측정 셀 마이그레이션에 대한 사용자 정의 상공 회의소

이 절차의 전반적인 목표는 세포 이동에 대한 화학주성 및 화학충동제의 효과를 연구하는 간단한 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 상처 치유에 대한 다양한 성장 인자의 영향과 같은 세포 상호 작용 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 응용 프로그램에 대해 쉽게 사용자 정의할 수 있고 모든 기술 수준의 연구원이 쉽게 사용할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 학부생인 Aniqa Chowdhury와 제 연구실의 대학원생인 Tyler Harvey입니다. 시작하려면 원하는 마이크로 채널 모양으로 CAD 파일을 만듭니다. 채널의 너비와 길이를 조정하여 필요한 그라디언트를 얻습니다.

여기서 2.254cm 정사각형은 0.127cm 너비의 채널로 연결됩니다. 다음으로, 마이크로 채널의 적절한 깊이를 생성하기 위해 원하는 두께의 아크릴 조각을 얻습니다. 약 1/16인치의 아크릴 시트 너비는 두꺼운 시트는 절단하기 어렵고 매우 얇은 시트는 공정 중에 파손되거나 뒤틀릴 수 있으므로 이상적입니다.

CAD 파일을 레이저 절단 장치로 가져오고 아크릴 조각을 절단 표면에 놓습니다. 그런 다음 제조업체의 프로토콜에 따라 챔버를 잘라냅니다. 갓 자른 바벨 모양의 아크릴 컷아웃을 작은 페트리 접시에 넣고 필요할 때까지 덮습니다.

계량 보트에 엘라스토머 베이스 10부와 경화제 1부를 넣고 마이크로 피펫을 사용하여 5분 동안 저어줍니다. 혼합물을 진공 챔버로 옮기고 30분 동안 진공 청소기를 당겨 PDMS에 갇힌 기포를 제거합니다. 완료되면 진공 청소기를 끄고 계량 보트를 제거합니다.

가스가 제거된 PDMS를 작은 페트리 접시에 담긴 바벨 모양의 아크릴 컷아웃 위에 붓습니다. PDMS가 인서트를 완전히 덮는지 확인하십시오. PDMS가 실온에서 최소 18시간 동안 경화되도록 한 다음 메스로 아크릴 조각 주위의 PDMS를 조심스럽게 자르고 삽입물을 제거합니다.

표준 세포 배양 캐비닛에서 마이크로 채널 챔버를 페트리 접시에 넣고 면이 위로 향하게 한 다음 70% 에탄올로 완전히 덮습니다. 그런 다음 후드를 닫고 자외선을 켭니다. 챔버를 1-2시간 동안 자외선에 노출시킵니다.

노출 후 층류 후드를 열고 흐름 후드가 흐름을 다시 설정할 때까지 15분 동안 기다립니다. 다음으로, 70% 에탄올을 제거하고 멸균 PBS로 챔버를 두 번 세척합니다. 세탁할 때마다 1밀리리터 PBS를 사용하십시오.

최종 세척 후 PBS를 제거하고 뚜껑을 연 상태에서 챔버를 밤새 건조시킵니다. 테스트할 세포 유형을 채취하고 100마이크로리터의 세포 현탁액을 0.4%트리판 블루 400마이크로리터에 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 이 용액 100마이크로리터를 유리 커버 슬립 아래의 두 챔버를 부드럽게 채워 혈구계에 적용합니다.

10x 대물렌즈가 있는 현미경을 사용하여 혈구계의 그리드에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 핸드 집계 카운터를 사용하여 혈구계의 16개 사각형으로 구성된 4개 세트 모두에서 살아 있고 지속되지 않은 세포를 계산합니다. 총 세포 수를 4로 나누고 이 숫자에 50, 000을 곱하면 세포 현탁액 밀리리터당 세포 수를 얻을 수 있습니다.

이 계산을 기반으로 2,500개의 셀과 100마이크로리터의 배지를 각 챔버의 하나의 웰에 추가합니다. 세포를 챔버에 60분 동안 그대로 두었다가 배지를 추가합니다. 시작하려면 물에 아가로스를 넣고 용액을 전자레인지에서 1분 동안 또는 아가로스가 완전히 용해되고 용액이 투명해질 때까지 가열합니다.

페트리 접시에 붓기 전에 용액을 15-30초 동안 식히십시오. 거품을 제거하려면 페트리 접시를 진공 챔버에 넣고 아가로스가 진공 상태에서 30분 동안 응고되도록 합니다. 굳어지면 페트리 접시에서 메스로 2mm x 2mm x 2mm 입방체의 아가로스를 자릅니다.

원하는 농도의 화학 전술 인자를 포함하는 용액에 큐브를 완전히 담그고 아가로스 블록을 실온에서 밤새 담가둡니다. 다음으로, chemo tactic factor를 포함하는 agarose 블록을 microchannel chamber의 맨 끝에 배치합니다. 폴리스티렌 마이크로비드 또는 챔버의 미세한 결함과 같은 마커를 활용합니다.

셀의 상대적인 시작 위치를 식별합니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 12시간 동안 매시간 움직이는 세포 전면의 타임랩스 이미지를 촬영합니다. 여기에 표시된 일련의 이미지는 채널의 반대쪽 끝에 배치된 소 태아 혈청의 구배에 반응하여 채널을 가로지르는 세포 전면의 움직임을 문서화합니다.

이동 거리는 장치의 미세한 결함으로부터 성장 전선의 거리를 기준으로 측정되었습니다. 이러한 측정에서 평균 셀 전면 속도는 시간당 13.4마이크로미터인 것으로 나타났습니다. 이 기술을 마스터하면 4시간 안에 완료할 수 있으며, PDMS가 치료될 때까지 18시간의 대기 시간이 추가되고 타임 랩스 이미징에 12시간이 추가로 소요됩니다.

개발 후 이 기술은 실험실 경험이 거의 없는 학부생을 포함하여 다양한 기술 수준의 연구자들이 상처 치유 및 체외 세포 이동을 쉽게 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 마이크로 채널 챔버의 성공적인 생산을 보장하기 위해 PDMS 금형에서 아크릴 인서트를 조심스럽게 제거하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 다양한 화학적 신호에 대한 반응으로 세포 이동을 연구하기 위한 간단한 마이크로채널 챔버를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차에 따라 다중 용해성 화학적 구배, 기질, 유체 깎아지 및 전기장과 같은 다른 단서를 연구하여 세포 이동에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. 레이저 절단기로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 교육을 받고 개인 보호 장비를 사용하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.