항체의 특이성 프로파일링을 위한 펩타이드 마이크로어레이 기술

표적 및 비표적 번역 후 변형 또는 PTM이 있는 히스톤 펩타이드가 포함된 마이크로어레이 슬라이드를 가져갑니다.

펩타이드는 스트렙타비딘 기능화된 유리 슬라이드의 특정 지점에서 접액 비오틴을 통해 고정됩니다.

반점에는 고정화된 비오틴 접합 녹색 형광단도 포함되어 있어 반점 식별이 용이합니다.

비특이적 항체 상호작용을 방지하기 위해 차단 완충액을 도입합니다.

완충액을 제거하고 원심분리하여 슬라이드를 건조시킵니다.

왁스 임프린트 내부에서 배열을 왁스로 경계합니다.

하이브리드화 버퍼로 어레이를 평형화합니다.

표적 PTM에 특이적인 1차 항체와 함께 배양합니다.

1차 항체에 결합하는 적색 형광단 접합 2차 항체를 도입합니다.

결합되지 않은 항체를 제거하고 원심분리하여 슬라이드를 건조시킵니다.

마이크로어레이 스캐너를 사용하여 슬라이드를 이미지화합니다. 녹색 형광은 반점을 식별하는 데 도움이 되고, 빨간색 형광은 PTM-항체 상호작용을 나타내어 항체 특이성을 보여줍니다.

표적 PTM의 인식은 항체 특이성을 나타내는 반면, 비표적 PTM의 인식은 항체 교차 반응성을 나타냅니다.

소스 플레이트 맵에 따라 각 펩타이드 특징의 1-2마이크로리터를 하나 이상의 384웰 소용량 플레이트의 지정된 웰에 로드합니다. 1% 소 혈청 알부민 및 마이크로리터당 5마이크로그램의 소 혈청 알부민과 마이크로리터당 5마이크로그램의 단백질 마이크로어레이 프린팅 완충액으로 각 특징을 10배 희석합니다. 그런 다음 플레이트를 실온에서 500배 g으로 2분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 마이크로어레이 프린터의 폐기물을 비웁니다. 가습기 용기에 세척액을 멸균 증류수를 채웁니다. 마이크로어레이 프린터 소프트웨어에 어레이 슬라이드 매개변수를 입력합니다.

세탁 절차를 한 번 담그고 1초 동안 세탁하고, 세척 후 후 핀을 5번 교체하고, 습도를 60%로 설정합니다. 그런 다음 스트렙타비딘 코팅된 유리 슬라이드를 기판 플래튼에 삽입합니다. 플래튼을 플래튼 엘리베이터에 로드합니다. 소스 플레이트를 플레이트 홀더에 삽입하고 홀더를 소스 플레이트 엘리베이터에 로드합니다. 인쇄 프로세스를 실행합니다.

그런 다음 기기에서 기판 플래튼을 제거합니다. 1x 단백질 마이크로어레이 차단 완충액으로 인쇄된 슬라이드를 30분 동안 흔들면서 차단합니다. 그런 다음 슬라이드를 실온 pH 7.6 인산염 완충 식염수로 10분 동안 세척합니다. 새로운 PBS 배치로 세척을 반복합니다. 슬라이드를 실온에서 30초 동안 원심분리하여 건조시킵니다.

그런 다음 마이크로어레이 왁스 임프린터를 섭씨 85도에서 30분 동안 또는 왁스가 녹을 때까지 예열합니다. 그런 다음 슬라이드를 인쇄된 면이 아래로 향하도록 홀더에 삽입하고 홀더를 임프린터 몰드에 맞춥니다. 금형을 슬라이드에 접촉시키고 2초 동안 유지합니다. 그런 다음 홀더에서 슬라이드를 빠르게 제거하고 왁스 테두리를 검사하여 어레이가 제대로 밀폐되었는지 확인합니다. 분할된 슬라이드는 섭씨 4도의 건조하고 어두운 곳에 보관하십시오.

하이브리드화 절차를 시작하려면 분할된 어레이 슬라이드를 플라스틱 접시에 놓고 슬라이드를 하이브리드화 버퍼로 덮습니다. 저속으로 흔들면서 섭씨 30도에서 4분 동안 슬라이드를 평형을 유지합니다. 실온에서 마이크로어레이 슬라이드 원심분리기에서 회전시켜 슬라이드를 건조시킵니다. 그런 다음 각 히스톤 PTM 항체 용액 5마이크로리터를 어레이의 최소 2개 웰에 추가하고 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다.

배양 후, 항체 용액을 제거하고 어레이를 차가운 PBS로 섭씨 4도에서 각각 5분 동안 세 번 세척합니다. 다음으로, 빛이 없는 상태에서 섭씨 4도에서 30분 동안 형광 염료 접합 2차 항체 용액에서 어레이를 배양합니다. 이전과 같이 차가운 PBS로 슬라이드를 세 번 세척합니다.

어레이를 실온 0.1x PBS에 담가 과도한 염분을 제거하고 실온에서 짧은 원심분리로 슬라이드를 건조시킵니다. 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 최소 25미크론의 해상도로 슬라이드를 이미지