인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

이 절차의 전반적인 목표는 인간 유도만능줄기세포 유래 신경세포의 수지상 돌기 가시를 이미징하고 이를 3차원으로 정량화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 6-웰 플레이트의 커버슬립을 폴리우레탄과 라미닌으로 처리하여 신경줄기세포 배양 환경을 조성합니다. 그다음 배양액에 희석된 신경줄기세포를 처리합니다.

배지를 플레이팅할 때 피펫을 부드럽게 회전시키는 동작을 사용하며, 배양액 내에서 최대 70일 동안 분화하도록 둡니다. 배지를 정기적으로 교체한 후, GFP 렌티바이러스를 통해 세포를 형질전환시키고 anti GFP 항체로 염색하여 시각화합니다. 마지막으로, 배양물을 고정한 뒤 공초점 현미경을 사용하여 수지상 돌기(dendritic spines)의 이미지를 획득합니다.

최종적으로, 인간 수지상 돌기(dendritic spine)의 이미지 데이터는 분류 및 정량을 위해 3D로 재구성됩니다. 본 프로토콜은 인간 뇌 피질의 2층에서 4층에 해당하는 글루탐산 작동성 뉴런(glutamatergic neurons)을 얻기 위한 단계별 절차를 제공합니다. 여기에는 이전에 발표된 방법을 기반으로 인간 섬유아세포로부터 유도된 인간 유도 전분화능 줄기세포 유래 신경 줄기세포의 사용이 포함됩니다.

기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 DON 우측 및 PY의 자동 3D 분할이 가능하다는 점입니다. 이는 일반적으로 2D 분석만 제공하는 기존 소프트웨어들에 비해 상당한 시간 단축 효과를 가져옵니다. 또한 donr 및 spy 분류 방식은 매우 유용하며 사용법이 간편합니다.

신경세포 배양물을 준비하려면, 6-well 배양 접시에 유리 커버슬립을 넣고 poly ornithine을 추가한 후 클린벤치 내에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 DPBS를 사용하여 커버슬립을 3회 세척하고 laminin을 추가한 후 클린벤치 내에서 최소 10시간 동안 배양합니다. 다음 성분을 포함하는 배양 배지를 준비합니다.

그 다음, 해당 배지를 사용하여 신경줄기세포(NSCs)를 cm²당 50,000 cells의 밀도로 도말하고 분주합니다. 이때 세포 응집을 줄이기 위해 천천히 회전하며 피펫팅하여 인간 iPSC 유래 뉴런을 형질전환합니다. 성숙 과정의 어느 단계에서든, 신선한 배지가 들어 있는 배양 웰당 40 ng의 GFP 렌티바이러스 벡터가 포함된 스탁 용액 1 µL를 첨가하고 37 °C에서 48시간 동안 배양합니다. 면역형광 염색을 위해 세포를 준비하려면, 배양 배지를 제거하고 4% formaldehyde를 사용하여 실온에서 10분 동안 형질전환된 세포를 고정합니다.

그다음 XPBS를 사용하여 세포를 10분씩 3회 세척합니다. 이어서 0.05% Triton X 110 및 horse serum이 첨가된 PBS에 커버슬립을 담그고 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS를 사용하여 커버슬립을 3회 세척합니다.

각 커버슬립에 PBS 4% horse serum에 1/1000로 희석한 GFP 1차 항체를 100 µL씩 첨가합니다. 암실 박스에서 4 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 이제 Alexa Fluor 488 접합 항체를 PBS 0.5% tween 20에 1/200로 희석하고, PBS로 슬라이드를 3회 세척한 후 항체 용액과 함께 세포를 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

형광 현미경 관찰을 위해 마운팅 매질을 사용하여 슬라이드를 마운팅합니다. 공초점 현미경 하에서, 조건당 피라미드 형태의 형태와 수지상 돌기 분지 구조를 가진 건강한 뉴런을 최소 10개 선택하여 수지상 돌기당 60 to 100 micrometers를 정량화합니다. 40 x na, 1.3 오일 대물렌즈와 샘플 수준에서 전형적인 피크 전력이 약 20 micro watts인 488 nanometer 레이저를 사용하여 이미지를 획득하며, 수지상 돌기 가시를 적절하게 샘플링할 수 있도록 픽셀 크기를 약 80 nanometers로 설정합니다.

뉴런 전체 부피를 샘플링하려면, Z 간격을 150에서 300 nanometers로 설정하여 Z 스택을 획득함으로써 수지상 돌기 가시의 3D 정량 분석을 위한 20에서 30개의 Z 슬라이스를 생성하십시오. 전처리를 위해 분석 소프트웨어에서 다음 설정을 사용하십시오. 이미지 프로세싱의 smoothing Gaussian filter를 선택하여 가우시안 필터링을 수행하십시오.

필라멘트 트레이서(filament tracer) 모듈에서 수상돌기를 반자동으로 추적하려면 필터 너비를 XY 평면의 픽셀 크기와 동일하게 설정하십시오. 슬라이스 탭에서 거리 측정 도구를 사용하여 수상돌기의 직경을 추정합니다. 다음으로 서패스드(surpassed) 탭에서 필라멘트 도구를 클릭하고, 드로우 탭에서의 견고성을 높이기 위해 자동 생성 건너뛰기(skip automatic creation)를 선택하십시오.

이제 method에서 select auto path를, type에서 dendrite를 선택하고, 추정되는 dendrite 직경을 입력하십시오. 포인터의 select 모드를 사용하여 커서를 상자 모양으로 변경한 후, shift 키를 누른 상태에서 dendrite 시작 지점을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오. 그러면 소프트웨어가 초기 계산을 수행합니다.

이제 시작점에서부터 수지상돌기를 따라 포인터를 이동하십시오. 가장 가능성이 높은 수지상돌기 경로를 나타내는 노란색 선이 표시됩니다. Shift 키와 왼쪽 방향키를 누르십시오.

모듈 인터페이스에서 수상돌기 말단을 클릭하여 자동 가시 분할을 수행하십시오. 재구축 드롭다운 목록에서 생성 탭을 클릭하십시오. 수상돌기 직경 재구축을 선택하고 데이터 유지 상자를 체크하십시오.

그런 다음 rebuild를 클릭하십시오. 분할된 부피가 실제 수상돌기 부피와 일치하도록 임계값을 설정하십시오. 알고리즘으로는 distance map에서의 shortest distance를 선택하십시오.

그런 다음 slice 탭 아래의 next 버튼을 클릭하여 가장 작은 spine, head 직경 및 최대 길이를 결정하십시오. 이어서 surpass 탭에서 파라미터 값을 입력하는데, 최소 직경은 200에서 300 nanometers, 최대 길이는 4 micrometers 정도로 설정하는 것이 적절한 시작점입니다. allow spines 상자를 체크하지 않은 상태에서 next 버튼을 클릭하십시오. 다음으로, spine을 나타내는 파란색 점들이 실제 spine head에 위치하도록 seed points 임계값을 조정하십시오.

그런 다음 'Next'를 클릭하십시오. 이제 핵심 계산이 수행되며, 분류 작업에 시간이 소요될 수 있습니다. 모듈 인터페이스의 'Tools' 탭에서 'Classify Spine'을 클릭하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 4개의 클래스가 있는지 확인하면, 모듈 인터페이스가 분류 결과로 4개의 새로운 필라멘트 객체를 생성합니다.

마지막으로, 통계 탭에서 'export all statistics to file'을 클릭하여 통계 데이터를 내보내십시오. 이 그림은 anti beta three tubulin 항체로 표지된 인간 뉴런 배양 상태를 보여줍니다. 세포 응집 경향 또한 여기서 분명하게 나타납니다.

후기 피질 전구세포로부터 분화된 지 40일이 지난 GFP 표지 파라메탈 뉴런(parametal neuron)의 모습입니다. 표층 피질 층에서 유래하였습니다. 삽입도는 세포체가 뚜렷하게 보이는 저배율 사진입니다.

이 패널들은 성숙 단계가 서로 다른 수지상 돌기 가시(dendritic spine) 세그먼트의 3D 재구성 영상을 나타냅니다. 가시 밀도와 가시 머리 부피에 대한 정량적 분석 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 예상한 바와 같이, 이 두 파라미터는 배양 기간이 경과함에 따라 증가합니다.

배양 절차를 수행할 때는 세포 응집을 줄이기 위해 완만한 회전 운동과 함께 세포를 천천히 첨가함으로써 신경 줄기세포를 매우 조심스럽게 분주하고 배치하는 것이 중요합니다. 실제로 이 방법은 개별 뉴런의 식별을 필요로 합니다.