시퀀스 및 선택적 인식 하 여 단일 가닥 RNAs에 더블-좌초 RNAs의 화학적 펩 티 드 핵 산 수정

이 방법 기사의 전반적인 목표는 화학적으로 변형된 펩타이드 핵산에 의한 이중 가닥 RNA의 분자 인식을 연구하기 위해 우리 실험실에서 사용하는 자세한 프로토콜을 소개하는 것입니다. 이 방법은 RNA 구조의 검출 및 표적화와 같은 RNA 화학 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 설계 원리가 모든 RNA 이중 구조의 표적화에 적용할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 연구원인 데지레 토(Desiree Toh)가 맡을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 이전에 준비한 RNA PNA 샘플에 35% 글리세롤 용액 4마이크로리터를 추가하고 부드럽게 혼합합니다. 마이크로피펫 및 젤 로딩 팁을 사용하여 각 샘플을 미리 준비된 폴리아크릴아미드 겔에 조심스럽게 20마이크로리터씩 넣고 기포가 유입되지 않도록 합니다.

250볼트의 일정한 전압에서 5시간 동안 젤을 실행합니다. 5시간 후 전원 공급 장치를 끄고 젤 스탠드에서 유리판을 제거합니다. 그런 다음 젤 밀봉 테이프를 제거하고 유리판을 분해합니다.

유리판에서 젤을 부드럽게 제거하고 350ml의 탈이온수로 채워진 용기에 넣습니다. 35마이크로리터의 브롬화 에티듐을 용기에 조심스럽게 넣고 플랫폼 셰이커에 올려 저속으로 30분 동안 놓습니다. 브롬화 에티듐 용액을 처분 한 후 1.5-2 리터의 증류수로 겔을 헹굽니다.

그런 다음 532나노미터의 녹색 레이저와 610나노미터로 설정된 방출 필터로 이미저를 사용하여 젤을 스캔합니다. 무료 소프트웨어를 사용하여 겔 밴드 강도를 정량화합니다. 적절한 양의 2-아미노퓨린 표지 이중 가닥 RNA를 깨끗한 1.5ml 튜브로 전달합니다.

그런 다음 진공 농축기를 사용하여 RNA 용액을 농축합니다. 다음으로, 이전에 준비된 주 재고에서 다양한 농도에 대한 적절한 부피의 표적 PNA를 1.5ml 튜브를 분리하기 위해 이동합니다. 진공 농축기를 사용하여 PNA 용액을 농축합니다.

건조된 RNA가 들어 있는 튜브에 975마이크로리터의 배양 완충액을 추가하고 모든 RNA가 용해되도록 철저히 혼합합니다. RNA 용액을 잠시 원심분리한 후 튜브를 예열된 열 블록에 10분 동안 넣어 어닐링합니다. 완료되면 열 블록을 끄고 샘플을 실온으로 식힙니다.

건조된 PNA가 들어 있는 각 튜브에 75마이크로리터의 RNA를 추가하고 완전히 섞습니다. 샘플을 실온에서 최소 1시간 동안 방치한 후 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 이제 적절한 양의 2-아미노퓨린 표지 단일 가닥 RNA를 1.5ml 튜브를 분리하기 위해 전달합니다.

다양한 농도에 대한 적절한 부피의 표적 PNA를 주 스톡에서 단일 가닥 RNA를 포함하는 각 튜브로 전달합니다. 샘플을 건조시킨 후 각 튜브에 75마이크로리터의 배양 버퍼를 추가하고 완전히 혼합합니다. 각 튜브를 10분 동안 예열된 가열 블록에 넣어 각 샘플을 어닐링합니다.

샘플을 실온으로 식힌 후 밤새 섭씨 4도에서 배양합니다. 그런 다음 각 샘플 70마이크로리터를 1cm 정사각형 큐벳으로 옮깁니다. 큐벳을 형광 분광 광도계에 놓고 330 - 550 나노미터의 파장 범위에서 방출을 측정합니다.

측정이 완료되면 큐벳에서 버퍼를 제거합니다. 큐벳을 증류수로 헹구고 질소 가스로 건조시킵니다. 모든 샘플에 대해 측정을 반복한 후 파장에 대한 형광 강도를 플롯합니다.

적절한 양의 단일 가닥 RNA를 1.5ml 튜브를 분리하기 위해 전달합니다. 그런 다음 적절한 부피의 표적 PNA를 주 스톡에서 단일 가닥 RNA를 포함하는 각 튜브로 전달합니다. 샘플을 건조시킨 후 각 튜브에 130마이크로리터의 배양 완충액을 추가하고 완전히 혼합합니다.

각 튜브를 10분 동안 예열된 가열 블록에 넣어 각 샘플을 어닐링합니다. 샘플을 실온으로 식힌 후 밤새 섭씨 4도에서 배양합니다. 이제 각 시료 130마이크로리터를 배양 완충액이 포함된 하나의 셀이 있는 8개의 마이크로셀 큐벳으로 옮깁니다.

UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 260나노미터에서 각 샘플의 흡광도를 측정합니다. 온도를 섭씨 15도에서 95도까지 상승시킨 다음 온도를 섭씨 95도에서 15도로 낮추는 조건에서 측정합니다.amp 분당 섭씨 0.5도의 속도 PNA 올리고머는 2회의 역상 HPLC 정제 후에 수득하였다.

PNA의 정체는 MALDI/TOF 분석을 통해 확인할 수 있습니다. 비변성 PAGE 데이터는 Q 및 L 변형 PNA가 C-G 쌍을 가진 이중 가닥 RNA 영역만 인식할 수 있음을 시사합니다. 이 특이하고 향상된 인식은 T-A-U-L-G-C 및 Q-C-G PNA RNA 2 기반 삼중 형성을 통해 이루어집니다.

2-아미노퓨린 형광 적정 연구는 Q 및 L 변형 PNA가 표적 이중 가닥 RNA에 결합하지만 단일 가닥 RNA에는 결합하지 않는다는 것을 보여주었습니다. Q 잔기를 포함하는 PNA는 Q-G 쌍과 같은 Watson Watson-Crick의 입체 충돌로 인해 단일 가닥 RNA에 대한 결합이 없음을 시사하는 열 용융 전이를 나타내지 않습니다. 변형되지 않은 PNA P1과 비교하여 L 잔기를 포함하는 PNA P4 및 P5는 L-G 쌍과 같은 Watson-Crick의 입체 충돌로 인해 해당 RNA PNA 듀플렉스에 대해 더 낮은 용융 온도를 나타냅니다.

UV 흡광도 검출 열 용융 데이터는 2-아미노퓨린 형광 적정 데이터와 일치하며, 이는 Q 및 L 잔기를 포함하는 PNA가 단일 가닥 RNA에 강하게 결합하지 않음을 보여줍니다. Q 베이스를 통합하는 것은 Q 베이스가 Q-G 쌍과 같은 왓슨-크릭의 형성에서 더 큰 입체 충돌을 일으키기 때문에 L 베이스보다 더 불안정합니다. 일단 숙달되면 다양한 실험을 제대로 수행하면 일주일 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차에 따라 이중 가닥 RNA 결합 PNA를 사용하여 RNA 구조를 감지하고 RNA 기능을 조절할 수 있는지 여부와 같은 추가 질문에 답하기 위해 세포의 RNA 구조를 프로빙 및 표적으로 삼는 것과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 RNA 생물학 및 질병 분야의 연구자들이 RNA 구조를 대상으로 하는 치료 개발을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.