확산 및 무부하 인간의 섬유 아 세포의 게놈 넓은 사본 감소율을 결정

이 절차의 전반적인 목표는 증식 및 정지 섬유아세포에서 전사체 붕괴 속도를 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 유전자 발현의 변화가 전사체 붕괴율의 변화로 인해 발생하는지 여부와 같은 분자 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전사체 풍부도뿐만 아니라 전사체 붕괴 속도에 대한 정보를 제공한다는 것입니다.

프로토콜을 시작하려면 섬유아세포의 증식 및 정지 배양을 확립합니다. 증식하는 섬유아세포는 정기적으로 트립신화해야 합니다. 정지 배양은 플레이트가 규칙적인 매체 변화와 합류점에 도달하도록 함으로써 확립될 수 있습니다.

모든 생물학적 복제 세포 배양 플레이트에 대해 예열된 매체 10ml에 ActD 150마이크로리터를 추가합니다. 매체 밀리리터당 15마이크로그램의 농도로 ActD를 추가합니다. 용액을 잘 섞으십시오.

기존 배지를 흡인하고 ActD를 포함하는 배지를 세포에 추가합니다. 제로 타임 포인트 샘플을 수집하려면 ActD 배지와 피펫을 5-10mL의 예열된 PBS를 100mm 플레이트, 100mm 플레이트의 경우 5ml의 용액, 6웰 플레이트의 웰에는 2ml, 12웰 플레이트의 웰에는 1ml로 부드럽게 흡인합니다. PBS를 부드럽게 흡인합니다.

그런 다음 페놀-구아니딘 이소티오시아네이트 용액을 조직 배양 플레이트에 직접 첨가합니다. 페놀-구아니딘 이소티오시아네이트 용액 세포 혼합물을 여러 번 위아래로 피펫팅하여 균일한 혼합물을 만듭니다. 앞에서 설명한 방법을 사용하여 적절한 시간이 경과한 후 각 시점을 수집합니다.

RNA 단백질 복합체의 완전한 용해를 보장하기 위해 실온에서 샘플을 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 사용된 방법론으로 검출할 수 있는 스파이크인 제어 전사체를 소개합니다. 이러한 대조군을 알려진 양과 농도로 각 샘플에 도입합니다.

피펫을 사용하여 페닐구아니딘 이소티오시아네이트 용액 혼합물을 2.0ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 사용되는 페닐 구아니딘 이소 티오 시아네이트 용액 1 밀리리터마다 페닐 구아니딘 이소 티오 시아네이트 용액 혼합물에 0.2 밀리리터의 클로로포름을 첨가한다. 마이크로 원심분리기 튜브를 15초 동안 세게 흔든 다음 클로로포름 페닐구아니딘 이소티오시아네이트를 배양합니다.

배양 후에, 12, 000 시간 g에 4 섭씨 온도에 20 분 동안 견본을 회전시키십시오. 샘플은 세 개의 층으로 분리되어야 합니다. 마이크로피펫을 사용하여 수성층을 새로운 2.0ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 이 과정에서 계면을 방해하지 않도록 주의하십시오.

계면 및 유기 분획을 폐기합니다. 그런 다음 수성 분획에 동일한 부피의 2-프로판올을 첨가하고 튜브를 10회 반전시킵니다. 특히 수율이 낮을 것으로 예상되는 경우 샘플 20마이크로리터당 20밀리그램 당 20밀리그램을 최대 1마이크로리터까지 추가합니다.

샘플을 실온에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후 샘플을 회전시킵니다. 스핀이 끝날 때 RNA가 침전되어 튜브 바닥에 펠릿을 형성했는지 확인하십시오.

피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 버리고 흰색 RNA 펠릿을 방해하지 않도록 특별히주의하십시오. 펠릿을 세척하기 위해 페닐구아니딘 이소티오시아네이트 용액 시약 1밀리리터당 75% 에탄올 1밀리리터를 첨가합니다. 12, 000 시간 g에 10 분 동안 샘플을 회전시킵니다.

대부분의 상등액을 제거한 후 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 에탄올을 제거하되 펠릿을 방해하지 마십시오. 샘플을 회전시켜 모든 초과 에탄올을 펠릿화합니다. RNA 펠릿은 이 단계에서 덜 조밀하고 움직이는 경향이 있습니다.

탈수 후 펠릿을 방해하지 않고 튜브에서 과도한 에탄올을 모두 제거하십시오. RNA 펠릿을 5분 동안 자연 건조시킵니다. RNA 펠릿에 50마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 추가하고 펠릿을 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁합니다.

DNA를 제거하고 그 후에 Deanase 및 양이온을 비활성화하기 위하여 1마이크로리터 Deanase의 표본을 대우하십시오. RNA 샘플을 섭씨 영하 80도의 2.0ml 마이크로 원심분리기 튜브에 보관하십시오. 분광광도계를 사용하여 RNA를 정량화하고 RNA의 순도를 확인합니다.

순도를 확인한 후 1% 아가로스 겔로 RNA를 분석하여 분해 정도를 시각화합니다. 18S 및 28S rRNA를 나타내는 두 개의 투명한 띠가 명확하게 보여야 합니다. 이러한 띠가 보이지 않으면 RNA가 분해될 수 있습니다.

다음으로, Real-Time qPCR을 사용하여 스파이크인 내부 표준물질과 비교하여 RNA의 수집 분취액에서 전사체 존재량을 모니터링합니다. 마이크로어레이, RNA 염기서열분석 또는 노던 블롯도 사용할 수 있습니다. 시간 경과에 따른 형광 강도는 유전자 발현에 해당합니다.

섬유아세포는 접촉 억제 상태가 되는 반면, 상처 치유 중에 축적된 세포외 기질을 생성하는 데 매우 중요한 유전자인 전사체를 암호화하는 콜라겐 3A1은 더 안정되고 빠르게 부패하지 않습니다. 페놀로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 피부에 닿지 않도록 하는 것이 중요하다는 것을 잊지 마십시오. 이 비디오를 시청한 후에는 증식 및 정지 섬유아세포에서 전사체 붕괴 속도를 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

전사체 붕괴율의 변화는 유전자 삼각 측량의 중요한 메커니즘이 될 수 있습니다.