Name: 현미경 기반 방법을 생체 외에서 상처 치유 중 상피 세포 이동의 평가 대 한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 배우세요 생체 외 상피 세포 단층 배양에서 인공 상처를 이용한 상처 치유 모델링 방법을. 공초점 현미경을 활용한 세포 이동 정량 분석과 조기 약물 테스트에 활용할 수 있습니다.

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개선 하 고 이러한 기술을 실제의 상태를 수정 하는 데 도움이 실험실의 이전 회원 감사 하겠습니다: 모라-닥터 셀 리아 마 르 티 네즈; 박사 안 나 Mrowiec, 닥터 카 탈리 나 루이즈-카나다와 닥터 안토니 아 Alcaraz-가르시아. 우리는 강력 하 게 이러한 기술의 개발을 지원 하기 위한 병원 Clínico 대학교 일 드 라 Arrixaca에 게 빚을입니다. 또한 기관 드 건배 카를로스 III, Fondo 드 Investigaciones Sanitarias. Estatal 계획 나 + D + 어 Instituto de 건배 카를로스 III-Subdirección 일반 드 Evaluación y Fomento 드 라 Investigación (허가 번호: PI13/00794); www.isciii.es. 자금 페더 "Una 마네 드 대처해 유로 파". 우리 또한 감사 IMIB Arrixaca, 대학 드 무르시아, FFIS 행정 지원 및 지원. 마지막으로, 우리 특별 한 닥터 이사벨 마르티네스-Argudo 고은 Facultad 드 Ciencias Ambientales y Bioquímica, 캠퍼스 Tecnológico 드 라 디렉터리 드 무기, 대학 카스 티 야 라만 차, 톨레도 기꺼이 넘겨주는에 그들의 종류 지원에 대 한 감사를 주고 싶어 여 의학 및 생명 공학 연구소가이 종이의 촬영된 부분을 가능 하 게

1. 인공 상처 스크래치 분석 결과 양적 연구
<ol>
	<li>세포 단층 준비
	<ol>
		<li>무 균 조건 하에서 작업, 씨 그리고 혈 청-보충 매체를 사용 하 여 문화 플라스 크에 Mv1Lu 또는 HaCaT 상피 세포 성장. 한 번 모든 24-48 h 매체를 새로 고침 합니다. 셀 도달 80% 합류, 후는 적절 한 방법, 즉, trypsinization9를 사용 하 여 셀을 분리 합니다. 참고: Mv1Lu 및 EMEM 및 DEMEM 문화 매체를 사용 하 여 상피 세포를 교양 HaCaT 각각 2 m L-글루타민, 보완 및 5% CO2의 제어 분위기 37 ° C에서 알을 품. 모든 셀 라인 셀 농도 전체 confluency를 도달 하는 데 필요한 타이밍을 결정 하기 위해 철저 하 게 분석 해야 합니다. 일반적으로 Mv1Lu 또는 HaCaT 세포에 대 한 2-4 x 104 또는 4-6 x 104 셀/글쎄, 각각은 시드 175 cm2 문화 플라스 크에 고 합류 하 80%에서 최대 35 x 106 Mv1Lu 또는 1 x 107 HaCaT 세포 생성 합니다.</li>
		<li>12 잘 또는 24-잘 문화 접시에 각 잘 셀의 2 mL에에서 씨. 일단 모든 24-48 h. 확인 셀 숫자는 2 ~ 3 일 후 100% 합류에 도달 충분히 높은 매체를 새로 고침 합니다.</li>
		<li>셀 도달 합류, 후 혈 청-보충 매체를 제거 하 고 신선한 혈 청 무료 매체와 두 번 세척. 긁 적 전에 24 h에 대 한 혈 청 자유로운 매체에 셀을 계속. 참고: Mv1Lu 또는 HaCaT 세포 하지 않아도 특별 한 기판 요구 사항; 그러나, 셀 라인 세럼 무료 조건에서 저절로 분리에 취약, 사전 코팅 폴 리-L-리 신 솔루션을 사용 하 여 문화 접시 표면의 고려 되어야 한다10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>단층 긁 적
	<ol>
		<li>메 마른 환경에서 working, 단단히 20 µ L 또는 원하는 스크래치 폭에 따라 200 µ L 살 균 micropipette 팁의 좁은 끝을 드래그 하 여 문화 단층 스크래치. 팁 유지 간격 동질성을 극대화 하기 위해 문화 표면에 수직.<ol>
			<li>명확 하 게 셀 단층을 모니터링 하는 어두운 표면 문화 접시를 놓습니다. 필요한 경우 각 잘 4 마이그레이션 분야까지 공부에 두 수직 흠집 (십자가 모양)을 수행 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>부드럽게 문화 매체와 부드럽게 추가 신선한 혈 청 무료 매체를 제거 하 여 분리 된 세포를 씻어. 두 번, 반복 또는 가장 첨부 되지 않은 세포 제거 되었습니다 때까지.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>실험 절차 및 데이터 수집
	<ol>
		<li>잘 사용 하 여 각 CCD 카메라를 통합 하는 반전된 단계 대조 현미경에서 스크래치 간격을 중심으로 최대 4 전처리 참조 이미지를 가져가 라. 스크래치의 인접 한 교차점으로 현미경 필드의 가장자리를 정렬 하 여 관심 영역을 선택 합니다. 참고: 일반적으로, 이미지는 인수 10 배 확대와 1280 x 1024 픽셀 이미지 크기를 사용 하 여. 쉽게 지역화 및 잘 당 최대 4 측정의 유효성 검사에 대 한 도움이 됩니다 위에서 설명한 대로 관심 영역을 선택 합니다.</li>
		<li>일단 모든 이미지는 인수 지정 치료 우물; 선택 된 치료 포함 된 신선한 매체와 우물에서 매체를 교환 합니다. 참고: 또는, 화학 제품, 문화 매체 동질성을 방해 하지 않는 화합물에 대 한 치료 수 수 주사 문화 매체에 직접.</li>
		<li>관측 범위 90% 스크래치 간격 폐쇄 조건까지 긁힌된 플레이트 (37 ° C 5% CO2를 포함 하는 제어 분위기)를 품 어. 완전 폐쇄를 하지 마십시오. 참고: 총 간격 폐쇄 무효화 치료 후 사진 모음 참조 영역 감지 되지 않습니다 하 고 갭 닫는 시간 참조를 설정할 수 없습니다. Mv1Lu 또는 HaCaT 세포의 경우 16-19 h 90% 합류에 도달 해야 합니다.</li>
		<li>셀; 수정 하 여 셀 마이그레이션 중지 부드럽게 실험적인 문화 매체 1 mL PBS에 4% 포 르 말린의 대체. 실시간에서 15 분 동안 품 어</li>
		<li>초과 말린;를 제거 하는 세포를 씻어 부드럽게 신선한 PBS 우물에 솔루션 대체. 두 번 이상 반복 합니다. 참고:이 단계에서 씰링, 후 접시 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 무기한.</li>
		<li>긁 적 후 캡처한 원본 참조 영역에서 각의 후 처리 참조 이미지를 가져가 라. 사용 하 여 동일한 장비 (거꾸로 광학 단계 대조 현미경 통합 CCD 카메라)와 일치 그림 설정 (확대 및 디지털 해상도/밀도). 참고: 개별적으로 마이그레이션 하 고 일관 된 정면 (예를 들어, MDA-MB-231 유방암 인간의 세포)의 형성에 관계 없이 공백을 채울 셀에 대 한 시간 코스 이미지는 개별 셀 마이그레이션 속도의 계산을 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>이미지 분석 및 마이그레이션의 정량화
	<ol>
		<li>이미지 프로세싱 소프트웨어 (예를 들어, ImageJ)를 사용 하 여 스크래치 간격 한계를 정의 하 고 치료 전 사진에 최대 4 개의 측정 간격 표면 결정. "표면 전처리 격차"로 데이터 기록 (PREGAP). 치료 후 사진에 대 한 동일한 절차를 반복 합니다. "후 처리 간격 표면"으로 데이터를 기록 (POSTGAP).<ol>
			<li>ImageJ를 사용 하 여 기록 된 이미지를 엽니다. "이미지" 메뉴에서 이미지 형식 8 비트 설정. "프로세스" 메뉴에서 "필터" 메뉴에가 고 "분산" 필터링 적용.</li>
			<li>"이미지" 메뉴에서 "조정" 하위 메뉴 및 설정된 임계값 흑인과 백인을 입력 (B &#38; W), "어두운 배경"을 선택 하지 않은 있는지 확인 하십시오. "프로세스" 메뉴에서 "바이너리" 하위 메뉴에가 고 "구멍 채우기"를 선택 합니다.</li>
			<li>"분석" 메뉴에서 "측정 설정"을 선택 하 고 "지역"를 활성화 합니다. 다음 따라서 격차를 구분 마이그레이션 가장자리 윤곽을 따라 측정 영역을 그립니다.</li>
			<li>"분석" 메뉴에서 "입자 분석"을 선택 하 고 그려진된 영역 표면에 대 한 "전체 영역" 값을 기록 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>PREGAP 및 POSTGAP 총 면적 값 간격 표면 측정의 차이 개별 샘플의 각 집합에 대 한 절대 마이그레이션 척도를 스프레드시트에 소개: PREGAP − POSTGAP [임의 단위]. 또한, 각 조건 제어 샘플의 절대 마이그레이션 데이터를 정상화: (샘플 / 제어) * 100 [%]. 참고: 셀을 개별적으로 마이그레이션할 일관 된 정면, (예를 들어, MDA-MB-231 유방암 인간의 세포)의 형성에 관계 없이 공백을 채울, 절대 마이그레이션 산출 될 수 있다 계산 셀 중앙에 침입 하 여 스트립에 컨트롤 또는 치료 샘플입니다.</li>
		<li>( 그림 1참조) 부 량 출력을 플롯 합니다. 필요한 경우 통계 분석을 수행 합니다.</li></ol></li></ol>비교 하는 두 가지 조건 또는 더 많은 수의 조건에 대 한 분산 분석 테스트 스튜던트 t-검정을 고려 하십시오.
	
	

2. 인공 마이그레이션 지형 연구에 대 한 전면 분석 결과
<ol>
	<li>세포 단층 준비
	<ol>
		<li>무 균 조건에서 작업 플레이트의 표면이 완전히 덮여 때까지 빈 문화 접시에 소독된 라운드 coverslips의 1 개의 층을 놓습니다. 참고: 12와 33 coverslips까지에 맞게 5 cm, 10 cm 직경 접시, 각각.</li>
		<li>문화 접시에 2 ~ 3 일 후 100% 합류를 허용 하는 농도에서 세포의 적절 한 볼륨을 씨앗 부드럽게. 아니 coverslip 겹치는 인접 coverslips 다는 것을 확인 하 고 살 균 micropipette 팁 부드러운 압력을 적용 하 여 부동에서 coverslips를 방지 합니다. 모든 24-48 h 매체를 새로 고칩니다. 참고: 모든 셀 라인 셀 농도 전체 confluency를 도달 하는 데 필요한 타이밍을 결정 하기 위해 철저 하 게 분석 될 해야 합니다. 일반적으로 Mv1Lu 또는 HaCaT 세포에 대 한 2-3 x 106 또는 2.5-4 x 106 세포/10 cm 직경 접시, 각각은 시드. 작은 접시에 대 한 셀 숫자 축소 되어야 합니다.</li>
		<li>셀 도달 합류, 후 혈 청-보충 매체를 제거 하 고 신선한 혈 청 무료 매체를 바꿉니다. 인위적인 상처를 수행 하기 전에 셀 24 h에 대 한 혈 청 자유로운 매체에 계속. 참고: Mv1Lu 또는 HaCaT 세포 하지 않아도 특별 한 기판 요구 사항; 그러나, 셀 라인 세럼 무료 조건에서 저절로 분리의 취약, 사전 코팅 폴 리-L-리 신 솔루션을 사용 하 여 문화 표면의 고려 되어야 한다10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>단층 부상
	<ol>
		<li>깨끗 한 10 cm 접시 신선한 혈 청 무료 매체를 포함 하는 coverslip 이동 조심 스럽게 멸 균 핀셋을 사용 하 여. 핀셋으로 주변에는 coverslip를 눌러는 단층을 손상 하지 마십시오. Coverslip 파손에서 발생할 수 있는 과도 한 압력을 피하십시오.</li>
		<li>coverslips의 중심에 가로 라인에 소독된 면도날을 끌어 인공 상처를 만듭니다. 뒤로-및-앞뒤, 완전히 중앙 단층 스트립을 제거 하려면 3-4 m m를 끕니다. 아무 셀 파편 계속 부상된 가장자리에 연결 되어 있는지 확인 합니다. 참고: 12 m m 직경에 coverslip, 라운드 절 개에서 이루어집니다는 중반에 coverslip의. 셀의 충분히 큰 메인 전면 반대 (적어도 2 m m 폭)의 다음 단계에 coverslip 기울이기 피하기 위해 행진을 두고 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>깨끗 한 6 잘 플레이트 포함 최소 2 mL 신선한 혈 청 자유로운 매체를, 직면 하는 세포와 부상된 coverslips를 전송 합니다. 최대 4 부 coverslips/잘 맞습니다.</li>
		<li>부드럽게 씻어 두 번 사용 하 여 신선한 혈 청 자유로운 매체 분리 된 세포를 제거 하.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>실험 절차 및 샘플링
	<ol>
		<li>부드럽게 선택한 치료 포함 된 신선한 매체와 우물에서 매체를 교환 합니다. 참고: 또는, 화학 제품, 문화 매체 동질성을 방해 하지 않는 화합물에 대 한 치료 수 수 주사 문화 매체에 직접. 어떤 잠재적인 세포 분리를 피하기 위해 주의 함께 진행 합니다.</li>
		<li>원하는 실험 타이밍에 대 한 (37 ° C, 5% CO2) 셀 인큐베이터 안에 접시를 유지.</li>
		<li>셀; 수정 하 여 셀 마이그레이션 중지 부드럽게 실험적인 문화 매체 1 mL PBS에 4% 포 르 말린의 대체. 실시간에서 15 분 동안 품 어 참고: 시간 과정 실험, 문화 접시에서 샘플을 제거 하 고 다른, 지속적인 실험 조건에 영향을 주는 포 르 말린 가스를 피하기 위해 별도 접시에 그들을 수정.</li>
		<li>초과 말린;를 제거 하는 세포를 씻어 부드럽게 신선한 PBS 우물에 솔루션 대체. 두 번 이상 반복 합니다. 참고:이 단계에서 씰링, 후 접시 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 무기한.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>면역 형광 검사 (IF) 및 토폴로지 분석
	<ol>
		<li>만약 얼룩이 수행 하 고 영상으로 개별 coverslips에 설명 다른3,,411.<ol>
			<li>PBS에서 0.3% 트라이 톤 X-100 솔루션에서 coverslips를 immersing 하 여 10 분 동안 permeabilize.</li>
			<li>다음 차단 솔루션을 사용 하 여 30 분 동안 블록: 0.3% 소 혈 청 알 부 민; 10% 태아 둔감 한 혈 청; 5% 탈지 우유; 0.3 PBS에서 % 트라이 톤 X-100 솔루션. 참고: 우유 없이 솔루션 차단 사전에 준비 하 고 수-20 ° c.에 저장</li>
			<li>1 차적인 항 체 우유 무료 차단 솔루션에 희석 된 촉촉한 챔버 내부 실내 온도에서 1 h에 대 한 품 어. 거꾸로 15 µ L 항 체 솔루션을 적절 한 배포에는 coverslips를 놓습니다. 참고: 항 체 작업 희석 변수 이며 사용에서 항 체에 따라 달라 집니다. 예를 들어 토끼 6 월 안티-c 항 체는 1/100 희석이 필요합니다.</li>
			<li>PBS에는 0.1% 트라이 톤 X-100 솔루션에서 coverslips을 찍기로 세 번 세척.</li>
			<li>30 분 동안 우유 무료 차단 버퍼에 희석 이차 항 체에 coverslips를 품 어. 참고: 항 체 작업 희석 변수 이며 사용에서 항 체에 따라 달라 집니다. 예를 들어 염소-안티-토끼 (488) 최적 해상도 대 한 1/400 희석을 요구 한다. Phalloidin, Hoechst 33258 등 다른 표기 시 약이이 단계에서 인큐베이션 버퍼에 추가할 수 있습니다.</li>
			<li>PBS에서 0.1% 트라이 톤 X-100 솔루션에서 coverslips을 찍기로 세 번 세척.</li>
			<li>Coverslips는 10 µ L 장착 미디어 드롭 (예, Vectashield)는 현미경 슬라이드에 배치에 거꾸로 탑재 합니다. 장착 매체 강화 위해 하룻밤 실 온에서 어둠 속에서 슬라이드를 둡니다. 나중에, 어둠 속에서 4 ° C에서 무기한 저장 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Epifluorescence 또는 마이그레이션 앞쪽 가장자리에서 발생 하는 구조 변경의 confocal 현미경 이미지를 얻을. 참고: 토폴로지 연구 기와 내부 단층 마이그레이션 앞에서 사진을 하 여 수행할 수 있습니다. 반 양적 연구는 로컬 형광 강렬에 소프트웨어를 기반으로 분석 하 여 가능 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phospholipase+in+generating+lipid+second+messengers+in+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction.</a> FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).</li>
<li>Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+into+a+wounded+area+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration into a wounded area in vitro.</a> Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).</li>
</ol>

저자는 충돌의 관심은 선언 합니다.

피부 또는 점 막 파열, 수많은 종류의 세포, 섬유 아 세포 또는 상피와 면역 세포를 포함 하 여 행동에 의해 장벽 기능 복원 됩니다. 이 세포는 복잡 한을 받아야 하는 conjointly, apoptosis, 확산, 차별화, 그리고 중요 한 것은, 섬유 관련 된 프로세스 및 상피 세포 궁극적인 메커니즘 방해 조직의 복원에 대 한 책임은 마이그레이션 및 표면 상피 간격1,12 따라서, 세포 이동 공부 폐쇄 정확 하 게 또한 상처에 대 한 치료의 modulatory 잠재력을 결정 하면서 상피 세포의 생리 적인 동작을 설명 하는 데 도움이 치유.
생리 적인 조건2, 근처에이 복잡 한 과정의 복제 및 따라서 일부 병 적인 조건 평가 또는 제약의 효과 대 한 수 있습니다 다른 연구 동물 모델에서 인위적인 상처를 수행 처리<sup class=...

셀 이동은 상피 갭의 최종 폐쇄와 방해 표면1의 복원에 대 한 책임은 상처 치유, 필요 합니다. 생리 적인 조건2근처에이 복잡 한 과정의 복제 동물 모델에서 인위적인 상처를 수행 할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 종종 비용과 복잡 한 실험 절차, 잠재적으로 상처 치유 과정의 복잡 한 특성으로 인해 개별 프로세스의 연구에 대 한 정밀 부족 발생 합니다.
상피 세포의 생체 외에서 문화는 역할이이 세포에 상처 치유와 셀 철새 행동 치료의 효과 연구를 위한 동물 모델에 대 한 유용한 대안을 제공 합니다. 상피 세포의 생리는 종종 비 합칠 문화3,4,,56;를 사용 하 여 분자 기술로 공부 그러나, 상피 무결성 중단 일반적으로 정밀한 기계 절 개 함으로써 이루어집니다. 세포 배양에서이 셀의 무시할 수 상처 격차에 노출 될 수 있습니다 그리고 그들은 분자 생물학 기술에 대 한 너무 작은 샘플을 나타내는 의미 합니다. 그러나, 이러한 병 변 밍 크 폐 상피 세포 (Mv1Lu) 또는 자발적으로 불멸 하 게 인간의 keratinocyte (HaCaT) 셀 등 일부 상피 세포 라인의 타고 난 철새 속성의 활용, 미세한 규모에서 공부 될 수 있다 라인입니다.
여기 우리는 상처 치유3,4,,78의 맥락에서 상피 세포의 마이그레이션에 양적 데이터를 얻기 위해 적당 한 현미경 검사 법에 대 한 방법을 설명 합니다. 또한, 우리는 마이그레이션 중 상피 monolayers에 발생 질적으로 분자와 형태학 상 변화를 공부 도움이 되는 추가 방법을 제시. 전반적으로, 이러한 메서드는 상처 치유 하는 동안 역학과 상피 세포 행동 및 치료에 대 한 응답으로 관련 된 형태학 상 변화를 공부 하는 프레임 워크를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>둘베코' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Biowest, Nuaill&eacute;, France</td><td>L0102-500</td><td>옵션 10% FBS 보충제</td></tr><tr><td>Eagles' s 최소 필수 매체 (EMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12 -662F</td><td>선택적 10 % FBS 보충제</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td>에서 사용<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA</td><td>DE17603A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>T4049</td><td>적절하게 희석</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x)</td><td>Gibco by Life</td><td>Technologies 14200-067</td><td>1x</td></tr><tr><td>24-well 배양 플레이트</td>로 희석 <td>BD FALCON//SARSTED</td><td>734-0020</td><td></td></tr><tr><td>6-well culture plates</td><td>SARSTEDT</td><td>83-3920</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>E9644</td><td>중고 10 ng/mL</td></tr><tr><td>원형 커버 유리</td><td>MENZEL-GL&Auml; SER</td><td>MENZCB00120RA020</td><td>SHORT DEPTH OF FIELD</td></tr><tr><td>강화 면도날 No. 743</td><td>Martor (VWR을 통해)</td><td>MARO743.50</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l 멸균 에어로졸 피펫 팁</td><td>VWR</td><td>732-0541</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; l 멸균 에어로졸 피펫 팁</td><td>VWR</td><td>732-0528</td><td></td></tr><tr><td>디지털 카메라 결합 위상차 현미경</td><td>Motic Spain</td><td>Moticam 카메라 2300 3.0 M 픽셀 USB 2.0; Motic Optic AE31</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>ZEISS Microimaging, 독일</td><td>LSM 510 META</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 배양 접시</td><td>BD FALCON</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>토끼 다클론 안티 c-Jun 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1694</td><td>중고 1:100</td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG (polyclonal goat) AF 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>중고 1:400</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>14530</td><td>중고 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red)</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td>중고 1:100</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2323</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>탈지 우유</td><td>BD DIFCO</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, 미국</td><td>릴리스 1.50i</td><td></td></tr><tr><td>Zen LSM 510 이미지 처리 소프트웨어</td><td>ZEISS Microimaging, 독일</td><td>릴리스 5.0 SP 1.1</td><td></td></tr></tbody></table>

현미경 기반 방법을 생체 외에서 상처 치유 중 상피 세포 이동의 평가 대 한

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

셀 이동은 상처 치유에 대 한 의무적 측면 이다. 인공 생성 상처 연구 동물 모델에 비용과 복잡 한 실험 절차에 자주 결과 정밀도에서 잠재적으로 부족 한 동안. 상피 세포의 생체 외에서 문화는 상처 치유와이 세포에 치료의 영향에 셀 철새 행동 연구를 위한 적합 한 플랫폼을 제공 합니다. 상피 세포의 생리는 종종 비 합칠 조건;에서 공부 그러나,이 방법은 자연 상처 치유 조건 닮은 하지 않을 수 있습니다. 기계적 방법으로 상피 무결성을 방해 현실적인 모델을 생성 하지만 분자 기술 응용 프로그램을 방해 수 있습니다. 따라서, 현미경 기반 기술을 상피 세포 이동 공부에 대 한 최적의 생체 외에서. 여기 우리는 두 가지 구체적인 방법, 인공 상처 스크래치 분석 결과 및 인공 마이그레이션 전면 분석 결과, 상피 세포의 이동 성능에 각각, 양적 및 질적 데이터를 얻을 수 있는 선발.

양적 연구에 대 한 인공 상처 스크래치 분석 결과: 마이그레이션의 표 피 성장 인자 (EGF) 승진 평가:
EGF는 상피 세포 확산 및 마이그레이션, 그리고 이렇게 측정 마이그레이션 프로 모션에 대 한 긍정적인 통제의 유명한 유도. Mv1Lu 및 HaCaT 세포 monolayers 상처 스크래치 분석 실험에서 사용 되었다 고 치료 전 사진을 입수 했다. 10 ng/mL EGF와 함께 접종 후 셀 고정 및 치료 후 사진 전에 19 h incubated 했다. 확산은 혈 청 기아 상태를 유지 하 여 최소한으로 유지 되었다. 그림의 전처리 및 후 처리 집합 ImageJ를 사용 하 여 분석 했다 그리고 중앙 간격 영역 결정 했다. 실험은 중복 등록 하는 각 음에 대 한 4 개의 측정에서에서 실행 되었다. 절대적인 이동의 정량화 표면의 차이로 계산 했다: (PREGAP − PO...

이 원고 방법 절 개 같은 병 변 배양된 상피 세포 monolayers에 편리 하 게 모델 치료 생체 외에서이미징 confocal 의해 상처 또는 레이저 스캔 현미경, 고는 높은 품질을 제공할 수 있습니다. 공부 셀 동작 및 마이그레이션에 관련 된 메커니즘에 대 한 양적 및 질적 데이터입니다.

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

이러한 상피 세포 배양 인공 상처 시술의 전반적인 목표는 양적 및 질적 관점에서 세포 이동을 연구하여 상처 치유에 대한 관심 있는 특정 치료법의 효과를 평가할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 상피 파괴 중 특정 이동 과정의 역할을 정확하게 특성화할 수 있기 때문에 상처 치유 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 접근 방식의 주요 장점은 세포 이동 측정과 관련 분자 마커의 거동 변화의 상관 관계를 파악할 수 있다는 것입니다.이러한 기술의 함의는 조기 약물 검사 및 상처 봉합을 위한 편리한 설정을 제공하기 때문에 임상 상처 치료로 확장됩니다. 일반적으로 이 방법은 한 세대에 걸쳐 상처에서 일관된 재현성을 얻는 데 어려움이 있기 때문에 시작됩니다. 인공 상처 스크래치 분석의 경우, 배양 플레이트의 각 웰에 완전한 배지에 2ml의 관심 상피 세포를 파종하는 것으로 시작합니다.섭씨 37도에서 세포를 배양하고 이산화탄소 5%를 100%가 될 때까지 2-3일 동안 배양합니다. 세포가 준비되면 새로운 무혈청 배지로 세포를 두 번 세척한 다음 신선한 무혈청 배지에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 플레이트를 멸균 작업 영역에 놓고 멸균 마이크로 피펫 팁의 좁은 끝을 각 웰의 바닥을 가로질러 두 번 드래그하여 십자형 상처를 만듭니다.일관된 상처 간격은 상피 표면을 따라 팁을 부드럽게 움직이면서 일정하고 단단한 압력을 가함으로써 달성됩니다. 과도한 압력은 팁을 변형시켜 불규칙한 상처 반경을 유발합니다. 상층액을 부드럽게 제거하여 분리된 세포를 버리고 웰에 새로운 무혈청 배지를 조심스럽게 추가합니다.전하 결합 장치 카메라에 연결된 반전 위상차 현미경을 사용하여 현미경 필드의 가장자리를 스크래치의 인접한 교차점과 정렬하여 각 웰의 스크래치 갭에 대한 전처리 참조 이미지를 최대 4개까지 얻을 수 있습니다. 모든 이미지를 획득하면 지정된 처리 웰의 배지를 관심 있는 선별된 처리액을 보충한 새로운 배지로 교체하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 적어도 하나의 상태가 약 90%의 스크래치 갭 폐쇄에 도달하면 상등액을 PBS의 4% 포르말린 1ml로 부드럽게 교체하여 실온에서 15분 동안 배양합니다.그런 다음 PBS로 세포를 최소 3회 부드럽게 세척하여 과도한 포르말린을 제거하고 긁힌 후 캡처한 원래 참조 영역에서 동일한 이미징 매개변수를 사용하여 방금 설명한 대로 웰을 이미지화합니다. 적절한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하려면 관심 있는 기록된 전처리 이미지를 열고 이미지 메뉴에서 이미지 유형을 8비트로 설정합니다. Process 메뉴에서 Filters 하위 메뉴를 선택하고 Variance filtering을 적용합니다.Image 메뉴에서 Adjust 하위 메뉴를 열고 Threshold를 흑백으로 설정합니다. Process 메뉴에서 Binary 하위 메뉴를 선택하고 Fill Holes를 적용합니다. Analyze(분석) 메뉴에서 Set Measurements(측정 설정)를 선택하고 Area(영역)를 활성화합니다.그런 다음 이동하는 가장자리 윤곽선을 따라 측정 가능한 영역을 그려 간격을 구분합니다. Analyze(분석) 메뉴에서 Analyze Particles(파티클 분석)를 선택하고 그려진 영역 표면의 총 면적 값을 기록합니다. 각 개별 샘플 세트에 대한 절대 이동을 갭 표면 측정 간의 차이로 정량화하려면 사전 및 사후 처리 총 갭 표면적 값을 스프레드시트로 내보내고 정량화 출력을 플롯합니다.인공 이동 전면 분석의 경우, 멸균 조건에서 최대 33개의 멸균된 원형 커버슬립 한 층을 빈 10cm 배양 플레이트에 추가합니다. 플레이트 표면이 완전히 덮이면 배양 2-3일 후 100% 합류할 수 있는 농도로 관심 상피 세포를 부드럽게 파종합니다. 필요한 경우 멸균 마이크로피펫 팁으로 커버십을 부드럽게 눌러 뜨는 것을 방지합니다.세포가 포화도에 도달하면 상등액을 무혈청 배지로 교체하여 24시간 동안 더 배양합니다. 그런 다음 멸균 핀셋을 사용하여 하나의 커버슬립을 새로운 무혈청 매체가 들어 있는 새 10cm 플레이트로 조심스럽게 옮기고 주변을 따라 커버슬립을 잡도록 주의합니다. 인공 상처를 만들려면 멸균된 면도날을 각 커버슬립을 가로질러 앞뒤로 드래그하여 각 세포 배양의 중심에 3-4mm 가로선을 만들어 중앙 단층 스트립을 완전히 제거합니다.상처를 만들 때 면도날 가장자리를 커버슬립 표면에 무겁게 놓아 불규칙한 가장자리 모양과 펄럭이는 상피 부분의 생성을 방지하십시오. 최소 2밀리리터의 무혈청 배지가 함유된 6웰 플레이트의 개별 웰로 세포면이 위로 향하게 하여 최대 4개의 상처 커버슬립을 옮기고 새로운 무혈청 배지로 각 웰을 2회 부드럽게 세척하여 분리된 세포를 제거합니다. 분리된 세포가 모두 폐기되면 세척 배지를 관심 처리제가 보충된 새 배지로 부드럽게 교체하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.적절한 실험 기간이 끝나면 방금 설명한 대로 PBS에 4% 포르말린으로 세포를 고정하고 적절한 관심 형광 접합 항체로 세포를 염색합니다. 그런 다음 관심 있는 실험 매개변수에 따라 형광 현미경을 통해 이동하는 전면 가장자리에서 발생하는 구조적 변화를 이미지화합니다. 이 실험에서는 상피 세포 증식 및 이동의 잘 알려진 유도 인자인 표피 성장 인자로 치료하기 전과 후에 상처 간격을 측정했습니다.그런 다음 절대 이동은 사전 처리 및 사후 간격 표면적 간의 차이로 계산되었습니다. 표피 성장 인자를 사용한 치료는 대조군 및 성장 인자 자극 세포의 F-Actin 염색에 대한 이러한 레이저 스캐닝 현미경 이미지에서 관찰된 바와 같이 세포 세포골격 역학을 강화합니다. 또한, c-Jun 과발현은 이동하는 전선에 인접한 세포에서 명백한 단백질의 발현이 증가하면서 관찰됩니다.이 절차를 시도하는 동안 이동 정량화를 방해할 수 있는 상피 세포 피판이 있는지 상처 가장자리의 무결성을 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 의 이동 행동을 정량적, 질적으로 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

microscopy-based-methods-for-assessment-epithelial-cell-migration

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

일반적으로 사용되는 체외에서 세포의 이동 및 침윤을 조사하기위한 고도의 접근 방법이 설명되어 있습니다. 첫 번째 방법은 세포 운동성을 측정하는 세포 상처 폐쇄 분석이다. 두 번째 방법은 화성과 세포의 침략적인 능력을 평가하는 트랜스 웰 마이그레이션 및 침입 분석이다.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

세포 이동은 암과 같은 상처 치료 및 면역 반응 및 병태 생리 학적 과정으로, 생리의 과다에 관여하는 생물학적 현상이다. 3D-콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 3 차원 형상의 생리적 환경 내에서 다른 세포 유형의 이동성 특성을 분석하는 다용도 공구이다.

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

조기 내피 세포(EEC) 이동에 대한 조사는 특정 질병의 병태생리학을 이해하고 잠재적으로 치료 개입을 위한 새로운 전략을 식별하는 데 중요합니다. 다음 프로토콜은 EEC 조사에 맞게 조정된 세포 이동을 평가하는 기술을 설명합니다.

유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가

이 프로토콜의 목표 3 차원 섬유 소 매트릭스 내에서 셀 마이그레이션에 프로 및 안티 migratory 요인의 효과 평가 하는 것입니다.

환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

여기, TIP60 소진 MCF10A 유 방 상피 세포를 사용 하 여 상처 치유 분석 결과에서 셀 이동의 실시간 모니터링 하는 것이 선물이. 라이브 세포 이미징 기술 우리의 프로토콜의 구현 분석 하 고 실시간으로 단일 셀 운동 시간을 시각화 수 있습니다.

TIP60의 과도 한 소모 후 유 방 상피 세포 이동의 라이브 영상

이 연구 보고서의 세포 침입과 마이그레이션 분석에 대 한 두 가지 방법: Boyden 챔버 분석 결과 및 체 외에서 비디오 현미경-기반 상처 치유 분석 결과. 이 두 실험에 대 한 프로토콜 설명, 그리고 그들의 장점과 단점 비교 됩니다.

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

여기, 선물이 기관지 상피 세포의 마이그레이션에 펩 티 드의 효과 평가 하는 프로토콜. 이 메서드는 셀 마이그레이션 및 상처 폐쇄의 속도에 양적 데이터의 신속 하 고 재현성 높은 획득에 대 한 수 있습니다.

상처 치유 분석 결과 셀 마이그레이션 평가 하는 새로운 체 외에

여기는 자동된 광학 카메라 현미경으로는 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 테스트 하는 절차에 설명 합니다. 스크래치 분석 결과 널리 사용 되었습니다 어디 스크래치의 폐쇄는 세트 기간에 대 한 다음. 광학 현미경 세포 이동의 신뢰할만 하 고 저렴 한 감지 수 있습니다.

체 외에서 세포 마이그레이션 자동화 된 광학 카메라의 테스트에 대 한 스크래치 분석 결과 최적화

현재 프로토콜 암 세포 마이그레이션 및 실시간으로 단일 플랫폼에서 침입을 조사 하 고, 세포 이동성 및 형태학 연구를 쉽게 재현할 수 및 시간 효율적인 옵션을 제공 하는 통합된 방법을 설명 합니다.

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

여기서, 우리는 1차 섬유아세포를 이용한 시험관내 스크래치 분석및 마우스에서 의 피부 상처 치유 분석실험을 위한 프로토콜을 제시한다. 두 방법 모두 시험관 내 및 생체 내 상처 치유를 평가하는 간단한 방법입니다.

스크래치 마이그레이션 분석 및 등갈 피부 접기 챔버 에서 생체 외 및 상처 치유의 생체 내 분석

본 논문은 생체 내에서 고해상도로 상처 치유를 위해 살아있는 Clytia hemisphaerica medusa의 상피에 상처를 만드는 방법을 설명 한다. 또한, 상처 치유 동안 상피 세포 및 세포 외 기질의 신호 전달 과정을 교란시키기 위해 염료 및 약물을 도입하는 기술이 제시됩니다.

Cnidarian 모델 유기체 Clytia hemisphaerica를 사용한 생체 내 상피 상처 치유 특성화

배우세요 생체 외 상피 세포 단층 배양에서 인공 상처를 이용한 상처 치유 모델링 방법을. 공초점 현미경을 활용한 세포 이동 정량 분석과 조기 약물 테스트에 활용할 수 있습니다.

현미경 기반 방법을 생체 외에서 상처 치유 중 상피 세포 이동의 평가 대 한

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