절차 및 자동화 된 모 세관 전기 이동 기반 Immunoassay 방법에 대 한 중요 한 최적화 전략

이 절차의 전반적인 목표는 상용 플랫폼을 사용하여 모세관 전기영동 면역분석을 시연하는 것입니다. 이 플랫폼은 세포 배양 조직 및 생체 유체에서 얻을 수 있는 생물학적 샘플에서 단백질 표적을 구별하고 정량화합니다. 이 공정은 2킬로달톤에서 440킬로달톤에 이르는 크기에 따라 단백질을 검사합니다.

웨스턴 블롯(Western Blot)과 같은 기존 절차에 비해 이 자동화된 절차의 장점은 모세관 전기영동 면역분석법이 겔, 전사 장치 및 수동 세척의 필요성을 없애준다는 것입니다. 또한 필요한 단백질의 절대 양이 약 10배 적기 때문에 희귀 세포 유형 또는 제한된 샘플에 이상적입니다. 또한 자동화 시스템을 사용하여 3시간 이내에 결과를 얻을 수 있으며 기존의 웨스턴 블롯 절차보다 정량성과 재현성이 더 높은 것으로 나타났습니다.

제조업체의 제품 삽입물에 따라 샘플 버퍼, 디티오트레이톨, 형광 마스터 믹스 및 비오틴화 래더를 포함한 키트의 샘플과 시약을 준비합니다. 좋아하는 방법을 사용하여 단백질 샘플을 준비합니다. 여기에서 BEAS-2B 세포 배양에서 전체 세포 추출물을 분리했습니다.

단백질 샘플을 샘플 버퍼로 희석합니다. 5-X 형광 마스터 믹스 1부와 희석된 시료 4부를 혼합하여 원하는 최종 단백질 농도를 얻을 수 있습니다. 마이크로리터당 0.2마이크로그램의 70마이크로리터 최종 단백질 농도를 마이크로리터당 1.2마이크로그램의 단백질 스톡 농도로 시작하는 계산 예가 나와 있습니다.

마스터 믹스는 총 부피의 1/5이며, 이 경우 14마이크로리터입니다. 필요한 단백질 스톡의 부피를 계산하려면 원하는 최종 농도에 총 부피를 곱하고 단백질 스톡 농도로 나눕니다. 총 부피에서 마스터 믹스와 재고 부피를 빼서 샘플 버퍼의 부피를 계산합니다.

준비된 샘플과 사다리를 섭씨 95도에서 5분 동안 가열하여 변성시킵니다. 일부 단백질은 더 부드러운 변성 조건이 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 단백질 응집을 방지하고 이동을 개선하기 위해 10분 동안 70도

더 높은 분자량에서 심한 번짐이 있는 경우 이 옵션을 고려하십시오. 제공된 희석제에 원하는 항체 희석액을 준비합니다. 항체는 일반적으로 기존의 웨스턴 블로팅보다 모세관 기반 면역 분석에 더 높은 농도로 사용됩니다.

사용할 때마다 루미놀과 과산화물의 일대일 혼합물을 신선하게 준비하십시오. 샘플과 시약을 템플릿에 표시된 부피를 사용하여 분석 플레이트에 피펫팅합니다. 색상 코딩은 시약과 샘플이 분석 플레이트에 적절하게 적재되는 것을 나타냅니다.

웰 A1에 대한 피펫 비오틴화 사다리, 웰 A2에서 A25까지 샘플을 준비했습니다. 제공된 항체 희석제는 B1 웰 내지 B25 및 웰 C1에 희석제이다. 웰 C2에서 C25에 대한 1차 항체. 스트렙타비딘 HRP에서 잘 D1. 웰 D2 - D25에 대한 2차 항체.

및 루미놀-과산화물은 E1 내지 E25 웰에 혼합된다. 더 큰 중간 플레이트 웰의 처음 세 줄에 세척 버퍼를 추가합니다. 모세관 면역분석 기기를 켜고 함께 제공된 소프트웨어를 엽니다.

제조업체의 지침에 따라 모세관 카트리지와 분석 플레이트를 기계에 로드하고 실행을 시작합니다. 실행이 완료되면 형광 표준이 올바르게 식별되고 필요한 경우 올바른지 확인합니다. 또한 비오틴화된 래더가 사용된 키트에 대한 올바른 크기 피크를 보여주는지 확인합니다.

자세한 내용은 제조업체의 빠른 참조 가이드 또는 제품 설명서를 참조하십시오. 노출 시간, 단백질 농도 및 항체 희석과 같은 분석 조건의 최적화는 정확하고 재현성 있는 결과를 얻는 데 중요합니다. 이러한 조건은 각 모델 시스템 항체 조합에 따라 다르므로 각각의 새로운 분석에 대해 경험적으로 결정해야 합니다.

정량적 결과를 생성하는 능력은 기판 고갈로 인해 신호 손실 또는 신호 소진이 발생하기 때문에 루미놀 기질이 빠르게 고갈되지 않는 노출 시간 분석에 따라 달라집니다. 이는 그림 2와 같이 다양한 화학발광 노출 시간에서의 데이터를 검사하여 확인할 수 있습니다. 사용된 악기를 사용한 노출은 5초에서 480초 사이였습니다.

레인 뷰(lane views)는 p53 DO-1 항체로 조사된 BEAS-2B 추출물의 단백질 농도가 1:500 희석에서 감소하는 것을 보여주었습니다. 기기 소프트웨어에서 피크 높이로 보고된 화학발광 신호 계수가 중첩됩니다. 시각적 밴드 강도는 기기에 의해 자동으로 조정되며 한 패널에서 다른 패널로 비교할 수 없습니다.

신호 계수는 여기에서 볼 수 있듯이 루미놀이 고갈되면 순차적으로 더 긴 노출로 감소합니다. 신호가 사라지기 시작하고 가장 긴 두 번의 노출에서 피크가 분할됩니다. 이 때문에 데이터 분석을 위해 15초의 짧은 노출 시간이 선택되었습니다.

총 단백질 투입량은 또한 각 특정 분석 및 모델 시스템에 맞게 최적화되어야 합니다. 정량적 평가를 위해서는 각 분석의 선형 동적 범위 내에서 측정을 수행해야 합니다. 여기서 피크 면적으로 측정된 신호의 변화는 샘플의 단백질 양 변화에 비례합니다.

용해물 적정은 1 to 500 p53 DO-1 또는 1 to 50 alpha-Tubulin 항체로 조사할 때 BEAS-2B 용해물의 레인 뷰를 보여줍니다. 선형 회귀 분석은 분석이 테스트된 전체 범위에 걸쳐 선형임을 확인합니다. 선형 범위의 중간에 있는 총 단백질 농도는 어느 방향으로든 잠재적인 표적 단백질 변화를 수용하기 위해 선택되었습니다.

최종 최적화 고려 사항으로 적절한 1차 항체 희석을 평가해야 합니다. 봉합 농도의 항체를 사용하면 측정된 모든 신호 변화가 단백질 양의 변화에만 기인한다는 것을 확인하는 데 도움이 됩니다. 파란색과 주황색 점으로 표시되는 두 개의 BEAS-2B 단백질 샘플을 연속적으로 희석된 알파-튜불린 항체로 조사했습니다.

피크 면적(peak area)으로 측정된 화학발광 신호는 항체 희석에 대해 표시되었습니다. 채도는 1에서 50 희석 부근에서 관찰되었으며, 여기서 곡선은 눈에 띄는 고원을 시작합니다. 따라서 1 대 50이 이 항체에 대한 최적의 희석으로 선택되었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 ProteinSimple Wes 모세관 기반 면역분석 기기에서 시료를 준비하고, 시료를 적재하고, 분석을 실행하는 데 익숙해질 것입니다. 이 절차를 마스터하면 25개의 샘플로 전체 실행을 3시간 내에 수행할 수 있습니다. 실행을 분석할 때 각 모세관 및 샘플에 대한 품질 관리를 수행하는 것이 중요합니다.

여기에는 비오틴화 래더에서 형광 표준물질을 검증하는 것이 포함됩니다. 피크가 잘못 식별된 경우 분석 소프트웨어를 사용하여 주로 올바른 피크를 식별하고 잘못 식별된 피크를 제거해야 합니다. 실험실의 모든 분자 생물학 기법과 마찬가지로 자신과 샘플을 보호하기 위해 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.

여기에는 실험복, 장갑, 보안경 및 발가락이 막힌 신발이 포함됩니다. 측정되는 각각의 새로운 대상에 대해 또는 다른 샘플 소스가 사용될 때 최적화를 수행해야 한다는 점을 명심하는 것이 중요합니다. 검증 및 후속 단계에는 정제된 단백질 또는 항원결정기를 사용하여 항체 특이성 및 신호 평가가 포함됩니다.

일련의 샘플 희석액을 사용하여 분석의 동적 범위를 테스트하고 항체 농도 범위에서 신호 포화도를 평가하여 항체 희석을 최적화합니다. 일단 최적화되면, 이 모세관 면역 절차는 웨스턴 블롯(Western blot)과 같은 기존 방법에 비해 생물학적 샘플의 표적 단백질을 측정하는 더 빠르고 정량적인 방법을 제공할 것입니다.