만성 림프 성 백혈병 환자에서 Methyl-CpG- 결합 도메인 포착 기반 방법을 이용한 포괄적 인 DNA 메틸화 분석

이 연구는 만성 림프 구성 백혈병 (CLL) 환자에서 차별적으로 메틸화 된 CpG가 풍부한 부위를 확인하기 위해 최적화 된 메틸 -CpG 결합 도메인 (MBD) 시퀀싱 프로토콜과 계산 파이프 라인을 설명합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 글로벌 메틸화 프로파일링을 연구하고 차세대 염기서열분석을 사용하여 만성 림프구성 백혈병 환자에서 차등적으로 메틸화된 CpG가 풍부한 영역을 식별하는 것입니다. 이 방법은 잠재적인 CLL 특이적 시그니처 유전자 식별, 질병 발병 기전 및 예후와 같은 후성유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 편향되지 않고 PCR 독립적인 방식으로 CpG 메틸화의 완전한 게놈 전체 적용 범위를 제공한다는 것입니다.

먼저 시중에서 판매되는 DNA 추출 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 환자 및 정상 말초 혈액 단핵 세포 샘플에서 게놈 DNA를 분리합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 게놈 DNA를 정량화한 후 TE 버퍼를 사용하여 각 샘플에서 5마이크로그램의 게놈 DNA를 총 200마이크로리터로 희석하여 마이크로리터당 25나노그램의 최종 농도를 제공합니다. 다음으로, 초음파 처리기를 사용하여 특별히 설계된 튜브에서 30 초 켜기 및 30 초 끄기의 총 30 사이클 동안 초음파 처리를 수행합니다.

5 사이클마다 튜브를 짧게 돌려 샘플을 바닥으로 수집합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA 전기영동을 사용하여 모든 샘플의 초음파 처리 범위를 확인합니다. 마그네틱 스트렙타비딘 비드를 준비하려면 먼저 키트에서 제공하는 스톡 튜브에 다시 매달아 놓습니다.

균일한 현탁액을 얻기 위해 비드를 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 5마이크로그램의 단편화된 DNA 샘플마다 50마이크로리터의 구슬을 깨끗하고 라벨이 부착된 별도의 1.5밀리리터 튜브에 넣습니다. 50마이크로리터의 1X 비드 세척 버퍼를 추가하여 최종 부피인 100마이크로리터에 도달합니다.

튜브를 자기 스탠드에 1분 동안 놓아 모든 자기 구슬이 자석을 향하는 튜브의 내벽에 집중되도록 합니다. 200 마이크로 리터 피펫을 사용하여 비드를 건드리지 않고 액체를 제거하십시오. 그런 다음 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 250마이크로리터의 1X 비드 세척 버퍼를 추가한 다음 비드를 피펫으로 부드럽게 혼합합니다.

모든 샘플에 대해 이 단계를 4회 이상 반복한 후 마지막으로 250마이크로리터의 1X 비드 세척 버퍼에 샘플을 재현탁합니다. 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. MBD-비오틴 단백질을 세척된 비드에 결합하려면 먼저 35마이크로리터의 단백질을 별도의 튜브에 추가하고 1X 비드 세척 버퍼를 사용하여 총 부피를 최대 250마이크로리터까지 가져옵니다.

세척된 비드 250마이크로리터에 희석된 MBD 단백질 250마이크로리터를 추가하고 실온에서 종단 간 회전을 유지합니다. 단백질에 있는 비드를 1시간 동안 혼합한 후, 튜브를 마그네틱 스탠드에 1분 동안 올려 놓아 단백질 결합 마그네틱 스트렙타비딘 비드를 세척합니다. 피펫을 사용하여 비드를 건드리지 않고 액체를 제거합니다.

그런 다음 250마이크로리터의 1X 비드 세척 버퍼를 추가하고 튜브를 실온에서 5분 동안 회전 믹서에 놓습니다. 세척된 MBD-비오틴 비드를 200마이크로리터의 1X 비드 세척 완충액에 다시 현탁시키기 전에 세척 단계를 두 번 더 반복하여 비드를 메틸화된 DNA 캡처를 준비합니다. 깨끗한 1.5ml DNase-free 튜브에 100마이크로리터의 밀리리터 비드 세척 완충액과 180마이크로리터의 단편화된 게놈 DNA를 추가합니다.

DNase가 없는 물을 사용하여 최종 부피를 500마이크로리터로 가져옵니다. 380마이크로리터의 DNase-free 물을 나머지 20리터의 단편화된 게놈 DNA에 추가합니다. 샘플을 동결하여 나중에 추가로 처리하고 입력 DNA 대조군으로 사용합니다.

세척된 MBD-비오틴 비드가 들어 있는 튜브를 마그네틱 스탠드에 1분 동안 놓고 비드를 방해하지 않고 액체를 제거합니다. 그런 다음 비드 세척 완충액에 희석된 500마이크로리터의 단편화된 게놈 DNA를 추가합니다. 모든 튜브를 파라핀 필름으로 단단히 밀봉하고 분당 8-10회 회전하는 종단 간 회전 스탠드에서 섭씨 4도에서 밤새 그대로 두십시오.

DNA 및 MBD 비드 결합 반응 후 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 올려 놓고 모든 비드를 튜브 내벽에 집중시킵니다. 비드를 건드리지 않고 피펫으로 상층액을 제거하고 이 결합되지 않은 DNA 샘플 분획을 얼음에 저장합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 1X 비드 세척 버퍼를 비드에 추가하고 실온에서 3분 동안 회전 스탠드에 튜브를 놓습니다.

마그네틱 스탠드를 사용하여 액체를 제거한 후 세척을 두 번 더 반복하여 결합되지 않은 DNA를 제거합니다. 최종 세척 후 키트에 제공된 200마이크로리터의 고염 용출 완충액을 추가하여 DNA를 용리합니다. 그런 다음 튜브를 회전 스탠드에 놓고 실온에서 15분 동안 놓습니다.

배양 후 마그네틱 스탠드에 1분 동안 놓고 피펫을 사용하여 상층액을 깨끗한 새 1.5ml 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 다음으로, 비드에 200마이크로리터의 고염 용리 버퍼를 추가하고 실온에서 튜브를 추가로 15분 동안 회전시켜 용리를 반복합니다. 첫 번째 용리액 200마이크로리터가 들어 있는 동일한 튜브에 두 번째 용리액을 추가합니다.

DNA를 침전시키기 위해 400 마이크로리터의 용리된 DNA에 1 마이크로리터의 글리코겐, 40 마이크로리터의 3몰 아세트산나트륨, pH 5.2 및 800 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 절대 에탄올을 첨가합니다. 또한 이전에 냉동된 400마이크로리터의 입력 DNA 제어 샘플에 시약을 추가합니다. 튜브를 와류로 잘 혼합한 후 밤새 섭씨 영하 80도에서 배양합니다.

다음날, 30 분 동안 12, 000 시간 g 및 4 섭씨 온도에 관을 원심 분리하십시오. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 버리십시오. 그런 다음 500마이크로리터의 70% 에탄올을 넣고 튜브를 와류로 만듭니다.

동일한 조건으로 튜브를 다시 원심분리하되 15분 동안 피펫을 사용하여 조심스럽게 상층액을 제거합니다. 그런 다음 실온에서 1분 동안 최대 속도로 튜브를 원심분리하고 피펫 팁을 사용하여 잔류 에탄올을 완전히 제거합니다. 펠릿을 실온에서 5분 동안 자연 건조합니다.

마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 메틸화된 DNA 정량화, MBD 염기서열분석 및 분석을 진행하기 전에 10마이크로리터의 DNase-free 물을 DNA 펠릿에 추가합니다. 이 분석은 정상 대조군과 비교하여 CLL 샘플에서 농축된 여러 가지 차등적으로 과메틸화된 영역과 하이포메틸화된 영역을 식별했습니다. 이러한 차등적으로 메틸화된 영역은 서로 다른 종류의 단백질 코딩 및 비암호화 유전자에 매핑되었습니다.

마지막으로, 데이터 분석은 두 개의 서로 다른 정상 대조군 비교에서 얻은 CLL 관련 차등 메틸화 영역 간에 상당한 중복을 보여주었습니다. 여기서, 두 개의 차등적으로 메틸화된 유전자의 표적 영역에 위치한 모든 CpG 부위는 파이로시퀀싱을 사용하여 많은 수의 CLL 샘플에서 검증되었습니다. 이 방법에 필요한 최적의 초음파 처리 범위가 여기에 설명되어 있습니다.

이 범위의 단편화된 DNA는 이상적이며 차세대 염기서열분석 목적에 더 적합합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 최종 DNA 회수에 영향을 미치는 중요한 요소는 사용된 입력 DNA의 품질과 양, 초음파 처리 후 단편화된 DNA의 범위입니다.

이 방법을 사용하기로 결정한 이유는 이 방법이 게놈 전체의 모든 메틸화 영역을 포함하는 메틸화된 DNA를 농축하기 위한 면역침전을 기반으로 하는 최초의 CLL 글로벌 메틸화 연구이기 때문입니다. 이 기술의 의미는 예후 또는 치료로 확장되는데, 그 이유는 식별된 차등적으로 메틸화된 서명 유전자가 치료를 위한 글로벌 정상 바이오마커 및 후성유전학적 표적 역할을 할 수 있기 때문입니다. 이 절차에 따라, 풍성한 메틸로 말한 DNA는 하이브리드화 또는 microarrays를 하는 것과 같은 다른 하류 신청을 위해 배열에 존재하는 CpG 위치의 조정 세트를 사용하여 2개의 표본 또는 질병 실재물 사이 metalomes를 쉽게 비교하기 위하여 이용될 수 있습니다.

마지막으로, 이것은 단백질 코딩 유전자에 걸친 주석이 달린 염기서열과 반복적인 요소 및 긴 비암호화 RNA에 걸쳐 있는 주석이 없는 염기서열을 포함하여 게놈 전반에 걸쳐 메틸화된 염기서열에 대해 많은 수의 환자 샘플을 분석하는 비용 효율적인 기술입니다.