인간 독성 Pluripotent 줄기 세포의 신경 독성 테스트를위한 뉴런과 Glia의 혼합 문화로의 분화를위한 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 인간 유도 만능 줄기 세포 군체에서 유래한 신경 줄기 세포를 신경 세포와 신경교세포의 혼합 배양으로 분화하는 것입니다. 이 모델은 약물 및 화학적 독성 스크리닝에 적합합니다. 이 시험관 내 모델은 신경 세포와 신경교세포의 분화 과정에서 활성화되는 신호 전달 경로의 화학적 유도 교란을 평가하는 데 적용할 수 있습니다.

이 시스템의 주요 장점은 전통적으로 사용되는 암세포 및 동물 1차 배양에 대한 대안을 나타내는 유도 만능 줄기 세포에서 파생된 인간 모델을 사용하고 신경 세포와 신경교세포의 혼합 집단에서 신경 독성을 연구할 수 있다는 것입니다. 이 절차는 박사후 연구원인 Francesca Pistollato와 연구실의 대학원생인 Carolina Nunes가 시연할 것입니다. hiPSC 콜로니를 전달하여 시작합니다.

층류 캐비닛에서 4X 배율의 실체 현미경 아래에서 작업하려면 30게이지 바늘이 있는 1밀리리터 주사기를 사용합니다. 줄기세포 군체를 약 200미크론 x 200미크론의 정사각형으로 자릅니다. 군체를 잘라내려면 같은 크기의 파편을 얻기 위해 좋은 수작업 기술이 필요합니다.

시중에서 판매되는 절삭 공구를 사용하면 도움이 될 수 있습니다. 그런 다음 200마이크로리터 피펫을 사용하여 아래에 있는 배지를 부드럽게 피펫팅하여 조각을 들어 올려 접시 표면에서 콜로니 조각을 분리합니다. 100개 정도의 집락 단편을 4ml의 완전한 hiPSC 배지로 채워진 적격 매트릭스 DMEM F12 코팅 60mm 접시로 옮깁니다.

그런 다음 새 요리를 섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 배양합니다. 매일 전체 매체 변경을 수행하고 4X 및 10X 배율에서 위상차 현미경을 사용하여 군체의 형태를 검사합니다. 분화 절차의 0일차에 60mm 페트리 접시당 3ml의 배지를 추가하여 hiPSC 배지를 새로 고칩니다.

그런 다음 이전과 같이 200미크론 조각을 자르고 분리합니다. 분리된 조각과 배지를 15ml 튜브에 피펫으로 넣습니다. 접시를 2ml의 완전한 hiPSC 배지로 헹구고 모든 조각을 회수합니다.

그런 다음 112배 G에서 1분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 흡인하고 5ml의 완전한 hiPSC EB 배지에 단편을 부드럽게 재현탁합니다. 60mm 초저 부착 조직 배양 접시에 전체 볼륨을 담습니다.

섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 하룻밤 동안 접시를 배양합니다. 다음날 도립 현미경으로 세포를 확인합니다. 1일차 배아의 몸체는 여기에서 볼 수 있듯이 둥글고 서로 구별되는 것처럼 보여야 합니다.

그런 다음 접시에서 배아체와 배지를 피펫팅하고 15ml 튜브로 옮깁니다. 배아체를 1분 동안 112배 G로 원심분리한다. 2일차에는 미리 준비된 60mm 접시에서 표준 매트릭스 코팅 용액을 흡입하고 접시에 5ml의 완전 신경 상피 유도 매체(NRI)를 추가합니다.

4X 배율로 실체 현미경 아래에서 작업하고 200마이크로리터 피펫을 사용하여 약 50개의 떠다니는 배아체를 수집하고 하나의 코팅된 접시로 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 접시를 배양합니다. 다음 날, 분화 절차의 3일차에 현미경으로 접시를 10X 배율로 확인하여 배아체가 모두 부착되어 있는지 확인합니다.

그런 다음 완전한 NRI 배지로 전체 매체 변경을 부드럽게 수행합니다. 로제트와 같은 신경 상피 응집체가 보여야 하는 7일째까지 NRI 배지를 격일로 변경합니다. 7일차에 배양 배지에 희석된 표준 매트릭스 100마이크로리터를 각 웰에 피펫팅하여 96웰 플레이트를 코팅합니다.

8일째에 멸균 조건에서 10X 배율로 실체 현미경으로 장미와 같은 응집체를 조각으로 자릅니다. 로제트는 바늘로 만지면 접시에서 쉽게 분리되는 경향이 있습니다. 이 경우 바늘 끝으로 분리 된 로제트를 부분적으로 분해하십시오.

로제트가 부분적으로 부착된 상태로 유지되는 경우 200마이크로리터 피펫을 사용하여 로제트 조각의 분리를 완료하십시오. 로제트 절단은 신경배엽 유도체를 절단하지 않기 위해 우수한 수작업 기술과 정밀도가 필요합니다. 다음으로 로제트 조각과 그 배지를 15ml 원추형 튜브에 모읍니다.

모든 조각을 회수하기 위해 2ml의 NRI 배지로 접시를 헹굽니다. 그런 다음 로제트 조각을 112배 G로 1분 또는 2분 동안 회전시킵니다. 상층액을 흡인시킨 후, 칼슘과 마그네슘 없이 예열된 1 X DPBS 1 밀리리터에 펠릿을 부드럽게 재현탁시킵니다.

로제트 조각을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 부분적으로 해리시킵니다. 그런 다음 4ml의 완전한 NRI 배지를 추가하고 트리판 블루와 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다. 다음으로 96웰 플레이트에서 표준 매트릭스 코팅 용액을 흡인하고 약 15, NRI 배지에서 평방 센티미터당 000개의 셀의 밀도로 셀을 웰에 증착합니다.

섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 밤새 접시를 배양합니다. 10일째에 완전한 신경 분화 배지를 사용하여 전체 중간 변화를 수행합니다. 이 대표적인 이미지는 12일 후 체외에서 염색된 로제트를 보여주며, 녹색의 네스틴과 빨간색의 베타 3 튜불린을 위해 염색되었습니다.

여기에서 시험관에서 28일 동안 성장한 세포는 빨간색의 베타 3 튜불린과 녹색의 NF200으로 염색되었습니다. 이 대표적인 이미지는 NF200에 대해 빨간색으로, 녹색으로 견인된 시험관 내에서 21일 후 NSC와 분화된 신경 세포를 보여줍니다. 여기서 동일한 배양액의 신경교세포는 GFAP에 대해 빨간색으로 염색됩니다.

이 히스토그램은 IMR90 hiPSC 유도체 및 IMR90 hiPSC 유래 NSC에서 분화된 세포에서 nestin, MAP two, GFAP, 감마 아미노 부티르산, 소포성 글루타메이트 수송체 1 및 티로신 하이드록실라제 양성 세포의 정량화를 비교합니다. 10X 대물렌즈를 사용하여 촬영한 이 위상차 이미지는 21일 동안 분화를 겪는 신경 줄기 세포를 보여줍니다. 이러한 절차를 따르면 신경 세포 및 신경교세포의 생리학 및 표현형을 평가하고 화학 물질의 영향을 평가하기 위해 정량적 real-time PCR 및 다자간 재분석과 같은 다른 판독을 수행할 수 있습니다.

화합물을 사용하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 그렇기 때문에 특히 화학 처리를 수행할 때 플로우 후드 아래에 있는 고글, 장갑 또는 마스크를 사용하여 항상 관련 예방 조치를 취해야 합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 신경독성 테스트 개발에 적합한 모델인 체외 모델을 나타내는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 시작하여 뉴런과 신경교세포의 혼합 분화 집단을 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.