Name: 단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 배우세요 포유류 세포에서 레이저 마이크로-방사선을 이용한 이중 가닥 브레이크 수리 메커니즘을 실시간 영상화하는 방법을. 이 기법은 DNA 손상 부위에 수복 단백질이 모이는 역학을 정량적으로 분석하여 유전체 안정성 연구에 활용됩니다.

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저자 박사 사무엘 H. 윌슨에서 국립 연구소의 환경 건강 과학이이 작품에 사용 된 셀 라인에 대 한 감사 하 고 싶습니다.

<ol><li>Luijsterburg, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+and+reversible+assembly+of+a+multiprotein+DNA+repair+complex+ensures+accurate+target+site+recognition+and+efficient+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic and reversible assembly of a multiprotein DNA repair complex ensures accurate target site recognition and efficient repair.</a> J Cell Biol. 189 (3), 445-463 (2010).</li>
<li>Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+mammalian+NER+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Dynamics of mammalian NER proteins.</a> DNA Repair (Amst). 10 (7), 760-771 (2011).</li>
<li>Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+history+of+laser+scissors+%28microbeams%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A history of laser scissors (microbeams).</a> Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).</li>
<li>Cremer, C., Cremer, T., Zorn, C., Schoeller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+laser+uv-microirradiation+%28lambda+%3D+2573+A%29+on+proliferation+of+Chinese+hamster+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of laser uv-microirradiation (lambda = 2573 A) on proliferation of Chinese hamster cells.</a> Radiat Res. 66 (1), 106-121 (1976).</li>
<li>Cremer, C., Cremer, T., Fukuda, M., Nakanishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+laser--UV+microirradiation-induced+DNA+photolesions+by+immunofluorescent+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Detection of laser--UV microirradiation-induced DNA photolesions by immunofluorescent staining.</a> Hum Genet. 54 (1), 107-110 (1980).</li>
<li>Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+system+for+laser-UVA-microirradiation+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells.</a> J Microsc. 209, (Pt 2) 71-75 (2003).</li>
<li>Kielbassa, C., Roza, L., Epe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength+dependence+of+oxidative+DNA+damage+induced+by+UV+and+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light.</a> Carcinogenesis. 18 (4), 811-816 (1997).</li>
<li>Kielbassa, C., Epe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+induced+by+ultraviolet+and+visible+light+and+its+wavelength+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">DNA damage induced by ultraviolet and visible light and its wavelength dependence.</a> Methods Enzymol. 319, 436-445 (2000).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+laser+systems+to+study+cellular+responses+to+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 37 (9), 68(2009).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (38), 13738-13743 (2004).</li>
<li>Krasin, F., Hutchinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand+breaks+and+alkali-labile+bonds+induced+by+ultraviolet+light+in+DNA+with+5-bromouracil+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Strand breaks and alkali-labile bonds induced by ultraviolet light in DNA with 5-bromouracil in vivo.</a> Biophys J. 24 (3), 657-664 (1978).</li>
<li>Krasin, F., Hutchinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+breaks+from+single+photochemical+events+in+DNA+containing+5-bromouracil%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Double-strand breaks from single photochemical events in DNA containing 5-bromouracil.</a> Biophys J. 24 (3), 645-656 (1978).</li>
<li>Rosenstein, B. S., Setlow, R. B., Ahmed, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+dye+Hoechst+33258+in+a+modification+of+the+bromodeoxyuridine+photolysis+technique+for+the+analysis+of+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Use of the dye Hoechst 33258 in a modification of the bromodeoxyuridine photolysis technique for the analysis of DNA repair.</a> Photochem Photobiol. 31 (3), 215-222 (1980).</li>
<li>Cremer, T., Peterson, S. P., Cremer, C., Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microirradiation+of+Chinese+hamster+cells+at+wavelength+365+nm%3A+effects+of+psoralen+and+caffeine%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Laser microirradiation of Chinese hamster cells at wavelength 365 nm: effects of psoralen and caffeine.</a> Radiat Res. 85 (3), 529-543 (1981).</li>
<li>Limoli, C. L., Ward, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+introducing+double-strand+breaks+into+cellular+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">A new method for introducing double-strand breaks into cellular DNA.</a> Radiat Res. 134 (2), 160-169 (1993).</li>
<li>Carlsson, K., Mossberg, K., Helm, P. J., Philip, J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0739626092900178">Use of UV excitation in confocal laser scanning fluorescence microscopy.</a> Micron and Microscopica Acta. 23 (4), 413-428 (1992).</li>
<li>Stelzer, E. H. K., Haar, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1076567008702738">Confocal Microscopy: Recent Developments.</a> Advances in Imaging and Electron Physics. 106, 293-345 (1999).</li>
<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li>
<li>Tashiro, S., Walter, J., Shinohara, A., Kamada, N., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad51+accumulation+at+sites+of+DNA+damage+and+in+postreplicative+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rad51 accumulation at sites of DNA damage and in postreplicative chromatin.</a> J Cell Biol. 150 (2), 283-291 (2000).</li>
<li>Gassman, N. R., Stefanick, D. F., Kedar, P. S., Horton, J. K., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivation+of+PARP+triggers+nonhomologous+end-joining+in+repair-deficient+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hyperactivation of PARP triggers nonhomologous end-joining in repair-deficient mouse fibroblasts.</a> PLoS One. 7 (11), 49301(2012).</li>
<li>Bolin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+cyclin-dependent+kinase+5+depletion+on+poly%28ADP-ribose%29+polymerase+activity+and+responses+to+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The impact of cyclin-dependent kinase 5 depletion on poly(ADP-ribose) polymerase activity and responses to radiation.</a> Cell Mol Life Sci. 69 (6), 951-962 (2012).</li>
<li>Godon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP+inhibition+versus+PARP-1+silencing%3A+different+outcomes+in+terms+of+single-strand+break+repair+and+radiation+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PARP inhibition versus PARP-1 silencing: different outcomes in terms of single-strand break repair and radiation susceptibility.</a> Nucleic Acids Res. 36 (13), 4454-4464 (2008).</li>
<li>Hanssen-Bauer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC1+coordinates+disparate+responses+and+multiprotein+repair+complexes+depending+on+the+nature+and+context+of+the+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">XRCC1 coordinates disparate responses and multiprotein repair complexes depending on the nature and context of the DNA damage.</a> Environ Mol Mutagen. 52 (8), 623-635 (2011).</li>
<li>Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback-regulated+poly%28ADP-ribosyl%29ation+by+PARP-1+is+required+for+rapid+response+to+DNA+damage+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 35 (22), 7665-7675 (2007).</li>
<li>Mortusewicz, O., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+regulatory+protein+recruitment+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of regulatory protein recruitment at DNA damage sites.</a> J Cell Biochem. 104 (5), 1562-1569 (2008).</li>
<li>Mortusewicz, O., Rothbauer, U., Cardoso, M. C., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recruitment+of+DNA+Ligase+I+and+III+to+DNA+repair+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Differential recruitment of DNA Ligase I and III to DNA repair sites.</a> Nucleic Acids Res. 34 (12), 3523-3532 (2006).</li>
<li>Solarczyk, K. J., Zarębski, M., Dobrucki, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+local+DNA+damage+by+visible+light+to+study+chromatin+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Inducing local DNA damage by visible light to study chromatin repair.</a> DNA Repair (Amst). 11 (12), 996-1002 (2012).</li>
<li>Gassman, N. R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-irradiation+tools+to+visualize+base+excision+repair+and+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair.</a> DNA Repair (Amst). 31, 52-63 (2015).</li>
<li>Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+near+infrared+femtosecond+lasers+as+sub-micron+radiation+microbeam+for+cell+DNA+damage+and+repair+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Use of near infrared femtosecond lasers as sub-micron radiation microbeam for cell DNA damage and repair studies.</a> Mutat Res. 704 (1-3), 38-44 (2010).</li>
<li>Ferrando-May, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highlighting+the+DNA+damage+response+with+ultrashort+laser+pulses+in+the+near+infrared+and+kinetic+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling.</a> Front Genet. 4, 135(2013).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+Werner+protein+at+DNA+double-strand+breaks+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Accumulation of Werner protein at DNA double-strand breaks in human cells.</a> J Cell Sci. 118, Pt 18 4153-4162 (2005).</li>
<li>Salmon, T. B., Evert, B. A., Song, B., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+consequences+of+oxidative+stress-induced+DNA+damage+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Biological consequences of oxidative stress-induced DNA damage in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 32 (12), 3712-3723 (2004).</li>
<li>Caldecott, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">DNA single-strand break repair.</a> Exp Cell Res. 329 (1), 2-8 (2014).</li>
<li>London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+XRCC1-mediated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">The structural basis of XRCC1-mediated DNA repair.</a> DNA Repair (Amst). 30, 90-103 (2015).</li>
<li>Moser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sealing+of+chromosomal+DNA+nicks+during+nucleotide+excision+repair+requires+XRCC1+and+DNA+ligase+III+alpha+in+a+cell-cycle-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sealing of chromosomal DNA nicks during nucleotide excision repair requires XRCC1 and DNA ligase III alpha in a cell-cycle-specific manner.</a> Mol Cell. 27 (2), 311-323 (2007).</li>
<li>Campalans, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+spatiotemporal+patterns+and+PARP+dependence+of+XRCC1+recruitment+to+single-strand+break+and+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct spatiotemporal patterns and PARP dependence of XRCC1 recruitment to single-strand break and base excision repair.</a> Nucleic Acids Res. 41 (5), 3115-3129 (2013).</li>
<li>Cooke, M. S., Lunec, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCooke%2C+MS+%22Immunochemical+detection+of+oxidative+DNA+damage.+Vol.+I%22">Immunochemical detection of oxidative DNA damage. Vol. I</a>. , World Scientific. 275-293 (2003).</li>
<li>Rossner, P., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+detection+of+oxidatively+damaged+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Immunochemical detection of oxidatively damaged DNA.</a> Free Radic Res. 46 (4), 492-522 (2012).</li>
<li>Cleaver, J. E., Feeney, L., Revet, I. Phosphorylated H2Ax is not an unambiguous marker for DNA double-strand breaks. Cell Cycle. 10 (19), 3223-3224 (2011).</li>
<li>Rybak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+level+phosphorylation+of+histone+H2AX+on+serine+139+%28%CE%B3H2AX%29+is+not+associated+with+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (γH2AX) is not associated with DNA double-strand breaks.</a> Oncotarget. 7 (31), 49574-49587 (2016).</li>
<li>Haince, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1-dependent+kinetics+of+recruitment+of+MRE11+and+NBS1+proteins+to+multiple+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">PARP1-dependent kinetics of recruitment of MRE11 and NBS1 proteins to multiple DNA damage sites.</a> J Biol Chem. 283 (2), 1197-1208 (2008).</li>
<li>Caldecott, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-strand+break+repair+and+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-strand break repair and genetic disease.</a> Nat Rev Genet. 9 (8), 619-631 (2008).</li>
<li>Lomax, M. E., Gulston, M. K., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+aspects+of+clustered+DNA+damage+induction+by+ionising+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Prot+Dosimetry%22%5BJournal%5D)">Chemical aspects of clustered DNA damage induction by ionising radiation.</a> Radiat Prot Dosimetry. 99 (1-4), 63-68 (2002).</li>
<li>Ma, W., Westmoreland, J. W., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkylation+base+damage+is+converted+into+repairable+double-strand+breaks+and+complex+intermediates+in+G2+cells+lacking+AP+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Alkylation base damage is converted into repairable double-strand breaks and complex intermediates in G2 cells lacking AP endonuclease.</a> PLoS Genet. 7 (4), 1002059(2011).</li>
<li>Siddiqi, M. A., Bothe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-+and+double-strand+break+formation+in+DNA+irradiated+in+aqueous+solution%3A+dependence+on+dose+and+OH+radical+scavenger+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Single- and double-strand break formation in DNA irradiated in aqueous solution: dependence on dose and OH radical scavenger concentration.</a> Radiat Res. 112 (3), 449-463 (1987).</li>
<li>Sano, Y., Watanabe, W., Matsunaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore-assisted+laser+inactivation--towards+a+spatiotemporal-functional+analysis+of+proteins%2C+and+the+ablation+of+chromatin%2C+organelle+and+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromophore-assisted laser inactivation--towards a spatiotemporal-functional analysis of proteins, and the ablation of chromatin, organelle and cell function.</a> J Cell Sci. 127, (Pt 8) 1621-1629 (2014).</li>
<li>Wojtovich, A. P., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+ROS+production%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of ROS production.</a> Redox Biol. 2, 368-376 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기 설명 하는 조건을 사용 하 여, UV-A 또는 405 nm 레이저, 제조 업체에 의해 통합 또는 최종 사용자에 의해 추가 된 모든 confocal 현미경 세포의 핵 내 DNA 손상 유도 고 수의 사이트에 DNA 수 선 단백질의 신규 모집을 허용 모니터링할 DNA 손상을 유도 한다. 그러나, 프로토콜 및 대표 결과, 파장 선택 했 듯이 전원, 적용 하 고 손상을 특성화는 모든 중요 한 문제 해결 되어야 합니다 먼저 사용자가 특정 DNA를 연구 하기 위해 복구 통로. 또한, 사용자가 또한 고려 되어야 하는 실험 설계에서 다른 고려 사항이 있다.
라이브 셀 게시물에 단백질의 동작을 모니터링 하기 위해 마이크로-방사선, 붙일 레이블된 단백질 생성 되어야 합니다. 다양 한 괴기 하 게 분리 될 수 있다 형광 단백질의 가용성은 DNA 손상 유도 세포 응답을 특성화에 사용할 수 있는 단백질 융해를 만들기 위한 도구를 제공 합니다. 관심사의 형광 단백질의 과도 transfection 손상 조건, 돌연변이, 또는 심지어 억제제의 빠른 심사 안정적 transfected 세포를 제공 하는 동안 더 식 수준 이상의 제어 하 고 다른 생 화 확 적인 허용 수행 characterizations 마이크로 조사 결과 검증. 괴기 하 게 고유한 형광 단백질 또한 동일한 경로 또는 다른 경로에서 단백질 간의 상호 작용을 모니터링 하는 같은 셀에 활용할 수 있습니다. 형광 단백질 또한 관심사의 각 단백질을 위한 특정 항 체에 대 한 필요성을 제거 하 고 라이브 세포 손상의 유도 후 오랜 기간에 대 한 단백질 동작의 모니터링 허용.
그러나, 형광 단백질의 사용 또한 단점이 있다. 유전 배경 관심의 protein(s) 부족, 없이 생 단백질 붙일 태그가 단백질 경쟁할 것 이다. 단백질의 N 또는 C terminus에 형광 태그의 활용 수 있습니다 단백질 접기 변경, 주요 단백질-단백질 상호 작용을 방해 또는 차단 전 신호; 기능을 변경 하 고 잠재적으로 모집 역학에 영향을 미치는입니다. 이러한 효과 다양 한 보고서를 극적으로 다른 모집 및 피해 사이트28생 단백질에 대 한 보존 시간 시연 immunofluorescent 얼룩에 입증 되었습니다. 과도 transfection 또는 안정적인 클론의 사용 또한 관찰, 일반적으로 단백질 표정 수준에 변화를 통해 응답을 변경할 수 있습니다. 또한, 단일 실험에서 여러 형광 단백질의 사용 또한 변경할 수 있습니다 모집의 역학 단백질 레벨은 잘 equilibrated 하지 또는 다른 단백질의 신규 모집을 차단 하는 큰 붙일 태그가 단백질의 신규 모집 . 마지막으로, 형광 단백질 약한 과민성 에이전트, 반응성 산소 종의 형성을 증가 하 고 잠재적으로 DNA 손상 혼합물 유도46,47변경으로 작동할 수 있다. 이러한 단점에도 불구 하 고 형광 단백질 공부 DNA에 뚜렷한 장점을 마이크로-방사선, 복구 및 사용자 설명 여기, 피해 특성 등의 적절 한 컨트롤을 통합 하는 경우에, 그들은 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다 제공 에 손상 응답 및 단백질-단백질 상호 작용3.
라이브 셀 이미징 필요 하지 않으면, 면역 형광 유도 된 손상에 대 한 응답을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 특정 시간에 세포를 고정 하 여 손상 유도 및 항 체와 단백질 및 관심, 손상 유도의 정적 스냅샷 및 모집 병 변 및 단백질을 만들 수 있습니다 수리의 보존에 대 한 특정 얼룩 게시. 항 체는 관심의 포스트 번역 상 수정 DNA 손상 응답에 의해 유도 된 여러 단백질의 신규 모집을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 면역 형광의 사용 형광 성 단백질에 대 한 필요성을 제거 하 고 생 단백질 동작 검사를 허용 합니다. 그러나,이 메서드는 너무 그 단점이 있습니다. 매우 특정 항 체는 필요, 그리고 permeabilization 및 차단 절차 충분 한 신호 강도 가진 신규 모집의 검색 수 있도록 최적화 해야 합니다. 해결 절차는 순간, 고이 물리적 제약이이 접근의 시간 해상도 제한 합니다. 세포 염색 후 다시 찾을 수 있도록 손상 유도 사이트 매핑 또한 중요 한 과제를 제시할 수 있습니다. 이 작품에 사용 하는 confocal 현미경 수 있습니다 이미지 기반 등록 위에서 설명한 대로 그래서 손상 된 세포 높은 정밀도로 이전 될 수 있습니다. 고유한 간격으로 손상 유도 및 이미지 모집 된 결합 단계 등록을 하지 않고 재배치 세포 면역 형광을 만들 수 있습니다 단계 등록 또는 에칭된 coverglass 사용할 수 없는 경우, 투자에 참여 하는 시간 일부 사용자에 게 매력적. 그러나, 가장 정확 하 고 완전 한 마이크로 방사선 실험 디자인 제시 프로토콜에 설명 된 대로 이러한 유형의 형광 단백질의 사용과 동시에 접근을 통합할 예정 이다.
여기, 라이브 셀 이미징 및 면역 형광 레이저 마이크로-방사선의 유틸리티를 설명 하는 데 사용 됩니다. Immunofluorescent 얼룩 수 있도록 만든 DNA 손상의 혼합물을 정확 하 게 검사 하 고 더 나은 수 있게 하는 각 레이저 파워에 의해 유도 된 단백질의 채용 모집 및 XRCC1 GFP의 보존에 관찰된 변경 해석. 이러한 결과 바탕으로, 405 nm 레이저를 사용 하 여 BER 및 SSBR 단백질의 검사에 대 한 제한 되어야 합니다. 또한, 최적의 실험 설계 목적, 사용 하 고, 각 셀 라인에 대 한 전체 손상 혼합물 특성화 및 채용의 유효성 검사 후 전력 측정 포함 하 고에 놓여있는지 관찰 보존 태그와 단백질 면역 형광 검사입니다. 물론, 장비, 시간, 및 비용 고려 할 수 있습니다 이러한 최적의 실험 설계 불가능 한 일부 사용자에 대 한. 그러나, 이러한 요소 각각의 중요성은 여기, 증명 하 고 사용자가 이러한 고려 사항을 염두에 두어야 마이크로 조사 실험을 시작 하는 때.

형광 현미경 검사 법은 셀룰러 아키텍처를 시각화 하 고, 단백질 지 방화, 시험 하 고 단백질-DNA와 단백질-단백질 상호 작용을 모니터링 하는 강력한 기법으로 떠오르고 있다. DNA 손상 응답 글로벌 DNA 손상 자외선 (UV) 등 에이전트의 응용 프로그램 후 공부를 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 이온화 방사선, 화학 산화 alkylating 에이전트, 또는 chemotherapeutics 제공 하고있다 새로운 통찰력 시작, 신호, 및 DNA의 모집 단백질 DNA 손상1,2의 사이트를 복구 합니다. 그러나, 이러한 글로벌 및 손상 이벤트 비동기는 제한 경우 채용 순서, 협회 또는 분리의 활동에 대 한 자세한 정보 및 주요 DNA 수 선 단백질 사이의 관계는 모색 하 고 있다. 다행히, 레이저 confocal 현미경 검사에서 발전, 손상 유도 레이저 파장, 및 형광 단백질에서 지난 25 년 동안 개선의 광범위 한 가용성 제공 향상 된 도구와 연구원은 이러한 검사 타겟된 DNA 손상 유도 통해 DNA의 복구.
세포 및 subcellular 기능을 공부 하기 위하여 레이저 microbeams 셀의 조사는 셀 및 방사선 생물학3확고 도구입니다. DNA 수리의 학문에이 기술의 응용 프로그램 등장 Cremer 및 동료 사용 매우 초점을 맞춘 UV (257 nm) 중국 햄스터 난소 (CHO) 자리는 0.5 µ m 이상의 DNA 손상 유도 레이저 microbeam 체계4 세포와의 유도 설립 DNA photolesions이 시스템5. 동안 제공 크게 향상 UV microbeam 방법에 비해이의 입양 당시 시스템을 손상의 특수 설정, 및 생성을 하지 못하는 제한 된 이중 가닥 나누기 (DSBs)6. 자외선 B (290-320 nm)와 UV의 다양 한 후속 조사-몇명의 그룹에 의해 (320-400 nm)의 파장 UV photoproducts, 산화 병 변, 기본 밝혀 단일 가닥 (SSBs), 휴식과 DSBs 레이저 파장에 따라 유도 될 수 및 파워4,7,8,,910 ( 3에서검토) 적용. 또한, 이러한 자외선-B와 자외선 파장 sensitizing psoralen, bromodeoxyuridine (BrdU), Hoechst 염료, 같은 에이전트와의 조합 또한 발견 했다 파장, 전력, 그리고 노출의 기간에 DNA 손상을 유도 하 능력을 필요 유도 피해는 종종 이러한 에이전트11,12,13,,1415의 낮 췄 다. 이러한 방법의 더 넓은 채용을 위해 해결 되어야 아직 기술적인 장애물 있었지만 이러한 발전 마이크로-방사선의 사용 확대.
Cremer와 동료 셀에서 매우 지역화 된 영역 중요 한 파괴적인 에너지를 적용할 UV microbeam 정확 하 게 집중 하 여 마이크로-방사선 분야 고급 크게. Confocal 현미경과 레이저 서 시스템 고급, 긴밀 하 게 초점 맞춘된 빛이 더 광범위 하 게 액세스할 수; 그러나, UV 소스 범위에 커플링 하 고 그들은 여전히 유도 색수차를 다루는 대부분 사용자3,,616에 상당한 도전을 제시. UV 높은 만들 수 있는 능력에 초점을 맞춘 UV 염료 광학 초점의 수는 1990 년대 내내 인기에서 증가 하 고 캡처 UV 흥분 형광 되었다 더 광범위 하 게 사용할 수 있는16, 사용자가 제공 하는 레이저 스캐닝에서 개선 여기 셀6,17내 명소. 그러나, 그것이 2000 년대 초반까지 수많은 보고서와에 sensitizers 없이 DNA 가닥 나누기 유도 될 수 있는 시연 등장 때 높은 강도 레이저와 밀접 하 게 집중 된 광속의이 조합은의 진정한 영향 생각 했다는 UV-A 범위6,10,18,,1920, 405 nm21,22,,2324, 25,26, 488 nm27처럼 더 이상 보이는 파장에도. 이러한 발전은 다양 한 상업 시스템에 마이크로-방사선 조사 기술의 더 광범위 하 게 채택에 대 한 허용. 이러한 개발 병행, 2 광자 기술 또한 등장 DNA 손상;의 정확한 유도 허용 이러한 진보는 여기 논의 될 것입니다, 하지만이 방법론9,,2829,30논의 검토 기사 수가 있다.
Confocal 현미경 매우 집중된 UV 빛 및 DNA 수 선 단백질의 실시간 추적을 허용 하도록 형광 단백질의 대폭적인 가용성의 수의 현재 접근와 마이크로-방사선 조사 기술 진화 DNA 손상 응답 및 복구 경로 조사 하기 위한 강력한 도구. 그러나, 사용자는 DNA 손상의 세대는 매우 레이저 파장 및 하위 핵 영역에 적용 하는 파워에 의존 해야 합니다. UV-C의 사용 (~ 260 nm) 직접 DNA 여기 및 UV photoproducts7,8의 유도 대 한 높은 선택도 허용 하는 파장. 자외선-B와 자외선 A 파장이 DNA 손상 (기본 병 변, SSBs, 및 DSBs)의 혼합물을 생성, 적용 능력과 세포 배경에 따라 활용7. 타겟된 세포에 산화 수준과 생 photosensitizers이이 파장을 제작한 DNA 손상 혼합물을 좌우할 수 있다. 또한, 외 인 photosensitizers (BrdU, 등)를 사용 하 여 DNA 손상의 유도에 필요한 에너지를 낮추는에 도움이 수 있습니다. 그러나, 이러한 에이전트 스스로, DNA 손상을 일으킬 수 있다 그리고 그들의 사용 사용자가 고려해 야 하는 원치 않는 효과 생산할 수 있습니다 그래서 세포 주기 및 염색 질 구조를 변경할 수 있습니다 그들은. 따라서, 마이크로-방사선 조사를 사용 하 여 DNA 손상 응답 및 수리 공부를 하기 전에 관심, 사용, 사용할 수 있는 파장 그리고 만든 DNA 손상 혼합의 DNA 수 선 통로의 신중한 고려가 필요 합니다.
여기, 레이저 마이크로-방사선 두 가지 일반적으로 사용 되 파장, 355에서 수행 됩니다 및 405 nm,이 파장 및 이러한 손상 혼합물의 수리 검토에 영향에 의해 유도 된 DNA 손상의 혼합물을 보여 sensitizers 없이SSBs 및 DSBs. 사용자는이 파장 스트랜드 나누기 또는 기본 병 변의 단일 종 생성 하지 않는 알고 있어야 합니다. DNA 복구 경로 구분 하기 위해 사용자는 핵의 특정 영역에 적용 된 파워 제어 고 여러 가닥 휴식 마커 및 DNA 병 변 항 체를 사용 하 여 유도 된 손상 특성화 신중 하 게 해야 합니다. 제대로 적용을 특징 레이저 마이크로-방사선 DNA 손상으로 일부 기본 병 변 및 SSBs 또는 DSBs, 수리를 평가 하기 위해 사용자의 일부 수 종을 풍요롭게 수 있습니다. 따라서, 우리 사용자가 reproducibly 레이저 마이크로-방사선 조사를 수행, 적용 된 레이저 복용량에 의해 유도 된 DNA 손상 혼합물의 특성 및 데이터 분석을 수행 하는 방법을 제공.

<table><tbody><tr><td>니콘 A1rsi 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>니콘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS 요소 소프트웨어</td><td>니콘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>355nm 레이저</td><td>PicoQuant VisUV</td><td></td><td>방사선 소스</td></tr><tr><td>검류계 광활성화 미니 스캐너</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 포토다이오드 전력 센서</td><td>THORLabs</td><td>S170C</td><td></td></tr><tr><td>파이버 포토다이오드 파워 센서</td><td>THORLabs</td><td>S150C</td><td></td></tr><tr><td>디지털 핸드헬드 광학 전력 및 에너지 미터</td><td>THORLabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td></td><td></td><td>Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS의</td></tr><tr><td>최소 필수 매체</td><td>Hyclone</td><td>SH3026501</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>XRCC1-GFP</td><td>Origene</td><td>RG204952</td><td></td></tr><tr><td>Jetprime</td><td>Polyplus 형질주입</td><td>11407</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>ThermoFisher</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>4 챔버 커버 글라스</td><td>ThermoFisher</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>8 챔버 커버 글라스</td><td>ThermoFisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Anti 53BP-1</td><td>Novus</td><td>NB100304</td><td></td></tr><tr><td>안티-인산-히스톤 H2AX&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>05-636-I</td><td></td></tr><tr><td>안티 사이클로 부탄 피리 미딘 다이머</td><td>Cosmo Bio 클론</td><td>CAC-NM-DND-001</td><td></td></tr><tr><td>안티 8- 옥소 -2 급성; -deoxyguanosine&nbsp;</td><td>Trevigen</td><td>4354-MC-050</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 염소 안티 마우스</td><td>ThermoFisher</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 546 염소 안티 토끼</td><td>ThermoFisher</td><td>A11010</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>R37606</td><td>주의: 독성</td></tr>!<tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>ThermoFisher</td><td>0780</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>ThermoFisher</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>37% 포름알데히드</td><td>ThermoFisher</td><td>9311</td><td>주의 독성!</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>VWR</td><td>BDH1135</td><td>주의 독성이 있습니다!</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>SA49</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S2002</td><td>주의: 독성이 있습니다!</td></tr><tr><td>트리스 하이드로 클로라이드</td><td>Amresco</td><td>O234</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

높은 조정된 DNA 복구 경로 검색, 소비 세 및 손상 된 DNA 기초, 대체 및 DNA 가닥 나누기의 복구를 조정 존재 한다. 분자 생물학 기술 구조, 효소 기능 및 복구 단백질의 활동을 명확히 해야, 하는 동안 아직도 어떻게 수리는 핵 내에서 조정 필요가 하다. 레이저 마이크로-방사선 DNA 손상 유도 및 복구 단백질의 신규 모집을 모니터링을 위한 강력한 도구를 제공 합니다. 레이저 마이크로-방사선에 의해 DNA 손상을 유도 파장의 범위와 함께 발생할 수 있으며 사용자가 안정적으로 단일 가닥 나누기, 기본 병 변 및 복용량의 범위와 이중 가닥 나누기를 일으킬 수 있다. 여기, 레이저 마이크로-방사선 조사 선 단일 및 이중 가닥 나누기 두 일반적인 confocal 레이저 파장, 355에 의해 유도 된 검사는 nm, 405 nm. 사용자 reproducibly 레이저 마이크로 조사 데이터 수집 및 분석을 수행할 수 있도록 유도 하는 특정 손상 혼합물에 적용 된 레이저 복용량의 추가, 적절 한 특성 설명 되어 있습니다.

유도 된 DNA 손상의 특성 기본 병 변 및 스트랜드 나누기의 유도 선택한 핵 영역에 적용 된 레이저 복용량에 따라 달라 집니다 그리고 셀 모델의 휴대폰 microenvironment 사용7. 형광 단백질 융합 단백질 XRCC1, 53BP1, Ku70, 또는 Rad51 같은 복구, 제공 하는 유용한 단일 및 이중 가닥 손상 ROI 위의 내 형광 단백질의 축적을 참조 하는 데 필요한 최소한의 에너지를 설정 하기 위한 휴식 마커는 배경 형광9,,1931. 응답을 유도 하는 조건이 발견 되 면 그 특정 파장 및 복용량에 의해 유도 된 손상 혼합물의 특성에 중대 하다. 복용량과 기간 사용 하는 파장에서의 감쇠는 복잡 한 피해 혼합물의 형성을 최소화 하기 위해 사용자를 허용할 수 있습니다. UV-A 범위에서 낮은 레이저 복용량 SSBs와 작은 양의 기본 병 변, SSBR 및 BER 경로10,28공부에 대 한 적절 한 주로 생산 증명 있다. 복용량을 증가 더 복잡 한 기본 병 변, 산화 만들고 UV 유도, 그리고 DSBs7,10의 더 큰 숫자를 유도 합니다. 단일 종의 DNA 손상의 유도 특정 DNA 수 선 통로의 검사에 대 한 바람직한, 사용자 기본 병 변 또는 DSBs 보다 훨씬 더 자주 되 고 SSBs 같은 특정 병 변으로 DNA 변의 혼합 유도 더 가능성이 높습니다. 과산화 수소 (H2O2) 또는 메 틸 methanesulfonate (MM)32같은 화학 약품에 의해 유도 된 DNA 손상 혼합물와 비슷합니다. 사용자가 때 그들은 혼합물을 손상 결과 발생할 수 있습니다, 그리고 복용량 및 유도 피해 사이트에서 병 변 주의 특성화 comparability 그들의 결과의 재현성을 보장 하는 데 필요한 보고를 해야 합니다.
마이크로 조사 연구에서 XRCC1 GFP 기본 병 변 및 SSBs9,28의 유도 대 한 표식으로 종종 사용 됩니다. XRCC1 SSB 복구 (SSBR)에서 중요 한 역할을 하는 비 계 단백질 이며 기본 절단 (BER)를 수리 하 고 또한 뉴클레오티드 절단 복구 (NER)33,34,35 같은 다른 복구 경로에 참여 . 그것은 중요 한 역할 조정 poly(ADP-ribose) 중 합 효소 1 (PARP-1), DNA 중 합 효소 β를 포함 한 주요 단백질의 수와 상호 작용 하는 DNA 수리에서 (Pol β), 그리고 DNA 리가 III. 우리가 활용 XRCC1-GFP 안정적 조 K1 셀에 표현 SSBs DSBs 생성 하는 데 필요한 레이저 복용량을 결정. 우리는 먼저 각 파장 (그림 1)에 대 한 XRCC1 GFP의 관찰 채용을 유도 하는 데 필요한 최소 복용량을 식별. 355 nm 파장에 대 한 정의 손상 이상의 2 s 면만 시간 투자 수익 생성 배경 (그림 1A) 감지 했다 DNA 손상의 유도 나타내는 그 투자 수익 내 증가 형광 신호. 405에 대 한 nm, 8 fps 스캔 속도 ROI (그림 1A) 손상에 현저한 모집을 생성 하기 위해 필요 했다. 복용량 증가 다음 (10 s 355 nm을 405에 대 한 0.5 fps nm) 더 강렬한 만들려고 ROI (그림 1A) 손상.
모집 및 XRCC1-GFP 유발된 손상의 사이트에서의 보존 되었다 다음 timelapse 이미징에 의해 모니터링 됩니다. DNA 손상의 사이트에서 단백질의 보존 유발된 손상의 사이트에서 단백질의 분리는 종종 BER 또는 SSBR 완료에 대 한 마커를 간주가 DNA 수리를 나타낼 수 있습니다. 그러나, 명확한 증거가 수리의 완료와 함께 레이저 유도 DNA 손상 사이트에서 XRCC1의 분리를 연결 되었습니다. 손상의 사이트에 단백질의 신규 모집 의미 형광 신호 전체 핵 (그림 1B)에 대 한 측정을 통해 손상 된 투자 수익을 내는 형광 신호의 평균 강도 보고 하 여 측정 됩니다. 이 유형의 정규화 다른 정규화 기술 관심사의 단백질의 세포 분포에 따라 사용할 수 있지만 주소 강도 변동 핵 신호에 도움이 됩니다. 여기, 그래서 핵 영역에 정규화 측정 신호 손상 ROI 재배포 XRCC1 핵 구획, 지역화 됩니다. 투자 수익 평균 형광 강도 다음 사전 손상 이미지를 포함 하 고 시간 (그림 1C)의 함수로 그래프로 timelapse의 각 이미지에 대 한 기록 됩니다.
우리 다음 추가 특징 DNA 기본 병 변 형성 검사 두 선택한 레이저 복용량에 의해 유도 된 손상. 첫째, 일일, 부피가 UV 유도 된 병 변의 형성 NER 종류 병 변 (그림 2A)에 대 한 표식으로 면역 형광 검사에 의해 조사 되었다. 다음, oxidatively 유도 기본 lesion8 oxodG BER 유형 병 변 (그림 2B)에 대 한 표식으로 조사 했다. 일일 병 변에서 크게 증가 두 파장에 대 한 낮은 복용량 노출에서 관찰 되었다 (2 355 nm와 405에 대 한 8 fps에 대 한 s nm), 높은 복용량 두 파장에서 처리 하는 동안 (10 355 nm, 405에 대 한 0.5 fps에 대 한 s nm) 형광에 상당한 증가 보여주었다 신호 손상 ROI (그림 2A) 내에서 관찰. 각 손상 된 셀 쇼가 손상 형성 및 파장에 복용량, 일일 병 변의 저수준 더 낮은 복용량에 있을 수 있지만 부하 크게 되지 않을 수 있습니다 나타내는 탐지에 대 한 강도 의미 하는 일일 투자 수익의 점도 더 높은 복용량 적용 됩니다 때까지 발견 했습니다. scatterplot 또한 손상 혼합물의 정확한 정량화를 제한할 수는 항 체 탐지의 그 비효율성을 제안 합니다.
이것은 더 마커 8-oxodG에 의해 oxidatively 유발 DNA 변의 탐지에 강조 된다. 피해 내 형광 신호에 명확한 증가 투자 수익 8-oxodG 레이저 파장 또는 복용량 사용 (그림 2B)에 대 한 관찰 되었다. 이 작품에 사용 되는 항 체는 이전 간행물9,,1036;와 일치 그러나, 그것은 8-oxodG 항 체37,38와 형성을 관찰에 제한이 있을 수 있습니다 주목 해야한다. Oxidatively 유도 장애의 부족의 확인은 또한 8-Oxoguanine DNA Glycosylase (OGG1), 효소 DNA10에서 8 oxodG의 제거에 대 한 책임의 모집 같은 두 번째 표식에 의해 권장 됩니다. 우리가 우리의 DNA 손상 사이트; OGG1 모집을 준수 하지 않았다 그러나, oxidatively 유도 DNA 손상의 저급의 형성 수 없습니다 배제할 수 완전히.
마지막으로, 우리는 정도에서 53BP 1, γH2AX 및 2 개의 마커를 사용 하 여 하는 DSBs 형성 검사면역 형광 검사에 의해 d 레이저 복용량 (그림 3 &#38; 4). ΓH2AX 일반적으로 스트랜드 휴식 마커로 사용 하지만 DSBs에 대 한 그것의 구체적 보고서39,40수에 조사 되어 있다. 또한, 지역화 가닥 틈에 신호의 제한 때문에이 신호 전파 수 가닥 휴식 사이트에서 전파 되는 인 산화 이벤트입니다. 따라서, 53BP-1와 γH2AX를 결합 수 있습니다 손상 투자 수익 내 DSB 형성의 더 정확한 평가.
ΓH2AX과 53BP-1의 마이크로 조사에 응답은 파장 복용량 의존. 낮은 복용량 (2 s) 자극에 355 nm 5, 20 분, 그리고 모두 표시에 대 한 약한 및 가변 응답 10 분 게시물 방사선(그림 3)에서 응답을 elicits. 높은 복용량 (10 s) 355 nm 마이크로-방사선의 5, 10, 및 (그림 3B) 40 분 감소는 20 분 게시물 방사선 손상 ROI 내의 증가 형광 신호를 유도 한다. 이러한 결과 초기 시간 포인트에서 이중 가닥 휴식 마커 γH2AX의 감소 감지에 의해 증명으로 355 nm 복용량의 적정 수리 통로의 상호 자극을 최소화 하기 위해 필요한 주의 표시 (&#60; 20 분) 낮은 복용량에서 적용.
비슷한 실험은 모두 낮은 (8 fps)와 높은 복용량 (0.5 fps) 405 nm 레이저 자극 (그림 4)를 사용 하 여 수행 했다. 이 파장에서 형광 강도 피해 ROI 내에서 상당한 축적 53BP-1와 γH2AX 적용 된 복용량,이 복용이 생성 거의 단일 및 이중 가닥 나누기의 복잡 한 혼합물을 나타내는에 대 한 관찰 DNA 손상 (그림 4)의 유도 후 즉시. 또한, 405 nm 쇼 팬 핵 γH2AX 얼룩이 손상 유도 (그림 4B, 아래)의 10 분 이내에 증가의 고용량을 어려운 손상 투자 수익의 검색 53BP 1 축적 하는 동안 보고서를 더 피해 투자 수익에 포함.
이러한 결과 405 nm 마이크로-방사선 모니터링 SSBR 또는 BER, 적합 하지 않습니다 그리고 그 여러 DNA adducts 표식과 휴식 물가 완전히 유발된 병 변 및 DNA 복구 응답 특성을 고용 한다 명확 하 게 보여줍니다.
모집 및 XRCC1 GFP의 보존에 복용량 의존 변경 일단 유발된 DNA 손상, 성격 레이저 마이크로-방사선 DNA 수 선 단백질의 역학을 공부 하기 위한 이상적인 플랫폼을 수 있습니다. XRCC1 GFP의 보존 및 분리 활동은 예기치 않은 다른 손상 혼합물의 유도 각 파장에 의해 주어진 복용량 종속성 (그림 1)를 보여 줍니다. 높은 방사선 복용량 (10 s와 0.5 fps) 더 낮은 복용량에 상대적인 XRCC1 GFP의 높은 강도 모집 및 손상의 사이트에서 XRCC1 GFP의 더 긴 보존 20 분 시간 과정 (그림 1C) 표시합니다. 355와 405 nm에 대 한 더 높은 복용량에서 만든 DNA 손상 임을 나타냅니다 가능성이 모양과 DSB 마커, γH2AX 및 53BP-1의 유지와 일치 하는 실험의 과정에서 해결 되지 않은 (그림 3 &#38; 4 ).
흥미롭게도, 손상의 더 낮은 복용량 (2 s와 8 fps) 표시 XRCC1-GFP 피해 사이트의 신속한 채용 및 사전 조사 수준 (그림 1C) 실험 시간에 걸쳐 XRCC1 GFP의 분리. 손상 혼합물의 완전 한 특성 없이이 결론 SSBs 및 기본 병 변은 완전히 해결 한다는 이러한 손상 조건을 사용 하 여 발생할 수 있습니다. 그러나, γH2AX 및 53BP-355 위한 40 분에서 1 nm 405에 대 일 분에 nm는 다른 해석으로 이어질 수 있습니다. 355 nm 2의 복용량에 대 한 피해 혼합물 수 주로 SSBs, 있으므로 일부 배달된 병 변 DSBs 선도 수 있습니다 또는 DSBs이이 에너지에 의해 생성 된 더 긴 시간 규모에 수리는 40 분에서 DSB 마커 모양을 나타낼 수 있습니다. 시간 규모 차이 SSBR DSB 수리 이전에 보고 된28,,4142되었습니다. 마찬가지로, 405 nm 낮은 복용량 (8 fps) 분리 SSBs의 낮은 수준을 나타낼 수 있습니다 또는 에이전트 손상 마이크로 조사와 다른 DNA 손상 한 클러스터링 SSBs DSBs, 신속 하 게 변환 되는의이 대 한 언급 되었습니다 이전43, 44 , 45.
함께 특성화 유도 손상 혼합물의 중요성을 강조 하는이 결과 고 단백질 복구 여러 DNA를 이용 하 여 모집 및 DNA의 보존을 해석 하기 위한 마커 단백질 유도 손상의 사이트에 복구.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig1.jpg"> 
그림 1 . 레이저 마이크로-방사선 유도 XRCC1 GFP 모집 합니다.  (A) 조-K1 셀 XRCC1 GFP를 표현 안정적으로 반구 되었고 전후 즉시 손상 유도 몇 군데. 화살표 표시 마이크로 방사선 복용량의 위치와 눈금 막대는 10 µ m. (B) 모집 손상 ROI 내의 평균 형광 강도 결정 하 고 전체 핵의 평균 형광 강도를 정상화 하 여 측정 됩니다. 각 timelapse 이미지 (C) 신규 모집의 역학을 측정할 수 있습니다. 그래프는 두 개의 독립적인 실험 SEM를 나타내는 오차 막대를 (n = 24). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig2.jpg"> 
그림 2 . 레이저 마이크로-방사선 뉴클레오티드 손상을 유도합니다.  조-K1 셀 레이저 마이크로 조사를 받게 되었고 손상 유도 후 즉시 고정. 면역 형광 검사 일일 검색을 수행 하 고 8 oxodG adducts. (A) 가기, 점도 투자 수익 평균 형광 강렬에서 관찰의 일일 비용 얼룩 후 세포 손상. 하단, 일일 얼룩의 대표 이미지입니다. 화살표 표시 마이크로 방사선의 위치와 눈금 막대는 10 µ m (n = 12). (8-oxodG 얼룩에 대 한 B) 대표 이미지. 화살표마이크로-방사선의 위치를 표시 하 고 눈금 막대는 10 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig3.jpg"> 
그림 3 . DNA 이중 가닥 휴식 마커 복용량 의존 방식에서 355 nm 마이크로 조사에 응답.  조-K1 셀 마이크로 조사를 받게 되었고 시간 포인트 표시 후 자극에 고정. DSB 마커 γH2AX 및 53BP-1에 대 한 면역 형광 검사 수행 되었다. (A) 정규화 된 손상 손상 및 손상 된 세포에 대 한 형광 강렬 측정을 의미 하는 투자 수익의 음모를 피해 라. 오차 막대는 SEM의 대표 (n = 12). (ΓH2AX 및 53BP-1 얼룩 B) 대표 이미지. 화살표 표시 마이크로 방사선의 위치와 눈금 막대는 10 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig4.jpg"> 
그림 4. DNA 이중 가닥 휴식 마커 튼튼하게 405 nm 마이크로 조사에 응답. 조-K1 셀 마이크로 조사를 받게 되었고 시간 포인트 표시 된 게시물 자극에 고정. DSB 마커 γH2AX 및 53BP-1에 대 한 면역 형광. (A) 정규화 된 손상 손상 및 손상 된 세포에 대 한 형광 강렬 측정을 의미 하는 투자 수익의 음모를 피해 라. 오차 막대는 SEM의 대표 (n = 12). (ΓH2AX 및 53BP-1 얼룩 B) 대표 이미지. 화살표 표시 마이크로 방사선의 위치와 눈금 막대는 10 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

공초점 형광 현미경 검사 법 및 레이저 마이크로 조사 제공 도구 DNA 손상 유도 및 선택한 하위 핵 분야에서 DNA 수 선 단백질의 응답을 모니터링. 이 기술은 크게 손상 감지, 신호, 및 채용의 우리의 지식의 전진 했다. 이 원고에서는 단일 및 이중 가닥 브레이크 수리 검사 이러한 기술을 보여 줍니다.

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

본 절차의 전반적인 목표는 공초점 형광 현미경 레이저를 사용하여 세포의 핵 내 특정 부위에 DNA 손상을 유도하는 것입니다. 이 방법은 단백질이 DNA 손상 부위로 어떻게 모집되고 유지되는지와 같은 DNA 복제의 핵심 질문들에 대한 답을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 단백질을 실시간으로 시각화할 수 있어 모집 및 유지 프로파일을 구축할 수 있다는 점입니다.관심 세포가 포함된 챔버 슬라이드를 37 °C 및 5% 이산화탄소 상태로 유지되는 스테이지 상단 인큐베이터에 넣어 이 절차를 시작합니다. 인코딩된 자동 현미경 스테이지를 사용하여 이미지 영역을 등록합니다. 웰 사이의 경계와 같이 배양 용기에서 식별 가능한 특징을 선택하십시오.이미지를 획득하고 X-Y 좌표를 기록합니다. 이를 통해 시료 준비 후 선택된 영역들의 X-Y 좌표를 정렬하고 등록할 수 있습니다. 이미지 등록이 완료되면, 미세 조사(micro-irradiation)를 수행할 영역을 선택하고 시료의 초점을 맞춥니다.형광 표지 단백질을 발현하는 세포의 경우, 관심 있는 형광 채널에서 핵의 단면이 최대가 되는 초점 평면을 선택하십시오. 핵의 최대 단면에 초점을 맞추는 것은 유도된 손상 부위로 표적 단백질이 모집되는 것을 모니터링할 때 초점 지점이 핵의 중심에 위치하도록 보장하므로 매우 중요합니다. 인과 같은 핵 내의 명확한 특징을 선택하고, 이 모습의 변화를 관찰하면서 초점 평면을 위아래로 이동시키십시오.실제 초점면은 밝은 영역에서 어두운 영역으로 전환되는 구간 내에 위치하게 됩니다. 샘플의 초점을 맞추려면, 선택한 특징이 가장 선명한 대비를 보이는 초점면을 선택하십시오. 다음 단계는 관심 영역의 위치를 등록하는 것입니다.현미경 소프트웨어 내에서 3x3 픽셀 크기의 정사각형 관심 영역(ROI)을 생성합니다. 이 ROI를 손상시킬 세포의 핵 위에 배치하고, 이를 손상 ROI로 설정합니다. 손상 ROI의 위치가 포함된 손상 전 이미지를 수집합니다.관심 단백질의 형광 채널에서 명시야 이미지를 획득합니다. 이제 세포는 레이저 미세 조사(laser micro-irradiation)를 수행할 준비가 되었습니다. 본 시연에서는 405nm 레이저를 100% 출력으로 사용합니다.405nm 레이저 조사량은 스캔 속도를 조절하고 선택한 손상 ROI를 1회 스캔함으로써 제어합니다. 본 실험에서는 405nm 마이크로 조사 시 초당 8프레임 및 0.5프레임을 사용하십시오. 세포에 손상을 주기 위한 적절한 레이저 출력을 선택하는 것은 서로 다른 DNA 복구 경로를 구분하는 데 매우 중요합니다.손상 후 명시야 및 형광 채널의 타임랩스 이미지 획득을 수행하십시오. 데이터 수집을 최적화하기 위해 타임랩스의 지속 시간과 빈도를 조절하여, 손상 ROI에서의 형광 단백질 축적과 실험 과정에 따른 해리를 이상적으로 캡처하십시오. 타임랩스 과정이 완료되면, 손상을 가할 새로운 세포 영역을 선택하고 원하는 수의 손상된 세포 수를 확보할 때까지 미세 조사 및 타임랩스 이미징을 계속하십시오.선택한 조건당 10~25개의 세포를 권장합니다. 면역형광 분석을 위한 전체 세포 수를 늘리려면, 배양 용기 내의 추가 영역에 손상을 가하여 손상 후 반응의 다중 영역 시계열 데이터를 생성하십시오. 각 영역의 X-Y 좌표와 손상이 발생한 시간을 기록하십시오.세포는 손상 직후에 고정하거나, 고정 전까지 선택한 시간 간격 동안 회복하도록 둘 수 있습니다. 이 분석을 시작하려면 NIS-Elements와 같은 이미지 분석 애플리케이션에서 획득한 이미지를 엽니다. 측정할 각 세포에 대해, 먼저 핵을 나타내는 참조 ROI를 생성하십시오.핵을 구성하는 픽셀이 포함된 형광 신호에 임계값 설정 알고리즘을 적용한 다음, 이 영역을 ROI로 변환합니다. 이어서 6x6 픽셀 크기의 ROI를 생성하여 손상 ROI 위에 배치합니다. 이제 이 더 큰 ROI가 분석을 위한 손상 ROI가 됩니다.측정할 각 세포에 대해 기준(reference) 및 손상(damage) ROI의 평균 형광 강도를 기록하십시오. 타임 코스의 각 프레임마다 기준 ROI가 핵 영역을 정확하게 덮고 있는지 확인하여 조정하고, 손상 ROI가 손상 부위를 덮고 있는지 확인하여 조정하십시오. 타임 코스의 각 프레임에서 각 ROI 내 형광 신호의 평균 형광 강도를 기록하십시오.각 세포에 대해, 타임랩스의 매 프레임마다 평균 손상 ROI 형광 강도를 해당 참조 ROI의 강도로 정규화합니다. 여기서는 평균 핵 형광 강도를 참조 ROI로 사용하며, 평균 손상 ROI 형광 강도에서 평균 참조 ROI 형광 강도를 빼는 방식으로 정규화를 수행합니다. 모든 손상된 세포뿐만 아니라 최소 두 개의 손상되지 않은 대조군 세포에 대해서도 정규화를 반복합니다.마지막으로, 실험적 처리에 따른 리크루트먼트 역학의 변화를 보여주기 위해 시간에 따른 정규화된 강도 값을 그래프로 나타냅니다. XRCC1-GFP를 안정적으로 발현하는 세포를 손상 유도 전후로 조사하고 이미징했습니다. 손상 ROI로의 XRCC1-GFP 리크루트먼트를 관찰하고 리크루트먼트의 역학을 측정했습니다.두 가지 마커를 사용하여 이중 가닥 절단의 형성을 조사하였습니다. 두 마커 모두 355 nanometers에서의 두 번째 저선량 자극은 조사 후 5분과 20분에는 반응을 일으키지 않았으며, 10분에는 약하고 가변적인 반응을 보였습니다. 355 nanometers에서의 10초 고선량 미세 조사는 손상 ROI 내에서 조사 후 5분, 10분, 20분에 증가된 형광 신호를 유도하였으며, 이는 40분에 감소하였습니다.이러한 결과는 DNA 이중 가닥 절단 마커가 355nm 마이크로 조사에 대해 용량 의존적인 방식으로 반응한다는 것을 나타냅니다. 반면, 405nm 레이저 자극은 적용된 용량과 관계없이 손상 ROI 내에 두 마커 모두가 유의미하게 축적되는 결과를 가져왔습니다. 숙련된 후에는 적절하게 수행될 경우 10개의 세포에 대해 약 4시간 만에 이 기술을 수행할 수 있습니다.이 기술을 수행할 때는 모니터링하려는 복구 과정에 맞춰 레이저 파장과 인가 전력을 조정하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에 면역형광법을 수행하여 추가 단백질의 보충이나 인산화 상태 또는 기타 번역 후 변형의 변화에 관한 의문점을 해결할 수 있습니다. 이 기술을 통해 연구자들은 DNA 복구 단백질의 역동적인 보충 과정을 탐구하고, 단백질 도메인과 돌연변이가 DNA 손상의 인식 및 반응에 어떤 영향을 미치는지 더 정확하게 결정할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 DNA 손상을 유도하고 DNA 복구 단백질의 모집을 모니터링하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 레이저 및 포름알데히드와 같은 화학 물질을 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 개인 보호 장구 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

포유 동물 세포의 DNA 이중 가닥 브레이크 (DSB) 수리 분석

레이저는 자주 DNA 손상에 대한 세포 반응의 연구에 사용된다. 그러나, 이들은 그 공간, 주파수 및 복제 충돌 포크 거의없는 것을 특징으로 병변을 생성한다. 여기서, 우리는 레이저의 국소 interstrand 가교 이러한 매개 변수의 결정을 가능하게하는 방법을 설명한다.

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

레이저 microirradiation는 살아있는 세포에서 DNA 수리의 연구에 대 한 유용한 도구입니다. 다양 한 DNA 병 변 유발 하 UVA 레이저의 사용에 대 한 방법론 접근 표시 됩니다. 우리 지역 microirradiation; 정상적인 세포 주기를 유지 하는 방법을 최적화합니다 따라서, 비친된 세포 유사 분열을 통해 진행합니다.

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

이 프로토콜의 목표 레이저 microirradiation를 사용 하 여 다른 유형의 DNA 손상, 비교적 간단한 가닥 나누기 등 복잡 한 손상, DNA 손상 신호 및 복구 요소에서 어셈블리 피해 사이트 vivo에서 공부를 유도 하는 방법을 설명 하는 것입니다. .

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

두 광자 레이저를 통해 세포 막 부상 막 resealing 능력을 평가 하기 위한 널리 사용 되는 방법 이며, 여러 개의 셀 형식에 적용할 수 있습니다. 여기, 우리가 시험관에서 라이브 이미징 막 resealing dysferlinopathy 환자 셀 다음 2 광자 레이저 절제에에서의 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

세포 막 복구 분석 결과 2 광자 레이저 현미경을 사용 하 여

DNA 손상 복구 속도 론을 공부 하 고 정의 된 하위 핵 지역에서 병 변 유발 하는 시스템이 필요 합니다. 레이저 검사 confocal 현미경 405 nm 레이저 장비를 사용 하 여 지역화 된 이중 가닥 나누기를 만들고 이러한 병 변에서 수리 요인의 역학을 계량 하는 자동화 된 절차를 제공 하는 방법을 설명 합니다.

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

이 프로토콜은 레이저 미세 조사에 의한 DNA 수리 단백질 모집 측정과 같은 하류 현미경 연구를 위한 S상 세포를 효율적으로 식별하는 비침습적 방법을 설명합니다.

S 단계 동안 DNA 모집을 연구하는 레이저 미세 조사

이 원고는 γH2AX와 53BP1의 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 DNA 두 배 물가 틈의 분석을 위한 프로토콜을 제공합니다.

ΓH2AX와 53BP1 형성 및 DNA 두 배 물가 틈의 수리 분석에 대 한 면역 형광 검사 현미경 검사 법

인도네시아에서 센티넬 노드 생검(SNB)은 방사성 동위원소 트레이서 및 이소술판 또는 특허 청색 염료(PBD)를 제공하는 데 제한이 있기 때문에 유방암 수술을 위해 일상적으로 수행되지 않습니다. 이 장애물을 극복하기 위해 1% 메틸렌 블루 염료(MBD)를 단일 에이전트로 적용하여 센티넬 노드(SN)를 매핑했습니다.

유방암 센티넬 노드 생검에 있는 단 하나 기술로 1% 메틸렌 청색염의 응용

이중 가닥 DNA 틈의 수리 후 병 변 해결 뿐만 아니라 휴식, 하지만 또한 그들의 해상도에 선 단지의 형성을 필요로 역동적인 과정 이다. 여기, 사용 면역 형광 검사 현미경 검사 법 과도 하 고 오래 견 딘 더블-좌초 휴식을 위한 도구로 서이 게놈 유지 관리 메커니즘을 해 부 합니다.

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화

배우세요 포유류 세포에서 레이저 마이크로-방사선을 이용한 이중 가닥 브레이크 수리 메커니즘을 실시간 영상화하는 방법을. 이 기법은 DNA 손상 부위에 수복 단백질이 모이는 역학을 정량적으로 분석하여 유전체 안정성 연구에 활용됩니다.

단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

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