (hESCs)의 사용과 관련된 윤리적 및 입법상의 문제를 피하기 위해 인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)를 생산하기위한 체세포의 재 프로그램화가 가장 큰 장점이다. HiPSCs는 확대 될 수 있으며 독성 테스트를위한 테스트 시스템으로, 특히 신경 독성과 관련된 다양한 경로의 평가를 위해 여러 유형의 신경 및 신경 교세포로 효율적으로 분화 될 수 있습니다. 이 작품은 연결 및 glial 세포의 혼합 문화에 hiPSCs의 차별을위한 프로토콜을 설명합니다. 신경 세포 분화 (neuronal differentiation)에 의해 조절 및 / 또는 활성화되는 신호 전달 경로가 정의된다. 이 정보는 새로운 독성 테스트 패러다임에 대한 세포 모델의 적용에 중요합니다.이 패러다임에서는 화학 물질이 자신의 능력에 따라 평가됩니다rturb 생물학적 경로. 개념 증명으로 미토콘드리아 호흡 복합체 I의 억제제 인 로테 논 (rotenone)을 사용하여 산화 스트레스에 대한 항산화 - 반응 요소 - (ARE) - 유도 세포 방어 기작의 핵심 조절자인 Nrf2 신호 전달 경로의 활성화를 평가했다 .

인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 약물 및 화학 스크리닝 및 신경 독성을 포함한 독성 시험을위한 새로운 시험 관내 모델 개발을위한 강력한 도구로 간주됩니다. 여기, hiPSCs의 뉴런과 glia 로의 차별화에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

인간 독성 Pluripotent 줄기 세포의 신경 독성 테스트를위한 뉴런과 Glia의 혼합 문화로의 분화를위한 프로토콜

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

이 절차의 전반적인 목표는 인간 유도 만능 줄기세포 군락에서 유래한 신경 줄기세포를 신경세포와 글리아세포의 혼합 배양물로 분화시키는 것입니다. 이 모델은 약물 및 화학 물질의 독성 스크리닝에 적합합니다. 이 인 비트로(in vitro) 모델은 신경 및 글리아 분화 과정 중에 활성화되는 신호 전달 경로에 대해 화학 물질로 유도된 섭동을 평가하는 데 적용될 수 있습니다.이 시스템의 주요 장점은 기존에 사용되던 암세포나 동물 일차 배양의 대안이 되는 유도만능줄기세포 유래 인간 모델을 사용하여, 신경세포와 글리아세포가 혼합된 집단에서 신경독성을 연구할 수 있다는 점입니다. 본 절차는 저희 연구실의 박사후 연구원인 Francesca Pistollato와 대학원생인 Carolina Nunes가 시연하겠습니다. 먼저 hiPSC 콜로니를 계대 배양하는 것부터 시작하십시오.층류 작업대 내에서 4배 배율의 실체 현미경을 사용하여, 30게이지 바늘이 장착된 1mL 주사기를 이용합니다. 줄기세포 콜로니를 약 200µm x 200µm 크기의 정사각형으로 절단합니다. 콜로니를 절단할 때는 동일한 크기의 조각을 얻기 위해 숙련된 수작업 기술이 필요합니다.시판되는 절단 도구를 사용하면 도움이 될 수 있습니다. 그런 다음 200 µL 파이펫을 사용하여 조각 아래의 배지를 부드럽게 파이펫팅하여 조각들을 들어 올림으로써 플레이트 표면에서 콜로니 조각들을 분리합니다. 약 100개의 콜로니 조각을 4 mL의 완전 hiPSC 배지가 채워진, 적절한 matrix DMEM F12 코팅된 60 mm 플레이트로 옮깁니다.그다음 새 배양 접시를 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다. 매일 전체 배지 교체를 수행하고, 위상차 현미경의 4배 및 10배 배율로 콜로니의 형태를 관찰합니다. 분화 과정의 0일차에 60mm 페트리 접시당 3mL의 배지를 추가하여 hiPSC 배지를 갱신합니다.그런 다음 이전과 동일하게 200 micron 조각들을 절단하여 분리합니다. 분리된 조각들과 배지를 15 milliliter 튜브에 피펫으로 옮깁니다. 배양 접시를 2 milliliter의 완전한 hiPSC 배지로 헹구어 모든 조각을 회수합니다.그 다음 112 $\times$g에서 1분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 흡입하여 제거하고, 파편들을 5 mL의 완전한 hiPSC EB 배지에 부드럽게 재부유시킵니다. 전체 부피를 60 mm 초저부착 조직 배양 접시에 분주합니다.디쉬를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 도립 현미경으로 세포를 확인합니다. 여기서 보는 것처럼, 1일 차 배아체는 둥근 형태를 띠며 서로 뚜렷하게 구분되어야 합니다.그 다음, 디쉬에서 배아체와 배지를 피펫으로 흡입하여 15 milliliter 튜브로 옮깁니다. 배아체를 112 times G에서 1분 동안 원심 분리합니다. 2일 차에는 미리 준비된 60 millimeter 디쉬에서 표준 매트릭스 코팅 용액을 흡입하여 제거하고, 5 milliliter의 완전 신경상피 유도 배지(NRI)를 디쉬에 추가합니다.4배율의 실체 현미경 하에서 200 µL 피펫을 사용하여, 부유하는 배아체(embryoid bodies) 약 50개를 수집하여 코팅된 디쉬 하나로 옮깁니다. 그 후 디쉬를 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 분화 과정의 3일째가 되는 다음 날, 10배율 현미경으로 디쉬를 관찰하여 배아체가 모두 부착되었는지 확인합니다.그 다음, 완전한 NRI 배지로 배지를 전체적으로 조심스럽게 교체합니다. 로제트 형태의 신경상피 응집체가 보일 때까지 7일차까지 이틀마다 NRI 배지를 교체합니다. 7일차에, 배지로 희석한 표준 매트릭스 100 µL를 각 웰에 피펫팅하여 96-웰 플레이트를 코팅합니다.8일 차에, 멸균 상태에서 10배율 입체 현미경 하에 로제트 모양의 응집체를 조각으로 자릅니다. 이때 니들로 건드리면 로제트가 디쉬에서 쉽게 떨어지는 경향이 있으므로, 이 경우 니들 팁을 사용하여 떨어진 로제트를 부분적으로 분해하십시오.로제트가 부분적으로 부착되어 있는 경우, 200 µL 피펫을 사용하여 로제트 조각들을 완전히 분리하십시오. 로제트 절단 시에는 신경외배엽 유래 세포(neurexidermal derivatives)를 절단하지 않도록 숙련된 손기술과 정밀함이 필요합니다. 그다음, 로제트 조각들과 배지를 15 mL 원추형 튜브에 수집하십시오.모든 파편을 회수하기 위해 2 mL의 NRI 배지로 디쉬를 헹굽니다. 그런 다음 로제트 파편을 112 ×g에서 1~2분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거한 후, 칼슘과 마그네슘이 없는 미리 데워진 1X DPBS 1 mL에 펠릿을 부드럽게 재부유시킵니다.로제트 조각들을 조심스럽게 파이펫팅하여 부분적으로 해리시킵니다. 그런 다음 4 mL의 complete NRI medium을 첨가하고, trypan blue와 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 다음으로 96-well plate에서 표준 매트릭스 코팅 용액을 흡입하여 제거하고, NRI medium을 사용하여 cm²당 약 15,000개의 세포 밀도로 세포를 웰에 분주합니다.플레이트를 37°C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 10일 차에 완전 신경 분화 배지를 사용하여 배지를 전체적으로 교체합니다. 이 대표 이미지에서는 체외 배양 12일 후 nestin(녹색)과 beta three tubulin(적색)으로 염색된 로제트를 보여줍니다.여기서는 in vitro에서 28일 동안 배양한 세포를 beta three tubulin은 적색으로, NF200은 녹색으로 염색하였습니다. 이 대표 이미지는 in vitro에서 21일 후 NSCs로부터 분화된 신경세포를 NF200은 적색으로, tow는 녹색으로 염색한 모습입니다. 여기서는 동일한 배양물에서 유래한 글리아 세포를 GFAP로 적색 염색하였습니다.이 히스토그램은 IMR90 hiPSC 유도체와 IMR90 hiPSC 유래 NSC에서 분화된 세포 내 nestin, MAP two, GFAP, gamma-amino butyric acid, vesicular glutamate transporter one 및 tyrosine hydroxylase 양성 세포의 정량 분석 결과를 비교한 것입니다. 10X 대물렌즈를 사용하여 촬영한 이 위상차 이미지들은 21일 동안 분화가 진행 중인 신경줄기세포를 보여줍니다. 이러한 절차를 통해 정량적 실시간 PCR 및 다각적 재분석과 같은 다른 판독을 수행함으로써 신경 세포와 글리아 세포의 생리학적 특성 및 표현형을 평가하고 화학 물질의 영향을 분석할 수 있습니다.화학 화합물을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있음을 잊지 마십시오. 따라서 특히 화학적 처리를 수행할 때는 항상 고글, 장갑 또는 마스크를 착용하고 흄 후드 내에서 적절한 예방 조치를 취해야 합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 신경독성 시험의 적절한 인비트로(in vitro) 모델인 인간 유도만능줄기세포로부터 신경세포와 글리아 세포가 혼합된 분화 집단을 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

protocol-for-differentiation-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 미세유체 장치 내에서 글루타메이터성 뉴런과 소아 고급 신경교종(pHGG) 세포를 공동 배양하는 기술을 보여줍니다. 인간 유도 만능 줄기 세포는 미세유체 시스템에 도입되어 성숙한 피질 글루타메이터 뉴런으로의 분화를 촉진하기 위해 배양됩니다. 그 후, pHGG 세포가 성숙한 뉴런에 도입되어 공동 배양을 확립하고 뉴런과 pHGG 세포 간의 상호 작용을 가능하게 합니다.

글루타메이터성 뉴런(Glutamatergic Neuron)과 소아 고급 신경교종(Pediatric High-Grade Glioma Cells) 공동 배양

이 비디오는 비형질전환 및 형질전환 인간 만능 줄기세포(hPSC)에서 신경전구세포의 생성을 보여줍니다. hPSC는 신경세포 분화 배지를 사용하여 신경전구세포로 분화됩니다. 분화는 작은 분자를 사용하여 비형질전환 세포에서 유도되는 반면, 형질전환 hPSC는 뉴런 분화 특이적 전사 인자를 위해 프로모터를 유도하는 항생제를 첨가하여 분화됩니다.

Non-Transgenic 및 Transgenic Human Pluripotent Stem Cells into Neural Progenitor Cells (비유전자 변형 및 형질전환 인간 만능 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화)

이 비디오는 배아체(EB)를 신경 상피 응집체로 분화하고 이후 신경 세포와 신경교세포로 분열하는 과정을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 in vitro에서 신경 세포 및 신경교세포를 효율적으로 생성할 수 있으며, 이는 독성 테스트를 위한 테스트 시스템 역할을 할 뿐만 아니라 신경 독성과 관련된 다양한 경로를 평가할 수 있습니다.

Generating Neurons and Glial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Embryoid Bodies

프로토콜은 인간 배아 줄기 세포 및 사체 연구에 기초하여 두 개의 시험관 발생 독성 시험 시스템 (UKK 및 UKN1)를 설명한다. 테스트 시스템은 인간 발생 독성 위험을 예측하고, 동물 연구, 비용 및 화학 물질의 안전성 검사에 필요한 시간을 단축에 기여할 수있다.

화학 물질 안전 검사 및 시스템 생물학 데이터 생성을 위해 발생 독성 시험 법을 바탕으로 인간 다 능성 줄기 세포

마우스 ES 세포를 기능적 시냅스와 창발적 네트워크 행동을 나타내는 매우 순수한 뉴런의 정의된 집단으로 구별하기 위한 사용자 정의 프로토콜이 설명됩니다. 전기생리학적 분석은 보툴리눔 신경독소 혈청형/A-/G 및 파상풍 신경독에 노출된 후 시냅스 전달의 상실을 보여줍니다.

줄기의 네트워크 문화 생물 신경 독소의 기능 평가 중추 신경계 신경 세포가 유래

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

이 프로토콜은 이전에 여러 주 동안 시험관 내 신경 전구체로부터 분화 된 인간 줄기 세포 유래 뉴런을 재중단하고 배양하기위한 상세한 절차를 설명합니다. 이 절차는 경질 현미경 검사법 및 고함량 스크리닝과 호환되는 형식으로 neurites, 시냅스 및 늦게 발현되는 뉴런 마커의 이미징 기반 검술을 용이하게 합니다.

신형성 및 시냅스 성숙의 고함량 스크리닝을 위한 인간 다능성 줄기 세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅

손상된 미토콘드리아 수송 및 형태는 각종 신경 퇴행성 질환에 관여합니다. 제시된 프로토콜은 유전 경직 성 하반신 마비에서 미토콘드리아 수송 및 형태를 평가하기 위해 유도 된 다능성 줄기 세포 유래 전뇌 뉴런을 사용합니다. 이 프로토콜은 축축을 따라 미토콘드리아 인신 매매의 특성화와 신경 퇴행성 질환의 연구를 용이하게하는 형태학의 분석을 허용합니다.

유전 경직 성 하반신 마비에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 미토콘드리아 수송 및 형태 분석

우리는 척수 인간 유도 만능 유래 성상 세포와 뉴런을 구별하는 방법과 전기 생리 학적 기록을위한 이들의 공동 배양을 설명합니다.

지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축

이 연구는 미토콘드리아 부피, 미토콘드리아 막 전위, 활성 산소 종 수준, 미토콘드리아 호흡 사슬 조성 및 미토콘드리아 DNA의 변화를 감지하기 위해 두 개의 형광 리포터 또는 항체를 사용한 유세포 분석 및 이중 염색을 기반으로 여러 미토콘드리아 기능 매개 변수를 측정하는 새로운 접근 방식을보고합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포와 그 신경 및 신경교 유도체에서 여러 미토콘드리아 파라미터의 유세포 분석

학습하세요 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSCs)를 뉴런과 신경교세포 혼합 배양으로 분화시키는 방법을. 이 체외 모델은 신경독성 평가 및 약물 독성 선별에 활용됩니다.

인간 독성 Pluripotent 줄기 세포의 신경 독성 테스트를위한 뉴런과 Glia의 혼합 문화로의 분화를위한 프로토콜

더 많은 동영상 탐색