단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

본 절차의 전반적인 목표는 공초점 형광 현미경 레이저를 사용하여 세포의 핵 내 특정 부위에 DNA 손상을 유도하는 것입니다. 이 방법은 단백질이 DNA 손상 부위로 어떻게 모집되고 유지되는지와 같은 DNA 복제의 핵심 질문들에 대한 답을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 단백질을 실시간으로 시각화할 수 있어 모집 및 유지 프로파일을 구축할 수 있다는 점입니다.

관심 세포가 포함된 챔버 슬라이드를 37 °C 및 5% 이산화탄소 상태로 유지되는 스테이지 상단 인큐베이터에 넣어 이 절차를 시작합니다. 인코딩된 자동 현미경 스테이지를 사용하여 이미지 영역을 등록합니다. 웰 사이의 경계와 같이 배양 용기에서 식별 가능한 특징을 선택하십시오.

이미지를 획득하고 X-Y 좌표를 기록합니다. 이를 통해 시료 준비 후 선택된 영역들의 X-Y 좌표를 정렬하고 등록할 수 있습니다. 이미지 등록이 완료되면, 미세 조사(micro-irradiation)를 수행할 영역을 선택하고 시료의 초점을 맞춥니다.

형광 표지 단백질을 발현하는 세포의 경우, 관심 있는 형광 채널에서 핵의 단면이 최대가 되는 초점 평면을 선택하십시오. 핵의 최대 단면에 초점을 맞추는 것은 유도된 손상 부위로 표적 단백질이 모집되는 것을 모니터링할 때 초점 지점이 핵의 중심에 위치하도록 보장하므로 매우 중요합니다. 인과 같은 핵 내의 명확한 특징을 선택하고, 이 모습의 변화를 관찰하면서 초점 평면을 위아래로 이동시키십시오.

실제 초점면은 밝은 영역에서 어두운 영역으로 전환되는 구간 내에 위치하게 됩니다. 샘플의 초점을 맞추려면, 선택한 특징이 가장 선명한 대비를 보이는 초점면을 선택하십시오. 다음 단계는 관심 영역의 위치를 등록하는 것입니다.

현미경 소프트웨어 내에서 3x3 픽셀 크기의 정사각형 관심 영역(ROI)을 생성합니다. 이 ROI를 손상시킬 세포의 핵 위에 배치하고, 이를 손상 ROI로 설정합니다. 손상 ROI의 위치가 포함된 손상 전 이미지를 수집합니다.

관심 단백질의 형광 채널에서 명시야 이미지를 획득합니다. 이제 세포는 레이저 미세 조사(laser micro-irradiation)를 수행할 준비가 되었습니다. 본 시연에서는 405nm 레이저를 100% 출력으로 사용합니다.

405nm 레이저 조사량은 스캔 속도를 조절하고 선택한 손상 ROI를 1회 스캔함으로써 제어합니다. 본 실험에서는 405nm 마이크로 조사 시 초당 8프레임 및 0.5프레임을 사용하십시오. 세포에 손상을 주기 위한 적절한 레이저 출력을 선택하는 것은 서로 다른 DNA 복구 경로를 구분하는 데 매우 중요합니다.

손상 후 명시야 및 형광 채널의 타임랩스 이미지 획득을 수행하십시오. 데이터 수집을 최적화하기 위해 타임랩스의 지속 시간과 빈도를 조절하여, 손상 ROI에서의 형광 단백질 축적과 실험 과정에 따른 해리를 이상적으로 캡처하십시오. 타임랩스 과정이 완료되면, 손상을 가할 새로운 세포 영역을 선택하고 원하는 수의 손상된 세포 수를 확보할 때까지 미세 조사 및 타임랩스 이미징을 계속하십시오.

선택한 조건당 10~25개의 세포를 권장합니다. 면역형광 분석을 위한 전체 세포 수를 늘리려면, 배양 용기 내의 추가 영역에 손상을 가하여 손상 후 반응의 다중 영역 시계열 데이터를 생성하십시오. 각 영역의 X-Y 좌표와 손상이 발생한 시간을 기록하십시오.

세포는 손상 직후에 고정하거나, 고정 전까지 선택한 시간 간격 동안 회복하도록 둘 수 있습니다. 이 분석을 시작하려면 NIS-Elements와 같은 이미지 분석 애플리케이션에서 획득한 이미지를 엽니다. 측정할 각 세포에 대해, 먼저 핵을 나타내는 참조 ROI를 생성하십시오.

핵을 구성하는 픽셀이 포함된 형광 신호에 임계값 설정 알고리즘을 적용한 다음, 이 영역을 ROI로 변환합니다. 이어서 6x6 픽셀 크기의 ROI를 생성하여 손상 ROI 위에 배치합니다. 이제 이 더 큰 ROI가 분석을 위한 손상 ROI가 됩니다.

측정할 각 세포에 대해 기준(reference) 및 손상(damage) ROI의 평균 형광 강도를 기록하십시오. 타임 코스의 각 프레임마다 기준 ROI가 핵 영역을 정확하게 덮고 있는지 확인하여 조정하고, 손상 ROI가 손상 부위를 덮고 있는지 확인하여 조정하십시오. 타임 코스의 각 프레임에서 각 ROI 내 형광 신호의 평균 형광 강도를 기록하십시오.

각 세포에 대해, 타임랩스의 매 프레임마다 평균 손상 ROI 형광 강도를 해당 참조 ROI의 강도로 정규화합니다. 여기서는 평균 핵 형광 강도를 참조 ROI로 사용하며, 평균 손상 ROI 형광 강도에서 평균 참조 ROI 형광 강도를 빼는 방식으로 정규화를 수행합니다. 모든 손상된 세포뿐만 아니라 최소 두 개의 손상되지 않은 대조군 세포에 대해서도 정규화를 반복합니다.

마지막으로, 실험적 처리에 따른 리크루트먼트 역학의 변화를 보여주기 위해 시간에 따른 정규화된 강도 값을 그래프로 나타냅니다. XRCC1-GFP를 안정적으로 발현하는 세포를 손상 유도 전후로 조사하고 이미징했습니다. 손상 ROI로의 XRCC1-GFP 리크루트먼트를 관찰하고 리크루트먼트의 역학을 측정했습니다.

두 가지 마커를 사용하여 이중 가닥 절단의 형성을 조사하였습니다. 두 마커 모두 355 nanometers에서의 두 번째 저선량 자극은 조사 후 5분과 20분에는 반응을 일으키지 않았으며, 10분에는 약하고 가변적인 반응을 보였습니다. 355 nanometers에서의 10초 고선량 미세 조사는 손상 ROI 내에서 조사 후 5분, 10분, 20분에 증가된 형광 신호를 유도하였으며, 이는 40분에 감소하였습니다.

이러한 결과는 DNA 이중 가닥 절단 마커가 355nm 마이크로 조사에 대해 용량 의존적인 방식으로 반응한다는 것을 나타냅니다. 반면, 405nm 레이저 자극은 적용된 용량과 관계없이 손상 ROI 내에 두 마커 모두가 유의미하게 축적되는 결과를 가져왔습니다. 숙련된 후에는 적절하게 수행될 경우 10개의 세포에 대해 약 4시간 만에 이 기술을 수행할 수 있습니다.

이 기술을 수행할 때는 모니터링하려는 복구 과정에 맞춰 레이저 파장과 인가 전력을 조정하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에 면역형광법을 수행하여 추가 단백질의 보충이나 인산화 상태 또는 기타 번역 후 변형의 변화에 관한 의문점을 해결할 수 있습니다. 이 기술을 통해 연구자들은 DNA 복구 단백질의 역동적인 보충 과정을 탐구하고, 단백질 도메인과 돌연변이가 DNA 손상의 인식 및 반응에 어떤 영향을 미치는지 더 정확하게 결정할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 DNA 손상을 유도하고 DNA 복구 단백질의 모집을 모니터링하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 레이저 및 포름알데히드와 같은 화학 물질을 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 개인 보호 장구 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.