단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

이 절차의 전반적인 목표는 컨포칼 형광 현미경 레이저를 사용하여 세포의 핵 이하 영역에서 DNA 손상을 유도하는 것입니다. 이 방법은 DNA 손상 부위에서 단백질이 어떻게 모집되고 유지되는지와 같은 DNA 복구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 단백질을 실시간으로 시각화할 수 있어 모집 및 보유 프로파일을 구축할 수 있다는 것입니다.

섭씨 37도와 5%이산화탄소로 유지되는 스테이지 상단 인큐베이터에 관심 세포가 포함된 챔버 슬라이드를 배치하여 이 절차를 시작합니다. 인코딩된 자동 현미경 스테이지를 사용하여 이미지 필드를 등록합니다. 우물 사이의 장벽과 같은 배양 용기의 인식 가능한 기능을 선택합니다.

이미지를 수집하고 X-Y 위치를 기록합니다. 이렇게 하면 샘플 준비 후 선택한 필드의 X-Y 위치를 정렬하고 등록할 수 있습니다. 이미지 등록이 완료되면 미세 조사할 필드를 선택하고 샘플에 초점을 맞춥니다.

형광 표지된 단백질을 발현하는 세포의 경우, 관심 형광 채널에서 최대 핵 단면을 가진 초점면을 선택합니다. 핵의 최대 단면에 초점을 맞추는 것은 유도 손상 부위에 대한 관심 단백질의 동원을 모니터링하기 위해 초점이 핵에 집중되도록 하기 때문에 매우 중요합니다. 핵소체(nucleolus)와 같은 핵 내의 명확한 특징을 선택하고 초점면을 위아래로 이동하면서 이러한 모양의 변화를 관찰합니다.

진정한 초점면은 밝은 곳에서 어두운 곳으로 전환하는 시점에 있습니다. 샘플에 초점을 맞추려면 선택한 피처의 대비가 가장 선명한 초점면을 선택합니다. 다음 단계는 관심 필드의 위치를 등록하는 것입니다.

현미경 소프트웨어 내에서 3x3 픽셀 정사각형 관심 영역(ROI)을 생성합니다. 이 ROI를 손상될 세포핵 위에 놓고 이 ROI를 손상된 ROI로 설정합니다. 손상 ROI의 위치를 포함한 손상 전 이미지를 수집합니다.

관심 단백질에 대한 형광 채널에서 명시야를 포함하는 이미지를 획득합니다. 이제 세포는 레이저 미세 방사선 조사를 할 준비가 되었습니다. 이 시연에서는 405나노미터 레이저가 100% 출력으로 사용됩니다.

405나노미터 레이저 선량은 스캔 속도를 조절하고 선택한 손상 ROI를 한 번 스캔하여 제어됩니다. 이 실험에서는 405나노미터에서 미세 조사를 위해 초당 8프레임 및 0.5프레임을 사용합니다. 손상된 세포에 적합한 레이저 출력을 선택하는 것은 다양한 DNA 복구 경로를 분리하는 데 매우 중요합니다.

손상 후 명시야 및 형광 채널의 타임 랩스 이미지 획득을 수행합니다. 타임 랩스의 지속 시간과 빈도를 조정하여 데이터 수집을 최적화하고, 실험 시간 경과에 따른 손상 ROI에서 형광 단백질의 축적과 해리를 이상적으로 캡처합니다. 시간 경과가 완료된 후 손상시킬 새로운 세포 영역을 선택하고 원하는 손상된 세포 수에 도달할 때까지 미세 조사 및 타임 랩스 이미징을 계속합니다.

선택한 조건당 10 - 25개의 셀이 권장됩니다. 면역형광 분석을 위한 전체 세포 수를 늘리려면 배양 용기 내의 추가 필드를 손상시켜 손상 후 반응의 다중 필드 시간 경과를 생성합니다. 각 필드의 X-Y 위치와 손상이 발생한 시간을 기록합니다.

세포는 손상 직후 고정되거나 고정 전에 선택한 시간 동안 복구될 수 있습니다. 이 분석을 시작하려면 NIS-Elements와 같은 이미지 분석 응용 프로그램에서 획득한 이미지를 엽니다. 측정할 각 세포에 대해 먼저 핵을 나타내는 참조 ROI를 생성합니다.

핵을 구성하는 픽셀을 포함하는 형광 신호에 임계값 알고리즘을 사용한 다음 이 영역을 ROI로 변환합니다. 다음으로, 6x6 픽셀 ROI를 생성하고 손상 ROI 위에 배치합니다. 이 더 큰 ROI는 이제 분석을 위한 손상 ROI입니다.

측정할 각 세포에 대해 참조 및 손상 ROI에 대한 평균 개광 강도를 기록합니다. 시간 경로의 각 프레임에 대해 참조 ROI를 조정하여 핵 영역이 ROI에 의해 정확하게 커버되도록 하고 손상 ROI를 조정하여 손상된 지점이 커버되도록 합니다. 시간 경과의 각 프레임에 대한 각 ROI 내에서 형광 신호의 평균 형광 강도를 기록합니다.

각 셀에 대해 평균 손상 ROI 형광 강도를 타임 랩스의 각 프레임에서 해당 참조 ROI의 강도로 정규화합니다. 여기서, 평균 핵 형광 강도는 기준 ROI로 사용되며, 정규화는 평균 손상 ROI 형광 강도에서 평균 기준 ROI 형광 강도를 빼서 수행됩니다. 손상된 모든 셀과 손상되지 않은 두 개 이상의 제어 셀에 대해 정규화를 반복합니다.

마지막으로, 실험 처리의 함수로서 모집 역학의 변화를 보여주기 위해 시간 경과에 따른 정규화된 강도 값을 그래프로 표시합니다. XRCC1-GFP를 안정적으로 발현하는 세포를 손상 유도 전후에 조사하고 이미지화했습니다. 손상 ROI에 대한 XRCC1-GFP의 동원을 관찰하고 모집의 역학을 측정했습니다.

이중 가닥 절단의 형성은 두 개의 마커를 사용하여 조사되었습니다. 두 마커 모두 355나노미터에서 2초간 저선량 자극은 5분 및 20분에 반응을 일으키지 않으며 방사선 조사 후 10분에는 약하고 가변적인 반응을 이끌어냅니다. 355나노미터에서 10초 고선량 미세 조사는 조사 후 5분, 10분, 20분에 손상 ROI 내에서 증가된 형광 신호를 유도하고 40분에서 감소합니다.

이러한 결과는 DNA 이중 가닥 파손 마커가 355나노미터 미세 조사에서 용량 의존적 방식으로 반응한다는 것을 나타냅니다. 대조적으로, 405나노미터 레이저 자극은 적용된 선량에 관계없이 손상 ROI 내에서 두 마커가 모두 크게 축적되는 결과를 낳았습니다. 일단 숙달되면 이 기술은 제대로 수행되면 10개의 세포에 대해 약 4시간 내에 수행할 수 있습니다.

이 기술을 수행하는 동안 레이저 파장과 적용된 출력을 모니터링 중인 수리 프로세스에 맞게 조정하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 면역형광을 수행하여 추가 단백질 동원 또는 인산화 상태의 변화 또는 기타 번역 후 변형에 대한 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술을 통해 연구자들은 DNA 복구 단백질의 동적 동원을 탐색하고 단백질 도메인과 돌연변이가 DNA 손상의 인식 및 반응에 어떤 영향을 미치는지 더 잘 결정할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 DNA 손상을 유도하고 DNA 복구 단백질의 동원을 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 레이저 및 포름알데히드와 같은 화학 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.