Name: 인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 학습하세요 인간 유도 만능 줄기세포에서 유래한 피라미드 뉴런의 돌기 가지를 3차원 정량 분석하는 방법을. 공초점 현미경과 GFP 바이러스 매개 시각화를 활용하여 시냅스 구조와 신경 연결성을 연구합니다.

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이 연구는 파스퇴르 연구소, 베텐쿠르-슐러 재단, 국립 연구 과학 센터, 파리 디드로 대학, 국립 연구소(ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), Conny-Maeva 자선 재단, Cognacq Jay 재단, Orange 재단 및 Fondamental 재단. LG는 보건부의 학부 펠로우십의 지원을 받습니다. 우리는 이 작업의 초기 단계에서 BitPlane, 특히 Georgia Golfis의 도움을 인정합니다.

1. 신경 세포 문화 참고 : 만능 줄기 세포의 섬유 아세포 프로그래밍, 늦게 대뇌 피질의 조상의 지느러미 telencephalon 계통, 유도, 증폭, 및 금융에 대한 헌신 (LCP)는 Boissart 등의 알 4에 설명했다. LCP 유사 세포의 분화 신경 세포는 또한 약간의 수정 Boissart 동부 알 4에 따라 수행 하였다. 또 다른 과정은 뉴런으로 분화 유도 하였다 능성 줄기 세포로의 섬유 모세포의 직접 프로그래밍을 위해 개발되어왔다. 이 피라미드 글루타메이트 성 신경 세포의 선택적 제조 할 수 있으므로,이 프로토콜은 유지되었다. <ol><li> 폴리 오르니 틴 (DPBS에서 1/6로 희석, 주식 농도 0.01 %) DPBS 세 세척 다음 O / N로 커버 글라스 6 웰 배양 판을 취급합니다. 이어서 유동 후드 적어도 10 시간, 라미닌 (1 mg을 / ㎖, DPBS에서 500 배 희석 스톡 농도)를 추가<html> . </li><li> 플레이트 및 저밀도 NSC를 전달 N2 보충제의 (50,000 세포 / cm 2) 유리 DMEM / F12 이루어진 배지 3 ㎖에 커버 슬립 (500 ㎖), 2- 바이알 6 웰 배양 플레이트 (5 ㎖ 각) B27 보충제의 2 병 (각 10ml), 펜 스트렙토 마이신 10 ㎖ (페니실린 = mL 및 스트렙토 마이신 = 10,000 단위 / ㎖ 10,000 단위 /), 2- 머 캅토 에탄올 1 ㎖ (원액 : 50 밀리미터) 및 라미닌 (1 / 500), 성장 인자없이. 중요한 단계 : 셀 클러스터링을 줄이기 위해 느린 회전 움직임 세포를 첨가하여 조심스럽게이 단계를 수행합니다. </li><li> 배지를 제거합니다. 커버 글라스에 부착 된 신경 세포를 유지하고 응집을 방지하기 위해 신선한 라미닌 솔루션의 2 ㎍ / ㎖의를 포함하는 신선한 N2B27 매체를 추가합니다. 3 일마다 매체를 변경합니다. 건조로부터 세포를 방지하기 위해, 새로운 배지를 첨가하기 전에 남아있는 매체 (200 μL)의 일부를 유지한다. 다르게는, 급속하게 진행하고 전체 부피 (3 ㎖)을 변경. </li></ol>e_title &quot;&gt; 2. 렌티 바이러스 형질 도입 참고 : GFP 렌티 바이러스 벡터가 친절하게 파스퇴르 연구소에서 박사 우베 Maskos 연구소 (파리)에서 제공하고 게시 된 프로토콜 (5)에 따라 제조 하였다. GFP의 발현은 마우스 포스 포 키나아제 (PGK) 프로모터에 의해 구동된다. 이 연구를 위해 바이러스 역가 400 NG / μL (PBS 1X에서 원액)이었다. <ol><li> 배양 당 GFP 렌티 바이러스 벡터 웰 (6- 웰 플레이트) 40 ng의 함유 원액 1 μl를 첨가하여 바이러스 입자에 의한 성숙 중 어느 단계에서 인간 IPSC 유래 신경 세포를 형질 도입하고 신선한 배지에서 48 시간 동안 배양한다. 주 :이 프로토콜의 경우, 배양 기간은 척추 구조의 좋은 표시를 허용한다. </li></ol> 3. 면역 형광 주 : 전체 척추 형태의 라벨을 개선하기 위해, 면역 형광 라벨링 투과성이 조건에서 항 GFP 항체를 사용하여 수행 하였다. </p&gt; <ol><li> RT에서 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 커버 슬립에 형질 세포 배양 배지를 제거하고, 수정 후, 1X PBS (10 분마다)을 3 회 반복한다. </li><li> PBS에 Immerge coverslips를 0.05 % 트리톤 (100X)와 RT에서 1 시간 동안 10 %의 말 혈청, 1X PBS 후 3 번 세척 하였다. </li><li> 1X PBS 100 ㎕를 4 % 말 혈청 및 차 항체 (1 / 1,000) GFP에 대해 발생하고, 각 커버 슬립에 1000 배 희석하여 추가로 보충. 어두운 상자 O에 품어 / N 4 ° C에서, 다음 1X PBS로 3 회 세척한다. </li><li> PBS가 트윈 20의 0.5 %로 보충에 알렉사 형석 488 공역 항체 (1/200)을 희석하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 그런 다음 1X PBS에서 3 회 세척하고 형광 현미경을위한 매체를 장착하여 유리 슬라이드에 커버 슬립을 탑재합니다. </li></ol> 4. 수지상 척추 영상 <ol><li> 공 초점 레이저 주사 현미경을 통해 공 촛점 이미징을 수행합니다. </li><li> 피라미드 형태의 건강한 뉴런을 선택차 전체 수지상 arborization 및 별도의 실험 조건에 따라 최소 10 뉴런을 정량화. 수상 돌기 당 100 ㎛ - 60 정량화. </li><li> 20 μW 주위 샘플 레벨 전형적인 피크 파워와 NA는 대물 1.3 = 40X 오일 및 GFP 여​​기 대 488 nm의 레이저 선을 사용하여 이미지를 획득. 80 nm의 주위에 설정 픽셀 크기가 제대로 돌기 쪽을 샘플링합니다. 주 : 잡음 덴 드라이트 및 등뼈의 적절한 분할을 손상하지 않는 이미지에 대한 후속 호출을 분석. 상술 한 공간 샘플링 및 전력 설정과 함께, 우리는 3.15 μS의 화소 드웰 시간은 이미지를 구축 할 수있는 충분한 광자를 수집하기에 충분한 것을 관찰했다. 희미한 샘플 화질 2-4 스캔을 평균함으로써 개선 될 수있다. 여러 XY 타일의 인수는 다음 함께 처리하기 전에 스티치해야 관심 영역을 커버하기 위해 필요할 수있다. </li><li> 와, Z-스택을 획득, 전체 신경 세포의 볼륨을 샘플링Z는 20 ~ 30 Z 슬라이스를 산출, 150 나노 미터에서 300 나노 미터에 이르기까지 간격. 참고 :이 설정으로 달성 측면 공간 해상도는 234 나노 미터이며, 축 방향 해상도가 591 ㎚이다. 여기서 선택된 샘플링은 적절하지만 축 해상도가 묘화 될 수있는 쪽의 최소 크기보다 큰 경우로, 분석 돌기로부터 측 방향으로 연장되는 쪽을 선호. </li></ol> 돌기 쪽 5. 3D 정량화 주 : 다음 섹션 구체적 분석 Imaris 소프트웨어의 사용을 설명한다. 다른 구현은 유사한 결과를 제공 할 수 NeuronStudio 15 MetaMorph로부터 8 포함한 존재한다. 다음 키 설정을 사용 : <ol><li> 전처리 단계로서, 소프트웨어에 의해 제공되는 화상 처리 시설을 통해 가우시안 필터링을 사용한다. 이미지 처리&gt; Smoo 통해 가우시안 필터링을 수행일&gt; 가우시안 필터. XY의 픽셀 크기와 동일하게 필터 폭을 설정한다. </li><li> 소프트웨어 필라멘트 추적기 모듈을 이용하여, 덴 드라이트의 반자동 추적을 수행한다. <ol><li> 우선, 소프트웨어의 슬라이스 탭 거리 도구를 사용하여, 덴 드라이트 직경 견적. </li><li> 능가 탭에서 필라멘트 도구를 클릭합니다. 더 나은 안정성,이 프로토콜은 반 자동화 된 추적에 의존; 건너 뛰기 자동 생성을 클릭합니다. 모듈 인터페이스는 이제 그리기 탭을 보이고있다. 여기에있어서, 덴 드라이트 형 등 및 입력 예상 수지상 AutoPath 지름을 선택한다. </li><li> 상자에 커서를 회전, 포인터의 선택 모드를 사용합니다. 수상 돌기 시작 지점에 Shift 키를 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 주 : 소프트웨어가 초기 계산을 수행한다. </li><li> 수상 돌기를 따라 포인터를 이동합니다. 시작점에서 (대표파란색 영역으로서 ED), 대부분 수지상 경로를 나타내는 황색 라인이 도시되어있다. 수상 돌기의 엔드 포인트에서 Shift 키를 왼쪽 클릭합니다. </li></ol></li><li> 자동화 된 쪽이 분할을 수행합니다. 주 : 추적 수지상 등뼈가 모듈 인터페이스에 의해 자동으로 발견된다. <ol><li> 모듈 인터페이스에서 작성 탭을 클릭합니다. 다시 드롭 목록에서 덴 드라이트의 직경을 다시 선택하고 보관할 데이터 상자를 선택합니다. 그런 다음 다시 클릭합니다. </li><li> 분할 된 볼륨이 덴 드라이트 실제 용적에 대응되도록 임계 값을 설정한다. 알고리즘으로,. 거리지도에서 최단 거리를 선택하고 다음 버튼을 클릭합니다. </li><li> 가장 작은 척추 헤드 직경 및 최대 길이를 결정, 다시 소프트웨어의 슬라이스 탭의 거리 도구를 사용하여, 다시 능가 탭에 와서 매개 변수를 입력합니다. F또는이 프로토콜은 약 200 값 - 최소 직경 300 nm의 최대 길이 4 μm의 좋은 출발점이다. 허용 지점 쪽이 상자를 선택하지 마십시오. 다음 버튼을 클릭합니다. </li><li> 등뼈를 나타내는 파란색 점은 실제 척추 머리에 지역화 있도록 종자 포인트 임계 값을 조정합니다. 다음 버튼을 클릭합니다. 참고 : 핵심 계산은 현재 수행되고 길어질 수 있습니다. </li></ol></li><li> 모듈 인터페이스의 도구 탭으로 이동하여 척추를 분류. 분류 등뼈를 클릭합니다. 메시지가 사용자 인터페이스에서 다음과 같이 자신의 형태에 의해 정의 된 네 개의 클래스가 있다는 것을 확인하십시오 스터 : 길이 &lt;1 μm의; 버섯 : 길이 (척추)&gt; 3, 최대 폭 (머리)&gt; 폭 (목) × 2 의미; 긴 얇은 : 평균 폭 (머리) ≥ 평균 폭 (목) Filopodia 같은 : 길이 ≤ 4 μm의 (NO 머리). 참고 : 미주리dule 인터페이스 분류의 결과를 포함하는 4 개의 필라멘트 새로운 객체를 생성한다. </li><li> 수출 통계 데이터 :이 네 객체 인터페이스 중 하나에서, 통계 탭으로 이동합니다. 버튼을 파일로 내보내기 모든 통계를 클릭합니다. 참고 : 다른 통계 값이 수상 돌기 위해 내보낼 수 있습니다 (.. 예를 들면, 길이, 면적, 등등 직경, 분기 깊이, 분기 각도, 볼륨을 의미), 그리고 척추 (예 :, 진 직도, 첨부 파일, 길이와 별개의 볼륨의 영역 척추 부품, 척추 직경, 밀도, 등.) </li></ol>

<ol><li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHANK3+mutations+identified+in+autism+led+to+modification+of+dendritic+spine+morphology+via+an+actin-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism.</a> Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).</li>
<li>Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-synaptic+dendritic+spines+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Non-synaptic dendritic spines in neocortex.</a> Neuroscience. 145, 464-469 (2007).</li>
<li>Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-based+comparison+of+human+dendritic+spine+structure+using+complete+three-dimensional+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions.</a> Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).</li>
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<li>Avale, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+beta+2%2A+nicotinic+receptors+and+dopamine+pathways+in+the+control+of+spontaneous+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion.</a> Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+synaptic+adhesion+with+dendritic+spine+remodeling+by+AF6+and+kalirin-7%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7.</a> Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).</li>
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<li>Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).</li>
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<li>Stein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquantitative+framework+to+evaluate+modeling+of+cortical+development+by+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells.</a> Neuron. 83, 69-86 (2014).</li>
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<li>Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+dysgenesis+in+Rett+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).</li>
<li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Three+Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (4), e1997(2008).</li>
</ol>

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피라미드 신경 세포의 형태 학적 특성의 정량화 소프트웨어에 의존했다. 필라멘트 트레이서 인터페이스는 뉴런 및 등뼈의 분할을 위해 사용하고, XT 모듈들은 분석을 위해 사용 하였다. 우리의 기술의 정확성을 분석하기 위해, 우리는 먼저 배양 6, 7 및 인간 뇌 조직 3 쥐 성숙한 피라미드 신경 세포를 사용하여 게시 된 것과 측정 형태 학적 파라미터 (길이, 면적, 및 전체 척추 볼륨 적용)을 비교 하였다. 밀도는 모든 경우에 비교했다. 더 볼륨 데이터는 볼륨 재구성 자신의 프로토콜을 사용하여 베 나비 데스 - Piccione (3)의 연구에서, 조금 우리의 데이타와 비교하여 감소 된 전체 척추 볼륨 반면 (2D 분석을 제작자가 사용하는 소프트웨어로보고되었다) 래트 뉴런에서 설명되지 않았다 선택 등뼈에. 이러한 차이는 사용되는 세포의 지역 원점과 형광 염료에 의해 설명 될 수있는 그들의라벨. <p class="jo...

대뇌 피질의 피라미드 뉴런의 돌기 쪽은 설치류, 영장류, 그리고 인간의 뇌에서 이러한 신경 세포 아형의 기저와 혀끝의 수상 돌기를 따라 분포되어 작고 얇은 돌기 있습니다. 그들은 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트이며, 학습과인지 과정의 주요 기능을 표시합니다. 인간 돌기 쪽의 상세한 구조는 기술적으로 전자 현미경 (2)에 의해 연구되었다. 그러나, 이러한 방법은 시간이 많이 소요하고 무거운 부하를 나타냅니다. 최근 돌기 쪽의 형태의 3 차원 (3D)는 크게 재구성 척추 수동 분석 (3)에 결합 된 특정 소프트웨어를 사용하여 인간의 뇌 피질에서보고되었다. 면역 결합 녹색 형광 단백질 (GFP) 기술을 형광 현미경에 의해 식별 및 척추 모양 측정 정확한 도구를 나타낸다. 이 방법은 쉽게 배양 신경에 적용 할 수있다. 하우버전, 데이터는 유도 만능 줄기 세포 (IPSC)에서 파생 된 인간의 신경 세포에 척추 성숙과 형태의 분석보고되지 않았다. 이 연구의 목적은 시험 관내에서 배양 된 신경 세포에서 돌기 척추 촬상을 허용하는 프로토콜을 기술 하였다. Imaris 소프트웨어 필라멘트 추적기 모듈과 GFP 표지, 공 초점 현미경 및 3D 분석은 본 프로토콜에 사용 하였다. II 신경 줄기 세포로부터의 IV (NSC)에 층의 피질 글루타메이트 성 신경 세포를 획득하는 데 필요한 배양 단계는 여기서 설명 간략하다. 인간의 NSC 생산을위한 전체 프로토콜은 이미 다른 곳에서 4 게시되었습니다.

<table><tbody><tr><td>D-PBS (1x), 칼슘, 마그네슘 및 페놀 제외 Red</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-오르니틴 용액 생물 시약</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>마우스 라미닌</td><td>Dutscher Dominique</td><td>354232</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제 (비타민 A 제외) (50배)</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/너트. MIX F-12 W/GLUT-I</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Med SFM</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>2-메르토에탄올</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스텝토마이신</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GFP 토끼 혈청 다클론 항체</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>A-6455</td><td></td></tr><tr><td>말 세럼</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 안티-래빗&nbsp;</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Anti-betaIII tubulin 항체</td><td>Millipore</td><td>AB9354</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass 13mm</td><td>VWR</td><td>631-0150</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Reagent with</td><td>DAPI Gibco/ Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Tween(R) 20 Bioextra, 점성 액체</td><td>시그마 Aldrich Chimie</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich Chimie</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>인간 섬유아세포</td><td>Coriell 세포주 생물저장소</td><td>GM 4603 및 GM 1869</td><td>Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA</td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Zeiss (Germany)</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane AG, Zurich</td><td>6.4.0 version</td><td>Filament Tracer 및 Imaris XT 모듈이 필요합니다.</td></tr><tr><td>Huygens 소프트웨어</td><td>Huygens 소프트웨어, SVI, 네덜란드</td><td>Pro 버전</td><td>옵션(디콘볼루션 테스트용)</td></tr></tbody></table>

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

돌기 쪽은 중추 신경계의 흥분성 시냅스의 후 시냅스 구획에 해당하는 작은 돌기입니다. 그들은 수상 돌기를 따라 배포됩니다. 이들의 형태는 신경 세포의 활동에 크게 의존, 그들은 동적입니다. 돌기 쪽은 표면과 시냅스 밀도의 수준에서 글루타메이트 수용체 (AMPA와 NMDA 수용체)을 표현한다. 각각의 척추는 신경 세포가 독립적으로 주 및 지역 활동을 제어 할 수 있습니다. 척추 모폴로지 광범위 생체 내 접근법과 설치류로부터 얻어지는 신경 조직 배양을 모두 사용하여, 뇌 피질의 글루타메이트 피라미드 세포에서 연구되어왔다. 설치류 배양 뉴런과 일차원 정량 분석 1에 도시 된 바와 같이 신경 병리학 적 조건은, 변경된 척추 유도 및 성숙에 관련 될 수있다. 본 연구는 인간의 cortic를 사용하여 척추 형태학의 3D 정량 분석​​을위한 프로토콜을 설명신경줄 기세포 (늦은 피질 전구 세포)로부터 유래 된 알 뉴런. 이러한 세포는 처음에 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 얻었다. 이 프로토콜은 다른 배양 기간에서 척추 모폴로지의 분석이 가능하고, 정신 질환 환자로부터 수득 된 것과 제어 개체로부터 얻은 유도 된 다 능성 줄기 세포 사이와 비교 가능.

<html> 본 연구는 IPSC에서 파​​생 된 피라미드 신경 세포의 배양 수상 돌기의 척추 정량 표준화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 척추 인간의 신경 세포에 성숙 표준 설치류 신경의 문화 쪽의 성숙뿐만 아니라에서 생체 내 동물 모델과의 가능한 비교 분석을 할 수 있습니다. 도 1a는 피라미드 피질 뉴런의 생산을 허용 문화의 상이한 단계의 구조를 나타낸다. 이러한 개략적 인 도면은 더 등뼈의 다른 범주 부여 피라미드 신경의 생산의 글로벌 타임 스케일링을 이해하기 위해 제공된다. Reprogrammation 단계는, 그러나,이 연구의 범위 밖이며, 다른 4 설명되었다. 건강한 신경 세포는 65까지 문화에서 유지 될 수있다 -. 70 일도 1b는 이미징 및 등뼈의 3D 정량의 흐름을 보여줍니다. &quot;ove_content&gt; 그림 2A는</st...

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

이 절차의 전반적인 목표는 인간 유도만능줄기세포 유래 신경세포의 수지상 돌기 가시를 이미징하고 이를 3차원으로 정량화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 6-웰 플레이트의 커버슬립을 폴리우레탄과 라미닌으로 처리하여 신경줄기세포 배양 환경을 조성합니다. 그다음 배양액에 희석된 신경줄기세포를 처리합니다.배지를 플레이팅할 때 피펫을 부드럽게 회전시키는 동작을 사용하며, 배양액 내에서 최대 70일 동안 분화하도록 둡니다. 배지를 정기적으로 교체한 후, GFP 렌티바이러스를 통해 세포를 형질전환시키고 anti GFP 항체로 염색하여 시각화합니다. 마지막으로, 배양물을 고정한 뒤 공초점 현미경을 사용하여 수지상 돌기(dendritic spines)의 이미지를 획득합니다.최종적으로, 인간 수지상 돌기(dendritic spine)의 이미지 데이터는 분류 및 정량을 위해 3D로 재구성됩니다. 본 프로토콜은 인간 뇌 피질의 2층에서 4층에 해당하는 글루탐산 작동성 뉴런(glutamatergic neurons)을 얻기 위한 단계별 절차를 제공합니다. 여기에는 이전에 발표된 방법을 기반으로 인간 섬유아세포로부터 유도된 인간 유도 전분화능 줄기세포 유래 신경 줄기세포의 사용이 포함됩니다.기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 DON 우측 및 PY의 자동 3D 분할이 가능하다는 점입니다. 이는 일반적으로 2D 분석만 제공하는 기존 소프트웨어들에 비해 상당한 시간 단축 효과를 가져옵니다. 또한 donr 및 spy 분류 방식은 매우 유용하며 사용법이 간편합니다.신경세포 배양물을 준비하려면, 6-well 배양 접시에 유리 커버슬립을 넣고 poly ornithine을 추가한 후 클린벤치 내에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 DPBS를 사용하여 커버슬립을 3회 세척하고 laminin을 추가한 후 클린벤치 내에서 최소 10시간 동안 배양합니다. 다음 성분을 포함하는 배양 배지를 준비합니다.그 다음, 해당 배지를 사용하여 신경줄기세포(NSCs)를 cm²당 50,000 cells의 밀도로 도말하고 분주합니다. 이때 세포 응집을 줄이기 위해 천천히 회전하며 피펫팅하여 인간 iPSC 유래 뉴런을 형질전환합니다. 성숙 과정의 어느 단계에서든, 신선한 배지가 들어 있는 배양 웰당 40 ng의 GFP 렌티바이러스 벡터가 포함된 스탁 용액 1 µL를 첨가하고 37 °C에서 48시간 동안 배양합니다. 면역형광 염색을 위해 세포를 준비하려면, 배양 배지를 제거하고 4% formaldehyde를 사용하여 실온에서 10분 동안 형질전환된 세포를 고정합니다.그다음 XPBS를 사용하여 세포를 10분씩 3회 세척합니다. 이어서 0.05% Triton X 110 및 horse serum이 첨가된 PBS에 커버슬립을 담그고 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS를 사용하여 커버슬립을 3회 세척합니다.각 커버슬립에 PBS 4% horse serum에 1/1000로 희석한 GFP 1차 항체를 100 µL씩 첨가합니다. 암실 박스에서 4 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 이제 Alexa Fluor 488 접합 항체를 PBS 0.5% tween 20에 1/200로 희석하고, PBS로 슬라이드를 3회 세척한 후 항체 용액과 함께 세포를 실온에서 1시간 동안 배양합니다.형광 현미경 관찰을 위해 마운팅 매질을 사용하여 슬라이드를 마운팅합니다. 공초점 현미경 하에서, 조건당 피라미드 형태의 형태와 수지상 돌기 분지 구조를 가진 건강한 뉴런을 최소 10개 선택하여 수지상 돌기당 60 to 100 micrometers를 정량화합니다. 40 x na, 1.3 오일 대물렌즈와 샘플 수준에서 전형적인 피크 전력이 약 20 micro watts인 488 nanometer 레이저를 사용하여 이미지를 획득하며, 수지상 돌기 가시를 적절하게 샘플링할 수 있도록 픽셀 크기를 약 80 nanometers로 설정합니다.뉴런 전체 부피를 샘플링하려면, Z 간격을 150에서 300 nanometers로 설정하여 Z 스택을 획득함으로써 수지상 돌기 가시의 3D 정량 분석을 위한 20에서 30개의 Z 슬라이스를 생성하십시오. 전처리를 위해 분석 소프트웨어에서 다음 설정을 사용하십시오. 이미지 프로세싱의 smoothing Gaussian filter를 선택하여 가우시안 필터링을 수행하십시오.필라멘트 트레이서(filament tracer) 모듈에서 수상돌기를 반자동으로 추적하려면 필터 너비를 XY 평면의 픽셀 크기와 동일하게 설정하십시오. 슬라이스 탭에서 거리 측정 도구를 사용하여 수상돌기의 직경을 추정합니다. 다음으로 서패스드(surpassed) 탭에서 필라멘트 도구를 클릭하고, 드로우 탭에서의 견고성을 높이기 위해 자동 생성 건너뛰기(skip automatic creation)를 선택하십시오.이제 method에서 select auto path를, type에서 dendrite를 선택하고, 추정되는 dendrite 직경을 입력하십시오. 포인터의 select 모드를 사용하여 커서를 상자 모양으로 변경한 후, shift 키를 누른 상태에서 dendrite 시작 지점을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오. 그러면 소프트웨어가 초기 계산을 수행합니다.이제 시작점에서부터 수지상돌기를 따라 포인터를 이동하십시오. 가장 가능성이 높은 수지상돌기 경로를 나타내는 노란색 선이 표시됩니다. Shift 키와 왼쪽 방향키를 누르십시오.모듈 인터페이스에서 수상돌기 말단을 클릭하여 자동 가시 분할을 수행하십시오. 재구축 드롭다운 목록에서 생성 탭을 클릭하십시오. 수상돌기 직경 재구축을 선택하고 데이터 유지 상자를 체크하십시오.그런 다음 rebuild를 클릭하십시오. 분할된 부피가 실제 수상돌기 부피와 일치하도록 임계값을 설정하십시오. 알고리즘으로는 distance map에서의 shortest distance를 선택하십시오.그런 다음 slice 탭 아래의 next 버튼을 클릭하여 가장 작은 spine, head 직경 및 최대 길이를 결정하십시오. 이어서 surpass 탭에서 파라미터 값을 입력하는데, 최소 직경은 200에서 300 nanometers, 최대 길이는 4 micrometers 정도로 설정하는 것이 적절한 시작점입니다. allow spines 상자를 체크하지 않은 상태에서 next 버튼을 클릭하십시오. 다음으로, spine을 나타내는 파란색 점들이 실제 spine head에 위치하도록 seed points 임계값을 조정하십시오.그런 다음 'Next'를 클릭하십시오. 이제 핵심 계산이 수행되며, 분류 작업에 시간이 소요될 수 있습니다. 모듈 인터페이스의 'Tools' 탭에서 'Classify Spine'을 클릭하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 4개의 클래스가 있는지 확인하면, 모듈 인터페이스가 분류 결과로 4개의 새로운 필라멘트 객체를 생성합니다.마지막으로, 통계 탭에서 'export all statistics to file'을 클릭하여 통계 데이터를 내보내십시오. 이 그림은 anti beta three tubulin 항체로 표지된 인간 뉴런 배양 상태를 보여줍니다. 세포 응집 경향 또한 여기서 분명하게 나타납니다.후기 피질 전구세포로부터 분화된 지 40일이 지난 GFP 표지 파라메탈 뉴런(parametal neuron)의 모습입니다. 표층 피질 층에서 유래하였습니다. 삽입도는 세포체가 뚜렷하게 보이는 저배율 사진입니다.이 패널들은 성숙 단계가 서로 다른 수지상 돌기 가시(dendritic spine) 세그먼트의 3D 재구성 영상을 나타냅니다. 가시 밀도와 가시 머리 부피에 대한 정량적 분석 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 예상한 바와 같이, 이 두 파라미터는 배양 기간이 경과함에 따라 증가합니다.배양 절차를 수행할 때는 세포 응집을 줄이기 위해 완만한 회전 운동과 함께 세포를 천천히 첨가함으로써 신경 줄기세포를 매우 조심스럽게 분주하고 배치하는 것이 중요합니다. 실제로 이 방법은 개별 뉴런의 식별을 필요로 합니다.

three-dimensional-quantification-dendritic-spines-from-pyramidal

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

많은 최근의 연구는 뇌 pathologies와 관련된 시냅스 단백질에 돌연변이가 확인되었습니다. 기본 교양 피질 뉴런이 돌기 척추의 형태와 운동성에서 이러한 질병 관련 단백질의 영향을 조사 큰 유연성을 제공합니다.

교양 CNS의 뉴런의 돌기 스파인 형태론 분석

이 비디오는 신경 줄기 세포의 접착력과 성장을 향상시키기 위해 폴리오르니틴과 라미닌으로 코팅된 유리 커버슬립을 제조하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 순차적인 배양 및 세척을 포함하며, 뉴런에서 발견되는 구조를 모방하여 뉴런 세포 성장 및 분화를 촉진하는 지지 매트릭스의 형성을 촉진합니다.

인간 신경 줄기 세포에서 피질 피라미드 뉴런 생성

출처: Gouder, et. al. 인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생된 피라미드 뉴런의 수지상 가시의 3차원 정량화. J. Vis. 경험. (2015).이 비디오는 공초점 현미경을 사용하여 형질도입된 면역 표지 피라미드 뉴런에서 수지상 가시의 이미징 및 분석을 보여줍니다. 배경 소음이 감소하고 수상돌기가 직경과 길이를 추정하여 추적됩니다. 자동화된 척추 분할에는 수상돌기 및 척추 치수에 대한 매개변수 설정과 척추 분류가 포함됩니다. 3D 모델이 생성되고 분석을 위해 내보내집니다.

공초점 현미경 이미징을 사용한 수지상 가시의 정량화

이 문서는 구조적 조명 현미경 (SIM)을 사용하여 체외에서 해마 신경 세포에서 이미지 돌기 쪽을 작동 프로토콜을 설명합니다. SIM을 사용하여 초 고해상도 현미경 개선 된 세부 사항과 함께 개별 돌기 쪽의 영상을 허용, 크게 세 가지 차원 공간에서 빛의 회절 한계를 넘어 이미지 해상도를 제공합니다.

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

우리는 마우스 모델의 해마에서 수지상 수목화의 시각화 및 정량화를 위한 두 가지 방법, 즉 실시간 이미징과 확장된 피사계 심도 이미징에 대해 설명합니다. 전자의 방법은 정교한 지형 추적과 분기 정도의 정량화를 가능하게 하는 반면, 후자는 수지상 나무를 빠르게 시각화할 수 있습니다.

쥐의 해마 영역의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 수지상 Arborization의 평가

이 프로토콜은 시냅스 가소성을 모델링하기 위한 수지상 척추가 있는 수지상 세그먼트의 3차원(3D) 모델을 개발합니다. 생성 된 메쉬는 CellBlender 및 MCell을 사용하는 소프트웨어 프로그램 블렌더를 사용하여 장기 시냅스 가소성에서 AMPA 수용체 인신 매매의 전산 모델링에 사용할 수 있습니다.

시냅스 가소성을 가진 수지상 척추의 3D 모델링

우리는 신경 화학적 및 행동 적 이상을 뒷받침 할 수있는 뉴런과 수지상 척추의 잠재적 인 형태 학적 변화를 평가하는 데 중요한 피라미드 뉴런에 라벨을 지정하고 분석하는 프로토콜을 제시합니다.

뇌 슬라이스와 기본 세포 배양에서 피라미드 뉴런의 탄도 라벨링

이 프로토콜은 쥐의 해마 및 내측 전두엽 피질에서 뉴런을 염색하기 위해 신경계의 모든 부분에 적응할 수있는 신속한 골지 방법의 변형을 기술합니다.

해마와 전두엽 피질의 Dendritic Spine Visualization을위한 빠른 골지 얼룩

수지상 가시는 대부분의 흥분성 시냅스의 시냅스 후 구획입니다. 수지상 척추 형태의 변화는 신경 발달, 노화, 학습 및 많은 신경 및 정신 장애 중에 발생하며, 이는 신뢰할 수 있는 수지상 척추 분석의 중요성을 강조합니다. 이 프로토콜은 자동 3차원 뉴런 재구성 소프트웨어를 사용하여 수상돌기 척추 형태를 정확하고 재현성 있게 정량화하는 방법을 설명합니다.

자동 3차원 뉴런 재구성 소프트웨어를 사용한 수지상 척추 정량화

이 원고는 뽑은 모발에서 인간 각질세포를 유도 및 유지하고 우발적 벡터에 의한 통합이 없는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)를 후속 생성하기 위한 단계별 절차를 제공합니다.

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

학습하세요 인간 유도 만능 줄기세포에서 유래한 피라미드 뉴런의 돌기 가지를 3차원 정량 분석하는 방법을. 공초점 현미경과 GFP 바이러스 매개 시각화를 활용하여 시냅스 구조와 신경 연결성을 연구합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

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