Name: 확산 및 무부하 인간의 섬유 아 세포의 게놈 넓은 사본 감소율을 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 학습하세요 증식 및 정지 상태 인간 진피 섬유아세포에서 전사체 감소율을 측정하는 방법을. 이 기법은 유전자 발현 역학과 전사체 안정성 연구에 활용됩니다.

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HAC 리 타 알 렌 재단 (http://www.ritaallenfoundation.org)의 밀 튼 중 카셀 학자 이었다. 이 작품 HAC 우수성 그랜트 P50 GM071508의 국립 연구소의 종합 의료 과학 센터에서 (탐정 데이비드 Botstein), PhRMA 재단 그랜트 2007RSGl9572, 국립 과학 재단 부여 OCI-1047879 데이비드 8 월에 교부 금에 의해 투자 되었다 일반 의료 과학 R01 GM081686, 국립 연구소의 종합 의료 과학 R01 GM0866465, Eli의 국립 연구소 &#38; 재생 의학의 Edythe 넓은 센터 &#38; 줄기 세포 연구, 아이리스 칸토어 여자 건강 센터/UCLA CTSI NIH 그랜트 UL1TR000124, 그리고 백혈병 림프 종 사회입니다. 이 간행물에 보고 된 연구 보너스 번호 P50CA092131에서 국립 보건원의 국립 암 연구소에 의해 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. HAC는 Eli의 멤버인 &#38; Edythe 넓은 재생 의학 센터 &#38; 줄기 세포 연구, UCLA 분자 생물학 연구소와 UCLA 생물 정보학 각 부처간 프로그램.

설명 하는 모든 실험은 프린스턴 대학, 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스에서 제도적 검토 보드에 의해 승인 되었다.
1. ActD 시간 코스에 대 한 확산 및 접촉 저해 Fibroblasts 준비
참고:이 프로토콜 사용 하는 timecourse 4 timepoints입니다. 3 생물학으로 독립적인 샘플 timepoint 당 1 개의 실험에서 다른 조직 문화 접시를 수집 하 여 수집 될 수 있습니다 또는 실험 세포의 서로 다른 문화를 여러 번 반복 될 수 있다. 우리의 경험에서 한 10 cm (직경) 조직 문화 접시 (1 접시) 분석에 대 한 충분 한 RNA를 제공합니다. 필요한 경우 각 timepoint에 셀의 수를 늘리기 위해 각 샘플에 대 한 여러 조직 문화 요리를 풀링된 수 있습니다. 또한, 진정으로 독립적인 생물 복제로 다른 개인에서 격리 하는 섬유 아 세포와 같은 실험을 수행할 수 있습니다.
<ol>
	<li>대 본 부패 분석에 대 한 셀의 확산 및 무부하 문화를 설정 합니다. 확산 셀 분할 셀 마다 3 일 동안 접촉 저해 세포 접촉 저해 되 고 있다.
	<ol>
		<li>접촉 저해 셀에 대 한 매체를 7 일 동안 매 2 일 변경. 2 일 전에 접촉 저해 fibroblasts 컬렉션에 대 한 준비가 proliferating 셀을 분할 합니다. 셀 문화 체계의 예는 그림 1에 표시 됩니다. 이 섹션의 나머지 단계는 설정 하 고 셀 분할에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>13설립된 프로토콜 따르면 신생아 피부에서 기본 피부 섬유 아 세포를 격리 합니다. 균질 인구를 위해 통로 섬유 아 세포입니다. 참고: 섬유 아 세포 냉동 및 해 동, 필요한 경우 될 수 있습니다.</li>
	<li>해 동 또는 필요한 경우 섬유 아 세포, replate. 37 ° C, 5% CO2조직 문화 인큐베이터에서 무 균 조건 하에서 10% 세럼과 DMEM에 섬유 아 세포 성장. 10 미만 구절에 대 한 성장 된 섬유 아 세포를 사용 합니다. 섬유 아 세포 이어야 한다 &#60; 80% 합칠 확산 및 무부하 인구 수 있도록 셀 분할의 날에.</li>
	<li>조직 배양 접시를 여러 접시, prewarm PBS, 트립 신, 및 보통 20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 혈 청으로 분할.</li>
	<li>발음 또는 피펫으로 replated 될 세포와 각 조직 배양 접시에서 매체를 제거를 사용 하 여.</li>
	<li>각 접시 (10 mL 150 m m, 100 m m 플레이트에 대 한 솔루션의 5 mL, 6 잘 플레이트의 우물 2 mL에 대 한 솔루션의) 12 잘 접시의 우물 1 mL에 피펫으로 따뜻한 PBS.</li>
	<li>Aspirate 또는 피펫으로 각 조직 배양 접시에서 PBS를 제거 하려면.</li>
	<li>부드럽게 피펫으로 1 트립 신-EDTA 각 접시 (8 mL 150 mm 접시, 100 m m, 6 잘 플레이트의 우물 2 mL 및 12 잘 접시의 우물 1 mL에 대 한 솔루션의 3 mL에 대 한 솔루션의)에 x. 참고: 확인 1 살 균 10 diluting 하 여 트립 신-EDTA x 트립 신-EDTA 무 균 PBS에 x. 마지막 1 x 솔루션 0.05 %trypsin 및 0.02 %EDTA 이어야 한다.</li>
	<li>5 분에 대 한 셀과 트립 신을 품 어.</li>
	<li>부드럽게 접시 꺼내 접시에서 셀을 누릅니다.</li>
	<li>피펫으로 세포를 단일 세포 현 탁 액으로 resuspend.</li>
	<li>10% 세럼 150 m m 플레이트, 100 mm 접시, 6 잘 플레이트의 우물 2 mL에 대 한 솔루션의 3 mL에 대 한 솔루션의 (8 mL과 DMEM의 동일한 볼륨을 포함 하는 원뿔 튜브 셀 trypsin 솔루션에 전송 그리고 12의 우물 1 mL 잘 접시).</li>
	<li>트립 신을 제거 하려면 1000 x g 에서 5 분간 4 ° C에서 셀 아래로 회전 합니다.</li>
	<li>매체와 카운트의 적절 한 볼륨에 셀 셀 농도 결정 하는 hemacytometer와 resuspend.</li>
	<li>확산에 대 한 100 m m 조직 문화 접시 당 씨앗 5 x 105 세포와 접촉 저해 셀.</li>
	<li>이 메서드를 사용 하 여 확산 하 고 접촉 저해 샘플 분석 (그림 1)에 필요한 설정 합니다.</li>
</ol>
2. ActD 시간 코스
<ol>
	<li>ActD 1 mg/mL (ActD, 살 균 PBS의 사용 950 µ L 및 살 균 DMSO의 50 µ L의에 대 한 1 밀리 그램)의 재고 농도에서 resuspend. 참고: ActD의 냉동된 재고 솔루션 안정 되어야 한 달-20 ° c.에 대 한 희석 솔루션은 무시 되 고 더 사용 하기 위해 저장 하지 해야 합니다.</li>
	<li>모든 생물 복제 세포 배양 접시를 위한 prewarmed 매체의 적절 한 볼륨 ActD 추가 0, 120, 240, 그리고 480 분 timepoints (그림 2) 설정 했다. ActD 매체의 mL 당 15 µ g의 농도에 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 오래 된 매체 떨어져 발음 ActD 포함 된 매체에 있는 셀에 추가.
	<ol>
		<li>1 mg/mL 주식에 대 한 추가 15 µ L 150 µ L을 추가 하는 매체, 예를 들어, 100 mm 접시에 대 한 매체의 10 ml의 각 ml ActD ActD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>제로 timepoint 샘플을 수집, 부드럽게 ActD 매체를 피펫으로 발음 하는 셀에 PBS를 prewarmed. 피펫으로 100 m m, 6 잘 플레이트의 우물 2 mL 및 12 잘 접시의 우물 1 mL에 대 한 솔루션의 5 mL 150 mm 접시에 대 한 솔루션의 10 mL.</li>
	<li>부드럽게 발음 또는 피펫으로 PBS에서. 참고: RNA 격리를 포함 하는 모든 단계는 RNase 무료 물, RNase 무료 microcentrifuge 튜브, RNase 무료 펫과 수행 되어야 한다. 장갑 착용 하 고 RNA와 함께 작업 하는 경우에 자주 변경 해야 합니다.</li>
	<li>조직 문화 접시에 직접 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 (1 mL/10-cm 플레이트 4 x 105 4 x 107 셀)을 추가 합니다. 참고: 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션은 세포를 lysing 서로 다른 RNA, DNA, 그리고 단백질을 분리 하는 동안 RNA 품질을 유지 하는 monophasic 솔루션. 주의: 페 놀 및 guanidine isothiocyanate은 부식성. 적절 한 보호를 사용 합니다.</li>
	<li>피펫으로 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션-셀 혼합 균질 혼합물을 만들기 위해 여러 번 왔다 갔다. 참고: 또는 최대 1 년-20 ° C에서 4 ° C 하룻밤에 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 lysate를 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>후 적절 한 양의 시간 단계 2.3-2.6에 설명 된 방법을 사용 하 여 각 시간 포인트를 수집 합니다.</li>
</ol>
3. 페 놀 guanidine Isothiocyanate 솔루션 Lysate에서 총 RNA 격리
<ol>
	<li>RNA-단백질 복합물의 완전 한 해체를 위해 5 분 동안 실 온에서 샘플을 품 어. 참고: 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 프로토콜의 단계 다른 설명이 없는 한 상 온에서 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>방법론 사용으로 검출 될 수 있는 제어 스파이크에 녹취 록을 소개 합니다.</li></ol>알려진된 수량 및 농도에 각 샘플에 이러한 컨트롤을 소개 합니다. 참고: 외부 RNA 제어 컨소시엄 (ERCC) 스파이크 컨트롤 믹스14 특별히 설계 되었습니다 스파이크에서 컨트롤로 RNA-이 대 한 그것은 또한 북부 오 점 또는 실시간 정량에 대 한 사용할 수 있습니다. 스파이크에 컨트롤 microarray 기술을 위해 특별히 설계 된 제공 ( 테이블의 자료참조)도 있습니다.
	<li>Microcentrifuge 튜브 2.0 mL를 피펫으로에 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 혼합물을 전송. 사용 된 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션의 모든 1 mL에 대 한 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 혼합물에 0.2 mL 클로 프롬을 추가 (예를 들어, 1.5 mL 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 혼합물에 추가 하는 0.3 mL 클로 프롬).</li>
	<li>15 microcentrifuge 튜브를 적극적으로 흔들어 s 다음 3 분 동안 실 온에서 클로 프롬-페 놀-guanidine isothiocyanate 혼합물을 품 어 고.</li>
	<li>4 ° c.에 20 분 동안 12000 x g 에서 샘플을 회전 참고: 초기 스핀 후 샘플 해야 별도 레이어로 3-상단 (그림 3)에 명확한 수성 층 그리고 바닥, 화이트/핑크 interphase, 중간에 빨간색 유기 층.</li>
	<li>수성 층 새로운 2.0 mL microcentrifuge 튜브는 micropipette를 사용 하 여 전송. 참고: 수이 과정 동안에 interphase를 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 수 분수의 일부 떠날 괜찮습니다. 또한 interphase 레이어는 interphase 등의 일부를 포함 하도록 레이어 DNA와 RNA를 오염 시킬 것 보다는 수성 분수의 일부를 두고 하는 것이 낫다. 수성 층이 됩니다 약 절반 초기 볼륨, 그래서 약 0.9 mL의 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션/클로 프롬 혼합물은 1.8 mL.</li>
	<li>Interphase 및 유기 분수를 삭제 합니다.</li>
	<li>수성 분수 2-프로 판 올의 동일한 볼륨을 추가 하 고 반전 튜브 10 번. 수익률 10 미만6 셀 수집 때문에 낮을 것으로 예상 된다 하는 경우에 특히 샘플의 20 µ L 당 glycogen의 20 mg/mL 용액의 최대 1 µ L를 추가 합니다. 참고:이 조밀 하 고, 단단한 펠 릿 스핀 단계 후 모니터링을 쉽게 발생 합니다.</li>
	<li>10 분 동안 실내 온도에 샘플을 품 어.</li>
	<li>4 ° c.에 20 분 동안 12000 x g 에서 샘플을 회전 되도록,이 회전의 끝에, RNA는 튜브의 하단에 흰색 펠 릿을 형성 시 켰 던.</li>
	<li>피 펫, 제거와 상쾌한 화이트 RNA 펠 렛을 방해 하지 특별 한 주의가지고 삭제. 참고: 초과 에탄올을 제거 하는 손잡고 개최 하는 느슨한 피펫으로 팁을 사용할 수 있습니다. RNA 펠 릿 방해 하지만 삭제 하지 탐정 스핀을 반복 하 고 다시는 상쾌한을 제거 수 있습니다. 이 전체 절차를 반복 조사를 요구할 것 이다으로 펠 릿을 삭제 하지 마십시오.</li>
	<li>75% 에탄올과 물의 25 %nuclease 무료 솔루션을 준비 합니다. 펠 릿을 세척 하 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 시 약의 1 mL 당 75% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 10 분 동안 12000 x g 에서 샘플을 회전</li>
	<li>제거한 후에 상쾌한의 대부분를 피펫으로 사용 하 여 여전히 복용 하지 않도록 주의 펠 렛을 방해 하는 동안 최대한 많은 에탄올을 제거. 참고: RNA 펠 릿이이 단계에서 적은 소형 이며 이동 하는 경향이 있다. RNA를 손실 되지 않도록 하려면이 시점에서 펠 릿을 처리할 때 특별히 주의 해야 합니다.</li>
	<li>펠 렛의 모든 초과 에탄올을 실 온에서 2 분에 대 한 샘플 12000 x g 회전.</li>
	<li>사용 하는 펠 렛을 방해 하지를 돌보는 micropipette 튜브에서 모든 초과 에탄올을 제거 합니다.</li>
	<li>RNA 펠 릿 어 5 분 동안 건조 하자.</li>
	<li>RNA 펠 릿을 nuclease 무료 물 50 µ L을 추가 하 고 resuspend nuclease 무료 물 속에서 펠 릿.</li>
	<li>샘플 1 µ L 치료 DNase (2 단위 / µ L) DNA를 제거 하 고 다음 비활성화 DNase 및 양이온 ( 재료의 표참조)를.</li>
	<li>-80 ° c.에 2.0 mL microcentrifuge 튜브에 RNA 샘플 저장</li>

4입니다. 성적 풍부의 분석
<ol>
	<li>RNA를 계량 하 고 순도 분 광 광도 계를 사용 하 여에 대 한 RNA를 확인 합니다. 참고: 260에서 흡 광도의 비율 280 nm nm RNA에 대 한 약 2.0 이어야 한다.</li>
	<li>1 %agarose 젤 또는 저하의 정도 시각화 하는 해당 기술 RNA를 분석 합니다. 참고: 두 취소 18S를 대표 하는 밴드 그리고 28S rRNA 명확 하 게 보이는 (그림 4)를 해야 한다. 이러한 밴드 표시 되지 않는 경우 RNA 저하 될 수 있습니다. 문제 촬영 팁 RNA 저하에 대 한 토론에 제공 됩니다.</li>
	<li>모니터 대 본 풍부한 RNA의 수집된 aliquots에 비해 아군에 내부 표준 microarrays15, RNA-Seq16,17, 실시간 정량 Pcr 사용 하 여 또는 북부 몰아내고18.
	<ol>
		<li>알려진 풍요의 제어 아군에 비해 각 시간 지점에서 각 사본에 대 한 풍부를 결정 합니다. 참고: microarrays, 값 형광 강렬 될 것입니다. 북부 오 점, x 선 필름에 밴드를 측정할 수 있습니다. 실시간 정량 pcr, 2-σσCT 방법19알려진된 표준 비교해보면 사본 풍부를 확인할 수 있습니다. RNA-Seq에 대 한 정규화 된 값은 FPKM 또는 kilobase 백만 읽기 매핑된 당 exon의 당 조각으로 확인할 수 있습니다. Isoform 특정 감소율에 대 한 RNA-Seq 데이터 DEXSeq20같은 isoform 인식 방법론을 사용 하 여 분석 수 있습니다. Isoform 특정 감소율은 최고의 RNA이 결정 Microarray 데이터 결정 될 경우, 유전자에 의해 유전자 단위가 아닌 프로브, 프로브 기초 데이터를 분석 해야 합니다. 애 널 리스트는 감지기의 제한 된 수의 정보를 해석할 때 주의 해야 합니다. 예를 들어, 5 이하의 프로브 특정 isoform에 대해 유익 하지 않은 있을 수 있습니다. 이 경우에, 분석 결과 신뢰할 수 있는 이러한 프로브 동작 충분히 일관 되는지 확인 해야 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>C-Myc 및 자신감을 요금을 정확 하 게 감지 했다 그 성적 부패를 GAPDH 처럼 천천히 부패 유전자 처럼 급속 하 게 부패 유전자 분석에 수집 된 샘플에서 격리 된 RNA17 에 실시간 정량 Pcr을 수행 합니다. 참고: 추가 확인에 대 한 isoform 특정 실시간 정량 프로브 개발 고21동안 특정 isoforms의 풍부를 모니터링 하는 데 사용.</li>
</ol>
5입니다.감퇴 속도 상수 결정
<ol>
	<li>각 timepoint에 대 한 로그-변환 (유전자 또는 isoform 특정) 각 사본에 대 한 풍부한 값입니다. 참고: 로그 변환 값으로 변환 됩니다 지 수 감퇴 곡선 선형 감퇴 모델22로 들어갈 수 있는 라인.</li>
	<li>각 대 본 (유전자 또는 isoform 특정) 선형 감퇴 모델에 대 한 식 프로 파일에 맞게. 이러한 모델에 대 한 공식은 f (t) = C-r * t. 이 방정식에 C는 녹취 록의 시작을 나타냅니다 상수, r의 감소, 속도 이며 t는 시간 실험의 처음부터. 이 방정식에서 r*ln(10)와 감퇴 속도 결정 (참조11참조). 참고: maSigPro 소프트웨어 패키지는 회귀 기반 접근 시간 코스 데이터23에 중요 한 유전자 식 프로필 차이 탐지 하도록 설계 되었습니다. 샘플 코드 및 maSigPro에 대 한 결과에 사용할 수 있습니다: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf.</li>
	<li>필터 로그 선형 감퇴 모델에 맞게 실패 하는 유전자를. 이 ANOVA F-검정을 수행할 수 있습니다. 참고: F 검정은 유사로 정의 되는 F-통계, 기반 샘플 의미 샘플 내에서 변이 나눈 사이. 선형 스텝 업 Benjamini 및 Hochberg 거짓 발견 절차24를 적용 하 여 여러 비교에 대 한 p 값을 수정 합니다. Q 값 F-검정 0.05 보다 큰 로그 선형 감퇴 모델에 맞게 실패 하는 유전자는 컷오프로 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>여 지 없이 세포 주기 상태와 시간 사이 중요 한 상호 작용 기간 성적을 결정 하는 ANOVA F-검정을 수행 (틀린 발견 비율, 루즈벨트 &#60; 0.05).</li>
</ol>

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저자는 공개 없습니다 경쟁 관심사 있다.

정지는 mitogens 또는 혈 청의 철수, 세포 접착 및 접촉 금지의 부족을 포함 하는 외부 신호에 의해 유도 될 수 있다. 접촉 금지, 정지, 유도 대 한 여러 가지 방법 중 하나는 세포 증식 세포 주기 세포 세포 접촉에 대 한 응답에서 종료 매우 진화론 보존된 과정 이다. 우리는 정지를 유도 하는 방법의 예를 들어 접촉 저해에 여기 초점. 이전 연구 보고가 셀 셀 문의 예측에 관한 속25에 영향을 미칠 수 있습니다, 따라서, 한 정지 방법에 정보를 제공 하는 결과 및 추가 연구는 결정 하는 데 필요한 변경 내용을 정지 와 관련 된 se 당.
우리는 우리가 신생아 피부에서 고립 된 주 인간의 2 중 fibroblasts 사용. 우리는 10 번 미만 passaged 했다 섬유 아 세포와 함께 이러한 실험을 시작. 우리 때문에 나중에 통과 fibroblasts 삭제 그들은 senesce. 이 프로토콜은 확산 및 무부하 피...

성적 증명서의 정상 상태 수준 반영 성적 종합과 성적 부패의 기여. 규제 및 조정된 대 본 부패는 제어 생물 학적 과정1,2,,34중요 한 메커니즘입니다. 예를 들어 성적 감소율 염증 성 cytokine 종양 괴 사 인자5활성화 다음 이벤트의 시간 시리즈에 기여할 표시 되었습니다.
우리는 이전 확산 및 기본 인간 섬유 아 세포에 정지 사이 과도 많은 유전자6의 증명서 수준에 변화와 관련 된 나타났습니다. 이러한 변화 중 일부 녹음 방송 요인의 활동에 이러한 두 상태 사이의 차이 반영합니다.
녹취 록의 부패 속도 변화 또한 두 개의 서로 다른 상태7,8대 본 식 수준에 변화에 기여할 수 있다. 확산 및 정지 사이 과도 여러 microRNAs9의 수준에 변화와 관련 된 우리의 이전 연구 결과 바탕으로, 우리는 또한 변화에 차동 성적 부패에서 기여 여부 요청 무부하 fibroblasts 대 확산에 진 식입니다.
사본을 안정성을 모니터 하기 위해 우리는 성적 무부하 셀 대 확산에 게놈 넓은 감퇴의 속도 결정. 이를 위해, 우리는 새로운 전사의 억제제를 소개 하 고는 개별 성적표 사라진 시간이 지남에 속도 모니터링 하 여 무부하 fibroblasts 대 확산에 감소율 모니터링. 이 방법의 장점은, 단순히 새로운 사본 합성을 억제 함으로써 전체적인 유전자 발현을 모니터링 하는 방법에 비해 우리가 된다는 것에서 그들은 속도는 별도로이 성적에 대 한 부패 속도 확인할 수 복사할 수 있습니다.
새로운 전사를 억제 하 여 사본 감소율을 결정 ActD 치료 여러 이전의 연구에 성공적으로 적용 되었습니다. ActD 프로 염증 성 cytokines5치료에 기인 하는 사본 풍부에서에 RNA 안정성의 중요성을 해 부에 사용 되었습니다. 유사한 접근은 또한 그들은 차별화 된 근육 형10채택 차별화 된 C2C12 셀 대 확산 성적 부패 속도 차이 해 부하 사용 되었습니다. 또 다른 예로, 글로벌 mRNA 반감기 또한 만능에서 발견 된 하 고 차별화 된 마우스 배아 줄기 세포11. 이 예제에서 mRNA 감퇴 사본 풍부 규제에 대 한 및 다른 셀 상태를 셀의 변환에 대 한 중요 한 표시 되었습니다.
아래 설명 된 방법을 적용, 섬유 아 세포 확산 및 무부하 상태12에 비교할 때 약 500 유전자의 사본 감소율에 변화를 발견 우리. 특히, 우리는 예측에 관한 미르 29, downregulated 무부하 셀에는 대상 셀 전환 정지 때 안정화는 발견 했다. 여기 우리 확산 및 무부하 셀에 감소율을 결정 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법론은 급속 하 게 부패 유전자에 대 한 정보는 때 두 비슷한 조건 하지만 뚜렷한 글로벌 mRNA 감퇴 속도 비교 유용 합니다. 그것은 또한 2 차원 3 차원 문화 대에서 성적 부패, 예를 들어, 셀 문화 조건의 효과 등 다른 질문을 해결 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 감소율 등 microarrays RNA 시퀀스 또는 실시간 정량 Pcr 방법 결정된 게놈 넓은 수 또는 북부 blotting 유전자, 유전자 또는 isoform에 의해 isoform 기준 감소율을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 요금은 각 모니터링된 유전자의 반감기를 계산 하 고 부패 속도 두 가지 조건에 다른 유전자를 식별 하 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>12,000 x g 및 4&deg에 도달할 수 있는 마이크로 원심분리기 튜브용 원심분리기; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아가로스 겔</td><td></td><td></td><td></td>실행용 장비</tr><tr><td>멸균 조직 배양 플레이트 및 원뿔형 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>VWR</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양을 위한 멸균 혈청학 피펫, 피펫 및 피펫 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA 분리 및 분석을</td><td></td><td></td><td></td>위한 개별 포장된 일회용 Rnase-free 피펫, 피펫 팁 및 튜브</tr><tr><td>시약 및 RNA 시료</td><td></td><td></td><td></td>취급 시 착용할 수 있는 일회용 장갑</tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td> RNase 2.0 ml eppendorf tube <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 의 작업 표면 오염 제거용<tr><td>트립신-EDTA&nbsp; 솔루션: 10X</td><td>Millipore Sigma</td><td>9002-07-07</td><td></td></tr><tr><td>Sterile PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin D</td><td>Millipore Sigma</td><td>A1410-2 mg</td><td>은 전사를 억제합니다</td></tr>. <tr><td>Sterile DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>31-761-00ML</td><td>actinomycin D</td></tr><tr><td>용 용매클로로포름</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ICN19400225</td><td>MP Biomedicals, Inc 제품</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618500</td><td>분자생물학 등급</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP28184</td><td>분자생물학 등급</td></tr><tr><td>RNase-free 글리코겐(20 mg/ml 수용액)</td><td>RNA 침전</td><td></td><td></td></tr><tr><td>을 위한 Thermo Fisher Scientific R0551 캐리어TURBO DNA-free 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1907</td>은 <td>DNase로 DNA를 제거한 다음 후속 단계에서 DNA를 비활성화하고 2가 양이온을 제거합니다</td></tr><tr><td>. Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ICN820721</td><td>MP Biomedicals, Inc 제품</td></tr><tr><td>RNA 젤용 로딩 염료</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0641</td>은 <td>변성 전기영</td></tr>동 <tr><td>Millenium RNA 마커</td>에도 적합합니다.<td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7150</td><td>RNA ladder</td></tr><tr><td>단색 RNA 스파이크인 키트</td><td>애질런트 기술</td><td>5188-5282</td><td>Agient 마이크로어레이 분석을 위한 스파이크인 제어 예시</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>분자 생물학 등급, TAE 완충액용</td></tr><tr><td>빙초산</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>TAE 완충액</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher용 Scientific</td><td>BP120-500</td><td>전기영동 등급, 겔용</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7637</td><td>분자생물학용</td></tr><tr><td>외부 RNA 제어 컨소시엄 RNA 스파이크인 믹스</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4456740</td><td>Spike-in control for RNA Seq</td></tr><tr><td>TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48개 샘플, 12개 인덱스)</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2101</td><td>RNA 염기서열분석</td></tr><tr><td>96웰 0.3ml PCR 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0600</td><td>real-time qPCR용</td></tr><tr><td>Microseal B 접착 씰</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>real-time qPCR</td></tr><tr><td>Rnase/Dnase-free 시약 저장조</td><td>VWR</td><td>89094-662</td><td>real-time qPCR</td></tr><tr><td>Rnase/Dnase-free 용 8개의 튜브 스트립 및 캡</td><td></td><td>real-time qPCR</td><td></td></tr><tr><td>을 위한 Thermo Fisher Scientific AM12230SuperScript Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18090010</td><td>for real-time qPCR</td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>real-time qPCR</td></tr></tbody></table>

확산 및 무부하 인간의 섬유 아 세포의 게놈 넓은 사본 감소율을 결정

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

정지는 임시, 가역 상태 셀 세포 분열을 중지 해야 하지만 증식 하는 능력을 유지. 우리를 포함 한 여러 연구 정지 관련 유전자 발현에 광범위 한 변화 된가 설명 했다. 이러한 변화 중 일부는 수준 또는 확산 관련 된 녹음 방송 요인 E2F MYC 등의 활동에 변화를 통해 발생합니다. 우리 mRNA 감퇴 확산 및 무부하 셀 사이의 유전자 발현에서 변화에도 기여할 수 있다 설명 했다. 이 프로토콜에서 우리 인간의 피부 포 피 섬유 아 세포의 증식 및 무부하 문화를 설정 하기 위한 절차를 설명 합니다. 우리는 다음 악티노마이신 d (ActD) 확산 및 무부하 셀에 새로운 전사를 억제 하는 절차를 설명 합니다. ActD 치료 성적 부패에서 새로운 전사 해리를 간단 하 고 재현성 접근을 나타냅니다. ActD 치료의 단점은 ActD 세포 생존 능력에 영향을 하기 때문에 시간 코스는 짧은 시간 프레임에 제한 되어야 한다입니다. 대 본 수준 사본 감소율을 확인 하려면 시간이 지남에 모니터링 된다. 이 절차는 유전자와 무부하 fibroblasts 대 확산에 차동 부패 하는 isoforms의 식별에 대 한 수 있습니다.

우리 이전 8 시간 코스12통해 확산 및 접촉 저해 기본 인간 섬유 아 세포에서 사본 감소율의 microarray 분석의 결과 보고 있다. 확산 및 접촉 저해 fibroblasts 비교 성적 안정성에 중요 한 변화는 유전자 목록이 보충 표 1에 제공 됩니다. 형광 강도 ActD 치료 후 시간 코스 이상과 시간 0에 제공 됩니다. 유전자는 ANOVA F-검정을 사용 하 여 확산 하 고 접촉 저해 조건에서 크게 다른 슬로프를가지고 유전자를 확인 하 여 목록에 포함 되었다. 유전자를 확산 하 고 무부하 fibroblasts에 다른 감소율의 예는 그림 5에 나와 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="...

우리 성적 감소율, 모니터링 및 차동 부패 유전자 식별 생성 확산 및 무부하 기본 인간 피부 섬유 아 세포 프로토콜을 설명 합니다.

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

이 절차의 전반적인 목표는 증식 및 정지 섬유아세포에서 전사체 붕괴 속도를 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 유전자 발현의 변화가 전사체 붕괴율의 변화로 인해 발생하는지 여부와 같은 분자 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전사체 풍부도뿐만 아니라 전사체 붕괴 속도에 대한 정보를 제공한다는 것입니다.프로토콜을 시작하려면 섬유아세포의 증식 및 정지 배양을 확립합니다. 증식하는 섬유아세포는 정기적으로 트립신화해야 합니다. 정지 배양은 플레이트가 규칙적인 매체 변화와 합류점에 도달하도록 함으로써 확립될 수 있습니다.모든 생물학적 복제 세포 배양 플레이트에 대해 예열된 매체 10ml에 ActD 150마이크로리터를 추가합니다. 매체 밀리리터당 15마이크로그램의 농도로 ActD를 추가합니다. 용액을 잘 섞으십시오.기존 배지를 흡인하고 ActD를 포함하는 배지를 세포에 추가합니다. 제로 타임 포인트 샘플을 수집하려면 ActD 배지와 피펫을 5-10mL의 예열된 PBS를 100mm 플레이트, 100mm 플레이트의 경우 5ml의 용액, 6웰 플레이트의 웰에는 2ml, 12웰 플레이트의 웰에는 1ml로 부드럽게 흡인합니다. PBS를 부드럽게 흡인합니다.그런 다음 페놀-구아니딘 이소티오시아네이트 용액을 조직 배양 플레이트에 직접 첨가합니다. 페놀-구아니딘 이소티오시아네이트 용액 세포 혼합물을 여러 번 위아래로 피펫팅하여 균일한 혼합물을 만듭니다. 앞에서 설명한 방법을 사용하여 적절한 시간이 경과한 후 각 시점을 수집합니다.RNA 단백질 복합체의 완전한 용해를 보장하기 위해 실온에서 샘플을 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 사용된 방법론으로 검출할 수 있는 스파이크인 제어 전사체를 소개합니다. 이러한 대조군을 알려진 양과 농도로 각 샘플에 도입합니다.피펫을 사용하여 페닐구아니딘 이소티오시아네이트 용액 혼합물을 2.0ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 사용되는 페닐 구아니딘 이소 티오 시아네이트 용액 1 밀리리터마다 페닐 구아니딘 이소 티오 시아네이트 용액 혼합물에 0.2 밀리리터의 클로로포름을 첨가한다. 마이크로 원심분리기 튜브를 15초 동안 세게 흔든 다음 클로로포름 페닐구아니딘 이소티오시아네이트를 배양합니다.배양 후에, 12, 000 시간 g에 4 섭씨 온도에 20 분 동안 견본을 회전시키십시오. 샘플은 세 개의 층으로 분리되어야 합니다. 마이크로피펫을 사용하여 수성층을 새로운 2.0ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 이 과정에서 계면을 방해하지 않도록 주의하십시오.계면 및 유기 분획을 폐기합니다. 그런 다음 수성 분획에 동일한 부피의 2-프로판올을 첨가하고 튜브를 10회 반전시킵니다. 특히 수율이 낮을 것으로 예상되는 경우 샘플 20마이크로리터당 20밀리그램 당 20밀리그램을 최대 1마이크로리터까지 추가합니다.샘플을 실온에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후 샘플을 회전시킵니다. 스핀이 끝날 때 RNA가 침전되어 튜브 바닥에 펠릿을 형성했는지 확인하십시오.피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 버리고 흰색 RNA 펠릿을 방해하지 않도록 특별히주의하십시오. 펠릿을 세척하기 위해 페닐구아니딘 이소티오시아네이트 용액 시약 1밀리리터당 75% 에탄올 1밀리리터를 첨가합니다. 12, 000 시간 g에 10 분 동안 샘플을 회전시킵니다.대부분의 상등액을 제거한 후 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 에탄올을 제거하되 펠릿을 방해하지 마십시오. 샘플을 회전시켜 모든 초과 에탄올을 펠릿화합니다. RNA 펠릿은 이 단계에서 덜 조밀하고 움직이는 경향이 있습니다.탈수 후 펠릿을 방해하지 않고 튜브에서 과도한 에탄올을 모두 제거하십시오. RNA 펠릿을 5분 동안 자연 건조시킵니다. RNA 펠릿에 50마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 추가하고 펠릿을 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁합니다.DNA를 제거하고 그 후에 Deanase 및 양이온을 비활성화하기 위하여 1마이크로리터 Deanase의 표본을 대우하십시오. RNA 샘플을 섭씨 영하 80도의 2.0ml 마이크로 원심분리기 튜브에 보관하십시오. 분광광도계를 사용하여 RNA를 정량화하고 RNA의 순도를 확인합니다.순도를 확인한 후 1% 아가로스 겔로 RNA를 분석하여 분해 정도를 시각화합니다. 18S 및 28S rRNA를 나타내는 두 개의 투명한 띠가 명확하게 보여야 합니다. 이러한 띠가 보이지 않으면 RNA가 분해될 수 있습니다.다음으로, Real-Time qPCR을 사용하여 스파이크인 내부 표준물질과 비교하여 RNA의 수집 분취액에서 전사체 존재량을 모니터링합니다. 마이크로어레이, RNA 염기서열분석 또는 노던 블롯도 사용할 수 있습니다. 시간 경과에 따른 형광 강도는 유전자 발현에 해당합니다.섬유아세포는 접촉 억제 상태가 되는 반면, 상처 치유 중에 축적된 세포외 기질을 생성하는 데 매우 중요한 유전자인 전사체를 암호화하는 콜라겐 3A1은 더 안정되고 빠르게 부패하지 않습니다. 페놀로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 피부에 닿지 않도록 하는 것이 중요하다는 것을 잊지 마십시오. 이 비디오를 시청한 후에는 증식 및 정지 섬유아세포에서 전사체 붕괴 속도를 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.전사체 붕괴율의 변화는 유전자 삼각 측량의 중요한 메커니즘이 될 수 있습니다.

determining-genome-wide-transcript-decay-rates-proliferating

Research

연구

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Genetics

유전학

우리는 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)와 배아 줄기 (ES) 세포에서 염색질 단백질 역학을 모니터 (플립) Photobleaching에서 형광 손실을 포함하여 photobleaching 방법을 설명합니다. 염색질 소성을 연구하는 방법 중 하나가 될 것으로 간주됩니다 염색질 단백질 역학은, pluripotent 세포 향상됩니다.

배아 줄기 세포 생활에서 염색질 단백질 역학을 측정하는 Assays (FRAP 및 플립)를 Photobleaching

RNA 효소 II transcriptional 운동은 살아있는 세포에서 특정 유전자를 측정합니다. 관심의 유전자에서 베꼈는데 mRNAs는 찬란 태그와 (FRAP) transcriptional 신장의 생체내 반응 속도론에있는가를 얻을 수있다 Photobleaching 후 형광 복구를 사용하고 있습니다.

싱글 생활 세포에서 mRNA의 전사의 속도론을 측정

전체 세포 RN​​A 단기 RNA 합성과 붕괴의 변화뿐만 아니라 RNA 처리 속도론을 연구 가난한 템플릿을 제공합니다. 여기에, 우리는 4 thiouridine에 새로 전사 RNA의 대사 라벨을 설명하는 이러한 한계를 극복 할 수 있도록 새로 전사 RNA의 싸이 특정 biotinylation 및 정제에 의해 따랐다.

세포 배양에서 RNA 합성, 처리 및 부패의 높은 해상도 유전자 발현 프로파일에 대한 새로 전사 RNA 대사 라벨링

특정의 mRNA의 정상 수준은 mRNA의 합성과 부패의 속도에 의해 결정된다. 전체 게놈 mRNA의 분해율 또는 특정의 mRNA 붕괴 속도는 mRNA의 반감기를 측정함으로써 측정 할 수있다. 이 프로토콜은 사카로 미세스 세 레비 시아에서 mRNA의 붕괴 속도의 측정에 초점을 맞추고있다.

mRNA의 붕괴 요금의 측정에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em사용&gt;<em&gt; rpb1-1</em&gt; 균주

이 프로토콜에서는 단백질 반감기 하나의 살아있는 부착 세포, 펄스 라벨 및 스냅인 태그 융해 단백질의 형광 시간 경과 이미징 사용 하 여 결정 하는 방법을 설명 합니다.

부착 세포 배양에서 시간 경과 형광 현미경 검사 법에 의해 단백질 저하의 단일 셀 정량화

Neurodevelopmental 처리와 같은 확산, 마이그레이션, neurite 결과 종종 정신병 질환에 불안정 합니다. 따라서, 우리가 현재의 빠르게 그리고 reproducibly 인간의 iPSC 파생 된 NPCs에서 이러한 neurodevelopmental 프로세스를 평가 하는 프로토콜. 이러한 프로토콜은 또한 NPC 개발에 관련 된 성장 인자와 치료의 효과의 평가 허용 한다.

인간의 신경 선구자 세포 (Npc)에서 Neurodevelopmental 고기의 신속한 감지

이 프로토콜 칩 seq, 4sU-seq, seq-총 RNA, 리보솜 세포 선 및 1 차 셀에 대 한 프로 파일링의 조합 사용을 설명 합니다. 전사-요소 바인딩, 드 노 보 전사, RNA 가공, 회전율 및 시간이 지남에, 번역 활성화 및 급변 셀에서 이벤트의 전체 과정을 표시 하 고 변경 내용을 추적을 수 있습니다.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

여기서, 우리는 파이펫 전기화 기술에 결합된 유도성 발현 시스템을 이용하여 1차 폐포 상피 세포에서 전사체의 전사체의 후전사 변조를 연구하는데 사용될 수 있는 도구를 제시한다.

1 차적인 폐포 상피 세포에 있는 mRNA 전사체의 안정성의 조사를 위한 능률적으로 통제된 플라스미드 발현 시스템

이 프로토콜은 펄스 SILAC를 사용한 노화 및 비분열 세포의 대사 표지, 비표적 질량 분석법 분석 및 단백질 반감기의 간소화된 계산을 위한 워크플로우를 설명합니다.

대사 표지 및 질량 분광법으로 노화 및 비분할 배양된 세포에서의 단백질 회전율 측정

이 프로토콜은 악티노마이신 D 처리, RT-qPCR, 비선형 회귀분석을 사용하여 마우스 배아 줄기세포 내 유전자 간 및 유전자 내 강화자 RNA의 안정성과 반감기를 정량적으로 측정합니다. 위치별 정규화 전략이 eRNA 붕괴 역학을 맥락 의존적으로 정확하게 모델링하기 위해 도입됩니다.

마우스 배아 줄기세포에서 증강제 RNA 안정성의 최적화된 정량적 평가

이 논문은 IMR-90 인간 섬유아세포에서 노화 과정에서 리소좀 재형성을 측정하기 위한 생세포 LysoTracker 프로토콜을 제시합니다.

인간 섬유아세포의 세포 노화 정량 평가를 위한 LysoTracker를 이용한 리소좀 프로파일링

학습하세요 증식 및 정지 상태 인간 진피 섬유아세포에서 전사체 감소율을 측정하는 방법을. 이 기법은 유전자 발현 역학과 전사체 안정성 연구에 활용됩니다.

확산 및 무부하 인간의 섬유 아 세포의 게놈 넓은 사본 감소율을 결정

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