모 세관 지역 전기 이동 법 탠덤 질량 분석을 사용 하 여 대규모 하향식 단백질

이 방법은 세포에서 단백질 동소 형태 및 단백질 번역 후 변형의 대규모 및 고해상도 특성화를 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모세관 영역 전기 포근 질량 분석법이 손상되지 않은 단백질의 매우 효율적인 분리 및 매우 민감한 검출을 제공한다는 것입니다. 모세관을 미리 치료하려면 질소 가스로 10 psi에서 적어도 12 시간 동안 건조하십시오.

그런 다음 주사기 펌프를 사용하여 메탄올에서 50% 볼륨당 3-프로필 메타크릴레이트로 모세관을 채우게 한다. 실리카 고무로 모세관의 양쪽 끝을 밀봉하십시오. 적어도 24시간 동안 실온에서 배양한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 분리 모세관의 내벽에 선형 폴리아크릴아미드 코팅을 계속한다.

모세관의 한쪽 끝에서 약 4센티미터 떨어진 폴리아미드 외부 코팅을 제거하기 위해 부드러운 화염을 사용하여 모세관의 일부를 구울 수 있습니다. 폴리아미드 코팅을 완전히 제거하기 위해 닦아 모세관의 탄 부분을 부드럽게 청소하십시오. 이 구멍을 통해 나사로 연결되면 모세관을 충분히 제자리에 고정하기 위해 모세관 외량과 동일한 크기의 200 마이크로리터 튜브의 끝에 작은 구멍을 뚫습니다.

연소된 부분이 튜브에 들어갈 때까지 구멍을 통해 번트 부분에 가까운 모세관의 끝을 실어냅니다. 이어서, HF 용액이 모세혈관상탄부분의 절반 정도되도록 200 마이크로리터 튜브에 HF약 150마이크로리터를 첨가한다. HF 용액의 모세관을 실온에서 90~100분 동안 배양한다.

텍스트 프로토콜에 설명된 표준 단백질 혼합물 및 대장균 샘플을 준비한다. 모세관 영역 전기 포근 또는 CZE 시스템을 설정하려면 샘플, 배경 전해질 및 분리 모세관을 CZE 자동 샘플러로 로드합니다. CZE 자동 샘플러의 수동 제어 페이지에서 샘플 부하를 선택합니다.

백그라운드 전해질 바이알을 자동 샘플러의 버퍼 트레이에 로드하여 버퍼 트레이의 위치를 지정합니다. 그런 다음 샘플 유리병을 자동 샘플러의 샘플 트레이에 로드하여 샘플 트레이의 위치를 지적합니다. 수동 제어를 사용하여 자동 샘플러를 정렬 위치에 배치합니다.

이제 모세관의 비에칭 된 끝을 사용하여 분리 모세관을 CZE 자동 샘플러에 적재합니다. 샘플 부피가 50 마이크로리터보다 낮은 경우 모세관의 주입 끝의 높이를 조정합니다. 수동 제어를 사용하여 자동 샘플러를 대기로 전환합니다.

시스템에 샘플 위치를 입력하고 모세관을 샘플로 이동합니다. 모세관의 주입 끝을 더 아래로 밀어 샘플 유리병의 바닥에 도달합니다. 수동 제어를 계속 사용하여 20 psi의 압력을 사용하여 20 분 동안 배경 전해질로 모세관을 플러시하십시오.

이제 상업용 전기학적으로 펌핑된 칼집 흐름 인터페이스를 질량 분광계 의 전면에 장착합니다. 칼집 버퍼 저장소를 LCMS 급 물에서 10% 볼륨 볼륨 메탄올 및 0.2% 부피 포름산을 함유한 버퍼로 채웁니다. 주사기로 수동으로 압력을 가하여 시스 버퍼로 인터페이스에서 T를 플러시합니다.

슬리브 튜브를 통해 전기 스프레이 방출기의 1밀리미터 외부 직경 끝을 스레드하고 피팅을 통해 T의 한 포트와 방출기연결합니다. 주사기로 T를 수동으로 플러시하기만 하면 방사체를 칼집 버퍼로 채우기만 하면 됩니다. 인터페이스와 함께 제공 된 카메라의 도움으로 약 2 밀리미터에 방출기의 오리피스와 질량 분광계의 입구 사이의 거리를 조정합니다.

전기 스프레이용 칼집 완충 유리병에 2~2.2킬로볼트 전압을 적용합니다. 그런 다음 스프레이 전압을 조정하여 안정적인 전기 스프레이에 도달합니다. 모세관에 거품이 없는지 확인하기 위해 이 과정에서 모세관의 주입 끝에 저압을 적용하십시오.

스프레이 전압을 끄고 분리 모세관의 에칭 끝을 T를 통해 방출기에 부드럽게 스레드하여 더 밀수 없을 때까지. 모세관의 주입 끝에서 저압을 중지 한 후, 칼집 버퍼로 방출기를 조금 플러시. 다시, 스프레이 전압의 2 ~ 2.2 킬로볼트를 적용하여 스프레이를 테스트합니다.

기본 계측기 화면의 파일 드롭다운 메뉴 에서 새 메서드를 선택합니다. 거기에서, 시료 유리병을 시작, 샘플 유리병으로 끝, 샘플 바이알로 트레이, 5 psi로 압력, 0으로 킬로볼트, 샘플 주입을위한 95 초로 지속 시간으로 입구를 선택합니다. 이어서, 입구를 입구 바이알로, 트레이를 완충제로, 압력제로, 압력은 제로 psi로, 킬로볼트는 30으로, 표준 단백질 혼합물 샘플의 분리를 위해 4, 200초로 지속한다.

대장균 프로테오메 시료의 분리를 위해 입구 바이알, 트레이를 완충제로, 압력제로, 킬로볼트는 20초, 지속 시간을 6, 600초로 설정한다. 마지막으로 입구 바이알, 트레이를 버퍼로, 압력은 10psi, 킬로볼트를 30초로, 모세관 플러싱의 경우 600초로 선택합니다. 이제 4중 이온 트랩 마스크 분광계를 사용하여 손상되지 않은 단백질 분석을 위해 MS 및 MS/MS 매개변수를 설정합니다.

튜닝 파일 설정을 조정하려면 그대로 단백질 모드를 켜고 0.2의 트래핑 압력을 사용합니다. 이온 이송 모세관 온도를 섭씨 320도, S 렌즈 RF 레벨을 55도로 설정합니다. CZE MS/MS 실험을 수행하려면 먼저 실행 시퀀스를 선택하여 질량 분광계 컴퓨터에서 데이터 수집 방법을 시작합니다.

이어서, 모세관 전기포레시스 자동 시퀀스를 모세관 전기지질 자동 시료 컴퓨터에서 시작한다. TopPIC 제품군과 TopPIC 그래픽 사용자 인터페이스에서 TopPIC를 사용하여 데이터베이스 검색을 수행합니다. 데이터베이스 파일을 클릭하고 검색에 적합한 데이터베이스를 선택합니다.

스펙트럼 파일을 클릭하고 생성된 ms2를 선택합니다. 입력으로 생성된 msalign 파일입니다. MS1 피처 파일을 선택하고 생성된 피쳐 파일을 선택합니다.

시스테인 카르바미도메틸 C57을 요도아세타미드 처리로 인한 고정 변형으로 설정한다. 미끼 데이터베이스 기능을 선택하고 차단 설정 에서 스펙트럼 수준 옆에 있는 드롭다운 메뉴에서 잘못된 검색률을 선택합니다. 스펙트럼 수준에서 잘못된 검색 속도를 0.01로 설정합니다.

생성 함수를 선택 취소하고 오류 허용 오차를 백만 개당 15개 부품으로 설정합니다. 프로테오폼 수준에서 잘못된 검색 률을 0.05로 설정합니다. 고급 매개 변수에서 드롭다운 메뉴의 최대 질량 이동 수에 대해 두 개를 선택합니다.

알 수 없는 수정의 최대 질량 이동을 500 달톤으로 설정합니다. 다른 모든 매개 변수를 기본 값에 두고 그래픽 사용자 인터페이스의 오른쪽 하단에 있는 시작 단추를 클릭합니다. 표준 단백질 혼합물에 대한 대표적인 전기페로그램이 도시된다.

표준 단백질 혼합물은 전형적으로 시스템의 분리 효율 및 재현성을 평가하기 위해 적어도 복제하여 실행된다. 분리 효율은 일부 단백질의 이론적 플레이트 수로 평가될 수 있다. 재현성은 단백질 강도 및 이동 시간의 상대적 표준 편차에 의해 평가될 수 있다.

CZE MS/MS 플랫폼은 다양한 복합 프로테오옴에서 프로테오폼의 대규모 특성화에 사용될 수 있으며, 높은 확신을 가진 단일 실행에서 대장균 프로테오메에서 500개 이상의 프로테오폼과 190가지 단백질을 식별합니다. 여기서, 전기페로그램의 확대된 보기를 사용하여 시스템의 분리 창을 평가할 수 있다. 매우 낮은 E-값 및 스펙트럼 FDR은 프로테오폼 ID의 높은 자신감을 시사합니다.일치하는 조각 이온의 높은 수는 ID의 높은 자신감을 더 나타냅니다.이 절차를 시도하는 동안 에칭 분리 모세관을 전자 스프레이 방출기로 천천히 부드럽게 스레드하는 것이 중요합니다.

안정적인 동위원소 라벨링 또는 라벨프리 메서드는 CZE MS 절차에 통합되어 다양한 조건에서 세포에서 프로테오폼 풍부가 어떻게 변하는지 확인할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 세포에 있는 각종 생물학 프로세스를 통제에 있는 proteoforms의 역할을 탐구하기 위하여 하향식 proteomics의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다. 수력 불소산과 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 적절한 개인 보호 장비와 같은 예방 조치를 취하고 이 절차를 수행 할 때 비상 절차를 밟아야한다는 것을 잊지 마십시오.