Name: 셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 학습하세요 세포 침습 및 마이그레이션 평가를 위한 Boyden 챔버 분석과 비디오 현미경 기반 스크래치 상처 분석법을 비교하는 방법을. SQ20B 세포를 사용하여 재현성 높은 결과를 얻을 수 있습니다.

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이 기술은 LabEx 소수 (ANR-11-LABX-0063), 뚜 (CPER 2009-2013 년), 그리고 서 정시 그랜트 잉카-DGOS-4664의 과학적 프레임 워크 내에서 성립 계획 Etat 지역 (CPER)의 지원으로 개발 되었다.

참고: ECM의 포함 없이 Boyden 챔버와 스크래치 분석 실험 이라고 마이그레이션 분석 결과, 그리고 ECM과 같은 분석을 침공 분석 결과 라고.
1. Boyden 챔버 분석 결과
참고:이 프로토콜은 재발 머리와 목 편평 상피 세포 암 (HNSCC) 후 두 암에서 파생 되 고 존에서 얻은 SQ20B의 셀 라인에 맞게 작은 (보스턴, 메사추세츠, 미국).
주 1
<ol><li>
시드 셀
	<ol>
<li>시드 2 106 SQ20B 175 cm2 플라스 크 하루 전에 72 h에에서 문화 매체 (CM)의 12 mL에서 세포 고 80% 셀 합류에 성장 하는 세포.<ol>
<li>SQ20B 셀에 대 한 CM을 준비, 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 0.04 mg/mL 날린, 100 U/mL 페니실린과 0.1 g/L 스 Dulbecco의 수정된이 글 매체 (DMEM)을 보충.</li>
		</ol>
</li>
		<li>층 류 흐름 후드 셀 trypsinize. 매체를 제거 하 고 세척 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 셀 trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (0.5 g/L)의 2.5 mL을 추가. 37 ° C에서 5 분에 대 한 셀을 품 어 한 다음 37 ° c.로 예 열 하는 CM의 12.5 mL을 추가 하 여 반응을 중지합니다 셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.</li>
		<li>평가를 각 상태에 대 한 6 105 셀의 셀 밀도에서 25 cm2 플라스 크에 세포 씨앗 CM의 3 ml에서 24 h에 대 한 셀을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>주 2
<ol start="2"><li>
셀 기아와 코팅된 챔버의 준비
	<ol>
<li>FBS 대신 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 사용 하 여 낮은 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 매체의 3 mL와 함께 각 플라스 크에 매체를 대체 하 여 세포를 굶 어. 인큐베이터에서 24 h에 대 한 셀을 굶 어.<ol>
<li>기아 CM (s-CM) 준비, 0.1 %BSA, 0.04 mg/mL 날린, 100 U/mL 페니실린과 0.1 g/L 스 DMEM 보충.</li>
		</ol>
</li>
		<li>마이그레이션 분석 결과 대 한 단계로 1.3 이동 합니다.</li>
		<li>침공 분석 결과 대 한 3 년 전에 12 h 500 μ s-CM의 각 코팅된 챔버를 추가 하 여 코팅된 Boyden 챔버를 준비 합니다. 상업적으로 준비 된 코팅된 Boyden 챔버를 사용 하 고 사용 하기 전에 4 ° C에서 그들을 유지. 동반자 접시에 각 Boyden 챔버를 놓고 하룻밤 37 ° c 배양 기에서 그것을 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3 일
<ol start="3"><li>
Boyden 챔버에 시드 셀
	<ol>
<li>동반자 플레이트를 사용 하 여 준비 하는 chemoattractant. 각 채우기와 10 %FBS, 0.04 mg/mL 날린, 100 U/mL 페니실린, 0.1 g/L 스 완전 한 매체의 750 μ와 24-잘 동반자 판의 잘.<ol>
<li>각 셀 라인 및 각 치료 상태에 대 한 chemoattractant를 적응. Chemoattractant CM (ca-CM)를 준비 하려면 10 %FCS, 0.4 mg/mL 날린, 100 U/mL 페니실린과 0.1 g/L 스 DMEM 보충.</li>
		</ol>
</li>
		<li>거품을 피하기 위해 돌보는 prefilled 동반자 접시에 상단 챔버를 전송 합니다.</li>
		<li>침공 분석 결과 대 한 조심 스럽게 각 Boyden 상공에서 450 μ M의 제거.</li>
		<li>층 류 흐름 후드 셀 trypsinize. 매체를 제거, 살 균 PBS로 세포 세척, trypsin EDTA (0.5 g/L)의 0.5 mL을 추가 및 다음 37 ° c.에 5 분에 대 한 셀을 품 어 CM 37 ° c 예 열을 추가 하 여 반응을 중지합니다 셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.</li>
		<li>6 104 셀/mL의 최종 희석 주는 0.1 %BSA 매체의 500 μ에 시드 3 104 SQ20B 셀. 참고: 셀 농도 각 셀 라인에 대 한 적응 한다.</li>
		<li>24 h에 대 한 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4 일
<ol start="4"><li>
셀 고정 및 얼룩
	<ol>
<li>셀 라인에 배 시간 전에 셀을 수정 합니다. 24 시간 전에 SQ20B 셀을 수정 합니다.</li>
		<li>각 삽입 동반자 접시에서 제거 하 고 조심 스럽게 면봉을 사용 하 여 상단 챔버에서 셀을 제거. 그것은 특히 위 약 실에 있는 모든 셀을 제거 하는 것이 중요입니다.</li>
		<li>수정 및 얼룩 얼룩 키트 제공을 사용 하 여 5 월 Grunwald Giemsa 채색9 를 개별적으로 삽입 합니다. 또는 30 분 고정을 위한 또 다른 동반자 접시에 4 %paraformaldehyde 사용.</li>
		<li>각 약 실 건조 실험실 후드 빈 24 잘 동반자 플레이트 삽입 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5 일째
<ol start="5"><li>
현미경 분석
	<ol>
<li>20 단계 대조 현미경에 삽입과 함께 동반자 플레이트를 삽입 하 고 막의 아래 부분에 마이그레이션된 각 셀을 계산. 상단, 하단에서 목표를 이동 하 여 오른쪽 초점 위치를 최적화 하 고 막의 하단 부분에 위치를 중지.</li>
		<li>마이그레이션된 세포의 숫자와 시드 셀 사이의 비율을 계산 합니다. 3 중에서 각 치료 상태에 대 한 각 계산을 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 스크래치 상처 분석 결과: 셀 마이그레이션
참고: 지침 셀의 각 유형에 적응 해야 합니다.
주 1
<ol><li>
시드 셀
	<ol>
<li>시드 2 x 106 SQ20B 175 cm2 플라스 크 하루 전에 72 h에에서 CM의 12 mL에서 세포 고 80% 셀 합류에 성장 하는 세포.</li>
		<li>층 류 흐름 후드 셀 trypsinize. 매체를 제거 살 균 PBS로 세포 세척, trypsin EDTA (0.5 g/L)의 2.5 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 5 분에 대 한 셀을 품 어 37 ° c.로 예 열 하는 CM의 12.5 mL을 추가 하 여 반응을 중지합니다 셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.</li>
		<li>각 잘에서 100 μ 당 4 104 셀의 최종 밀도 주는 4 x 105/mL의 셀 밀도에서 prediluted 샘플을 생성 합니다. 이 농도 각 셀 라인에 맞게 조정 해야 합니다 그리고 1 x 104 6 104 셀의 범위에서 해야 한다.</li>
		<li>2.1.2 단계에서 준비 하는 솔루션의 입금 100 μ에 의해 96 잘 접시의 각 음에 시드 셀.</li>
		<li>우물의 바닥에는 셀을 균등 하 게 분산을 5 분 동안 실 온에서 접시를 남겨 주세요.</li>
		<li>인큐베이터에 접시를 놓고 12 ~ 16 h (최대) 37 ° c.에 대 한 플레이트에 셀 수</li>
	</ol>
</li>
</ol>주 2
<ol start="2"><li>
스크래치 상처 분석 결과
	<ol>
<li>인큐베이터에서 2.1 단계에서 준비 된 접시를 제거 합니다.</li>
		<li>후드, 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 부상 장치를 사용 하 여 상처를 확인 합니다.</li>
		<li>즉시 각 잘 사용 하는 피 펫을 상처를 건드리지 않도록 돌보는 적응 원추형 팁에서 매체를 제거 합니다.</li>
		<li>포부를 반복 하 고 각 잘 37 ° C로 예 열 하는 CM의 100 μ를 사용 하 여 두 번 셀을 씻어.</li>
		<li>CM 세척 단계 후 적응 원추형 팁을 피 펫을 사용 하 여 제거 합니다.</li>
		<li>각 잘 각 치료 조건에 대 한 특정 매체의 100 μ 추가.</li>
		<li>우물에서 모든 거품을 만들지 않도록 하려고 합니다. 반대로 pipetting 기술은 여기 도움이 될 수 있습니다. 또는, 주사기 바늘으로 거품을 제거 합니다.</li>
		<li>비디오 현미경의 적응 랙에 접시를 놓습니다.</li>
		<li>이미지 품질을 개선 하기 위해 접시의 더 낮은 측에 응축을 피하기 위해 첫 번째 검사 전에 적어도 15 분 동안 따뜻한 접시 허용.</li>
		<li>프로그램 잘 당 하나의 이미지에 비디오 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 검사의 일정. 2 h 간격 침공 마이그레이션 실험 필요 하다. 실험의 목표는 비디오를 생성 하는, 최대 30 분의 간격이 좋습니다.</li>
		<li>실험의 끝에, 신중 하 게 부상 장치를 세척 하 고 각 제조 업체에 의해 표시 된 4 개의 세척 단계를 따르십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3, 4, 및 5 일
<ol start="3"><li>
비디오 현미경을 사용 하 여 마이그레이션 분석
	<ol>
<li>24 h 및 최대 5 일의 최소, 모니터링 하 고 셀 마이그레이션을 확인 합니다.</li>
		<li>각 셀 형식에 맞게 적절 한 셀 마스크를 사용 하 여 셀 마이그레이션 분석. 각 셀 라인에 맞게 셀 마스크를 얻기 위해 특정 셀 이미지 컬렉션을 사용 하 여 소프트웨어에서 정의 처리 하는 셀을 생성 합니다.</li>
		<li>곡선을 추적 하 고 데이터를 분석 하 고 결과 비교 하 여 사용할 수 있는 스프레드시트를 내보낼.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 스크래치 상처 분석 결과: 셀 침공
참고: 지침 셀의 각 유형에 적응 해야 합니다.
주 1
<ol><li>
시드 셀
	<ol>
<li>동일한 프로토콜을 사용 하 여 셀 시드의 단계 2.1에에서 설명 된 대로.</li>
	</ol>
</li>
</ol>주 2
<ol start="2"><li>
ECM을 준비
	<ol>
<li>4 ° c.에 사용 하기 전에 적어도 12 h에 대 한 행렬에 서 리 없애다 없음 집계 표시는 다는 것을 확인 하십시오. 집계 표시 되는 경우는 집계 사라질 때까지 오랜 기간 동안 4 ° C에서 매트릭스를 유지. 얼음에 매트릭스를 유지. Precooled 피 펫 팁을 사용 합니다. 참고: 매트릭스 응고 됩니다 하지 않을 경우 4 ° c.에 유지</li>
		<li>5 분 동안 얼음에 microcentrifuge 튜브를 진정.</li>
		<li>받아 CM 냉장고에서 4 ° C에 냉각 그리고 300 μ g/mL의 최종 농도를 precooled microcentrifuge 관에 행렬을 희석.</li>
		<li>Prediluted 매트릭스 microcentrifuge 튜브 4 ° c.에 냉장고에 반환 참고: 냉각 랙 microcentrifuge 튜브에 대 한 적응은 실험을 통해 4 ° C에서 튜브를 유지 도움이 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>주 2
<ol start="3"><li>
스크래치 상처 분석 결과 및 ECM의 치료
	<ol>
<li>인큐베이터에서 3.1 단계에서 준비 된 접시를 제거 합니다.</li>
		<li>후드, 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 부상 장치를 사용 하 여 상처를 확인 합니다.</li>
		<li>즉시 각 잘 사용 하는 피 펫을 상처를 건드리지 않도록 돌보는 적응 원추형 팁에서 매체를 제거 합니다.</li>
		<li>열망 절차를 반복 하 고 37 ° c.로 예 열 하는 CM의 100 μ를 사용 하 여 두 번 셀을 씻어</li>
		<li>두 번째 세척 후 5 분 동안 그것의 온도 equilibrate에 4 ° C 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
		<li>원추형 팁, 가장자리에서 신중 하 게 플라스틱을 상처를 만지지 마십시오 돌보는 포부 피펫으로 각 잘에서 차가운 매체를 제거 합니다.</li>
		<li>Prediluted 매트릭스의 50 μ를 4 ° c.에 precooled 원추형 팁을 사용 하 여 각 영역 추가</li>
		<li>30 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 참고: 37 ° C에서 prewarmed 지원 랙 96 잘 접시의 온난화 가속 도움이 됩니다.</li>
		<li>인큐베이터에서 접시를 제거 하 고 각 치료 조건에 대해 표시 된 대로 각 잘 적응된 CM의 100 μ 추가.</li>
		<li>우물에서 모든 거품을 만들지 않도록 하려고 합니다. 반대로 pipetting 기술은 여기 도움이 될 수 있습니다. 또는, 주사기 바늘으로 거품을 제거 합니다.</li>
		<li>비디오 현미경에 맞게 선반으로 접시를 놓습니다.</li>
		<li>이미지 품질을 개선 하기 위해 접시의 더 낮은 측에 응축을 피하기 위해 첫 번째 검사 전에 적어도 15 분 동안 따뜻한 접시 허용.</li>
		<li>프로그램 스캔, 비디오 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 스크래치 상처 스캔 모드에서 잘 당 하나의 이미지에서의 일정. 2 h 간격 침공 마이그레이션 실험에 대 한 필요합니다. 실험의 목표는 비디오를 생성 하는, 최대 30 분의 간격이 좋습니다.</li>
		<li>실험의 끝에, 신중 하 게 부상 장치를 세척 하 고 각 제조 업체에 의해 표시 된 4 개의 세척 단계를 따르십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3, 4, 및 5 일
<ol start="4"><li>
비디오 현미경을 사용 하 여 셀의 분석입니다.
	<ol>
<li>2.3 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-enhanced+cell+migration%2Finvasion+process%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review.</a> Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).</li>
<li>Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+E-cadherin+and+integrins+in+mesoderm+differentiation+and+migration+at+the+mammalian+primitive+streak%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak.</a> Development. 118 (3), Cambridge, England. 829-844 (1993).</li>
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<li>Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases%3A+biologic+activity+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications.</a> J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).</li>
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<li>Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15576902">Wound-healing assay.</a> Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 23-29 (2005).</li>
<li>Piaton, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+recommendations+and+best+practice+guidelines+for+May-Gr%C3%BCnwald-Giemsa+staining%3A+literature+review+and+insights+from+the+quality+assurance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Path%22%5BJournal%5D)">Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance.</a> Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance%3A+cancer+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+lett%22%5BJournal%5D)">Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell.</a> Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+ion+irradiation+withstands+cancer+stem+cells%E2%80%99+migration%2Finvasion+process+in+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+%28HNSCC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC).</a> Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).</li>
<li>Gilormini, M., Wozny, A. -S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+a+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Subpopulation+Having+Stem+Cell+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics.</a> J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

우리 보고 여기 두 다른 modalities 셀 침공 및 마이그레이션 과정을 공부 합니다. 이 프로세스의 분석은 암 줄기 세포10,11이라고 하는 암 세포의 부분 모집단의 증가 운동에 의해 설명 될 수 있는 전이성 재발에 관련 된 요소를 이해 해야 합니다.
Boyden 챔버 실험은 가장 자주 사용 되는 기술을 탐구 하 세포 내 습 및 마이그레이션. 이 기술은 높은 실험의 전문성에 의존 하지만이 방법의 장점 중 하나는 재현성 이다. 셀 계산 수동 이며 경험 사이 다를 수 있습니다. 많은 중요 한 단계 표준화 하 고 뒤에 각 셀 라인에 적절 한 chemoattractant 및 기아 매체의 사용을 보장 하는 등 주의 해야 합니다. 면봉으로 위 막에서 세포를 제거 하는 것이 또한 최적의 결과 보장 하 고 그림 2A에 표시 된 차선...

셀 침공 및 마이그레이션 저항 처리1 의 주요 원인, 암 세포의 보급에 참여 하 고 locoregional 또는 전이성 재발 암 치료2후 발생할 수 있습니다. 상피 엽 전환 (응급) 셀 침공-마이그레이션은 암에서 세포에서 전환 상피는 엽 형의 초기 과정입니다. E-Cadherin 상피 형3의 extracellular 마커 이며 N cadherin vimentin의 증가 식 엽 형4의 특징입니다. 또한 마이그레이션 매트릭스 metalloproteases5의 행동을 통해 기질 (ECM)을 침략 암 세포의 내장 용량에 의존 한다.
이 침공-마이그레이션 메커니즘, 머리와 목 암6특히 여러 위치에서 암에 대 한 설명 하고있다. 많은 연구원은 암 세포가이 지식 새로운 치료 전략으로 이어질 것입니다 희망에서 보급 하는 방법을 더 잘 이해 하려면 마이그레이션 및 내 습 프로세스에 집중 했다. 그것은 중요 이러한 연구 신뢰성 및 재현성 분석 실험을 사용 하 여 수행 됩니다.
체 외에서 세포 운동 성의 분석 전하실 수 있습니다. 몇 년 전 개발, Boyden 챔버 분석 결과 침공-마이그레이션 분석7에 대 한 표준으로 간주 됩니다. 그러나, 그것은 시간이 소요 이며 자주 정확 하지 않다. 두 번째 테스트는 상처 치유 분석 결과8, 세포 단층 배양에 스크래치를 하 고 세포 내 습 및 마이그레이션 고정된 시간 간격의 이미지를 캡처입니다. 이 기술은 두 개의 연속 된 테스트의 결과 사이 큰 변이 때문에 넓게 강평 되었다. 그러나, 현미경에서 특히 현대 기술의 응용 프로그램 스크래치 상처 분석 결과의 재현성을 개선 했다. 비디오 현미경 인큐베이터에서 쉽게 도입 될 수 있는 고 셀 이동의 실시간 이미지를 생성할 수 있습니다. 이 소자는 현미경 데이터를 기록 하 고 시간이 지남에 상처 셀 합류의 자동 분석을 제공. 이 문서의 목표는 Boyden 챔버 분석 결과 최적화 된 스크래치 상처 분석 결과 설명 하 고 장점과 각 방식의 약점을 논의 하기 위해.

<table><tbody><tr><td>태아 송아지 혈청 골드</td><td>GE 헬스케어</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손 수용성</td><td>시그마-알드리치</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 100 X</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 너트 믹스 (1X) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td>용액은 매우 불안정하기 때문에 사용 직전에 준비해야 합니다</td></tr>. <tr><td>Z1 쿨터 입자</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B 세포주</td><td>존 리틀의 선물 s</td> <td>Laboratory-Wound</td><td></td></tr> <tr><td>Maker</td><td>Essen Bioscience</td><td>4494</td><td>안전하고 건조한 장소에 보관</td></tr><tr><td>96웰 ImageLock Plate</td><td>Essen Bioscience</td><td>4379</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox 96F 시스템(CoolSink 포함) 96F</td><td>Essen Bioscience</td><td>1500-0078-A00</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox(M30 시스템 포함</td>) <td>Essen Bioscience</td><td>1500-0078-A00</td><td></td></tr><tr><td>Boyden Insert</td><td>Dominique Dutcher</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Boyden 코팅 인서트</td><td>Dominique Dutcher</td><td>354483</td><td>-20 &deg; C</td></tr><tr><td>Companion 24웰 플레이트</td><td>Dominique Dutcher</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel 표준</td><td>BD BioScience</td><td>BD 354234</td><td>-20°C에 보관&nbsp;</td></tr><tr><td>RAL 555 염색 키트</td><td>RAL 진단</td><td>&nbsp; 361550</td><td>안전하고 건조한 장소에 보관</td></tr><tr><td>Microcentrifuge 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>33511</td><td></td></tr></tbody></table>

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 boyden 챔버 분석 결과 상처

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

종양 세포의 침입과 마이그레이션 능력 암 진행 및 재발 주 기여자입니다. 많은 연구는 새로운 치료 전략을 개발 하는 것을 목적으로, 암 세포 전파 하는 방법을 이해 하려면 마이그레이션 및 내 습 능력 탐험 있다. 이러한 능력의 세포질과 분자 기초의 분석 세포 이동성의 특성화 및 골격 및 세포 microenvironment의 물리 화학적 특성을 주도하 고 있다. 몇 년 동안, Boyden 챔버 분석 결과 스크래치 상처 분석 결과 표준 기술을 공부 셀 침공 및 마이그레이션 되었습니다 합니다. 그러나,이 두 기술에는 제한이 있습니다. Boyden 챔버 분석 결과 어렵고 시간 소모, 그리고 스크래치 상처 분석 결과 낮은 재현성. 현미경 검사 법에 특히 현대 기술의 개발은 스크래치 상처 분석 결과의 재현성을 증가 했다. 강력한 분석 시스템을 사용 하 여, 세포 이동과 내 습의 자동 및 실시간 분석을 제공 하는 "인큐베이터" 비디오 현미경을 사용할 수 있습니다. 이 문서의 목표는 보고 하 고 셀 침공 및 마이그레이션 공부 하는 데 사용 하는 두 분석 비교: Boyden 챔버 분석 결과는 최적화 된 생체 외에서 비디오 현미경-기반 스크래치 상처 분석 결과.

우리 보고 여기 셀 침공 및 마이그레이션 분석을 두 가지 방법. 그림 1 는 Boyden 챔버 실험을 보여준다. 셀은 CM에 시드와 삽입 chemoattractant 매체와 동반자 접시에 배치 됩니다. 막 코팅 수 (마이그레이션 분석 결과) 또는 코팅 (침공 분석 결과). 셀은 s c M에 상단 챔버로 시드. 낮은 챔버는 chemoattractant으로 CM으로 가득 합니다. 셀 2 배 시간 전에 고정 됩니다.
그림 2 는 셀 고정 후 Boyden 멤브레인을 보여준다. 그림 2A 는 차선의 결과, 막의 상부에 셀 클러스터를 보여 줍니다. 그림 2B 셀 ...

이 연구 보고서의 세포 침입과 마이그레이션 분석에 대 한 두 가지 방법: Boyden 챔버 분석 결과 및 체 외에서 비디오 현미경-기반 상처 치유 분석 결과. 이 두 실험에 대 한 프로토콜 설명, 그리고 그들의 장점과 단점 비교 됩니다.

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

이 실험의 전반적인 목표는 세포 침입 및 이동을 연구하는 데 사용되는 두 가지 분석법, Boyden 챔버 분석 및 최적화된 체외 비디오 현미경 기반 스크래치 상처 분석을 보고하고 비교하는 것입니다. 이러한 실험은 가장 관련성이 높은 방법의 선택과 같은 침입 및 이주 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 최적화된 체외 비디오 현미경 기반 스크래치 상처 분석의 주요 장점은 치료 조건 간의 재현 가능하고 정확한 비교를 제공한다는 것입니다.이 방법은 세포 이동 및 침입을 평가할 수 있지만 치유 또는 조직 재생과 같은 다른 연구 분야에도 적용할 수 있습니다. 175제곱센티미터 플라스크에서 25ml의 배양 배지에 있는 1/6 세포에 10배를 두 번 파종하여 분석 1일차 72시간 전에 SQ20B 세포를 준비합니다. 세포가 섭씨 80도에서 37%의 세포 합류점까지 성장하도록 합니다.트립신화(trypsinization) 및 세포 계수 후 첫째 날, 평가할 각 조건에 대해 3ml의 배양 배지에 있는 1/5 세포의 6배의 세포 밀도로 25제곱센티미터 플라스크에 세포를 파종합니다. 세포를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 각 플라스크의 배지를 3밀리리터의 저소 태아 혈청 배지로 교체하여 세포를 굶주리게 합니다.섭씨 37도의 인큐베이터에서 24시간 동안 세포를 굶깁니다. 침입 분석실험을 위해, 세포 결핍을 시작한 후에 12 시간 후에 입히는 Boyden 약실을 준비하십시오. 각 Boyden 챔버를 컴패니언 플레이트에 놓습니다.코팅된 각 챔버에 500마이크로리터의 기아 세포 배지를 추가합니다. 다음 날인 3일째에는 컴패니언 플레이트를 사용하여 화학유인제를 준비합니다. 24웰 컴패니언 플레이트의 각 웰에 10% FBS, 하이드로코르티손, 페니실린 및 스트렙토마이신이 함유된 750마이크로리터의 완전한 배지를 채웁니다.상부 챔버를 미리 채워진 컴패니언 플레이트로 옮기고 거품이 생기지 않도록 주의하십시오. 침입 분석의 경우 각 Boyden 챔버에서 450마이크로리터의 배양 배지를 조심스럽게 제거합니다. 고갈된 SQ20B 세포의 트립신화 및 계수 후, 0.1%BSA 배지 500마이크로리터의 1/4 세포에 10배의 3배를 파딩하여 밀리리터당 1/4 세포에 6배의 최종 희석을 제공합니다.Boyden 챔버를 섭씨 37도 인큐베이터에 24시간 동안 놓습니다. 4일차에는 컴패니언 플레이트에서 각 삽입물을 제거하고 면봉을 사용하여 상부 챔버에서 세포를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 각 삽입물을 개별적으로 고정하고 염색하여 제조업체의 지침에 따라 염색 키트를 사용하여 May-Grunwald Giemsa 착색을 얻습니다.5일째에 현미경 분석을 수행합니다. 인서트가 있는 컴패니언 플레이트를 20X 위상차 현미경에 삽입하고 멤브레인 하부에서 마이그레이션된 각 세포를 계산합니다. 175제곱센티미터 플라스크에서 25밀리리터의 배양 배지에 1/6 SQ20B 세포를 10회 파종하고 세포가 80% 세포 합류점까지 성장할 수 있도록 합니다.트립신화 및 세포 계수 후 첫날에 SQ20B 세포의 사전 희석된 샘플을 10의 4배에서 밀리리터당 1/5 세포의 밀도로 생성합니다. 100마이크로리터의 셀 용액을 96웰 플레이트의 각 웰에 분배하여 각 웰의 100마이크로리터당 1/4 셀에 대해 10의 4배의 최종 밀도를 제공합니다. 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 놓고 세포가 12-16시간 동안 플레이트에 부착되도록 합니다.다음 날에는 상업용 부상 장치를 사용하여 부상을 입히기 위해 플레이트를 후드로 가져갑니다. 상처 메이커의 상단을 제거하고 세척 보트 용액에 넣습니다. 플레이트를 베이스 플레이트 홀더에 삽입하고 플레이트 커버를 제거합니다.핀 블록의 후면 다웰을 베이스 플레이트의 후면 구멍으로 안내하여 핀 블록을 교체합니다. 검은색 레버를 누른 상태에서 검은색 레버를 계속 누르고 있으면서 핀 블록을 들어 올립니다. 원뿔형 팁이 조정된 피펫을 사용하여 상처를 만지지 않도록 주의하면서 각 웰에서 매체를 즉시 제거합니다.섭씨 37도로 가열된 100마이크로리터의 세포 배지를 각 웰에 추가하여 세포를 세척합니다. 두 번째 세척 후, 세포 배지를 흡인하기 위해 조정된 원뿔형 팁이 있는 피펫을 사용합니다. 다음으로, 각 처리 조건에 특정한 매체 100마이크로리터를 각 웰에 추가하여 웰에 기포가 생성되지 않도록 합니다.96웰 플레이트를 비디오 현미경의 개조된 랙에 놓습니다. 비디오 현미경 소프트웨어를 사용하여 웰당 하나의 이미지로 스캔 일정을 프로그래밍합니다. 이주 침입 실험의 경우 최대 2시간 간격이 필요합니다.실험의 목적이 동영상 제작인 경우 최대 30분 간격이 선호됩니다. 세포 이동을 분석하기 위해 각 세포 유형에 맞게 조정된 적절한 세포 마스크를 사용하여 최소 24시간에서 최대 5일 동안 세포 이동을 모니터링하고 확인합니다. 각 세포주에 적합한 세포 마스크를 얻으려면 특정 세포 이미지 컬렉션을 사용하여 소프트웨어에서 세포 처리 정의를 생성합니다.곡선을 추적하고 결과를 분석하고 비교하는 데 사용할 수 있는 스프레드시트로 데이터를 내보냅니다. 세포 침입 분석을 준비하기 위해 세포 이동 분석에서 입증된 것과 동일한 방식으로 SQ20B 세포를 시드하고 인큐베이터에서 96웰 플레이트를 배양합니다. 분석 2일차에 세포외 기질을 준비합니다.사용하기 전에 최소 12시간 동안 매트릭스를 섭씨 4도에서 해동하고 응집체가 보이지 않는지 확인하십시오. 마이크로 원심분리기 튜브를 얼음에 5분 동안 식힙니다. 섭씨 4도로 사전 냉각된 원뿔형 팁으로 매트릭스를 섭씨 4도로 냉각된 셀 매체와 함께 예냉각된 마이크로 원심분리기 튜브에 희석하여 밀리리터당 300마이크로그램의 최종 농도를 얻습니다.미리 희석된 매트릭스가 있는 마이크로 원심분리기 튜브를 냉장고에 섭씨 4도로 보관하십시오. 인큐베이터에서 96웰 플레이트를 회수합니다. 후드 아래에서는 앞에서 설명한 것처럼 제조업체의 프로토콜에 따라 상업용 상처 장치를 사용하여 상처를 만듭니다.원뿔형 팁이 조정된 피펫을 사용하여 각 웰에서 매체를 즉시 제거하고 상처를 만지지 않도록 주의하십시오. 섭씨 37도로 예열된 100마이크로리터의 세포 배지를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 접시를 얼음 위에 5분 동안 올려 온도를 평형을 유지합니다.각 웰에서 차가운 매체를 제거하고 가장자리에서 조심스럽게 피펫팅하고 상처를 만지지 않도록 주의하십시오. 섭씨 4도에서 사전 냉각된 원뿔형 팁을 사용하여 각 웰에 50마이크로리터의 사전 희석된 매트릭스를 추가합니다. 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다.30분 후, 각 처리 조건에 대해 표시된 대로 100마이크로리터의 적응된 세포 배지를 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 비디오 현미경의 적응형 랙에 놓습니다. 그런 다음 스캔을 프로그래밍하고 세포 이동 분석에 대해 입증된 대로 비디오 현미경 분석을 수행합니다.세포 고정 후 Boyden 막의 대표적인 결과가 표시됩니다. 차선의 막은 막의 위쪽에 세포 클러스터가 있어 해석할 수 없는 결과를 보입니다. 대조적으로, 최적의 멤브레인은 멤브레인의 아래쪽 부분에 파란색으로 염색된 셀 수 있는 세포를 가지고 있습니다.스크래치 상처 분석의 최적 결과는 0시, 15시간 및 30시간에 상처가 치유되는 이미지로 설명됩니다. 품질 실험의 기준은 선형 상처, 상처에서 관찰된 세포 단편 없음, 최적의 세포 합류입니다. 90% confluence는 패널 A.Panel C는 낮은 세포 밀도의 예이고 Panel B는 세포 펠릿의 불충분한 세척으로 인한 세포 클러스터를 보여줍니다.비디오 현미경 소프트웨어를 사용하여 얻은 상처 치유의 그래픽 표현은 4가지 치료 조건의 시간에 따른 상처 세포 합류 매개변수의 정량화를 보여줍니다. 병용 처리는 세포 이동을 현저히 감소시키는 것으로 관찰되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포 이동 및 침입 과정을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

evaluation-cell-invasion-migration-process-comparison-video

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

일반적으로 사용되는 체외에서 세포의 이동 및 침윤을 조사하기위한 고도의 접근 방법이 설명되어 있습니다. 첫 번째 방법은 세포 운동성을 측정하는 세포 상처 폐쇄 분석이다. 두 번째 방법은 화성과 세포의 침략적인 능력을 평가하는 트랜스 웰 마이그레이션 및 침입 분석이다.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

조기 내피 세포(EEC) 이동에 대한 조사는 특정 질병의 병태생리학을 이해하고 잠재적으로 치료 개입을 위한 새로운 전략을 식별하는 데 중요합니다. 다음 프로토콜은 EEC 조사에 맞게 조정된 세포 이동을 평가하는 기술을 설명합니다.

유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가

이 프로토콜은 또한 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 결정하기 위해 사용될 수있다 화학 유인 물질에 응답하여 세포 이동을 측정하는 방법을 자세히 맞춤형.

측정 셀 마이그레이션에 대한 사용자 정의 상공 회의소

이 프로토콜 셀 셀 microenvironment를 유지 하면서 3 차원 설정의 마이그레이션 및 침입 기능을 계량 하는 데 사용할 수 있는 반전된 세로 침공 분석 결과를 설명 합니다. 이 분석 결과 희소 한 또는 민감한 세포에 적합 합니다.

위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

이 원고 방법 절 개 같은 병 변 배양된 상피 세포 monolayers에 편리 하 게 모델 치료 생체 외에서이미징 confocal 의해 상처 또는 레이저 스캔 현미경, 고는 높은 품질을 제공할 수 있습니다. 공부 셀 동작 및 마이그레이션에 관련 된 메커니즘에 대 한 양적 및 질적 데이터입니다.

현미경 기반 방법을 생체 외에서 상처 치유 중 상피 세포 이동의 평가 대 한

여기는 자동된 광학 카메라 현미경으로는 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 테스트 하는 절차에 설명 합니다. 스크래치 분석 결과 널리 사용 되었습니다 어디 스크래치의 폐쇄는 세트 기간에 대 한 다음. 광학 현미경 세포 이동의 신뢰할만 하 고 저렴 한 감지 수 있습니다.

체 외에서 세포 마이그레이션 자동화 된 광학 카메라의 테스트에 대 한 스크래치 분석 결과 최적화

여기, 양적 측정 마이그레이션 및 시간이 지남에 조건 하에서 여러 치료 세포종 뇌 종양 줄기 세포의 내 습을 라이브 세포 이미징 기술을 설명 합니다.

라이브 셀 이미징 분석 실험 연구 세포종 뇌 종양 줄기 세포 이동과 내 습을

현재 프로토콜 암 세포 마이그레이션 및 실시간으로 단일 플랫폼에서 침입을 조사 하 고, 세포 이동성 및 형태학 연구를 쉽게 재현할 수 및 시간 효율적인 옵션을 제공 하는 통합된 방법을 설명 합니다.

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

여기서, 우리는 1차 섬유아세포를 이용한 시험관내 스크래치 분석및 마우스에서 의 피부 상처 치유 분석실험을 위한 프로토콜을 제시한다. 두 방법 모두 시험관 내 및 생체 내 상처 치유를 평가하는 간단한 방법입니다.

스크래치 마이그레이션 분석 및 등갈 피부 접기 챔버 에서 생체 외 및 상처 치유의 생체 내 분석

당사는 장비 집약적 방법을 사용하지 않고 세포 마이그레이션을 결정하는 새로운 접근 방식을 제공하는 스크래치 마이그레이션 분석법에 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 섬유아세포가 이 프로토콜에 사용되었지만, 세포 이동에 대한 추가 세포 유형과 영향을 연구하기 위해 적응하고 활용할 수 있습니다.

비용 효과적이고 적응 가능한 스크래치 마이그레이션 분석

이 연구는 2차원(2D) 스크래치 상처 이동 분석 및 3차원(3D) 스페로이드 발아 분석과 함께 RNA 추출 및 면역세포화학을 포함한 각각의 다운스트림 분석 방법과 함께 in vitro 혈관 신생을 연구하는 데 적합한 분석법으로 제시합니다.

Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

학습하세요 세포 침습 및 마이그레이션 평가를 위한 Boyden 챔버 분석과 비디오 현미경 기반 스크래치 상처 분석법을 비교하는 방법을. SQ20B 세포를 사용하여 재현성 높은 결과를 얻을 수 있습니다.

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

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