Name: 시퀀스 및 선택적 인식 하 여 단일 가닥 RNAs에 더블-좌초 RNAs의 화학적 펩 티 드 핵 산 수정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 학습하세요 화학적으로 변형된 펩티드 핵산(PNA)을 이용한 이중가닥 RNA 분자 인식 프로토콜입니다. 형광 및 UV-Vis 분광법으로 결합 친화도를 측정하여 RNA 화학생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 싱가포르 교육 (MOE) 계층 1의 (RGT3/13 및 RG42/15 G.C.)와 모에 계층 2 (MOE2013-t 2-2-024 및 MOE2015-t 2-1-028 G.C.에)에 의해 지원 되었다.

여기에서 보고 된 작업에 따라 (팻/179/14/15/PCT) 특허 출원을 제기 했다.

RNA 이중 바인딩 PNA 올리고 (예를 들어, 10 메)는 중간 크기의 분자 그리고 따라서 표시할 수 있습니다 바인딩 시 전기 이동 기동성 교대 RNAs를 비교 또는 약간 더 큰 크기 (예를 들어, 50-메 르 또는 더 작은). RNA PNA 보다 상당히 큰 경우에, 제한 된 젤 기동성 교대 때문 RNA에 PNA의 적정 작동 하지 않을 수 있습니다. 따라서, 비 변성 시키기 페이지 분석 실험에 대 한 큰 RNA는 잘릴 수 있습니다. Fluorophore 표시 된 PNA에 큰 RNA의 적정 감시를 위한 세 겹 형성 비 변성 시키기 agarose 젤에 의해 젤40중간 로드 샘플 수 있습니다.
RNA의 일정 총 농도와 비 변성 시키기 페이지 적정 실험을 위해 우리는 일반적으로 효율적인 게시물 ethidium 평범한 사람에 의해 무료 RNA와 트리플 밴드의 얼룩에 대 한 1 µ M의 레이블이 RNA 농도 사용 합니다. RNA 농도 0.2 µ M로 낮은 RNA 구조31에 따라 충분 한 있을 수 있습니다. 레이블이 없는 RNA의 농도 (0.2 µ M)를 정확 하 게 측정 될 수 있다 Kd 값은 0.2 µ M에 대 한 또는 더 큰 이어야 합니다 결정 합니다. 다른 얼룩 염료 착 효율을 향상 시키기 위해 사용할 수 있습니다. 또는 게시 되지 않은 데이터 Cy3 염료-표시 된 RNAs 꽉 바인딩 이벤트 측정 하 비 변성 시키기 페이지 실험에 사용할 수 있습니다 것이 좋습니다.
사실은 2-aminopurine은 적당히 형광만, 2-aminopurine 형광 적정도 Kd 값 0.2 µ M31이상 가까이 바인딩의 측정에 제한 됩니다. RNA 또는 PNA 측정 형광 적정을 통해 솔루션에 상대적으로 꽉 바인딩 바인딩 변경 형광 신호53,54, 경우에 상대적으로 밝은 염료와 함께 표시 될 수 있습니다. 55.
DsRNA 바인딩 PNAs에 의해 RNA 구조를 대상으로 전략 RNAs의 제한 된 수에 대 한 테스트 되었습니다. 바인딩 속성 따라 달라질 수 있습니다 다른 시퀀스와 자료 쌍 작곡으로 dsRNAs 높습니다. 하나는 항상 TFPNAs의 디자인에 대 한 이중의 퓨 린 부유한 가닥을 선택할 수 있습니다. 어떻게 연속 Q·를 이해 하는 것이 중요 C G 세 배는 삼박자의 안정성에 영향을 수 있습니다. 더 광범위 한 시퀀스 종속 연구 명확 하 게 TFPNAs의 시퀀스 종속 바인딩 속성을 이해 하는 것 필요 합니다.
TFPNAs의 바인딩 선호도 길이 증가 및/또는 추가는 기초 및 백본56,57 TFPNAs의 수정 더 향상 될 수 있습니다. 그러나, 연속 이중 지역 수 있습니다 자주 구성 하지 중단 없이 10 개 이상의 연속 기본적인 쌍의 비 왓슨 크릭 구조에 의해. 하나 비 왓슨 크릭 구조 dsRNA 지역에 인접 한의 인식에 대 한 작은 분자와 TFPNAs 켤레 있습니다. 원칙적으로, TFPNA-작은 분자 공액 바인딩 친 화력과 특이성 TFPNA 또는 작은 분자 혼자에 비해 향상 예정입니다. 그러나,는 활용58,59,60,61,,6263,64에 대 한 링커의 화학 및 물리적 특성 최적화 해야 합니다.
TFPNAs 바인딩할 수 있는 선택적으로 dsRNAs ssRNAs와 dsDNAs는 사실 매우 유용한 화학 프로브 및 RNA 구조 역학 및 상호작용의 규칙을 통해 잠재적인 치료 ligands로 TFPNAs를 개발 하는 것을 제안합니다 단백질 그리고 대사 산물입니다. TFPNAs의 세포질 통풍 관 작은 분자, 펩 티 드, 등 나노 입자, 세포 관통 moieties로 활용 또는 리5,6 같은 supramolecular 구조 complexation을 통해 촉진 될 수 있습니다. ,12,17,25,31,41,,6566. 더 fluorophores 등 radioisotopes bioimaging 태그와 TFPNAs의 기능화 용이 하 게 하는 검색, 이미징, 및 살아있는 유기 체에서 기능 RNA 구조를 대상으로 수 있습니다.

RNAs는 중요 한 생체 및 규칙에서 RNAs의 역할의 발견과 다양 한 생물 학적 과정1,2,3의 촉매의 최근 발전으로 인해 치료 대상으로 등장 하고있다. 전통적으로, 센스 가닥 왓슨 크릭 이중 형성3,,45,6,7,8, ssRNAs 바인딩할 사용 되었습니다. 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. 최근, 펩 티 드 핵 산 세 겹 형성 (TFPNAs) Hoogsteen 수소 결합 (그림 1)3,,2829통해 dsRNAs 바인딩할 설계 되었습니다. dsRNA는 사전 mRNAs와 mRNAs, 사전 또는 pri miRNAs3, 그리고 많은 다른 비 코딩 RNAs1,,2627를 포함 하 여 전통적인 antisense 대상 RNAs의 대부분에 존재. TFPNAs를 사용 하 여 트리플 헬릭스 형성을 통해 dsRNAs 타겟팅의 구조 특이성 때문에 유리한 수 있습니다 고는 dysregulated 질병, 예를 들면 RNAs의 정상적인 기능을 복원에 사용 하기 위해 큰 잠재력입니다.
최근에 출판 된3,,2829,30,31,32,33, Rozners 그 외 여러분, 그리고 우리에 의해 작동 34,35,36,,3738,39,40,41, 개선에 노력을 보고 향상 된 선호도 dsRNAs 향해 수정된 TFPNAs의 선택적 바인딩. Thio-pseudoisocytosine (L) 단위체30 및 guanidine 수정 5-메 틸 시 토 신 (Q) 단위체31를 포함 하 여 합리적으로 설계 된 PNA 단위체 (그림 2)에 대 한 합성 방법을 개발 했습니다. 다양 한 생 화 확 및 생물 특성 방법을 통해 우리는 상대적으로 짧은 PNAs (6-10 잔류물) L과 Q 잔류물 통합 표시 왓슨 크릭 G-C와 C-G 기본적인 쌍의 향상 된 인식 각각 dsRNAs 설명 했다. PNAs L과 Q 잔류물을 포함 하는 또한, ssRNA 이상과 dsDNA dsRNA 향해 더 선택적 바인딩을 표시 수정 되지 않은 PNAs에 비해. Q 자료에 guanidine 기능42 PNAs를 HeLa 세포31입력을 수 있습니다.
우리의 실험실에서 우리는 PNAs 수동 Boc 화학에 의해 합성 (Boc 또는 t-Boc tert-butyloxycarbony에 대 한 서 ( 그림 2참조) 단단한 단계 펩 티 드 합성 방법4. Boc 그룹은 sterically 덜 PNA 모노 머 연결 하는 동안 도움이 될 수 있습니다 그룹을 보호 하는 fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) 아민에 비해 부피가 큰 그룹을 보호 하는 아민으로 Boc와 PNA 단량체의 합성은 편리 합니다 단단한 지원입니다. Boc 그룹 산 정한 이며 제거할 수 있습니다 쉽게 고체 지원에 dichloromethane (DCM)에 20-50 %trifluoroacetic 산 (TFA) PNA 합성 하는 동안. 자동된 펩타이드 합성기 PNA 올리고; 합성 채택 될 수 있다 그러나, 3 5 배 초과 PNA 단위체의 자동된 펩타이드 합성기 필요 합니다. 수동 합성 훨씬 적은 PNA 단위체를 (2-3-배 초과), 각 커플링 쉽게 카이 저 테스트43에 의해 모니터링이 필요 합니다. 또한, 많은 자동된 합성기 호환 되지 않습니다 부식성 TFA의 사용으로 인해 Boc 전략 합성 Boc 제거 단계.
PNA 올리고 역 상 고성능 액체 착 색 인쇄기 (라인란트-HPLC) MALDI TOF에 의해 분자량 특성 뒤에 의해 순화 될 수 있다 (그림 3 및 4)30, 31. 우리 고용 세 겹 형성 모니터링, 인해는 사실 무료 RNA 이중 구성 및 PNA 바인딩된 triplexes 종종 표시 다른 마이그레이션 속도 (그림 5)30,31 페이지 비 변성 시키기 . 효율적인 포스트 얼룩 RNA 이중 및 PNA· 둘 다를 위해 달성 될 수 있다 필요 없는 라벨 RNA2 트리플 밴드입니다. 비교적 적은 양의 샘플 페이지 실험 비 변성 시키기 위해 필요 하다. 그러나, 로드 (부 화) 버퍼 및 실행 버퍼 (pH 8.3) 않을 수 있습니다 같은, 비교적 높은 pH 8.3의 크게는 삼박자를 불안정 수 있습니다 때문에 접착 안정적인 triplexes 제한 되 고 측정 결과.
2 Aminopurine는 아데닌 (6-aminopurine);의 이성질체 2 aminopurine 형광 강도 (약 370에서 방출 피크 nm) 지역 구조 환경 변화에 민감한 이며 적합 한 바인딩 사이트 (PNA 근처 통합 트리 2 aminopurine 잔류물 형성의 모니터링에 대 한 그림 6) 31. 많은 다른 염료를 보이는 범위에서 형광 방출 쇼와 달리 2 aminopurine 표시 된 RNA 노출 될 수 있습니다 방에 빛 사진 표백 하지 않고. 페이지 실험 pH 8.3의 실행 버퍼 자주 필요 하다, 달리 2-aminopurine 기반으로 형광 적정 바인딩 지정된 pH에 1 개의 해결책에서 사용 하 고 따라서 측정 및 탐지의 상대적으로 약한 수 고 평형에 운동 불안정 바인딩입니다.
자외선 흡 광도 감지 열 용융 실험 허용 duplexes (그림 7)31 와 트라이의 열 안정성 측정플렉스30,32,,4445. 길이 시퀀스 구성에 따라 triplexes의 용 해 되거나 명확한 전환 표시 되지 않을 수 있습니다. 가 열 및 냉각 곡선 겹치면 열역학 매개 변수를 얻을 수 있습니다. 등온선 적정 열 량 측정 (ITC)32; 여 정확한 열역학 매개 변수를 얻을 수 있습니다. 그러나, 비교적 많은 양의 샘플은 ITC 일반적으로 필요 합니다.

<table><tbody><tr><td>분자체, 4A, 직경 1-2mm 펠릿&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>87956</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&Yuml; HCl)</</td><td>532444</td><td></td> <td>span</td>></tr><tr><td>N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25251</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 무히화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser 테스트 키트&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td></td></tr><tr><td>비변성 PNA 단량체</td><td>ASM Research Chemicals GmbH</td><td>5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8389 / 47624</td><td></td></tr><tr><td>Thioanisole</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14846</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>Alfa Aesar</td><td>L12865</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoromethanesulfonic acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10173</td><td></td></tr><tr><td>LiChrosper&reg; 100 RP-18 엔드캡 (5 &micro; m) LiChroCART&reg; 250-4</td><td>Merck Millipore 150838</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA 올리고&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>맞춤형&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39468</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J15694</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>N.N'-메틸렌비사아크릴아미드</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>146072 암모늄 퍼설페이트 (APS)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>10X Tris-Borate-EDTA (TBE) 버퍼, pH 8.3</td><td>1st Base</td><td>BUF-3010-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤&nbsp;</td><td>프로메가&nbsp;</td><td>H5433</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드 (10 mg/mL)</td><td>바이오-라드&nbsp;</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>고정밀 셀 (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td><td>Hellma Analytics&nbsp;</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr></tbody></table>

시퀀스 및 선택적 인식 하 여 단일 가닥 rnas에 더블-좌초 rnas의 화학적 펩 티 드 핵 산 수정

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs 중요 한 바이오 마커 및 치료 대상으로 떠오르고 있다. 따라서, 화학 프로브와 RNA 순서 및 구조의 인식에 대 한 치료 ligands 개발 잠재력이 있다. 화학적 펩 티 드 핵 산 (PNA) 올리고 최근 개발 된 시퀀스 별로 RNA duplexes 인식할 수 있는 수정. PNAs 중립 펩 티 드와 같은 등뼈와 화학적으로 안정 되어 있다. PNAs 수 수 합성 비교적 쉽게 수동 Boc 화학 단단한 단계 펩 티 드 합성 방법에 의해. PNAs 역 상 HPLC, 분자량 특성 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 (TOF MALDI)에 의해 다음에 의해 정화 된다. 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지) 기술을 용이 하 게 세 겹 형성의 영상 때문에 신중 하 게 설계 된 무료 RNA 이중 구성 및 PNA 바인딩된 triplexes 자주 쇼 다른 마이그레이션 속도. Ethidium 평범한 사람 게시물 얼룩과 비 변성 시키기 페이지 종종 바인딩 친 화력 및 특이성 PNA 올리고의 특성화를 위한 쉽고 유익한 기술입니다. 일반적으로, 여러 개의 동 곳 RNA 또는 단 하나 기본적인 쌍 돌연변이와 duplexes 바인딩 친 화력 및 특이성 등의 PNA 바인딩 속성의 특성을 사용할 수 있습니다. 2 Aminopurine는 아데닌 (6-aminopurine);의 이성질체 2 aminopurine 형광 강도 지역 구조 환경 변화에 민감한 이며 PNA 바인딩 사이트 근처 통합 2 aminopurine 잔류물과 세 겹 형성의 모니터링에 적합. 2-Aminopurine 형광 적정 대상된 더블-좌초 RNAs (dsRNAs)으로 수정된 PNAs 바인딩 선택도 단일 가닥 RNAs (ssRNAs)를 통해 확인 하도 사용할 수 있습니다. 자외선 흡 광도 감지 열 용융 실험 허용 PNA RNA duplexes와 PNA·의 열 안정성 측정 RNA2 triplexes입니다. 여기, 우리는 합성을 설명 하 고 PNA 올리고 통합의 정화 잔류물, 수정 하 고 수정된 PNAs에 의해 RNA duplexes의 인식의 특성에 대 한 생화학 및 생물 방법을 설명.

역 상 HPLC PNA 올리고 정화 수 있습니다. 우리는 순수한 PNA 올리고 HPLC 정화 (그림 3)의 2 라운드와 얻을 수 있습니다. MALDI TOF 분석 (그림 4)는 PNAs의 id는 확인할 수 있습니다.
비 변성 시키기 페이지 바인딩 친 화력 및 특이성 PNA 올리고의 특성화를 위한 쉽고 유익한 기술입니다. 우리 일반적으로 사용 하 여 여러 개의 RNA 헤어핀 또는 duplexes 단 하나 기본적인 쌍 돌연변이와 특성 바인딩 속성 (그림 5). 그림 5 에 표시 된 비 변성 시키기 페이지 데이터 명확 하 게 제안는 Q-및 L-수정 PNA dsRNA 지역 C G 쌍 (그림 5B, 하단 패널)을 인식할 수 없습니다 (그림 5B, 상위 C G 쌍 없이 하나 패널)입니다. T·을 통해이 구체적이 고 향상 된 인식이 이다 A-U, L· G-C, 및 Q· C G PNA· RNA2 기본 트리플 (그림 1A, C, D) 형성. 하나 또는 여러 개의 돌연변이와 다양 한 PNAs 수정된 PNA의 향상 된 바인딩 속성을 보여 주기 위해 사용할 수 있습니다. 우리는 2 mM Mg2 + 외피 버퍼에 추가 영향을 주지 않습니다 바인딩을 나타났습니다 크게31.
우리는 Q L 수정 PNA 타겟된 dsRNA 지역 (그림 6A, 6 C 6 D) 하지만 (그림 6B, 6E 6F) ssRNA 하지 2 aminopurine 형광 적정에 의해 증명 하고있다. PNA P3 Kd 값이 0.8 ± 0.1 µ M 2 aminopurine 표시 된 dsRNA에 바인딩합니다. 370에서 형광 강도 2 aminopurine 라는 ssRNA에 대 한 nm는 ssRNA PNA P3의 바인딩의 부족을 나타내는 다양 한 P3 농도로 비교적 일정 하 게 유지.
PNAs 전환 (그림 7)는 ssRNA에 대 한 바인딩을 제안 녹는 아무 열 Q 잔류물 (P2 및 P3) 쇼를 포함 하. 이것은 입체 충돌 왓슨 크릭에서 Q G 쌍 같은 존재입니다. 수정 되지 않은 PNA P1에 비해, PNAs P4 그리고 P5 포함 수정 L 잔류물 하지만 아무 Q 잔류물, 표시 해당 RNA PNA duplexes 입체 충돌 왓슨 크릭에서 L G 쌍 같은 존재 때문에 용융 온도 감소. 자외선 흡 광도 감지 열 녹는 데이터는 2 aminopurine 형광 적정 데이터, 또한 그 질문 및 L 잔류물을 포함 하는 PNA에 바인딩되지 않기 ssRNA appreciably 표시와 일치 (그림 6B, 6E 6F). Q 자료 (그림 1E 왓슨 크릭 같은 L G 쌍에 비해 왓슨 크릭 같은 Q G 쌍 (그림 1F)의 형성에 더 중요 한 입체 충돌 있다 L 자료 보다 더 불안정은 Q 자료 통합 ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
그림 1 : 안정적인 기본 트리플 하 고 불안정 한 기초 쌍 구조의 화학 구조. (A-D) 주요 홈 PNA· T·의 세 배 RNA2 기본 (A) A U, C+· G-C (B), L· G-C (C), 및 Q· C-G (D)입니다. (E, F) L-G (E)와 Q-G (F)의 PNA RNA 기본적인 쌍 같은 불안정 한 왓슨 크릭. 편지 R RNA의 설탕 인산 염 등뼈를 나타냅니다. 수소 결합은 검은색 파선으로 표시 됩니다. 그림 참조31에서 재현 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
그림 2 : PNA 단위체의 화학 구조. 4 PNA 단위체 (T, C, L, 및 Q) 표시 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
그림 3 : PNA 올리고 머와 RP HPLC에 의해 정화의 화학 구조. (A) PNA 시퀀스 P3의 화학 구조. (B, C) 원유 PNA P3의 RP HPLC 데이터 (B) 다시 정화 PNA P3 (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
그림 4 : 정화 PNA P3의 MALDI TOF 스펙트럼. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
그림 5 : RNA 머리 핀 및 PNA 시퀀스와 비 변성 시키기 페이지 바인딩 특성. (A) RNA 헤어핀 (rHP1 및 rHP2), PNA P3, 그리고는 PNA· RNA2 세 겹 PNA P3 및 rHP2 사이 형성. (B) 비 변성 시키기 페이지 (12%) rHP1 및 rHP2 바인딩 PNA P3에 대 한 결과. 인큐베이션 버퍼가 200 m m NaCl, 0.5 m m EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5입니다. 로드 된 RNA 헤어핀 (rHP1 및 rHP2) 20 µ L에 1 µ M에 있다. 오른쪽에서 왼쪽 차선에서 PNA 농도 0, 0.2, 0.4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, 50 µ M. PNA P3 않습니다 하지 바인딩합니다 rHP1 하 고 (위 패널) 하지만 rHP2에 바인딩합니다 (하단 패널). P3 rHP2 바인딩을 위해 (C) Kd 결정. 세 겹 형성 (Y)의 분수는 PNA 농도 대 한 플롯은. 그림은 참조31에서 적응. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
그림 6 : PNA P3 바인딩의 형광 적정 연구2 aminopurine 표시 된 RNAs 하. 2 aminopurine 잔류물 RNA 순서에서 '2'로 지정 됩니다. 인큐베이션 버퍼가 200 m m NaCl, 0.5 m m EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5입니다. (A)는 PNA· RNA2 세 겹 P3 및 2 aminopurine 표시 된 dsRNA (dsRNA2-2AP) 사이 형성. (B) 가상 PNA RNA 이중 P3 및 2 aminopurine 레이블 ssRNA (ssRNA2-2AP) 사이 형성. (C, E) 형광 방출 스펙트럼 2 aminopurine 표시 된 RNA 이중 (1 µ M) 및 ssRNA (1 µ M), 각각,와 P3 농도 pH 7.5에 다양합니다. 약 475에 피크 nm PNA에 L 자료의 약한 형광 방출 예정 이다. (D, F) K d 결정 2 aminopurine 형광 강도 플롯에 따라 (370에서 nm)의 RNA 이중 및 ssRNA, 각각, PNA P3 농도 대. 그림은 참조31에서 적응. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
그림 7 : RNA PNA duplexes에 대 한 결과 용 해 열. 인큐베이션 버퍼 200 m m NaCl, 0.5 m m EDTA, 20 m NaH2포4, pH 7.5 m 이다. 모든 샘플의 단일 가닥 RNA (ssRNA1)와 PNA 130 µ L. (A) 단일 가닥 RNA (ssRNA1)에, PNAs (P1, P2, P3, P4, 및 P5)와 PNA P3 및 평행 방향에 ssRNA1 사이 형성 하는 가상 PNA RNA 이중 5 µ M를 포함. Q-G와 L G 쌍 같은 왓슨 크릭 입체 충돌을 가리킨다. (B) 융해 곡선 다른 PNAs에 대 한 ssRNA1에 바인딩. 녹는 온도 녹는 전환으로 곡선에 대 한 표시 됩니다. 그림은 참조31에서 적응.

우리는 합성에 대 한 프로토콜와 펩 티 드 핵 산 (PNA) 올리고 통합의 정화 수정 잔류물. 수정된 PNAs에 의해 RNA duplexes의 인식 특성에 대 한 생화학 및 생물 방법은 설명 합니다.

시퀀스 및 선택적 인식 하 여 단일 가닥 RNAs에 더블-좌초 RNAs의 화학적 펩 티 드 핵 산 수정

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

본 방법론 논문의 전반적인 목적은 화학적으로 변형된 펩타이드 핵산에 의한 이중 가닥 RNA의 분자 인식 연구를 위해 저희 연구실에서 활용하는 상세 프로토콜을 소개하는 것입니다. 이 방법은 RNA 구조의 검출 및 표적화와 같은 RNA 화학 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 그 설계 원리를 모든 RNA 이중 가닥 구조의 표적화에 적용할 수 있다는 점입니다.본 실험 과정의 시연은 저희 연구실의 연구원인 Desiree Toh가 담당하겠습니다. 이 절차를 시작하기 위해, 이전에 준비한 RNA PNA 샘플에 35% glycerol 용액 4 µL를 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 마이크로피펫과 겔 로딩 팁을 사용하여, 기포가 생기지 않도록 주의하며 이전에 준비한 폴리아크릴아마이드 겔에 각 샘플 20 µL를 조심스럽게 분주합니다.겔을 250 V의 정전압으로 5시간 동안 전기영동합니다. 5시간 후, 전원 공급 장치를 끄고 겔 스탠드에서 유리판을 제거합니다. 그런 다음 겔 밀봉 테이프를 제거하고 유리판을 분해합니다.겔을 유리판에서 조심스럽게 떼어내어 350 milliliters의 탈이온수가 채워진 용기에 넣습니다. 용기에 35 microliters의 ethidium bromide를 조심스럽게 첨가하고, 플랫폼 쉐이커 위에 올려 저속으로 30분 동안 흔들어 줍니다. ethidium bromide 용액을 폐기한 후, 1.5에서 2 liters의 증류수로 겔을 헹굽니다.그런 다음 532 nanometers의 녹색 레이저와 610 nanometers로 설정된 방출 필터가 장착된 이미지 분석기로 젤을 스캔합니다. 무료 소프트웨어를 사용하여 젤 밴드의 강도를 정량화합니다. 적절한 양의 2-aminopurine 표지 이중 가닥 RNA를 깨끗한 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다.그 다음, 진공 농축기를 사용하여 RNA 용액을 농축합니다. 이어서, 이전에 준비한 메인 스톡에서 다양한 농도를 위한 적절한 부피의 표적 PNA를 각각 별도의 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다. 진공 농축기를 사용하여 PNA 용액을 농축합니다.건조된 RNA가 들어있는 튜브에 975 µL의 배양 버퍼를 넣고, 모든 RNA가 완전히 용해되도록 충분히 혼합합니다. RNA 용액을 짧게 원심분리한 후, 튜브를 예열된 히트 블록에 10분 동안 넣어 어닐링을 수행합니다. 완료되면 히트 블록의 전원을 끄고 샘플을 실온까지 식힙니다.건조된 PNA가 들어 있는 각 튜브에 75 µL의 RNA를 첨가하고 충분히 혼합합니다. 샘플을 실온에서 최소 1시간 동안 방치한 후, 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이제 적절한 양의 2-aminopurine 표지 단일 가닥 RNA를 각각의 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.다양한 농도의 표적 PNA를 메인 스톡에서 각각의 단일 가닥 RNA가 포함된 튜브로 적절한 부피만큼 옮깁니다. 샘플을 건조시킨 후, 각 튜브에 75 microliters의 배양 버퍼를 추가하고 충분히 섞습니다. 각 튜브를 미리 가열된 히트 블록에 10분 동안 두어 각 샘플의 어닐링을 수행합니다.시료를 실온까지 식힌 후, 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그 다음, 각 시료 70 µL를 1 cm² 큐벳에 옮깁니다. 큐벳을 형광 분광광도계에 넣고 330에서 550 nm의 파장 범위에서 방출 스펙트럼을 측정합니다.측정이 완료되면 큐벳에서 완충액을 제거하십시오. 큐벳을 증류수로 헹구고 질소 가스로 건조시키십시오. 모든 시료에 대해 측정을 반복한 후, 파장에 따른 형광 강도를 도표로 나타내십시오.적절한 양의 단일 가닥 RNA를 각각의 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다. 그다음, 메인 스톡에서 적절한 부피의 표적 PNA를 단일 가닥 RNA가 들어 있는 각각의 튜브로 옮깁니다. 샘플을 건조시킨 후, 각 튜브에 130 microliters의 배양 버퍼를 넣고 충분히 섞어줍니다.각 튜브를 미리 가열된 히트 블록에 10분 동안 넣어 각 샘플을 어닐링합니다. 샘플을 상온으로 냉각시킨 후, 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이제 각 샘플 130 µL를 배양 버퍼가 들어 있는 8-마이크로셀 큐벳의 각 셀로 옮깁니다.UV-Vis 분광광도계를 사용하여 각 시료의 260 nm에서 흡광도를 측정합니다. 15°C에서 95°C까지 온도를 높이며 측정하고, 이어서 분당 0.5°C의 램프 속도로 95°C에서 15°C까지 온도를 낮추며 측정합니다. PNA 올리고머는 두 번의 역상 HPLC 정제를 통해 얻었습니다.PNA의 정체성은 MALDI/TOF 분석을 통해 확인할 수 있습니다. 비변성 PAGE 데이터는 Q 및 L이 수식된 PNA가 C-G 쌍이 있는 이중 가닥 RNA 영역만을 인식할 수 있음을 시사합니다. 이러한 특이적이고 강화된 인식은 T-A-U-L-G-C 및 Q-C-G PNA RNA의 2-염기 트리플 형성으로 인한 것입니다.2-aminopurine 형광 적정 연구 결과, Q 및 L로 변형된 PNA는 표적 이중 가닥 RNA에는 결합하지만 단일 가닥 RNA에는 결합하지 않는 것으로 나타났습니다. Q 잔기를 포함하는 PNA는 열적 융해 전이를 보이지 않았으며, 이는 Watson-Crick 유사 Q-G 쌍의 입체 장애로 인해 단일 가닥 RNA와의 결합이 일어나지 않음을 시사합니다. 변형되지 않은 PNA P1과 비교했을 때, L 잔기를 포함하는 PNA P4와 P5는 Watson-Crick 유사 L-G 쌍의 입체 장애로 인해 해당 RNA-PNA 이중 가닥의 융해 온도가 더 낮게 나타났습니다.UV 흡광도로 검출된 열변성 데이터는 2-aminopurine 형광 적정 데이터와 일치하며, 이는 Q 및 L 잔기를 포함하는 PNA가 단일 가닥 RNA에 강하게 결합하지 않음을 보여줍니다. Q 염기의 도입은 L 염기보다 더 불안정하게 만드는데, 이는 Q 염기가 Watson-Crick 유사 Q-G 쌍을 형성할 때 더 심각한 입체 장애를 일으키기 때문입니다. 숙달된 후에는 적절하게 수행한다면 일주일 안에 다양한 실험을 완료할 수 있습니다.본 절차 이후, 이중 가닥 RNA 결합 PNA를 사용하여 RNA 구조를 검출하고 RNA 기능을 조절할 수 있는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 세포 내 RNA 구조의 프로빙 및 타겟팅과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 RNA 생물학 및 질환 분야의 연구자들이 RNA 구조 타겟 치료제 개발을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

프라이머 확장 (SHAPE)에 의해 분석 높은 처리량의 선택 2 '수산기 실화는 단일 염기 해상도에서 수천 개의 뉴클레오티드로 수백에서의 RNA 구조를 결정하는 기술을 프로빙 소설 화학, 역전사, 모세관 전기 영동 및 이차 구조 예측 소프트웨어를 사용합니다.

높은 처리량 SHAPE를 사용하여 RNA 이차 구조 예측

RNA-단백질 상호 작용은 많은 세포 과정의 핵심에 있습니다. 여기에서는 특정 RNA를 분리하고 이와 관련된 새로운 단백질을 식별하는 in vivo 방법에 대해 설명합니다. 이것은 RNA가 세포에서 어떻게 조절되는지에 대한 새로운 빛을 비출 수 있습니다.

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우리는 RNA 의무적인 단백질을 확인 하 고 중재 하는 UV photocrosslinking 및 질량 분석을 사용 하 여 라이브 셀에서 그들의 RNA 바인딩 영역 지도를 프로토콜을 설명 합니다.

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RNA 바이러스 복제 생산 하는 이중 가닥 RNA는 타고 난 면역 반응 유도 하 패턴 인식 수용 체에 의해 인식할 수 있습니다. 부정적인 감 RNA 바이러스에 대 한 낮은 수준의 dsRNA와 호흡기 간의 상호 작용 불분명 남아 있습니다. Arenavirus dsRNA와 개별 셀에서 PRR를 시각화 하는 confocal 현미경 검사 법 방법을 개발 했습니다.

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서열 특이성은 유전자 조절에 매우 중요합니다. 특정 서열을 인식하는 조절 단백질은 유전자 조절에 중요합니다. 이러한 단백질에 대한 기능적 결합 부위를 정의하는 것은 어려운 생물학적 문제입니다. RNA 결합 단백질에 대한 결합 부위의 식별을 위한 반복적 접근법은 여기에 기재되어 있으며 모든 RNA 결합 단백질에 적용가능하다.

규제 RNA 결합 단백질에 대한 결합 부위를 식별하기 위한 서열 공간 탐색

변경된 뉴클레아제 활성은 바이오마커로서의 잠재력을 기점으로 다른 인간 조건과 연관되어 있다. 이 논문에 제시된 모듈식 및 구현 방법론은 뉴클레아제 활성을 질병의 바이오마커로 활용하기 위한 특정 핵산 프로브를 선택할 수 있게 한다.

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현재 프로토콜은 표적을 검출하기 위해 빠른 3단계 압타머 기반 지수 증폭 분석의 사용을 보여줍니다. 샘플 준비, 신호 증폭 및 색상 현상은 카페인보다 테오필린의 존재를 인식하기 위해 이 시스템을 구현하기 위해 다룹니다.

3단계 G-Quadruplex 등온 지수 증폭 반응에 의해 촉진되는 Aptamer 기반 표적 검출

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DNAzyme 10-23 - 핵산 인식을 위한 기반 나노머신

학습하세요 화학적으로 변형된 펩티드 핵산(PNA)을 이용한 이중가닥 RNA 분자 인식 프로토콜입니다. 형광 및 UV-Vis 분광법으로 결합 친화도를 측정하여 RNA 화학생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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