인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

이 절차의 전반적인 목표는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 peral neuron의 수지상 가시를 이미지화하고 3차원으로 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 신경 줄기 세포를 배양하기 위해 폴리우레탄과 라미닌으로 6개의 웰 플레이트에서 커버 슬립을 처리함으로써 이루어집니다. 다음으로 배양에서 희석된 신경 줄기 세포.

배지는 부드럽게 회전하는 피펫 움직임을 사용하여 도금되며 배양에서 최대 70일까지 구별할 수 있습니다. 배지를 정기적으로 갱신함으로써 세포는 항 GFP 항체로 염색된 GFP 렌티바이러스로 형질전환되고 시각화됩니다. 마지막으로, 배양물은 고정되고 수지상 가시는 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지화됩니다.

궁극적으로 인간 수지상 가시의 이미지 데이터는 분류 및 정량화를 위해 3D로 재구성됩니다. 이 프로토콜은 인간 뇌 피질의 2층에서 4층의 글루타메이터 뉴런을 얻기 위한 단계적 절차를 제공합니다. 여기에는 이전에 발표된 방법을 기반으로 한 인간 섬유아세포에서 유래한 인간 유도 전능 줄기세포에서 유래한 신경 줄기세포의 사용이 포함됩니다.

기존 방법에서 이 기술의 주요 장점은 3D에서 DON right와 PY를 자동으로 분할할 수 있다는 것입니다. 이는 일반적으로 2D 해석에서만 준비하는 기존 소프트웨어에 비해 상당한 시간 단축을 제공합니다. 분류의 donr 및 spy는 매우 편리하고 사용하기 쉽습니다.

신경 세포 배양을 준비하려면 유리 커버 슬립을 6개의 웰 배양 접시에 넣고 다음 날 유동 후드 아래에서 하룻밤 동안 폴리 오르니틴 배양을 추가합니다. DPBS를 사용하여 커버 슬립을 세 번 세척하고 최소 10시간 동안 플로우 후드 아래에서 라미닌 인큐베이트를 추가합니다. 하기 성분을 포함하는 배양 배지를 제조합니다.

그런 다음 배지를 사용하여 신경 줄기 세포 또는 NSCS를 평방 센티미터당 50, 000개의 세포 밀도로 플레이팅하고 파견하여 인간 IPSC 유래 뉴런을 형질도입하기 위해 세포 클러스터링을 줄이기 위해 느린 회전 운동으로 피펫팅합니다. 모든 성숙 단계에서 신선한 배양 배지를 함유한 배양 웰당 40나노그램의 GFP 렌티바이러스 벡터를 함유한 1마이크로리터의 원액을 첨가하고 섭씨 37도에서 48시간 동안 배양합니다. 면역형광을 위해 세포를 준비하려면 배양 배지를 제거하고 4% 포름알데히드를 사용하여 형질도입된 세포를 실온에서 10분 동안 고정합니다.

그런 다음 하나의 XPBS를 사용하여 각각 10분씩 세 번 세포를 세척합니다. 다음으로, 0.05% Triton X 110% 호스 세럼을 보충한 PBS에 커버 슬립을 담그고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS를 사용하여 커버 슬립을 세 번 세탁합니다.

PBS 4%horse 혈청 100마이크로리터에 1000번째 GFP 1차 항체 1개를 각 커버 슬립에 추가합니다. 섭씨 4도의 어두운 상자에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이제 Alexa Fluor 4 88 복합 항체를 PBS 0.5%tween 20에 희석하고 PBS를 사용하여 슬라이드를 세 번 세척한 후 실온에서 1시간 동안 항체 용액으로 세포를 배양합니다.

장착 매체를 사용하여 형광 현미경 검사용 슬라이드를 장착합니다. 컨포칼 현미경에서 초금속 형태와 접힌 수지상 수목화를 사용하여 조건당 최소 10개의 건강한 뉴런을 선택하여 수상돌이당 60-100마이크로미터를 정량화합니다. 40 x na, 1.3 오일 대물렌즈 및 488 나노미터 레이저로 약 20마이크로와트의 샘플 레벨에서 일반적인 피크 파워로 이미지를 획득하고, 픽셀 크기를 약 80나노미터로 설정하여 적절하게 샘플링된 수지상 가시를 만듭니다.

전체 뉴런 부피를 샘플링하려면 Z 간격이 150 - 300 나노미터인 Z 스택을 획득하여 20 - 30 Z 슬라이스를 생성하여 수지상 가시의 3D 정량화를 수행합니다. 사전 처리를 위한 해석 소프트웨어에 대해 다음 설정을 사용합니다. 이미지 처리, 평활화, 가우스 필터를 선택하여 가우스 필터링을 사용합니다.

필터 너비를 XY 평면의 픽셀 크기와 동일하게 설정하여 필라멘트 추적기 모듈에서 덴드라이트의 반자동 트레이싱을 수행합니다. slice 탭에서 distance 도구를 사용하여 수상돌기 지름을 추정합니다. 다음으로 능가하는 탭에서 필라멘트 도구를 클릭하고 그리기 탭에서 더 나은 견고성을 위해 자동 생성 건너뛰기를 선택합니다.

이제 자동 경로를 방법으로 선택하고, 수상돌기를 유형으로 선택하고, 예상 수상돌기 직경을 입력합니다. 포인터의 선택 모드를 사용하여 커서를 상자로 바꾸고 Shift 키를 선택한 다음 수상돌기 시작점을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 소프트웨어가 초기 계산을 수행합니다.

이제 시작점에서 수상돌기를 따라 포인터를 이동합니다. 가장 가능성이 높은 수상돌기 경로를 나타내는 노란색 선이 표시됩니다. Shift 키를 누른 상태에서 왼쪽을 누릅니다.

수상돌기 종말점을 클릭하여 모듈 인터페이스에서 자동화된 척추 분할을 수행합니다. 재생성 드롭 목록에서 생성 탭을 클릭합니다. rebuild dendrite diameter(덴드라이트 지름 재생성)를 선택하고 keep data box(데이터 유지) 상자를 선택합니다.

그런 다음 재구축을 클릭합니다. 세그먼트화된 부피가 실제 덴드라이트 부피와 일치하도록 임계값을 설정합니다. 알고리즘으로 거리 맵에서 최단 거리를 선택합니다.

그런 다음 슬라이스 탭 아래의 다음 버튼을 클릭하고 가장 작은 척추, 머리 직경 및 최대 길이를 결정합니다. 그런 다음 surpass 탭에서 최소 직경에 대해 약 200-300 나노 미터의 매개 변수 값을 입력하고 최대 길이에 대해 4 마이크로 미터를 입력하십시오. 시작 지점은 spines 허용 상자를 선택하지 않고 다음 버튼을 클릭하십시오. 다음으로, 시드 포인트 임계값을 조정하여 척추를 나타내는 파란색 점이 실제 척추 머리에 국한되도록 합니다.

그런 다음 다음을 클릭합니다. 이제 코어 계산이 수행되며 모듈 인터페이스의 도구 탭에서 스파인을 분류하는 데 시간이 걸릴 수 있으며 Spine 분류를 클릭합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 4개의 클래스가 있는지 확인한 후 모듈 인터페이스는 분류 결과와 함께 4개의 새로운 필라멘트 개체를 생성합니다.

마지막으로, Export All Statistics to File(모든 통계를 파일로 내보내기)을 클릭하여 통계 탭 아래에서 통계 데이터를 내보냅니다. 이 그림은 항베타 3 튜불린 항체로 표시된 인간 뉴런의 배양을 보여줍니다. 세포 클러스터링의 경향은 여기에서도 분명합니다.

여기에 표시된 것은 후기 피질 전구 세포에서 분화 후 40일 후에 GFP로 표지된 파라메탈 뉴런입니다. 표재성 피질층에서. 삽입물은 겉보기 세포체와 함께 더 낮은 배율을 보여줍니다.

이 패널은 다양한 성숙 단계에서 수지상 가시 세그먼트의 3D 재구성을 나타냅니다. 척추 밀도와 척추 머리 부피의 정량적 분석이 여기에 나와 있습니다. 예상대로 이 두 매개변수는 배양 기간 동안 증가합니다.

배양 절차를 시도하는 동안 세포 콜린을 줄이기 위해 완만한 회전 운동으로 세포를 천천히 첨가하여 신경 줄기 세포를 매우 조심스럽게 플레이트하고 파견하는 것이 중요합니다. 실제로 이 방법은 개별 뉴런을 식별해야 합니다.