셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

이 연구 보고서의 세포 침입과 마이그레이션 분석에 대 한 두 가지 방법: Boyden 챔버 분석 결과 및 체 외에서 비디오 현미경-기반 상처 치유 분석 결과. 이 두 실험에 대 한 프로토콜 설명, 그리고 그들의 장점과 단점 비교 됩니다.

이 실험의 전반적인 목표는 세포 침입 및 이동을 연구하는 데 사용되는 두 가지 분석법, Boyden 챔버 분석 및 최적화된 체외 비디오 현미경 기반 스크래치 상처 분석을 보고하고 비교하는 것입니다. 이러한 실험은 가장 관련성이 높은 방법의 선택과 같은 침입 및 이주 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 최적화된 체외 비디오 현미경 기반 스크래치 상처 분석의 주요 장점은 치료 조건 간의 재현 가능하고 정확한 비교를 제공한다는 것입니다.

이 방법은 세포 이동 및 침입을 평가할 수 있지만 치유 또는 조직 재생과 같은 다른 연구 분야에도 적용할 수 있습니다. 175제곱센티미터 플라스크에서 25ml의 배양 배지에 있는 1/6 세포에 10배를 두 번 파종하여 분석 1일차 72시간 전에 SQ20B 세포를 준비합니다. 세포가 섭씨 80도에서 37%의 세포 합류점까지 성장하도록 합니다.

트립신화(trypsinization) 및 세포 계수 후 첫째 날, 평가할 각 조건에 대해 3ml의 배양 배지에 있는 1/5 세포의 6배의 세포 밀도로 25제곱센티미터 플라스크에 세포를 파종합니다. 세포를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 각 플라스크의 배지를 3밀리리터의 저소 태아 혈청 배지로 교체하여 세포를 굶주리게 합니다.

섭씨 37도의 인큐베이터에서 24시간 동안 세포를 굶깁니다. 침입 분석실험을 위해, 세포 결핍을 시작한 후에 12 시간 후에 입히는 Boyden 약실을 준비하십시오. 각 Boyden 챔버를 컴패니언 플레이트에 놓습니다.

코팅된 각 챔버에 500마이크로리터의 기아 세포 배지를 추가합니다. 다음 날인 3일째에는 컴패니언 플레이트를 사용하여 화학유인제를 준비합니다. 24웰 컴패니언 플레이트의 각 웰에 10% FBS, 하이드로코르티손, 페니실린 및 스트렙토마이신이 함유된 750마이크로리터의 완전한 배지를 채웁니다.

상부 챔버를 미리 채워진 컴패니언 플레이트로 옮기고 거품이 생기지 않도록 주의하십시오. 침입 분석의 경우 각 Boyden 챔버에서 450마이크로리터의 배양 배지를 조심스럽게 제거합니다. 고갈된 SQ20B 세포의 트립신화 및 계수 후, 0.1%BSA 배지 500마이크로리터의 1/4 세포에 10배의 3배를 파딩하여 밀리리터당 1/4 세포에 6배의 최종 희석을 제공합니다.

Boyden 챔버를 섭씨 37도 인큐베이터에 24시간 동안 놓습니다. 4일차에는 컴패니언 플레이트에서 각 삽입물을 제거하고 면봉을 사용하여 상부 챔버에서 세포를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 각 삽입물을 개별적으로 고정하고 염색하여 제조업체의 지침에 따라 염색 키트를 사용하여 May-Grunwald Giemsa 착색을 얻습니다.

5일째에 현미경 분석을 수행합니다. 인서트가 있는 컴패니언 플레이트를 20X 위상차 현미경에 삽입하고 멤브레인 하부에서 마이그레이션된 각 세포를 계산합니다. 175제곱센티미터 플라스크에서 25밀리리터의 배양 배지에 1/6 SQ20B 세포를 10회 파종하고 세포가 80% 세포 합류점까지 성장할 수 있도록 합니다.

트립신화 및 세포 계수 후 첫날에 SQ20B 세포의 사전 희석된 샘플을 10의 4배에서 밀리리터당 1/5 세포의 밀도로 생성합니다. 100마이크로리터의 셀 용액을 96웰 플레이트의 각 웰에 분배하여 각 웰의 100마이크로리터당 1/4 셀에 대해 10의 4배의 최종 밀도를 제공합니다. 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 놓고 세포가 12-16시간 동안 플레이트에 부착되도록 합니다.

다음 날에는 상업용 부상 장치를 사용하여 부상을 입히기 위해 플레이트를 후드로 가져갑니다. 상처 메이커의 상단을 제거하고 세척 보트 용액에 넣습니다. 플레이트를 베이스 플레이트 홀더에 삽입하고 플레이트 커버를 제거합니다.

핀 블록의 후면 다웰을 베이스 플레이트의 후면 구멍으로 안내하여 핀 블록을 교체합니다. 검은색 레버를 누른 상태에서 검은색 레버를 계속 누르고 있으면서 핀 블록을 들어 올립니다. 원뿔형 팁이 조정된 피펫을 사용하여 상처를 만지지 않도록 주의하면서 각 웰에서 매체를 즉시 제거합니다.

섭씨 37도로 가열된 100마이크로리터의 세포 배지를 각 웰에 추가하여 세포를 세척합니다. 두 번째 세척 후, 세포 배지를 흡인하기 위해 조정된 원뿔형 팁이 있는 피펫을 사용합니다. 다음으로, 각 처리 조건에 특정한 매체 100마이크로리터를 각 웰에 추가하여 웰에 기포가 생성되지 않도록 합니다.

96웰 플레이트를 비디오 현미경의 개조된 랙에 놓습니다. 비디오 현미경 소프트웨어를 사용하여 웰당 하나의 이미지로 스캔 일정을 프로그래밍합니다. 이주 침입 실험의 경우 최대 2시간 간격이 필요합니다.

실험의 목적이 동영상 제작인 경우 최대 30분 간격이 선호됩니다. 세포 이동을 분석하기 위해 각 세포 유형에 맞게 조정된 적절한 세포 마스크를 사용하여 최소 24시간에서 최대 5일 동안 세포 이동을 모니터링하고 확인합니다. 각 세포주에 적합한 세포 마스크를 얻으려면 특정 세포 이미지 컬렉션을 사용하여 소프트웨어에서 세포 처리 정의를 생성합니다.

곡선을 추적하고 결과를 분석하고 비교하는 데 사용할 수 있는 스프레드시트로 데이터를 내보냅니다. 세포 침입 분석을 준비하기 위해 세포 이동 분석에서 입증된 것과 동일한 방식으로 SQ20B 세포를 시드하고 인큐베이터에서 96웰 플레이트를 배양합니다. 분석 2일차에 세포외 기질을 준비합니다.

사용하기 전에 최소 12시간 동안 매트릭스를 섭씨 4도에서 해동하고 응집체가 보이지 않는지 확인하십시오. 마이크로 원심분리기 튜브를 얼음에 5분 동안 식힙니다. 섭씨 4도로 사전 냉각된 원뿔형 팁으로 매트릭스를 섭씨 4도로 냉각된 셀 매체와 함께 예냉각된 마이크로 원심분리기 튜브에 희석하여 밀리리터당 300마이크로그램의 최종 농도를 얻습니다.

미리 희석된 매트릭스가 있는 마이크로 원심분리기 튜브를 냉장고에 섭씨 4도로 보관하십시오. 인큐베이터에서 96웰 플레이트를 회수합니다. 후드 아래에서는 앞에서 설명한 것처럼 제조업체의 프로토콜에 따라 상업용 상처 장치를 사용하여 상처를 만듭니다.

원뿔형 팁이 조정된 피펫을 사용하여 각 웰에서 매체를 즉시 제거하고 상처를 만지지 않도록 주의하십시오. 섭씨 37도로 예열된 100마이크로리터의 세포 배지를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 접시를 얼음 위에 5분 동안 올려 온도를 평형을 유지합니다.

각 웰에서 차가운 매체를 제거하고 가장자리에서 조심스럽게 피펫팅하고 상처를 만지지 않도록 주의하십시오. 섭씨 4도에서 사전 냉각된 원뿔형 팁을 사용하여 각 웰에 50마이크로리터의 사전 희석된 매트릭스를 추가합니다. 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다.

30분 후, 각 처리 조건에 대해 표시된 대로 100마이크로리터의 적응된 세포 배지를 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 비디오 현미경의 적응형 랙에 놓습니다. 그런 다음 스캔을 프로그래밍하고 세포 이동 분석에 대해 입증된 대로 비디오 현미경 분석을 수행합니다.

세포 고정 후 Boyden 막의 대표적인 결과가 표시됩니다. 차선의 막은 막의 위쪽에 세포 클러스터가 있어 해석할 수 없는 결과를 보입니다. 대조적으로, 최적의 멤브레인은 멤브레인의 아래쪽 부분에 파란색으로 염색된 셀 수 있는 세포를 가지고 있습니다.

스크래치 상처 분석의 최적 결과는 0시, 15시간 및 30시간에 상처가 치유되는 이미지로 설명됩니다. 품질 실험의 기준은 선형 상처, 상처에서 관찰된 세포 단편 없음, 최적의 세포 합류입니다. 90% confluence는 패널 A.Panel C는 낮은 세포 밀도의 예이고 Panel B는 세포 펠릿의 불충분한 세척으로 인한 세포 클러스터를 보여줍니다.

비디오 현미경 소프트웨어를 사용하여 얻은 상처 치유의 그래픽 표현은 4가지 치료 조건의 시간에 따른 상처 세포 합류 매개변수의 정량화를 보여줍니다. 병용 처리는 세포 이동을 현저히 감소시키는 것으로 관찰되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포 이동 및 침입 과정을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.