비오틴 유도체를 사용한 표적 표면 단백질의 내재화 평가

절단 가능한 비오틴 유도체로 마우스 피질 성상세포를 처리합니다.

단백질 내재화를 방지하고 표적 표면 단백질에 비오틴 부착을 촉진하기 위해 저온에서 배양합니다.

세척하고 따뜻한 배지를 첨가한 다음 배양하여 비오티닐화된 단백질의 내재화를 유도합니다.

내재되지 않은 비오틴을 절단하기 위해 막 불투과성 환원제로 세척하고 처리합니다.

담금질 시약을 첨가하여 반응을 멈추고 세척합니다.

세포를 수확하고 원심분리합니다. 상청액을 제거합니다.

용해 완충액을 첨가하여 세포를 용해하여 비오티닐화 및 내재화된 비오티닐화 단백질을 방출합니다.

원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다.

단백질을 함유한 상청액을 수집하고 스트렙타비딘-아가로스 비드를 첨가하고 혼합하여 비오티닐화된 단백질을 포획합니다.

원심분리하여 구슬을 펠릿화하고 상층액을 버립니다.

로딩 완충액을 첨가하고 가열하여 가열하여 단백질을 변성시키고 비드에서 방출합니다.

단백질을 겔에 바르고 블로팅 멤브레인에 옮깁니다.

1차 및 2차 항체를 사용하여 뚜렷한 단백질 밴드를 시각화하여 성공적인 단백질 내재화를 확인합니다.

먼저, 인큐베이터에서 성상세포 배양물을 제거하고 배지를 흡인합니다. 그런 다음 식힌 CM-PBS 4밀리리터로 세포를 세 번 씻고 으깬 얼음 위에 접시를 놓습니다. CM-PBS를 흡인한 다음 3밀리리터의 비오틴 완충액을 각 접시에 피펫팅합니다. 접시를 앞뒤로 몇 번 기울여 완충액이 잘 분포되도록 하고 얼음 위에 30분 동안 그대로 둡니다.

그런 다음 비오틴 완충액을 흡인하고 5밀리리터의 따뜻한 배지로 교체합니다. 배양 접시 하나를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하고 두 번째 접시를 같은 온도에서 30분 동안 배양합니다. 섭씨 4도의 다른 접시를 0분 샘플로 남겨 둡니다.

배양 기간이 끝나면 배지를 버리고 냉각된 CM-PBS 4밀리리터로 세포를 세 번 세척합니다. 그런 다음 CM-PBS를 흡인한 다음 세포 위에 환원 완충액 6밀리리터를 피펫팅하고 샘플을 얼음 위에 15분 동안 둡니다.

그런 다음 배지를 6밀리리터의 신선한 환원 완충액으로 교체하고 샘플을 얼음 위에 추가로 15분 동안 놓습니다.

환원 완충액 내에 포함된 글루타티온이 세포 표면에 남아 있는 비오틴 부분을 절단하기 때문에 이 단계는 매우 중요합니다. 이렇게 하면 내재화된 단백질만 편향되고 라벨링됩니다.

그런 다음 환원 용액을 제거하고 담금질 완충액 6밀리리터로 교체합니다. 샘플을 얼음 위에 15분 더 두었다