시퀀스 및 선택적 인식 하 여 단일 가닥 RNAs에 더블-좌초 RNAs의 화학적 펩 티 드 핵 산 수정

본 방법론 논문의 전반적인 목적은 화학적으로 변형된 펩타이드 핵산에 의한 이중 가닥 RNA의 분자 인식 연구를 위해 저희 연구실에서 활용하는 상세 프로토콜을 소개하는 것입니다. 이 방법은 RNA 구조의 검출 및 표적화와 같은 RNA 화학 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 그 설계 원리를 모든 RNA 이중 가닥 구조의 표적화에 적용할 수 있다는 점입니다.

본 실험 과정의 시연은 저희 연구실의 연구원인 Desiree Toh가 담당하겠습니다. 이 절차를 시작하기 위해, 이전에 준비한 RNA PNA 샘플에 35% glycerol 용액 4 µL를 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 마이크로피펫과 겔 로딩 팁을 사용하여, 기포가 생기지 않도록 주의하며 이전에 준비한 폴리아크릴아마이드 겔에 각 샘플 20 µL를 조심스럽게 분주합니다.

겔을 250 V의 정전압으로 5시간 동안 전기영동합니다. 5시간 후, 전원 공급 장치를 끄고 겔 스탠드에서 유리판을 제거합니다. 그런 다음 겔 밀봉 테이프를 제거하고 유리판을 분해합니다.

겔을 유리판에서 조심스럽게 떼어내어 350 milliliters의 탈이온수가 채워진 용기에 넣습니다. 용기에 35 microliters의 ethidium bromide를 조심스럽게 첨가하고, 플랫폼 쉐이커 위에 올려 저속으로 30분 동안 흔들어 줍니다. ethidium bromide 용액을 폐기한 후, 1.5에서 2 liters의 증류수로 겔을 헹굽니다.

그런 다음 532 nanometers의 녹색 레이저와 610 nanometers로 설정된 방출 필터가 장착된 이미지 분석기로 젤을 스캔합니다. 무료 소프트웨어를 사용하여 젤 밴드의 강도를 정량화합니다. 적절한 양의 2-aminopurine 표지 이중 가닥 RNA를 깨끗한 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다.

그 다음, 진공 농축기를 사용하여 RNA 용액을 농축합니다. 이어서, 이전에 준비한 메인 스톡에서 다양한 농도를 위한 적절한 부피의 표적 PNA를 각각 별도의 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다. 진공 농축기를 사용하여 PNA 용액을 농축합니다.

건조된 RNA가 들어있는 튜브에 975 µL의 배양 버퍼를 넣고, 모든 RNA가 완전히 용해되도록 충분히 혼합합니다. RNA 용액을 짧게 원심분리한 후, 튜브를 예열된 히트 블록에 10분 동안 넣어 어닐링을 수행합니다. 완료되면 히트 블록의 전원을 끄고 샘플을 실온까지 식힙니다.

건조된 PNA가 들어 있는 각 튜브에 75 µL의 RNA를 첨가하고 충분히 혼합합니다. 샘플을 실온에서 최소 1시간 동안 방치한 후, 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이제 적절한 양의 2-aminopurine 표지 단일 가닥 RNA를 각각의 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.

다양한 농도의 표적 PNA를 메인 스톡에서 각각의 단일 가닥 RNA가 포함된 튜브로 적절한 부피만큼 옮깁니다. 샘플을 건조시킨 후, 각 튜브에 75 microliters의 배양 버퍼를 추가하고 충분히 섞습니다. 각 튜브를 미리 가열된 히트 블록에 10분 동안 두어 각 샘플의 어닐링을 수행합니다.

시료를 실온까지 식힌 후, 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그 다음, 각 시료 70 µL를 1 cm² 큐벳에 옮깁니다. 큐벳을 형광 분광광도계에 넣고 330에서 550 nm의 파장 범위에서 방출 스펙트럼을 측정합니다.

측정이 완료되면 큐벳에서 완충액을 제거하십시오. 큐벳을 증류수로 헹구고 질소 가스로 건조시키십시오. 모든 시료에 대해 측정을 반복한 후, 파장에 따른 형광 강도를 도표로 나타내십시오.

적절한 양의 단일 가닥 RNA를 각각의 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다. 그다음, 메인 스톡에서 적절한 부피의 표적 PNA를 단일 가닥 RNA가 들어 있는 각각의 튜브로 옮깁니다. 샘플을 건조시킨 후, 각 튜브에 130 microliters의 배양 버퍼를 넣고 충분히 섞어줍니다.

각 튜브를 미리 가열된 히트 블록에 10분 동안 넣어 각 샘플을 어닐링합니다. 샘플을 상온으로 냉각시킨 후, 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이제 각 샘플 130 µL를 배양 버퍼가 들어 있는 8-마이크로셀 큐벳의 각 셀로 옮깁니다.

UV-Vis 분광광도계를 사용하여 각 시료의 260 nm에서 흡광도를 측정합니다. 15°C에서 95°C까지 온도를 높이며 측정하고, 이어서 분당 0.5°C의 램프 속도로 95°C에서 15°C까지 온도를 낮추며 측정합니다. PNA 올리고머는 두 번의 역상 HPLC 정제를 통해 얻었습니다.

PNA의 정체성은 MALDI/TOF 분석을 통해 확인할 수 있습니다. 비변성 PAGE 데이터는 Q 및 L이 수식된 PNA가 C-G 쌍이 있는 이중 가닥 RNA 영역만을 인식할 수 있음을 시사합니다. 이러한 특이적이고 강화된 인식은 T-A-U-L-G-C 및 Q-C-G PNA RNA의 2-염기 트리플 형성으로 인한 것입니다.

2-aminopurine 형광 적정 연구 결과, Q 및 L로 변형된 PNA는 표적 이중 가닥 RNA에는 결합하지만 단일 가닥 RNA에는 결합하지 않는 것으로 나타났습니다. Q 잔기를 포함하는 PNA는 열적 융해 전이를 보이지 않았으며, 이는 Watson-Crick 유사 Q-G 쌍의 입체 장애로 인해 단일 가닥 RNA와의 결합이 일어나지 않음을 시사합니다. 변형되지 않은 PNA P1과 비교했을 때, L 잔기를 포함하는 PNA P4와 P5는 Watson-Crick 유사 L-G 쌍의 입체 장애로 인해 해당 RNA-PNA 이중 가닥의 융해 온도가 더 낮게 나타났습니다.

UV 흡광도로 검출된 열변성 데이터는 2-aminopurine 형광 적정 데이터와 일치하며, 이는 Q 및 L 잔기를 포함하는 PNA가 단일 가닥 RNA에 강하게 결합하지 않음을 보여줍니다. Q 염기의 도입은 L 염기보다 더 불안정하게 만드는데, 이는 Q 염기가 Watson-Crick 유사 Q-G 쌍을 형성할 때 더 심각한 입체 장애를 일으키기 때문입니다. 숙달된 후에는 적절하게 수행한다면 일주일 안에 다양한 실험을 완료할 수 있습니다.

본 절차 이후, 이중 가닥 RNA 결합 PNA를 사용하여 RNA 구조를 검출하고 RNA 기능을 조절할 수 있는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 세포 내 RNA 구조의 프로빙 및 타겟팅과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 RNA 생물학 및 질환 분야의 연구자들이 RNA 구조 타겟 치료제 개발을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.