Name: 측정 셀 마이그레이션에 대한 사용자 정의 상공 회의소 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 학습하세요 화학유도제 및 화학반발제가 세포 이동에 미치는 영향을 연구하는 간단한 방법을. 이 사용자 정의 가능한 마이크로채널 기법은 상처 치유 및 세포 상호작용 연구에 활용됩니다.

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저자는이 프로젝트에 자금을 제공하는 클렘 슨 대학의 크리 에이 티브 귀하의 프로그램과 NSF CBET1254609을 인정합니다.

1. 농도 구배를 만드는 마이크로 챔버를 생산 <ol><li> 아크릴 몰드 피스를 절단 <ol><li> 원하는 폭의 아크릴의 조각을 얻습니다. 일반적으로 16분의 1 인치 두께의 아크릴 시트를 사용합니다. 두꺼운 시트는 그들을 과정에서 깨지거나 왜곡하는 원인이 필요한 기계적 강도를하지 않아도 잘 매우 얇은 시트를 절단하기가 어렵다. </li><li> 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 내에 공동을 생성하기 위해 아크릴 조각의 소망하는 형상의 CAD 파일을 만든다. 개별 실험 프로토콜에 관련된 원하는 경사를 달성하기 위해 채널 폭과 길이를 조정한다. <ol><li> 두 개의 사각형 (0.254 cm X 0.254 cm)를 0.127 cm 폭 채널에 의해 (0.254 cm 길이)에 연결한다 (그림 1) : 여기에, 다음과 같은 크기의 아크릴 조각을 사용합니다. </li></ol></li><li> 마뉘에 따라 레이저 커터에 아크릴 조각을 레이저 절단 장치로 CAD 파일 가져 오기 및 배치의 facturer의 프로토콜입니다. 참고 : 또는, CAD 디자인에서 조각을 3D는-인쇄 할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 다른 재료를 주형에 사용될 수 있다는 것이다; 그러나, 해상도 및 재현성은 레이저 가공에 비해 3D 인쇄로 감소 될 수있다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55264/55264fig1.jpg" /> 그림 1 : 마이크로 채널 상공 회의소의 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 대표. 이 이미지는 마이크로 챔버를 작성하는 데 필요한 아크릴 인서트의 CAD 도면을 도시한다. 1 A) CAD 도면, 1B) 인치 치수 도면 CAD의 측면보기, 1C) 인치 치수 도면 CAD의 상위 뷰의 상위 뷰 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55264/55264fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="2"><l난&gt;은 폴리 디메틸 실록산 쏟아져 (PDMS) <ol><li> 무게 보트에서, 상업 엘라스토머 경화제 (예를 들어, 실 가드 194)의 1 중량 부와 상업 엘라스토머 자료의 무게 (예를 들어, 실 가드 184)에 의해 10 부 섞는다. 전형적으로, 엘라스토머 경화제 1g에 엘라스토머 기지 10g을 혼합한다. </li><li> 5 분 동안 마이크로 피펫으로 기재와 경화제를 결합 교반한다. </li><li> 진공 벨을 설정하고 갇혀있는 공기 방울을 제거하는 30 분 동안 진공에 PDMS와 무게 보트를 배치합니다. </li><li> 진공을 끄고 무게 보트를 제거합니다. 작은 페트리 접시에 아크릴 컷 아웃의 상단에있는 PDMS를 따르십시오. PDMS의 완전히 삽입을 다루고 있는지 확인합니다. </li><li> PDMS의 실내 온도 (최소 18 시간) 밤새 치료 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> PDMS에서 삽입물을 제거 <ol><li> PDMS의 경화 후, 조심스럽게 메스와 아크릴 조각 주위에 PDMS를 절단하여 삽입물을 제거합니다. </li></ol&gt; </li></ol> 2. 마이크로 챔버 내의 도금 세포 <ol><li> 세포를 도금 챔버를 살균. 주 : PDMS가 에틸렌 옥사이드 또는 다른 기술을 사용하여 소독 될 수 있지만, 짧은 UV 처리는 세포 배양 연구에 대한 빠르고 저렴하고 충분하다. 짧은 UV 처리 기간은 PDMS 부재의 구조 또는 기계적 완전성을 손상하지 않았다. <ol><li> 표준 세포 배양 캐비닛 완전히 70 % 에탄올로 챔버 커버. </li><li> 뚜껑 오프와 층류 후드에 페트리 접시를 넣어. </li><li> 후드를 종료하고 자외선을 켭니다. 1 ~ 2 시간 동안 자외선에 노출. </li><li> 층류 후드를 열고 흐름을 다시 15 분을 기다립니다. </li><li> 70 % 에탄올을 제거합니다. </li><li> 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 두 번 챔버를 씻으십시오. 각각의 세척을 위해 PBS 1 ㎖를 사용합니다. PBS를 제거하고 챔버 뚜껑 떨어져 밤새 건조 할 수 있습니다. 참고 : 또는 대신가능한 경우 층류 후드를 사용하는 살균하는 UV 챔버 박스를 사용한다. 알루미늄 호일 늘어선 골판지 상자의 배면에 UV 광원을 배치하여 UV 상자를 만든다. 알루미늄 포일은 샘플 심지어 조명을 허용하도록 광을 반사한다. </li></ol></li><li> 상공 회의소에 세포를 도금 <ol><li> 트리 판 블루와 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. <ol><li> 0.4 % 트리 판 블루의 400 μL의 세포 현탁액 100 μL를 추가하고 부드럽게 섞는다. 부드럽게 유리 커버 슬립 아래에 모두 실을 작성하여 혈구이 용액 100 μL를 적용합니다. </li><li> 혈구의 그리드에 초점을 10 배 목표로 현미경을 사용합니다. 혈구 16 사각형의 한 세트에서 라이브 흠없는 세포를 계산하는 손 집계 카운터를 사용합니다. </li><li> 16 사각형의 4 세트에서 세포를 계산합니다. 16 사각형의 4 세트에서 평균 세포 수를 가지고 5 × 4 곱합니다. 마지막 숫자는 한 접점 인세포 현탁액을 세포 / ㎖ (R). </li></ol></li><li> 각 챔버에 잘 하나에 2,500 셀을 추가합니다. 이것은 ~ 30,000 / cm (2)의 거의 융합 세포 밀도로 변환한다. </li><li> 세포가 미디어를 추가하기 전에 60 분 동안 챔버에 앉아 허용 (둘 베코의 수정 이글의 중간, 10 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신). </li></ol></li></ol> 3. 덱스 트란 젖 아가로 오스 블록 <ol><li> 아가로 오스 블록 만들기 <ol><li> 3 차원 인쇄 금형 (2mm X 2mm X 2mm)로 아가로 오스 3 %를 붓는다. </li><li> 30 분 모든 거품을 제거하기 위해 아가로 오스는 진공 챔버 내에서 응고 할 수 있습니다. </li><li> 금형에서 아가로 오스 블록을 제거합니다. 주 : 또는 2mm의 두께의 작은 페트리 접시에 3 % 아가로 오스를 붓는다. 메스 또는 다른 절삭 공구를 사용하여 2mm X 2mm X 2mm 블록을 잘라. 이것은 금형 시스템과 같은 정밀한 아니지만 할 좀 더 쉽게 할 수있다. </li></ol></li><li> 완전히 submerg주 화성 인자의 원하는 농도의 용액 E 아가 블록. 농도 구배의 형성을 평가하기 위해, 형광 덱스 트란과 함께 첫번째 챔버를 세척. 덱스 트란의 농도 및 분자량 수용성 인자 또는 관심의 약물의 일치해야합니다. </li><li> 아가로 오스 블록 하룻밤을 만끽 해보세요. </li></ol> 가용성의 인자 농도 구배를 평가하는 덱스 트란 확산의 4 시간 경과 <ol><li> 마이크로 챔버의 작은 사각형 웰 덱스 트란 젖은 아가로 오스 블록을 배치합니다. </li><li> 세포 이미징 시스템의 마이크로 챔버를 놓거나 저속 기능과 다른 형광 현미경을 사용한다. 제조업체의 지침에 따라 시간 경과를 시작합니다. 참고 : 표시된 결과는 GFP 필터, 50 %의 빛, 4/10의 pH 및 4 배 배율로 촬영하고 있습니다. </li></ol> 세포 성장의 5 시간 경과 <ol><li> 의 일단 마이크로 챔버 플레이트 세포방. 여기 3T3 섬유 아세포를 사용합니다. 마이크로 챔버에 잘 하나에 2,500 셀을 추가합니다. 2.2.1에 설명 된대로 세포를 계산합니다. <ol><li> 세포가 미디어를 추가하기 전에 60 분 동안 챔버에 앉아 허용 (둘 베코의 수정 이글의 중간, 10 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신). 5 % CO 2에서 37 ℃에서 도금 셀과 마이크로 챔버를 유지한다. 채널을 통해 세포 이동은 현미경으로 볼 수 있습니다. </li><li> 마커를 추가하거나 거리를 셀 전방 이동을 정량화하기위한 출발점 역할을하기 위해 마커로 챔버 내에서 미세한 결함을 사용합니다. </li></ol></li><li> 아가로 오스 겔 (8mm 3 블록)를 포함하는 배치하여 구배를 마련 농축 성장 인자, 화학 - 유인 제는 약물 또는 다른 인자 테스트되는 마이크로 채널의 한쪽 끝 (여기에서는, 40 % FBS가 예로서 사용되는) 방. </li><li> 이동 셀 앞의 시간 경과 이미지를 가져 가라. 여기서, 결과는 이리저리 셀의 이미지 표시NT 즉, 촬상 시스템을 이용하여 12 시간마다 촬영 하였다. </li><li> 세포 성장을 정량화 셀 앞에 사진을 사용한다. 첫번째 셀 전면 채널 벽 및 기준 마커에 의해 정의되는 다각형 마스크를 만드는 (roipoly)에 MATLAB polyfit의 기능을 이용하여 성장 속도를 계산한다. 이 마스크의 크기는 평균 셀 전면의 속도를 산출하는 전방의 이동 거리를 얻었다. 다른 연구는 유사한 방법 8을 이용했다. 참고 : 동일한 거리 가용성 인자의 농도로 각 프레임에 대한 세포 성장 전면의 가장자리를 비교한다. 가용성 인자의 농도 구배가 1 차원 확산 모델 근사치를 이용하여 계산된다. </li><li> Phalloidin의 및 DAPI 염색을 이용하여 세포의 형광 이미지를 가져 가라. <ol><li> Phalloidin의 염색하기 전에 세포를 수정. <ol><li> 37 ° C에서 따뜻한 4 % 파라 포름 알데히드. </li><li> 세포를 커버하기에 충분한 4 % 파라 포름 알데히드를 추가합니다. 세포 보관10 분 동안 파라 포름 알데히드. </li><li> 15 분마다 두 번 PBS로 씻어. 세포를 충당하기 위해 충분한 PBS를 사용합니다. </li></ol></li><li> 세포에서 PBS를 제거하고 세포를 커버하기에 충분한 permeabilizing 솔루션 (PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100)를 추가합니다. 10 분 동안 솔루션을 둡니다. </li><li> 각 5 분 동안 PBS로 두 번 세척 하였다. 세포를 충당하기 위해 충분한 PBS를 사용합니다. </li><li> 세포에서 PBS를 제거하고 20 분 동안 솔루션 (PBS에 1 % 소 혈청 알부민)를 차단 추가합니다. </li><li> 차단 솔루션을 제거하고 5 분마다 PBS로 2 회 세척한다. 세포를 충당하기 위해 충분한 PBS를 사용합니다. </li><li> 사용하지 않을 때이 점에서, 알루미늄 호일로 광으로부터 세포를 보호한다. 세포에서 PBS를 제거하고 1 시간 동안 PBS에 희석 Phalloidin의 488 1:50 추가합니다. </li><li> 각 세척에 대한 5 분 PBS에 2 회 반복한다. 세포를 충당하기 위해 충분한 PBS를 사용합니다. 그런 다음 셀에서 PBS를 제거합니다. </li><li> 15 분 동안 세포를 PBS로 1,000 : DAPI (4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌)를 추가 한 희석. </li><li> 제거 DAPI와각 세척에 대한 5 분 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 마지막 세척을 제거하고 세포를 충당하기 위해 충분한 PBS를 추가합니다. 세포는 이제 형광 현미경으로 이미지화 될 수있다. </li></ol></li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

우리 마이크로 챔버는 성장 인자 및 화학 유인 물질에 반응하여 세포의 이동 속도를 결정하고, 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 측정을 포함 목적의 다수를 위해 사용될 수있다. 이 세포를 성장 챔버의 일단에 화학 유인 물질을 배치하기 위해 마이크로 챔버를 이용할 수있다. 세포는 화학 주성 인자에 반응하여 증가하고, 세포 이동은 세포의 이동 속도를 결정하기 위해 분석 될 수있다 경과 화상 촬영에 의해 정량화 될 수있다. 이 방법의 대표적인 결과 성장 속도가 MATLAB polyfit의 함수를 사용하여 13.4 μm의 / H를 측정되었다도 3에 도시되어있다. 우리 마이크로 챔버의 또 다른 사용은 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 측정하는 것이다. 관심 약물 유사한 분자량의 덱스 트란 형광 태그는 DRU의 확산을 모델링하는데 사용될 수있다관심 g. 이는 샘플 기울기를 중단한다 대류 다량주의 깊게 취급해야하는 것이 중요하다. 이 방법의 대표...

상처 치유, 면역 반응 및 배아 발달과 같은 중요한 과정이 일어나기 위해서는 세포 이동이 일어나야 합니다. 세포 이동에는 세포와 인접 세포 간의 상호 작용, 세포 외 기질 및 용해성 화학 신호(유인제 또는 기피제)가 포함됩니다. 예를 들어, 상처 치유 과정에서 섬유아세포는 섬유형성과 상처 수축에 필수적인 역할을 하며, 세포는 세포외 기질3을 형성하기 위해 콜라겐을 합성하기 위해 손상 부위로 모집됩니다. 섬유아세포가 상처 부위로 이동하는 수많은 메커니즘이 연구되었으며, 여기에는 다양한 기계적, 물리적, 전기적, 화학주성 요인이 포함됩니다4. 섬유아세포는 성장 인자의 다양한 농도 구배에 특히 잘 반응합니다. 이러한 다양한 성장 인자는 함께 작용하여 조직 재생을 최적화합니다5. 성장 인자 농도에 대한 섬유아세포의 화학주성 반응을 관찰하는 동안, 섬유아세포의 방향성 이동 패턴과 섬유아세포가 목적지에 도달하기 위해 물리적 장애물을 우회하는 방법을 연구할 수 있습니다. 따라서 이 연구의 목표는 먼저 물리적 장벽의 안내에 따라 섬유아세포의 성장을 추적할 수 있는 시스템을 개발하고, 두 번째로 섬유아세포가 시스템을 탐색할 때 섬유아세포의 성장을 모델링하는 것이었습니다.
현재 Boyden 챔버 분석은 세포의 이동을 측정하는 데 가장 널리 사용되는 시스템입니다6. Boyden 챔버는 2개의 챔버 다중 웰 플레이트로 구성되며, 각 웰에는 화학유인제가 있거나 없는 매체가 포함될 수 있습니다7. 필터 멤브레인은 각 웰의 두 챔버 사이에 다공성 인터페이스를 제공합니다. 이것은 세포가 적극적인 이동에 의하지 않는 한 통과할 수 없도록 장벽을 만듭니다. 일반적으로 Boyden 챔버의 경우 화학 유인제가 하부 챔버에 추가되고 시스템이 평형을 이루어 상부 웰과 하부 웰 사이에 구배를 형성할 수 있습니다4. Boyden 챔버 분석의 한 가지 문제점은 가파른 구배가 멤브레인 표면과 수직인 단일 축을 따라 형성된다는 것입니다. 이로 인해 상부 웰과 하부 웰 사이의 화학유인 물질 농도 차이가 원래 예상했던 것보다 낮아집니다. 이러한 제약으로 인해 Boyden 챔버 분석은 특정 세포 반응을 기울기 및 농도 차이와 같은 특정 구배 특성과 연관시키기 어렵게 만듭니다. 이러한 측정 없이는 다중 기울기 신호 적분을 연구하기 어렵습니다.
전통적인 Boyden 챔버 분석의 제약 조건 중 일부를 해결하기 위해 미세유체 분석은 사용자 정의 가능한 농도 구배를 형성하도록 개발되었습니다1. 미세유체 시스템을 만들기 위한 표준 방법은 리소그래피 기술을 위한 클린룸을 필요로 합니다. 이러한 기술은 특히 표준 교실 환경에서 배우기 어려울 수 있습니다. 따라서 우리는 클린룸을 사용하지 않고 만들 수 있는 세포 이동을 측정하기 위한 챔버 시스템을 설계했습니다. 당사 시스템을 사용하여 분석의 웰을 원하는 크기로 조정할 수 있으며 맞춤형 기울기의 선형 농도 구배를 생성할 수 있습니다. 이를 통해 무작위 이동에서 화학주성을 정확하게 측정할 수 있습니다. 이 설계는 다양한 화학적 자극에 대한 반응으로 세포 성장을 모델링할 수 있는 저렴하고 사용하기 쉬운 시스템입니다.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td>폴리(dimethylsiloxane) 실리콘 엘라스토머 베이스와 실리콘 엘라스토머 경화제 포함</td></tr><tr><td>아크릴 시트</td><td>US 플라스틱</td><td>44200</td><td></td></tr><tr><td>일회용 페트리 접시&nbsp;</td><td>팔콘&nbsp;</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>플루오레세인 이소티오시아네이트; 덱스트란</td><td>시그마-알드리치</td><td>FD20s-100MG</td><td></td></tr><tr><td>아가로스, 유형 I, 낮은 EEO</td><td>시그마-알드리치</td><td>A6013-100G</td><td></td></tr><tr><td>둘베코의 변형 독수리 매체 피</td><td>셔 사이언</td>티픽 <td>11965092</td><td>세포 배지 구성 요소</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>피셔 사이언티픽 16000036</td><td></td><td>세포 배지 구성</td></tr> 요소 <tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>15140148</td><td>세포 매체 구성 요소</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24384</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL 세포 이미징 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AME3300</td><td>시간 경과 이미지 촬영에 사용되는 기기</td></tr><tr><td>Versa Laser</td><td>Universal Laser Systems, Inc.&nbsp;</td><td>모델 번호 VLS2.30</td><td>플라스틱 절단에 사용되는 레이저 절단기</td></tr></tbody></table>

측정 셀 마이그레이션에 대한 사용자 정의 상공 회의소

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

세포 이동은 면역 반응, 성장 및 상처 치유의 중요한 부분이다. 세포 이동은 세포, 세포 외 매트릭스와 수용성 및 비 수용성 화학 인자 (예, 화학 유인 물질) 사이의 상호 작용을 포함하는 복잡한 과정이다. 예 보이든 챔버 분석, 칸막이의 양측에 세포를 카운트함으로써 작업 등의 세포의 이동을 측정하기위한 표준 방법. 이 기술은 사용하기 쉽고; 그러나, 서로 다른 애플리케이션 작은 기하학적 변형을 제공한다. 대조적으로, 마이크로 유체 장치는 가용성 요소들 (1, 2)의 맞춤형 농도 기울기를 가진 세포의 이동을 관찰 할 수있다. 그러나, 미세 유체 기반의 분석을 만들기위한 방법을 배우기 어려울 수 있습니다. 여기서는 화학적 농도 기울기에 응답하여 세포 이동을 측정하기 위해 세포 배양 챔버를 생성하는 편리한 방법을 설명한다. 우리의 세포 마일연계 가능성 챔버 방법은 다양한 애플리케이션에 대해 세포 이동을 연구하기 위해 다양한 선형 농도 구배를 생성 할 수있다. 이 방법을 사용하는 것이 상대적으로 용이하고 일반적으로 학부 학생들에 의해 수행된다. 마이크로 챔버는 잘 페트리 접시에 최종 마이크로 챔버의 모양 아크릴 삽입을 배치하여 만들어졌습니다. 그 후, 폴리 (디메틸 실록산) (PDMS)의 삽입 위에 부었다. PDMS의가 경화시킨 후 삽입물을 제거 하였다. 이것은 어떤 원하는 모양이나 크기 우물의 생성을 허용했다. 이어서, 세포 마이크로 챔버에 첨가 될 수 있고, 가용 화제는 요구 에이전트에 아가 블록 담가 웰 중 하나에 첨가 될 수있다. 아가 블록 웰 중 하나에 첨가하고, 저속 이미지는 세포 이동을 정량화하기 위해 마이크로 챔버로 촬영 될 수있다. 이 방법의 변형이 방법 HIG을, 특정 응용 프로그램에 대해 할 수있다hly 사용자 정의 할 수 있습니다.

도 2는 세포가 도금되는 위치에서 상기 채널의 대향 단부에 배치 된 소 태아 혈청의 구배에 응답하여 상기 채널을 통해 상기 셀 전면의 이동을 나타낸다. 셀 앞에 48 시간 (그림 2A), 72 시간 (그림 2B), 96 시간 (그림 2C), 120 시간 (그림 2D) 후 도금에 표시됩니다. 셀 전면의 이동이 경과 이미지를 추적하고, 이동 거리 및 성장 속도는 MATLAB polyfit의 함수로 계산 하였다. 이것으로부터, 평균 셀 전면 속도는 13.4 μm의 / H (도 3) 인 것으로 밝혀졌다. 도 4는 채널의 일단에 흠뻑 덱스 트란, 아가 로스 블록을 배치하고, 덱스 트란 12 시간 동안 채널을 통해 확산 할 수 있도록함으로써 설정된 형광 기울기를 나타낸다...

이 프로토콜은 또한 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 결정하기 위해 사용될 수있다 화학 유인 물질에 응답하여 세포 이동을 측정하는 방법을 자세히 맞춤형.

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

본 절차의 전반적인 목적은 화학유인 및 화학척력 물질이 세포 이동에 미치는 영향을 연구할 수 있는 간편한 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 서로 다른 성장 인자가 상처 치유에 미치는 영향과 같은 세포 상호작용 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 응용 분야에 맞게 쉽게 맞춤 설정할 수 있으며, 모든 숙련도의 연구자가 간단하게 사용할 수 있다는 점입니다.시연은 저의 연구실 소속 학부생인 Aniqa Chowdhury와 대학원생인 Tyler Harvey가 진행하겠습니다. 먼저, 마이크로 채널의 원하는 모양으로 CAD 파일을 생성하십시오. 필요한 구배를 형성할 수 있도록 채널의 너비와 길이를 조정하십시오.여기서는 2.254 cm 정사각형들이 폭 0.127 cm의 채널로 연결되어 있습니다. 다음으로, 마이크로채널의 적절한 깊이를 만들기 위해 원하는 두께의 아크릴 조각을 준비합니다. 더 두꺼운 시트는 절단하기 어렵고 매우 얇은 시트는 공정 중에 깨지거나 휠 수 있으므로, 약 1/16인치 너비의 아크릴 시트가 가장 이상적입니다.CAD 파일을 레이저 절단 장치로 가져온 다음, 아크릴 조각을 절단 표면에 놓습니다. 그 후 제조사의 프로토콜에 따라 챔버를 절단합니다. 갓 절단한 바벨 모양의 아크릴 컷아웃을 작은 페트리 접시에 넣고 사용할 때까지 덮어둡니다.칭량 보트에 엘라스토머 베이스 10부분과 경화제 1부분을 넣고 마이크로 피펫을 사용하여 5분 동안 섞습니다. 혼합물을 진공 챔버로 옮기고 30분 동안 진공을 가하여 PDMS 내부에 갇힌 기포를 제거합니다. 완료되면 진공을 끄고 칭량 보트를 꺼냅니다.탈기된 PDMS를 작은 페트리 접시에 담긴 바벨 모양의 아크릴 컷아웃 위에 붓습니다. PDMS가 인서트를 완전히 덮었는지 확인하십시오. PDMS를 실온에서 최소 18시간 동안 경화시킨 후, 메스로 아크릴 조각 주변의 PDMS를 조심스럽게 절단하고 인서트를 제거합니다.표준 세포 배양기 내의 페트리 접시에 마이크로채널 챔버의 특징면이 위로 향하게 놓고 70% ethanol로 완전히 덮습니다. 그런 다음 후드를 닫고 UV 램프를 켭니다. 챔버를 1~2시간 동안 UV 광선에 노출시킵니다.노출 후, 층류 후드(laminar flow hood)를 열고 기류가 다시 안정될 때까지 15분 동안 기다립니다. 그다음, 70% ethanol을 제거하고 멸균 PBS로 챔버를 2회 세척합니다. 각 세척 시 1 mL의 PBS를 사용하십시오.최종 세척 후 PBS를 제거하고 뚜껑을 연 상태로 챔버를 하룻밤 동안 건조합니다. 테스트할 세포 유형을 수확하고, 0.4% trypan blue 400 microliters에 세포 현탁액 100 microliters를 첨가하여 부드럽게 혼합합니다. 이 용액 100 microliters를 헤모사이토미터의 유리 커버 슬립 아래의 두 챔버에 부드럽게 채워 도포합니다.10x 대물렌즈가 장착된 현미경을 사용하여 헤모사이토미터의 격자에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 수동 계수기를 사용하여 헤모사이토미터 내 16개 사각형으로 구성된 4개 세트 전체에서 살아있고 응집되지 않은 세포 수를 셉니다. 총 세포 수를 4로 나누고 이 값에 50,000을 곱하여 세포 현탁액 1mL당 세포 수를 구합니다.이 계산을 바탕으로, 각 챔버의 웰 하나에 세포 2500개와 배지 100 microliters를 첨가하십시오. 세포가 챔버 내에 60분 동안 머물게 한 다음 배지를 추가로 첨가하십시오. 시작하려면, 물에 agarose를 넣고 용액을 전자레인지에서 1분 동안, 또는 agarose가 완전히 용해되어 용액이 투명해질 때까지 가열하십시오.용액을 페트리 접시에 붓기 전 15~30초 동안 식힙니다. 기포를 제거하려면 페트리 접시를 진공 챔버에 넣고 30분 동안 진공 상태에서 아가로스를 응고시킵니다. 응고가 완료되면 메스로 페트리 접시에서 2 mm x 2 mm x 2 mm 크기의 아가로스 큐브를 절단합니다.원하는 농도의 화학 유인 인자가 포함된 용액에 큐브를 완전히 담그고, 아가로스 블록을 상온에서 하룻밤 동안 침지시킵니다. 다음으로, 화학 유인 인자가 포함된 아가로스 블록을 마이크로채널 챔버의 끝단에 배치합니다. 폴리스티렌 마이크로비드나 챔버 내의 미세한 결함과 같은 마커를 활용하십시오.세포의 상대적인 시작 위치를 확인합니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 12시간 동안 매시간 이동하는 세포 전면(cell front)의 타임랩스 이미지를 촬영합니다. 여기에 표시된 일련의 이미지들은 채널 반대편 끝에 배치된 태아 송아지 혈청(fetal bovine serum) 농도 구배에 반응하여 채널을 가로지르는 세포 전면의 이동을 기록한 것입니다.이동 거리는 장치 내의 미세 결함으로부터 성장 전면까지의 거리를 기준으로 측정되었습니다. 이러한 측정 결과, 평균 세포 전면 속도는 시간당 13.4 micrometers인 것으로 나타났습니다. 이 기술에 숙달되면, PDMS 경화에 필요한 18시간의 대기 시간과 타임랩스 이미징을 위한 12시간이 추가로 소요되며, 실제 작업은 4시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 기술의 개발 이후, 실험 경험이 적은 학부생을 포함하여 다양한 숙련도의 연구자들이 인비트로(in vitro) 환경에서 상처 치유와 세포 이동을 쉽게 탐구할 수 있는 길이 열렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 마이크로채널 챔버를 성공적으로 제작하기 위해서는 PDMS 몰드에서 아크릴 인서트를 조심스럽게 제거하는 것이 중요하다는 점을 명심하십시오. 이 영상을 시청하고 나면, 다양한 화학적 신호에 반응하는 세포 이동을 연구하기 위한 간단한 마이크로채널 챔버 제작 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.이 절차에 따라 여러 가용성 화학 농도 구배, 기질, 유체 전단력 및 전기장과 같은 다른 단서들을 연구하여 이들이 세포 이동에 미치는 영향을 분석할 수 있습니다. 레이저 커터를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 적절한 교육을 이수하고 개인 보호구를 사용하는 등의 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

암 줄기 세포 이주를 조사하기위한 compartmentalizing 마이크로 유체 장치가 설명되어 있습니다. 이 소설 플랫폼은 가능한 세포 microenvironment를 생성 및 라이브 세포 운동의 미세 시각화 할 수 있습니다. 높은 운동성 암 세포는 잠재적으로보다 효과적인 미래의 치료로 이어지는 공격적인 침투 분자 메커니즘을 공부 절연되어 있습니다.

Compartmentalizing 마이크로 유체 장치와 라이브 세포 이미징을 사용하여 암 줄기 세포 마이그레이션 평가

phagokinetic 운동성 트랙 분석은 세포의 움직임을 평가하는 데 사용되는 방법입니다. 특히, 분석은 양적 방식으로 시간이 지남에 chemokinesis (임의의 셀 운동성)을 측정합니다. 검정은 콜로이드 골드 코팅 coverslips에 미치는 운동의 측정 트랙을 만들 수있는 세포의 능력을 활용합니다.

Phagokinetic 트랙 운동성 분석에 의한 세포 마이그레이션의 수량 평가

라이브 셀 마이그레이션 연구에 대한 현미경 챔버의 접착제 및 가용성 그라디언트의 조립 방법이 설명되어 있습니다. 엔지니어링 환경 솔루션 기울기와 antifouling 표면과 접착제 트랙을 결합하기 때문에 하나가지도 단서의 상대적 중요성을 확인할 수 있습니다.

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

일차원 국한 미세 환경에서 세포의 자발적인 이동을 연구하는 정량적 방법이 설명된다. 이 방법은 미세 채널을 활용하고 번의 실험에서 서로 다른 조건 하에서 세포의 다수의 이동을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

미세 채널에서 세포의 이동에 관한 연구

조기 내피 세포(EEC) 이동에 대한 조사는 특정 질병의 병태생리학을 이해하고 잠재적으로 치료 개입을 위한 새로운 전략을 식별하는 데 중요합니다. 다음 프로토콜은 EEC 조사에 맞게 조정된 세포 이동을 평가하는 기술을 설명합니다.

유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가

이 연구 보고서의 세포 침입과 마이그레이션 분석에 대 한 두 가지 방법: Boyden 챔버 분석 결과 및 체 외에서 비디오 현미경-기반 상처 치유 분석 결과. 이 두 실험에 대 한 프로토콜 설명, 그리고 그들의 장점과 단점 비교 됩니다.

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

이 프로토콜 셀 셀 microenvironment를 유지 하면서 3 차원 설정의 마이그레이션 및 침입 기능을 계량 하는 데 사용할 수 있는 반전된 세로 침공 분석 결과를 설명 합니다. 이 분석 결과 희소 한 또는 민감한 세포에 적합 합니다.

위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

현재 프로토콜 암 세포 마이그레이션 및 실시간으로 단일 플랫폼에서 침입을 조사 하 고, 세포 이동성 및 형태학 연구를 쉽게 재현할 수 및 시간 효율적인 옵션을 제공 하는 통합된 방법을 설명 합니다.

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

과립 하이드로겔 내부 및 계면으로의 3D 세포 이동에 대한 정량적 평가를 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

Quantifying three-dimensional cell migration within and into granulular hydrogel biomaterials(과립 하이드로겔 생체 물질로의 3차원 세포 이동 정량화)

소포 자료의 속도론을 측정하는 능력은 neurotransmission의 기초의 일부에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기 hippocampal의 연결을 문화에 presynaptic 소포 릴리스의 속도를 측정하기 위해 빨간색 형광 염료 FM 4-64으로 표시 vesicles의 실시간 이미지를 사용합니다.

FM 레이블을 사용하여 뉴런의 Exocytosis 측정

학습하세요 화학유도제 및 화학반발제가 세포 이동에 미치는 영향을 연구하는 간단한 방법을. 이 사용자 정의 가능한 마이크로채널 기법은 상처 치유 및 세포 상호작용 연구에 활용됩니다.

측정 셀 마이그레이션에 대한 사용자 정의 상공 회의소

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