January 2nd, 2018
이 원고 방법 절 개 같은 병 변 배양된 상피 세포 monolayers에 편리 하 게 모델 치료 생체 외에서이미징 confocal 의해 상처 또는 레이저 스캔 현미경, 고는 높은 품질을 제공할 수 있습니다. 공부 셀 동작 및 마이그레이션에 관련 된 메커니즘에 대 한 양적 및 질적 데이터입니다.
이러한 상피 세포 배양 인공 상처 시술의 전반적인 목표는 양적 및 질적 관점에서 세포 이동을 연구하여 상처 치유에 대한 관심 있는 특정 치료법의 효과를 평가할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 상피 파괴 중 특정 이동 과정의 역할을 정확하게 특성화할 수 있기 때문에 상처 치유 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 접근 방식의 주요 장점은 세포 이동 측정과 관련 분자 마커의 거동 변화의 상관 관계를 파악할 수 있다는 것입니다.
이러한 기술의 함의는 조기 약물 검사 및 상처 봉합을 위한 편리한 설정을 제공하기 때문에 임상 상처 치료로 확장됩니다. 일반적으로 이 방법은 한 세대에 걸쳐 상처에서 일관된 재현성을 얻는 데 어려움이 있기 때문에 시작됩니다. 인공 상처 스크래치 분석의 경우, 배양 플레이트의 각 웰에 완전한 배지에 2ml의 관심 상피 세포를 파종하는 것으로 시작합니다.
섭씨 37도에서 세포를 배양하고 이산화탄소 5%를 100%가 될 때까지 2-3일 동안 배양합니다. 세포가 준비되면 새로운 무혈청 배지로 세포를 두 번 세척한 다음 신선한 무혈청 배지에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 플레이트를 멸균 작업 영역에 놓고 멸균 마이크로 피펫 팁의 좁은 끝을 각 웰의 바닥을 가로질러 두 번 드래그하여 십자형 상처를 만듭니다.
일관된 상처 간격은 상피 표면을 따라 팁을 부드럽게 움직이면서 일정하고 단단한 압력을 가함으로써 달성됩니다. 과도한 압력은 팁을 변형시켜 불규칙한 상처 반경을 유발합니다. 상층액을 부드럽게 제거하여 분리된 세포를 버리고 웰에 새로운 무혈청 배지를 조심스럽게 추가합니다.
전하 결합 장치 카메라에 연결된 반전 위상차 현미경을 사용하여 현미경 필드의 가장자리를 스크래치의 인접한 교차점과 정렬하여 각 웰의 스크래치 갭에 대한 전처리 참조 이미지를 최대 4개까지 얻을 수 있습니다. 모든 이미지를 획득하면 지정된 처리 웰의 배지를 관심 있는 선별된 처리액을 보충한 새로운 배지로 교체하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 적어도 하나의 상태가 약 90%의 스크래치 갭 폐쇄에 도달하면 상등액을 PBS의 4% 포르말린 1ml로 부드럽게 교체하여 실온에서 15분 동안 배양합니다.
그런 다음 PBS로 세포를 최소 3회 부드럽게 세척하여 과도한 포르말린을 제거하고 긁힌 후 캡처한 원래 참조 영역에서 동일한 이미징 매개변수를 사용하여 방금 설명한 대로 웰을 이미지화합니다. 적절한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하려면 관심 있는 기록된 전처리 이미지를 열고 이미지 메뉴에서 이미지 유형을 8비트로 설정합니다. Process 메뉴에서 Filters 하위 메뉴를 선택하고 Variance filtering을 적용합니다.
Image 메뉴에서 Adjust 하위 메뉴를 열고 Threshold를 흑백으로 설정합니다. Process 메뉴에서 Binary 하위 메뉴를 선택하고 Fill Holes를 적용합니다. Analyze(분석) 메뉴에서 Set Measurements(측정 설정)를 선택하고 Area(영역)를 활성화합니다.
그런 다음 이동하는 가장자리 윤곽선을 따라 측정 가능한 영역을 그려 간격을 구분합니다. Analyze(분석) 메뉴에서 Analyze Particles(파티클 분석)를 선택하고 그려진 영역 표면의 총 면적 값을 기록합니다. 각 개별 샘플 세트에 대한 절대 이동을 갭 표면 측정 간의 차이로 정량화하려면 사전 및 사후 처리 총 갭 표면적 값을 스프레드시트로 내보내고 정량화 출력을 플롯합니다.
인공 이동 전면 분석의 경우, 멸균 조건에서 최대 33개의 멸균된 원형 커버슬립 한 층을 빈 10cm 배양 플레이트에 추가합니다. 플레이트 표면이 완전히 덮이면 배양 2-3일 후 100% 합류할 수 있는 농도로 관심 상피 세포를 부드럽게 파종합니다. 필요한 경우 멸균 마이크로피펫 팁으로 커버십을 부드럽게 눌러 뜨는 것을 방지합니다.
세포가 포화도에 도달하면 상등액을 무혈청 배지로 교체하여 24시간 동안 더 배양합니다. 그런 다음 멸균 핀셋을 사용하여 하나의 커버슬립을 새로운 무혈청 매체가 들어 있는 새 10cm 플레이트로 조심스럽게 옮기고 주변을 따라 커버슬립을 잡도록 주의합니다. 인공 상처를 만들려면 멸균된 면도날을 각 커버슬립을 가로질러 앞뒤로 드래그하여 각 세포 배양의 중심에 3-4mm 가로선을 만들어 중앙 단층 스트립을 완전히 제거합니다.
상처를 만들 때 면도날 가장자리를 커버슬립 표면에 무겁게 놓아 불규칙한 가장자리 모양과 펄럭이는 상피 부분의 생성을 방지하십시오. 최소 2밀리리터의 무혈청 배지가 함유된 6웰 플레이트의 개별 웰로 세포면이 위로 향하게 하여 최대 4개의 상처 커버슬립을 옮기고 새로운 무혈청 배지로 각 웰을 2회 부드럽게 세척하여 분리된 세포를 제거합니다. 분리된 세포가 모두 폐기되면 세척 배지를 관심 처리제가 보충된 새 배지로 부드럽게 교체하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.
적절한 실험 기간이 끝나면 방금 설명한 대로 PBS에 4% 포르말린으로 세포를 고정하고 적절한 관심 형광 접합 항체로 세포를 염색합니다. 그런 다음 관심 있는 실험 매개변수에 따라 형광 현미경을 통해 이동하는 전면 가장자리에서 발생하는 구조적 변화를 이미지화합니다. 이 실험에서는 상피 세포 증식 및 이동의 잘 알려진 유도 인자인 표피 성장 인자로 치료하기 전과 후에 상처 간격을 측정했습니다.
그런 다음 절대 이동은 사전 처리 및 사후 간격 표면적 간의 차이로 계산되었습니다. 표피 성장 인자를 사용한 치료는 대조군 및 성장 인자 자극 세포의 F-Actin 염색에 대한 이러한 레이저 스캐닝 현미경 이미지에서 관찰된 바와 같이 세포 세포골격 역학을 강화합니다. 또한, c-Jun 과발현은 이동하는 전선에 인접한 세포에서 명백한 단백질의 발현이 증가하면서 관찰됩니다.
이 절차를 시도하는 동안 이동 정량화를 방해할 수 있는 상피 세포 피판이 있는지 상처 가장자리의 무결성을 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 의 이동 행동을 정량적, 질적으로 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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본 원고는 배양된 상피 세포 단일층에 절개 유사 병변을 사용하여 세포 상처 치유를 모델링하는 방법을 설명합니다. 이 접근 방법은 영상화를 가능하게 하고 세포 행동 및 이동 메커니즘을 연구하기 위한 고품질 데이터를 제공합니다.
Assessing epithelial cell migration in vitro provides a scalable, reproducible platform for early-stage wound healing research, enabling mechanistic de-risking of therapeutic candidates. Quantitative and qualitative readouts from scratch and migration front assays support target validation by linking cellular behavior to molecular marker changes. This approach improves predictive confidence in preclinical models by correlating migration dynamics with treatment effects, informing go/no-go decisions in wound therapy pipelines.
The method integrates into early discovery workflows, supporting hypothesis testing in target validation and enabling scalable assay development for lead identification in wound healing programs.