부착 세포 배양에서 시간 경과 형광 현미경 검사 법에 의해 단백질 저하의 단일 셀 정량화

이 프로토콜에서는 단백질 반감기 하나의 살아있는 부착 세포, 펄스 라벨 및 스냅인 태그 융해 단백질의 형광 시간 경과 이미징 사용 하 여 결정 하는 방법을 설명 합니다.

이 형광 이미징 접근법의 전반적인 목표는 SNAP 태그를 사용하여 살아있는 단일 세포에서 관심 단백질의 반감기를 결정하는 것입니다. 세포 단백질은 각 단백질에 대해 특이적인 합성 및 분해 속도로 광범위하게 전환되며 생리학적 조절의 대상이 됩니다. 그러나 단백질 반감기를 측정하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법은 이 세포의 집단 평균으로 제한되거나 단백질 합성 억제제의 사용이 필요합니다.

이 동영상에서는 SNAP 태그를 형광 타임 랩스 현미경 검사와 함께 사용하여 살아있는 세포의 단백질 반감기를 측정하는 방법을 보여줍니다. 이 방법의 장점은 단일 세포 분해능을 달성하므로 배양된 세포 집단에서 반감기의 이질성에 대한 추정치를 제공한다는 것입니다. 여기에 제시된 실험 절차는 SNAP-tag에 융합된 관심 단백질을 발현하는 모든 유형의 부착 배양 세포에 적용할 수 있습니다.

이는 내인성 단백질 태깅(endogenous protein tagging) 또는 태깅된 단백질의 과발현(over-expression)을 사용하여 달성할 수 있습니다. SNAP-tag는 DNA 복구 효소인 O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase의 돌연변이 버전으로, 분자 프로브에 결합할 수 있는 benzylguanine과 특이적으로 반응합니다. 그러므로, 어떤 SNAP 꼬리표 융합 단백질든지 형광 세포 투과성 염료로 비가역적으로 표지될 수 있습니다.

잔류 염료가 씻겨 나오면 표지된 단백질 집단은 기하급수적으로 감소하고 해당 단백질의 반감기를 추론할 수 있습니다. 이 비디오에서는 배아 줄기 세포를 사용하는데, 이 세포는 젤라틴으로 코팅된 접시에서 고전적으로 자랄 때 촘촘한 군체를 형성합니다. 세포의 단층으로 성장하여 형광 이미징 실험을 위한 단일 세포 해상도를 달성하기 위해 원형질막에서 발현된 세포 inc 부착에 의해 매개되는 세포 간 상호 작용을 줄이는 inc 접착 코팅 플레이트에서 배양했습니다.

PBS에서 마이크로리터당 5나노그램으로 접착하는 재조합 inc를 희석하고 이미징에 적합한 96 밸브 플레이트에 밸브당 부착된 30마이크로리터의 희석된 inc를 추가합니다. 재조합 inc 부착은 매우 취약하므로 광범위한 피펫팅을 피하십시오. 37도에서 1시간 30분 동안 배양합니다.

inc 부착 용액을 흡인하고 100마이크로리터의 PBS로 한 번 세척한 다음 최대 200마이크로리터의 사전 웜화된 ESL 배양 배지를 추가합니다. SNAP 태그에 융합된 관심 단백질을 발현하는 ESL 라인을 사용합니다. PBS 5ml로 세포를 씻으십시오.

그런 다음 Tripson 2ml를 넣고 37도에서 4분 동안 배양합니다. ESL 배양 배지 4ml를 넣고 다시 현탁한 다음 1000T에서 4분 동안 스핀다운합니다. 상층액을 흡인하고 새로운 배지에 다시 현탁하고 세포를 계수합니다.

좌석 30, inc 고착 입히는 화상 진찰 판에 있는 평방 센티미터 당 000의 세포. cell sitting 후 24시간 후에 SNAP dye 염색을 진행합니다. ELS 배양 배지에서 세포 염료를 이전에 결정된 최적 농도로 희석합니다.

피펫을 사용하여 배지를 흡입하고 희석된 SNAP 염료 50마이크로리터를 조심스럽게 추가합니다. 37도에서 30분 동안 배양합니다. 염료를 흡입하고 200마이크로리터의 pre-worm PBS로 3회 세척합니다.

200마이크로리터의 ESL 배양 배지를 넣고 37도에서 15분 동안 배양합니다. 세척 단계는 부드럽게 피펫으로 세척하며, 세포가 쉽게 분리되는 경향이 있으므로 자동 흡입기를 사용하지 마십시오. 동일한 세척 단계를 두 번 더 반복한 다음 200마이크로리터의 이미징 매체를 추가합니다.

페놀 레드 프리 배지를 사용하여 형광 배경을 줄입니다. 온도와 CO2를 제어할 수 있는 현미경을 사용하십시오.사용하기 전에 온도를 37도로 설정하고 CO2를 5%로 설정하고 1-2시간 동안 평형을 유지합니다.

플레이트를 현미경에 놓고 이미징에 적합한 지점을 선택합니다. 명시야 이미지는 단층으로 코팅된 접시를 부착하는 INC에 부착된 ESL을 보여줍니다. 목표를 선택하면 20X 목표가 이 크기의 ESL에 적합합니다.

기록할 형광 채널의 조명 설정을 선택합니다. 영화가 진행됨에 따라 감소하므로 강한 신호를 얻기 위해 레이저 출력과 노출을 조정하십시오. 타임랩스 실험에 대한 획득 매개변수를 선택합니다.

2-20시간의 예상 반감기를 가진 단백질의 경우 15분의 시간 간격으로 12-24시간의 수집 시간을 선택하십시오. 이미징 실험을 시작합니다. FIJI 소프트웨어를 사용하여 영화를 처리하고 분석합니다.

획득한 이미지를 스택으로 수집하고 변형합니다. 배경 빼기 FIJI 함수를 사용하여 스택의 모든 그림에서 배경을 제거합니다. 관심 셀을 선택하고, FIJI 도구 모음을 사용하여 그 주위에 관심 영역을 그리고, 관심 영역을 ROI Manager에 추가합니다.

다음 프레임으로 진행하여 이전 작업을 반복합니다. 동영상이 진행되는 동안 관심 있는 셀을 따라가면서 추적된 각 셀에 대한 ROI 세트를 저장합니다. 측정값을 클릭하여 평균 강도와 ROI의 면적에 대한 값을 구합니다.

로컬 배경을 추정하려면 각 시간 프레임에 대해 관심 셀에 가까운 관심 영역을 추가합니다. 마지막으로 측정값을 클릭하여 평균 배경 강도에 대한 값을 구합니다. 먼저, 세포 ROI의 평균 강도에 대해 얻은 값과 해당 면적을 곱하여 세포의 평균 강도를 계산합니다.

그런 다음 배경 ROI의 평균 강도와 세포 ROI의 면적을 곱하여 셀의 통합 배경 값 계산을 진행합니다. 마지막으로, 세포의 통합 강도에 대한 배경 보정된 값을 얻기 위해, 통합 세포 강도 값에서 통합 배경 강도 값을 뺍니다. 세포 집단의 평균 반감기를 얻으려면 얻어진 값을 각 세포에 대한 첫 번째 프레임의 강도 값으로 정규화합니다.

이것은 각 세포가 절대 형광 강도와 독립적으로 평균 반감기 값에 동일한 무게로 기여하도록 합니다. 세포 분열 후 두 딸 세포를 개별적으로 추적하고 배경 빼기 후 통합 강도를 합산하여 세포 분열 중 단백질 희석을 설명합니다. 두 딸 세포에 대한 ROI 세트를 저장합니다.

단백질 반감기를 추정하려면 MATLAB의 곡선 피팅 툴을 사용하십시오. 단백질 붕괴는 지수를 따르며, 여기서 F(x)는 주어진 시점의 형광 강도, a"는 초기 강도, b는 붕괴 속도입니다. 적합에서 붕괴율 b"에 대한 값을 얻은 후, 반감기는 2의 로그를 b"로 나누어 계산할 수 있습니다.이 동영상은 doxycycline에서 사용할 수 없는 opt four SNAP-tag 융합 세포주에서 SNAP 염료 형광의 붕괴를 보여줍니다.

관찰된 형광 신호는 사용된 세포주, 관심 단백질의 발현 수준, 사용되는 염료의 특성에 따라 달라집니다. 단백질 붕괴 실험의 경우 적절한 SNAP 염료 농도를 사용하는 것이 중요합니다. 농도는 타임랩스가 시작될 때 밝은 형광 신호를 생성할 수 있을 만큼 충분히 높아야 합니다.

그러나 너무 높은 염료 농도를 사용하면 세척 후에도 배지에 잔류 염료가 남을 수 있습니다. 유리 염료는 영화가 진행되는 동안 새로 생성된 SNAP 태그 분자에 결합할 수 있으며, 이는 붕괴 곡선을 왜곡시킬 수 있습니다. 따라서 다양한 희석액을 테스트하여 SNAP 염료 농도를 최적화하는 것이 중요합니다.

이 그림은 독시사이클린(doxycycline)을 사용할 수 없는 세포주에서 테스트한 형광 SNAP 염료의 8가지 농도에 대한 붕괴 곡선을 보여줍니다. 라이브 셀 이미징을 위한 제조업체 지침에 따라 3마이크로몰의 초기 염료 농도를 선택하고 1.4 나노몰의 농도에 도달할 때까지 1 내지 3의 연속 희석을 수행했습니다. 가장 높은 두 농도의 경우 신호가 감소하지 않는 반면, 관찰된 감쇠는 낮은 농도의 경우 지수 곡선을 따릅니다.

이 예에서는 12 나노 몰의 최적 농도가 선택되었는데,이 농도는 세척 후 매체에 남아있는 잔류 염료의 최소량을 보장하지만 형광 신호는 여전히 명확한 붕괴 곡선을 관찰 할 수있을만큼 충분히 밝습니다. 설명된 프로토콜은 SNAP-tag에 융합된 주어진 단백질에 대한 세포 간 변동성 및 반감기의 추정치를 제공합니다. 이 그림은 단일 세포 붕괴와 3개의 서로 다른 독시사이클린 사용 불가 SNAP-tag 융합 세포주에 대한 집단 평균을 보여줍니다.

Nanog"및 Oct4"는 평균 반감기가 2.9 및 4.8 시간으로 다소 짧습니다. 반면 Srsf11"은 평균 반감기가 25.3시간으로 더 오래 지속됩니다. 상자 그림은 세 단백질에 대한 반감기의 분포를 보여줍니다.

우리는 형광 시간 경과 현미경 검사법과 함께 SNAP 태그의 사용이 관심 단백질의 반감기를 결정할 수 있음을 보여주었습니다. 단일 세포 붕괴 측정은 세포 집단에서 반감기의 이질성에 대한 추정치를 제공하며, 이는 단백질 반감기를 결정하기 위해 다른 방법을 사용할 때 생략됩니다. SNAP 태그를 사용하여 단백질 붕괴를 모니터링할 때 가장 중요한 단계 중 하나는 세척 후 배지 또는 세포에 결합되지 않은 염료가 남아 있지 않은지 확인하는 것입니다.

그렇지 않으면 나중에 실험 과정에서 새로 생성된 SNAP 태그 분자에 결합하여 붕괴 곡선을 손상시킬 수 있습니다. 이것은 한편으로 설명된 모든 세척 단계를 주의 깊게 수행함으로써 달성됩니다. 반면에 SNAP 염료 농도는 양호한 신호 대 잡음비를 얻을 수 있는 범위에 있는 동안 가능한 한 낮게 유지되어야 합니다.

SNAP 염료 농도는 세포주와 사용되는 염료 유형에 따라 각 실험에 대해 최적화되어야 합니다. SNAP-tag가 일부 경우에 후보 단백질의 반감기를 변경할 수 있지만, 후보 단백질 테스트의 결정된 반감기가 발표된 값과 밀접하게 일치하기 때문에 이러한 효과에 대한 증거는 없습니다. 단백질 분해에 대한 SNAP-tag의 영향을 추가로 배제하기 위한 한 가지 옵션은 시클로헥시미드로 단백질 합성을 차단하고 토착 단백질을 인식하는 항체를 사용하여 다른 시점에서 화장실 블롯을 수행하는 것입니다.

그리고 SNAP-tag 후보 단백질의 붕괴를 태그가 지정되지 않은 토착 버전과 직접 비교합니다.