Name: 부착 세포 배양에서 시간 경과 형광 현미경 검사 법에 의해 단백질 저하의 단일 셀 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 배우세요 부착 세포 배양에서 SNAP-Tag와 형광 현미경을 이용한 단백질 반감기 측정법을. 단일 세포 수준에서 단백질 동역학을 정량화하여 세포 집단 내 이질성을 분석할 수 있습니다.

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시간 경과 현미경 실험에는 바이오 검사 시설 (BSF), EPFL을 수행 했다. 우리는 videography 및 영화 편집을 위한 마크 Delachaux (서비스 Audiovisuel, EPFL) 감사 합니다.

참고:이 연구에서 E14 ES 세포 라인 사용 되었다. 그러나,이 프로토콜 어떤 다른 마우스 ES 세포 라인 생 단백질을 태그 하거나 overexpression를 사용 하 여 스냅인 태그에 융합 하는 관심사의 단백질을 표현에 직접 적용 됩니다. Doxycycline 유도할 수 있는 스냅인 태그 퓨전 셀 라인 사용한 결과 섹션에 표시 된 예제에 대 한 (다음 단백질을 융합 하는 스냅-태그: Nanog, Oct4, Srsf11, 또는 형광 단백질 mOrange2 및 sfGFP, 및의 통제에 넣어 한 doxycycline 유도할 수 있는 발기인. 참조 대 한 자세한 내용은11 doxycycline 유도할 수 있는 스냅인 태그 퓨전 셀 라인의 생성에 사용 되는 플라스 미드에). Doxycycline 유도할 수 있는 시스템은 특히 유용할 수 있습니다, 그것은 밀접 하 게 제어 하는 타이밍 및 관심사의 단백질의 식의 강도 대 한 수로. 스냅-태그의 C-터미널 위치는 것이 좋습니다, 그리고 N 맨끝 변경 아미노산 시퀀스는 대상 단백질 (N-엔드 규칙12)의 반감기를 변경할 가능성이 더.
1. E-cadherin 코팅 및 셀 시드
<ol><li>스냅인 태그4를 융합 하는 관심사의 단백질을 표현 하는 ES 세포 라인을 생성 합니다.</li>
	<li>코트 100 mm 셀 문화 요리 4 mL의 0.1% 젤라틴 (Ca2 +/Mg2 +없이 버퍼링 인산 염 분 (PBS)에 희석) 1 헤에 대 한 젤라틴을 제거 및 1 h. 사용에 대 한 건조 즉시 하거나 최대 2 개월까지 코팅된 접시를 저장.</li>
	<li>ES 세포 배양 매체 (글래스고 최소 필수 보통 10 %ES 세포 자격 태아 둔감 한 혈 청, 2mm 나트륨 pyruvate, 1% 비 본질적인 아미노산, 1% 페니실린/스, 2 mM L-글루타민, 100 µ M 2-보충의 셀 라인을 성장 mercaptoethanol, 백혈병 금지 요인 (LIF), 3 µ M CHIR99021 및 0.8 µ M PD184352) 젤라틴 코팅 요리 접시 당 10-20 미 오 셀의 합류를 도달할 때까지 2 일 동안 37 ° C, 5% CO2 . 참고: 여기, LIF HEK 293T 세포, 표면에 뜨는 수집 및 필터링의 과도 transfection에 의해 제작 되었다. LIF의 각 배치 pluripotency를 유지 하기 위해 그것의 잠재력에 대 한 테스트를 했다 하지만 농도 결정 하지 했다. 그러나, 재조합 형 LIF 또한 상업적으로 사용할 수 있으며 마우스 ES 세포 배양에 대 한 일반적으로 사용 되는 농도 1000 단위/mL13.</li>
	<li>96 잘 접시 재조합 마우스의 30 µ L로 잘 (5 ng / µ L, 캘리포니아2 +/Mg2 +PBS에 희석 당 전자 cadherin Fc 키메라 단백질 (E-cad-Fc) 이미징에 대 한 적합 한 코트. 사용 하 여 재고 농도 100 ng / µ L,-80 ° C에 저장). 전자 cad Fc은 매우 깨지기 쉬운 광범위 한 pipetting 하지 마십시오. 1.5 h 37 ° C에서 품 어. 참고: 현미경에 따라 다른 형식은 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>전자 cad Fc를 발음 하 고 캘리포니아2 +/Mg2 +, PBS의 100 µ L로 한 번 씻어 미리 따뜻하게 ES 세포 배양 매체의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>없이 Ca2 +/Mg2 +PBS의 5 mL와 관심사의 세포를 씻어. 발음 하 고 0.25% Trypsin EDTA의 2 개 mL를 추가 합니다. 37 ° c.에 4 분 동안 품 어 ES 세포 배양 매체의 4 개 mL를 추가, resuspend 그리고 4 분 Aspirate는 상쾌한 1000 x g에서 스핀 다운 신선한 ES 세포 배양 매체의 2 mL에 펠 릿을 resuspend. 참고: 없이 Ca2 +/Mg2 + PBS 한다 사용할 수 세척 trypsinization 전에 세포에 세포 접착에 필요한 캘리포니아2 + 이온을 제거 하기 위해. 반면, 전자 cad Fc 희석 및 코팅 (1.4 단계), PBS를 사용 하 여 Ca2 +/Mg2 +, 전자 cad Fc를 ES 세포의 접착 이후 코팅된 요리는 캘리포니아2 +-종속14.</li>
	<li>ES 세포 배양 매체 및 횟수, 세 실 (0.1 m m 깊이의 챔버에 대 한 부하 10 µ L)를 사용 하 여 1 ml resuspended 셀 1시 10분 희석.</li>
	<li>전자 cad Fc에서 시드 30000 셀/cm2 이미징 플레이트 코팅. ES 세포 배양 매체에 잘 당 최대 200 µ L 채우십시오. Doxycycline 유도할 수 있는 셀 라인, doxycycline의 적절 한 복용량으로 유도 (복용량과 사전에 유도의 타이밍 최적화. 여기에 사용 되는 셀 라인 치료 했다 500 ng/mL doxycycline 이미징 하기 전에 24 시간으로). 37 ° C, 5% CO2 incubate 고 라벨 및 셀 시드 후 24 h를 이미징 펄스와 함께 진행 합니다.</li>
</ol>2. 펄스 스냅인 태그 라벨
참고: 단백질 부패 실험에 대 한 그것은 적절 한 스냅 염료 농도 사용 하 여 중요 한입니다. 농도, 시간 경과의 시작 부분에 밝은 신호를 충분히 높은 해야로 형광 시간이 지남에 저하 됩니다. 그러나, 너무 높은 염료 농도 사용 하 여 세척 후에 매체에 또는 셀에 남아 잔류 염료를 발생할 수 있습니다. 무료 염료 수 이후에 바인딩할 새로 생산된 스냅인 태그 분자 감퇴 곡선 왜곡 됩니다 동영상의 과정을 통해. 관찰 된 형광 신호는 해당 단백질 식 수준 뿐만 아니라 염료, 사용, 셀 라인의 속성에 따라 달라 집니다. 따라서, 테스트 다른 희석, 희석 제조업체가 라이브 셀 이미징에 대 한 제안에서 시작 하 여 염료 농도 최적화 하기 위해 결정적 이다. 이 연구를 위해 빨강 형광 기판 사용 되었다. 12의 최적 농도 nM doxycycline 유도할 수 있는 overexpression 셀 라인에 대 한 결정 했다.
<ol><li>미리 데워 진된 ES 세포 배양 매체에 적절 한 농도에 스냅 염료 희석. 부드럽게 96 잘 접시에 시드 이전 세포에서 매체를 제거 하는 피 펫을 사용 하 고 잘 당 희석된 스냅 염료의 50 µ L를 추가 합니다. 37 ° c.에 30 분 동안 품 어</li>
	<li>피 펫과 희석된 염료를 발음 하 고 미리 데워 공영 (없이 캘리포니아2 +/Mg2 +)의 200 µ L 3 x를 씻어. ES 세포 배양 매체의 200 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 15 분 동안 품 어</li>
	<li>이전 세 단계를 두 번 더 반복 합니다. 참고: 광범위 한 세척은 어떤 언바운드 염료를 제거 하기 위해 중요 합니다. PBS 가진 반복된 세척 단계 15 분 외피 강력한 이미징 실험을 시작 하기 전에 스냅인 태그 융해 단백질의 라벨을 확인 하는 반면, 매체에서 잔여 extracellular 염료를 제거 합니다. 그러나, 부드러운 pipetting으로 세척 단계를 수행 하 고 셀 전자 cad Fc에 시드 쉽게 분리 하는 경향이 자동 흡 인기를 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>영상 매체의 200 µ L를 추가 합니다. 줄이기 위해 형광 배경, 페 놀 레드 무료 매체를 사용 하 여 (보충 10 %ES 세포 자격 태아 둔감 한 혈 청, 2mm 나트륨 pyruvate, 1% 비 본질적인 아미노산, 1% 페니실린/스, 2 m m L-글루타민, 100 µ M 2-mercaptoethanol, LIF, 3 µ M CHIR99021 및 0.8 µ M PD184352).</li>
</ol>3. 시간 경과 현미경
<ol><li>라이브 영상, 제어 온도 CO2를 위해 적당 한 현미경을 사용 합니다. 설정 온도 37 ° C, 5% CO2 를 사용 하 고 1-2 h에 대 한 equilibrate를 허용 하기 전에.</li>
	<li>접시를 현미경에 놓고 이미징에 대 한 적합 한 장소를 찾을 합니다. 관광 명소 어디 세포는 균등 하 게 분산, 하지만 너무 조밀한,이 분석을 용이 하 게 합니다를 선택 합니다. 분석에 필요한 셀의 수 선택 된 관광 명소의 수를 조정 합니다. 이 연구에서는 셀 라인 당 3-5 관광 명소를 기록 했다.</li>
	<li>목표를 선택 합니다. 20 X 목표는 ES 세포의 크기에 적합 합니다.</li>
	<li>기록 형광 채널에 대 한 조명 설정을 선택 합니다. 레이저 파워 및 관심사의 세포에서 형광 신호 강도 따라 노출 조정 합니다. 하지만, 영화의 과정을 통해 감소, phototoxicity 및 photobleaching을 최소화 하기 위해 30% 보다 높은 레이저 능력을 방지 이후 강한 초기 신호를 얻을 수 있는지 확인 합니다. 이 연구, 632/22 여기 필터에 대 한 nm (파장/대역), 679/34의 방출 필터 nm (파장/대역), 100 ms의 10% 및 노출 시간의 레이저 파워를 사용 했다.</li>
	<li>이미징 간격 및 시간 경과 실험 기간을 선택 합니다. 2-20 h의 예상된 반감기와 단백질에 대 일 분의 시간 간격으로 12-24 h의 수집 시간을 선택 합니다. Shorter-lived 단백질에 대 한 간격 및 수집 시간을 최소로 단백질 증가에 따라 줄일.</li>
	<li>이미징 시작 합니다.</li>
</ol>4. 이미지 처리 및 분석
<ol><li>스택 tiff 형식에서으로 얻은 이미지를 수집 합니다. 추가 처리 및 분석에 대 한 피지 소프트웨어15를 사용 합니다. 저속 데이터 현미경 소프트웨어 스택으로 수집 되지 않습니다, 소프트웨어에서 시간 경과 실험의 모든 프레임을 열고 ( 파일 을 클릭 하 여 | 오픈... 또는 드래그 앤 도구 모음에 해당 하는 파일) 이미지 클릭 | 스택 | 이미지 스택입니다.</li>
	<li>Subtract 배경 함수를 사용 하 여 스택의 모든 그림에서 배경을 제거 하. 이렇게 하려면 프로세스 | 배경 빼기. 팝업 창에서 롤링 볼 radius를 선택 합니다. 반지름은 적어도 몇 군데 셀의 크기를 사용 합니다. 배경 빼기 스택의 모든 셀에 적용 하려면 선택 예 에 프로세스 스택? 팝업 창.</li>
	<li>관심의 셀을 선택 하 고 도구 모음을 사용 하 여 주위 (ROI) 관심 영역을 그립니다. 핵 신호에 대 한 첫 번째 도구 모음에서 해당 탭을 클릭 하 고 다음 클릭 하 여 관심의 핵 조정 주위 타원형 타원형 선택을 사용 합니다. 세포질 신호 또는 매우 조밀한 지역에 대 한 자유형 선택을 사용 하 여 밀접 하 게 셀 윤곽선을 따를 수 있을. 비록 모든 배경 픽셀 (단계 4.8-4.9)의 후속 빼기 때문에 정확 하 게 셀 윤곽선을 따라 하는 데 필요한 배경, 너무 큰 영역을 포함 하지 마십시오.</li>
	<li>분석을 클릭 하 여 투자 수익 관리자에 관심 영역을 추가 | 도구 | 투자 수익 관리자 | 추가, 또는 키보드에서 T 를 눌러.</li>
	<li>스택 창에서 탭을 이동 하 여 또는 shift 키를 누르면 다음 프레임으로 진행 + &lt; 키보드, 다음 이전 작업을 반복. 동영상의 과정을 통해 관심의 셀 따라 고 각 프레임의 ROI ROI 관리자 추가. 최종 투자 수익 더 를 클릭 하 여 추적 된 각 셀에 대 한 설정 저장 | 저장...에 ROI 관리자. 참고: 셀 분할 후 두 딸 셀을 개별적으로 추적 하 고 배경 빼기 후 그들의 통합된 강렬을 합계 (단계 4.6 4.9 참조) 세포 분열 동안 단백질 희석에 대 한 계정. 두 딸 세포에 대 한 투자 수익 집합을 저장 합니다.</li>
	<li>일단 관심의 셀은 영화 내내 추적, 측정, 평균 강도와 ROIs의 영역에 대 한 값을 클릭 합니다. 전자 스프레드시트 프로그램으로 얻은 값을 복사 하 고 각 시간 지점에 대 한 셀의 원시 통합된 강도 다음과 같이 계산. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq1.jpg"> 어디 c의미평균 강도 및지역C해당 투자 수익의 영역.</li>
	<li>로컬 백그라운드를 예상 하려면 각 시간 프레임에 대 한 관심의 셀에 가까운 수익을 추가 합니다. 어떤 세포 형광 신호를 포함 하지 마십시오. 셀의 크기는 대략 원형 ROI를 사용 하 여 이동 하거나 필요한 경우, 예를 들어 인접 셀 간섭 하는 경우 적절 하 게 축소 합니다. 투자 수익 배경 투자 수익을 얻으려면 설정 설정 휴대와 앞에서 설명한 대로 진행 하 고 스프레드시트에 측정된 강도 값을 복사 합니다.</li>
	<li>셀의 통합 된 강도 대 한 배경 수정 값을 가져오려면 먼저 각 시간 지점에 대 한 백그라운드의 통합된 강도 계산: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq2.jpg"> 배경 신호 및 지역C 의 평균 강도 BG 의미 셀 포위 망 투자 수익의 영역입니다. 두 영역 모두 동일한 크기를 가지 않는 한 ROI, 배경 영역을 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>각 시간 지점에 대 한 셀의 마지막 배경 빼고 통합된 강도 계산: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq3.jpg">
</li>
	<li>정규화 단일 셀 감퇴 곡선, 첫째 시간 점의 강도 값으로 각 시간 점의 강도 값을 나눕니다. 참고: 커브 피팅 (단계 4.11 참조)도 수행할 수 있습니다 각 단일 셀에서 또는 인구 평균에. 기반 인구 평균 셀 사이의 다른 형광 강렬에서 편견을 피하기 위해 계산 하는 경우에 정규화가 필요 합니다. 정규화는 따라서 각 셀 마지막 감퇴 곡선을 같은 무게로 공헌 한다 다는 것을 보장 합니다. 또한, 정상화 ( 그림 3A-3 C참조) 그들의 절대 형광 강렬은 별도로 단일 셀 부패 한다를 시각화 하기 위해 유용할 수 있습니다. 그러나, 경우에 단일 셀 반감기를 결정 하 고 데이터 평균 하지, 정규화 단계를 생략할 수 있다 고 커브 피팅 원시 데이터에서 직접 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>단백질 반감기 예측에 대 한 커브 피팅 도구를 사용 합니다. 이 연구의 MATLAB 사용자 인터페이스 애플 리 케이 션 섹션에서 기본적으로 위치한 MATLAB 커브 피팅 도구 상자 3.4.1가 사용 되었다. 형광 강도 가져오기 및 가져오기 데이터 탭에서 클릭 하 여 MATLAB에 전자 스프레드시트에서 시간 값 커브 피팅 도구 상자를 열고 선택한 시간 포인트 및 형광 붕괴 데이터 X 데이터 및 Y 데이터 탭 선택 사용자 정의 방정식 곡선 맞춤 탭을 입력 하는 지 수 감퇴의 공식: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq4.jpg"> f (t) 주어진 시간 포인트, 형광 강도가 는 초기 강도 및 b 감퇴 속도. 맞는 옵션탭, 0 모두 a 와 b의 낮은 한도 대 한 선택. A 와 b 에 대 한 예상된 값 결과 창에 나타납니다. 다음과 같이 반감기를 계산. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq5.jpg">
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

가장 중요 한 단계는 아니 잔여 언바운드 염료 남아 매체 또는 셀으로 세척 후 그것을 보장 하기 위해 수도 바인딩할 새로 단백질 부패 모니터링 스냅인 태그를 사용 하 여 생산 실험 및 거기 동안 나중 스냅인 태그 분자 eby 타협 감퇴 곡선입니다. 이것은 한 손으로 모든 설명된 세척 단계를 신중 하 게 수행 하 여 달성 에입니다. 다른 한편으로, 염료 농도 유지 되어야 한다, 가능한 한 낮은 여전히 좋은 신호 대 잡음 비를 얻기 위해 허락 하는 범위에 있는 동안. 그림 2에서 같이 염료 농도 다른 희석을 테스트 하 여 각 실험에 대 한 최적화 되어야 합니다. 우리의 경우, doxycycline 유도할 수 있는 셀 라인 상대적으로 높은 식 레벨, 따라서 낮은 염료 농도 사용 하 여 수 있다.
이 프로토콜 시간 경과 형광 이미징 하 여 단일 셀의 단백질 저하를 계량 하는 일반적인 접근 방식을 설명 합니다 및 프로토콜의 다양 한 측...

그것은 잘 알려진 세포질 단백질 합성 및 분해 속도 특정 각 단백질에 대 한 및 생리 적 규정이 적용 되 고 광범위 한 회전율, 받 다. 전통적으로, 단백질 저하 속도 측정 된 방사성 펄스 체이스 분석 같은 대량 방법을 사용 하 여 또는 cycloheximide1단백질 합성 억제제와 관련 된 되었습니다. 더 최근에, 안정 동위 원소 질량 분석 함께에서 세포 배양 (SILAC) 아미노산으로 세계적인 규모2단백질 회전율 계량에 설립 되었습니다. 그러나, 이러한 방법은 인구 평균에 의해 제한 되 고 셀 다양성에 대 한 정보 손실 따라서 됩니다. 또한, 세포 인구에서 동기화 되는 단백질 저하의 과도 변화를 확인할 수 수 없습니다.
또는, 단백질 반감기 또한 종종 단일 셀 해상도 제공 하는 이점을 있는 형광-기반 접근에 의해 결정 수 있습니다. 예를 들어 photoactivatable 녹색 형광 단백질 (paGFP) 초기 포유류 배아3Oct4 반감기를 결정 하기 위해 사용 되었습니다. 살아있는 세포에서 단백질 부패를 감시 하는 또 다른 방법은 형광 시간 경과 영상에와 함께 스냅인 태그의 사용 이다. 스냅-태그는 DNA 수리 효소 O6-alkylguanine를 DNA-alkyltransferase (AGT) 특별히 benzylguanine와 반응 분자 프로브4,5, 로 결합 될 수 있다 (BG) 파생 하의 돌연변이 체 버전 6. 따라서, 모든 스냅인 태그 융해 단백질 수 irreversibly 표시 형광, 세포 투과성 염료와. 펄스 잔여 염료의 희미하게 다음 스냅인 태그에 융합 하는 관심사의 단백질의 라벨 표시 단백질 인구의 저하를 모니터링 및 따라서 단백질 반감기를 결정 수 있습니다. 스냅-태그 펄스 체이스 단백질의 라벨에 대 한 성공적으로 사용 된 고 단백질을 결정 하기 위한 점착에 반감기 셀 문화 그리고 vivo에서5,7,,89. 일반적으로 사용 되 포함 하는 스냅인 태그 기판의 큰 다양 한 형광 스펙트럼 상업적으로, 각 특정 응용 프로그램에 대 한 최적의 염료의 선택 사용 사용할 수 있습니다. 따라서, 스냅-태그 다른 형광 성 융해 단백질 또는 염료와 함께 멀티 컬러 이미징에 대 한 또한 사용할 수 있습니다. 셀 스며들 지 않는 염료는 세포 투과성 염료는 세포내, 막 바인딩 단백질을 모니터링에 적용 하는 반면 단백질 막 곁의 라벨 적합 합니다. 또한, 일부 이러한 프로브 거의 없는 기저 형광을 전시 하 고만 스냅인 태그10바인딩 시 강한 형광 신호를 방출 시작 합니다.
이 프로토콜 스냅인 태그를 사용 하 여 단일 셀에 대 한 관심의 다른 단백질의 저하 속도 측정 하는 방법을 설명 합니다. 여기 우리가 마우스 배아 줄기 (ES) 세포 E cadherin에 교양된이 방법 적용 하지만 모든 부착 교양된 셀 종류 사용 가능 해야 한다. 우리 표시 펄스 라벨 형광 시간 경과 영상 다음 스냅인 태그 융해 단백질의 관심의 다양 한 단백질의 단일 셀 반감기를 결정 하기 위한 허용에 반감기의 셀 다양성에 대 한 견적을 제공 한다는 경작된 한 세포의 인구입니다.

<table><tbody><tr><td>관심 SNAP-tag 융합 단백질을 발현하는</td><td></td><td></td> EquipmentES cell line -<td></td></tr><tr><td>-Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate</td><td>Corning</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td></td> Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Marienfeld-superior</td><td>640030</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td>5804000528</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified</td><td>ThermoFisher</td><td>16141-079</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>113-24-6</td><td></td></tr><tr><td>최소 필수 매체&nbsp; 비필수 아미노산</td><td>ThermoFisher</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00H</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 200mM</td><td>ThermoFisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>백혈병 억제 인자</td><td>-</td><td>-</td><td>실험실에서 HEK-293T 세포의 일시적인 transfection에 의해 생산된 후 상층액의 수집 및 여과에 의해 생성됩니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR99021 (GSK-3 억제제 XVI)</td><td>Merck Millipore</td><td>361559</td><td></td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>391210-10-9</td><td></td></tr><tr><td>소 가죽에서 추출한 젤라틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 PBS 10x 농축</td><td>BioConcept</td><td>3-05K00-I</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 Ca++/Mg++</td><td>BioConcept</td><td>3-05F29-I</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA-용액 0.25%</td><td>시그마-알드리치</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 E-Cadherin Fc 키메라 단백질</td><td>R& D 시스템</td><td>748-EC-050</td><td></td></tr><tr><td>독시사이클린 히클레이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>스냅셀 647-SiR</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩</td><td>S9102S</td><td></td></tr><tr><td>플루오로브라이트 DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI-</td><td></td><td>-</td><td>오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>MATLAB R2014a</td><td>Mathworks-Microsoft</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Excel</td>: <td>Microsoft</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

부착 세포 배양에서 시간 경과 형광 현미경 검사 법에 의해 단백질 저하의 단일 셀 정량화

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

단백질 합성의 동적 상태에 있고 저하 및 그들의 반감기는 다양 한 상황에서 조정 될 수 있다. 그러나, 가장 일반적으로 사용 되 접근 단백질 반감기는 결정 하기 위해 인구 평균 lysed 세포에서 제한 하거나 단백질 합성 억제제의 사용을 필요로. 이 프로토콜 단백질 반감기 하나의 살아있는 부착 세포에 형광 현미경 검사 시간 경과 함께에서 스냅인 태그 융해 단백질을 사용 하 여 측정 하는 방법을 설명 합니다. 스냅인 태그를 융합 하는 관심사의 어떤 단백질 covalently에 바인딩될 수 있는 결합 된 형광, 세포 투과성 염료에 의해 benzylguanine 파생, 그리고 잔여 염료의 세척 후 레이블이 단백질 인구의 감퇴를 모니터링할 수 있습니다. 이후 셀 추적 그리고 통합된 형광 강도 곡선 기준으로 단일 세포에서 단백질 저하 속도 결정 하기 위한 수 있도록 추적 된 각 셀에 대 한 지 수 감퇴 곡선에서 시간 결과 정량화. 이 메서드는 다른 방법으로 쉽게 평가 될 수 없는 경작된 한 세포의 인구에 반감기의이 대 한 견적을 제공 합니다. 여기에 제시 된 접근 스냅인 태그를 융합 하는 관심사의 단백질을 표현 하는 교양된 부착 세포의 모든 종류에 적용 됩니다. 여기 전자 cadherin 코팅 세포 배양 배지에서 자란 마우스 배아 줄기 (ES) 세포 사용 하 여 단백질의 반감기의 광범위 한 범위와 속도 확인할 수 있습니다 어떻게 단일 셀 저하를 설명 하기 위해.

설명된 프로토콜 스냅인 태그 융합 어떤 주어진된 단백질에 대 한 하프 라이프 셀 가변성의 견적을 제공 합니다. 이미징 판의 코팅에 대 한 재조합 형 전자 cadherin Fc를 사용 하 여 단일 셀 해상도 ES 세포는 식민지에서 성장에 대 한 수 있습니다. 단일 셀 영화 ( 그림 1A)의 과정을 통해 개별적으로 추적할 수 있습니다.
각 단일 셀에 대 한 단백질 반감기를 결정 하기 위하여 그것은 약술에 두 딸 세포의 통합된 농도와 시간별 ( 그림 1B), 통합, 배경 빼고 스냅인 태그 형광 신호를 측정 하는 중요 한 사단의 경우입니다. 이 결과는 부패 속도 따라서 반감기 추출 될 수 있다 ( 그림 1C) 피팅 곡선에 의해 각 셀에 대 한 지 수 감퇴 곡선. 중요 한 것은, 평균 감퇴 곡선을 계산 하는 경우 단일 셀 추적 각...

이 프로토콜에서는 단백질 반감기 하나의 살아있는 부착 세포, 펄스 라벨 및 스냅인 태그 융해 단백질의 형광 시간 경과 이미징 사용 하 여 결정 하는 방법을 설명 합니다.

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

이 형광 이미징 접근법의 전반적인 목표는 SNAP 태그를 사용하여 살아있는 단일 세포에서 관심 단백질의 반감기를 결정하는 것입니다. 세포 단백질은 각 단백질에 대해 특이적인 합성 및 분해 속도로 광범위하게 전환되며 생리학적 조절의 대상이 됩니다. 그러나 단백질 반감기를 측정하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법은 이 세포의 집단 평균으로 제한되거나 단백질 합성 억제제의 사용이 필요합니다.이 동영상에서는 SNAP 태그를 형광 타임 랩스 현미경 검사와 함께 사용하여 살아있는 세포의 단백질 반감기를 측정하는 방법을 보여줍니다. 이 방법의 장점은 단일 세포 분해능을 달성하므로 배양된 세포 집단에서 반감기의 이질성에 대한 추정치를 제공한다는 것입니다. 여기에 제시된 실험 절차는 SNAP-tag에 융합된 관심 단백질을 발현하는 모든 유형의 부착 배양 세포에 적용할 수 있습니다.이는 내인성 단백질 태깅(endogenous protein tagging) 또는 태깅된 단백질의 과발현(over-expression)을 사용하여 달성할 수 있습니다. SNAP-tag는 DNA 복구 효소인 O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase의 돌연변이 버전으로, 분자 프로브에 결합할 수 있는 benzylguanine과 특이적으로 반응합니다. 그러므로, 어떤 SNAP 꼬리표 융합 단백질든지 형광 세포 투과성 염료로 비가역적으로 표지될 수 있습니다.잔류 염료가 씻겨 나오면 표지된 단백질 집단은 기하급수적으로 감소하고 해당 단백질의 반감기를 추론할 수 있습니다. 이 비디오에서는 배아 줄기 세포를 사용하는데, 이 세포는 젤라틴으로 코팅된 접시에서 고전적으로 자랄 때 촘촘한 군체를 형성합니다. 세포의 단층으로 성장하여 형광 이미징 실험을 위한 단일 세포 해상도를 달성하기 위해 원형질막에서 발현된 세포 inc 부착에 의해 매개되는 세포 간 상호 작용을 줄이는 inc 접착 코팅 플레이트에서 배양했습니다.PBS에서 마이크로리터당 5나노그램으로 접착하는 재조합 inc를 희석하고 이미징에 적합한 96 밸브 플레이트에 밸브당 부착된 30마이크로리터의 희석된 inc를 추가합니다. 재조합 inc 부착은 매우 취약하므로 광범위한 피펫팅을 피하십시오. 37도에서 1시간 30분 동안 배양합니다.inc 부착 용액을 흡인하고 100마이크로리터의 PBS로 한 번 세척한 다음 최대 200마이크로리터의 사전 웜화된 ESL 배양 배지를 추가합니다. SNAP 태그에 융합된 관심 단백질을 발현하는 ESL 라인을 사용합니다. PBS 5ml로 세포를 씻으십시오.그런 다음 Tripson 2ml를 넣고 37도에서 4분 동안 배양합니다. ESL 배양 배지 4ml를 넣고 다시 현탁한 다음 1000T에서 4분 동안 스핀다운합니다. 상층액을 흡인하고 새로운 배지에 다시 현탁하고 세포를 계수합니다.좌석 30, inc 고착 입히는 화상 진찰 판에 있는 평방 센티미터 당 000의 세포. cell sitting 후 24시간 후에 SNAP dye 염색을 진행합니다. ELS 배양 배지에서 세포 염료를 이전에 결정된 최적 농도로 희석합니다.피펫을 사용하여 배지를 흡입하고 희석된 SNAP 염료 50마이크로리터를 조심스럽게 추가합니다. 37도에서 30분 동안 배양합니다. 염료를 흡입하고 200마이크로리터의 pre-worm PBS로 3회 세척합니다.200마이크로리터의 ESL 배양 배지를 넣고 37도에서 15분 동안 배양합니다. 세척 단계는 부드럽게 피펫으로 세척하며, 세포가 쉽게 분리되는 경향이 있으므로 자동 흡입기를 사용하지 마십시오. 동일한 세척 단계를 두 번 더 반복한 다음 200마이크로리터의 이미징 매체를 추가합니다.페놀 레드 프리 배지를 사용하여 형광 배경을 줄입니다. 온도와 CO2를 제어할 수 있는 현미경을 사용하십시오.사용하기 전에 온도를 37도로 설정하고 CO2를 5%로 설정하고 1-2시간 동안 평형을 유지합니다.플레이트를 현미경에 놓고 이미징에 적합한 지점을 선택합니다. 명시야 이미지는 단층으로 코팅된 접시를 부착하는 INC에 부착된 ESL을 보여줍니다. 목표를 선택하면 20X 목표가 이 크기의 ESL에 적합합니다.기록할 형광 채널의 조명 설정을 선택합니다. 영화가 진행됨에 따라 감소하므로 강한 신호를 얻기 위해 레이저 출력과 노출을 조정하십시오. 타임랩스 실험에 대한 획득 매개변수를 선택합니다.2-20시간의 예상 반감기를 가진 단백질의 경우 15분의 시간 간격으로 12-24시간의 수집 시간을 선택하십시오. 이미징 실험을 시작합니다. FIJI 소프트웨어를 사용하여 영화를 처리하고 분석합니다.획득한 이미지를 스택으로 수집하고 변형합니다. 배경 빼기 FIJI 함수를 사용하여 스택의 모든 그림에서 배경을 제거합니다. 관심 셀을 선택하고, FIJI 도구 모음을 사용하여 그 주위에 관심 영역을 그리고, 관심 영역을 ROI Manager에 추가합니다.다음 프레임으로 진행하여 이전 작업을 반복합니다. 동영상이 진행되는 동안 관심 있는 셀을 따라가면서 추적된 각 셀에 대한 ROI 세트를 저장합니다. 측정값을 클릭하여 평균 강도와 ROI의 면적에 대한 값을 구합니다.로컬 배경을 추정하려면 각 시간 프레임에 대해 관심 셀에 가까운 관심 영역을 추가합니다. 마지막으로 측정값을 클릭하여 평균 배경 강도에 대한 값을 구합니다. 먼저, 세포 ROI의 평균 강도에 대해 얻은 값과 해당 면적을 곱하여 세포의 평균 강도를 계산합니다.그런 다음 배경 ROI의 평균 강도와 세포 ROI의 면적을 곱하여 셀의 통합 배경 값 계산을 진행합니다. 마지막으로, 세포의 통합 강도에 대한 배경 보정된 값을 얻기 위해, 통합 세포 강도 값에서 통합 배경 강도 값을 뺍니다. 세포 집단의 평균 반감기를 얻으려면 얻어진 값을 각 세포에 대한 첫 번째 프레임의 강도 값으로 정규화합니다.이것은 각 세포가 절대 형광 강도와 독립적으로 평균 반감기 값에 동일한 무게로 기여하도록 합니다. 세포 분열 후 두 딸 세포를 개별적으로 추적하고 배경 빼기 후 통합 강도를 합산하여 세포 분열 중 단백질 희석을 설명합니다. 두 딸 세포에 대한 ROI 세트를 저장합니다.단백질 반감기를 추정하려면 MATLAB의 곡선 피팅 툴을 사용하십시오. 단백질 붕괴는 지수를 따르며, 여기서 F(x)는 주어진 시점의 형광 강도, a"는 초기 강도, b는 붕괴 속도입니다. 적합에서 붕괴율 b"에 대한 값을 얻은 후, 반감기는 2의 로그를 b"로 나누어 계산할 수 있습니다.이 동영상은 doxycycline에서 사용할 수 없는 opt four SNAP-tag 융합 세포주에서 SNAP 염료 형광의 붕괴를 보여줍니다.관찰된 형광 신호는 사용된 세포주, 관심 단백질의 발현 수준, 사용되는 염료의 특성에 따라 달라집니다. 단백질 붕괴 실험의 경우 적절한 SNAP 염료 농도를 사용하는 것이 중요합니다. 농도는 타임랩스가 시작될 때 밝은 형광 신호를 생성할 수 있을 만큼 충분히 높아야 합니다.그러나 너무 높은 염료 농도를 사용하면 세척 후에도 배지에 잔류 염료가 남을 수 있습니다. 유리 염료는 영화가 진행되는 동안 새로 생성된 SNAP 태그 분자에 결합할 수 있으며, 이는 붕괴 곡선을 왜곡시킬 수 있습니다. 따라서 다양한 희석액을 테스트하여 SNAP 염료 농도를 최적화하는 것이 중요합니다.이 그림은 독시사이클린(doxycycline)을 사용할 수 없는 세포주에서 테스트한 형광 SNAP 염료의 8가지 농도에 대한 붕괴 곡선을 보여줍니다. 라이브 셀 이미징을 위한 제조업체 지침에 따라 3마이크로몰의 초기 염료 농도를 선택하고 1.4 나노몰의 농도에 도달할 때까지 1 내지 3의 연속 희석을 수행했습니다. 가장 높은 두 농도의 경우 신호가 감소하지 않는 반면, 관찰된 감쇠는 낮은 농도의 경우 지수 곡선을 따릅니다.이 예에서는 12 나노 몰의 최적 농도가 선택되었는데,이 농도는 세척 후 매체에 남아있는 잔류 염료의 최소량을 보장하지만 형광 신호는 여전히 명확한 붕괴 곡선을 관찰 할 수있을만큼 충분히 밝습니다. 설명된 프로토콜은 SNAP-tag에 융합된 주어진 단백질에 대한 세포 간 변동성 및 반감기의 추정치를 제공합니다. 이 그림은 단일 세포 붕괴와 3개의 서로 다른 독시사이클린 사용 불가 SNAP-tag 융합 세포주에 대한 집단 평균을 보여줍니다.Nanog"및 Oct4"는 평균 반감기가 2.9 및 4.8 시간으로 다소 짧습니다. 반면 Srsf11"은 평균 반감기가 25.3시간으로 더 오래 지속됩니다. 상자 그림은 세 단백질에 대한 반감기의 분포를 보여줍니다.우리는 형광 시간 경과 현미경 검사법과 함께 SNAP 태그의 사용이 관심 단백질의 반감기를 결정할 수 있음을 보여주었습니다. 단일 세포 붕괴 측정은 세포 집단에서 반감기의 이질성에 대한 추정치를 제공하며, 이는 단백질 반감기를 결정하기 위해 다른 방법을 사용할 때 생략됩니다. SNAP 태그를 사용하여 단백질 붕괴를 모니터링할 때 가장 중요한 단계 중 하나는 세척 후 배지 또는 세포에 결합되지 않은 염료가 남아 있지 않은지 확인하는 것입니다.그렇지 않으면 나중에 실험 과정에서 새로 생성된 SNAP 태그 분자에 결합하여 붕괴 곡선을 손상시킬 수 있습니다. 이것은 한편으로 설명된 모든 세척 단계를 주의 깊게 수행함으로써 달성됩니다. 반면에 SNAP 염료 농도는 양호한 신호 대 잡음비를 얻을 수 있는 범위에 있는 동안 가능한 한 낮게 유지되어야 합니다.SNAP 염료 농도는 세포주와 사용되는 염료 유형에 따라 각 실험에 대해 최적화되어야 합니다. SNAP-tag가 일부 경우에 후보 단백질의 반감기를 변경할 수 있지만, 후보 단백질 테스트의 결정된 반감기가 발표된 값과 밀접하게 일치하기 때문에 이러한 효과에 대한 증거는 없습니다. 단백질 분해에 대한 SNAP-tag의 영향을 추가로 배제하기 위한 한 가지 옵션은 시클로헥시미드로 단백질 합성을 차단하고 토착 단백질을 인식하는 항체를 사용하여 다른 시점에서 화장실 블롯을 수행하는 것입니다.그리고 SNAP-tag 후보 단백질의 붕괴를 태그가 지정되지 않은 토착 버전과 직접 비교합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 invadopodia로 인한 매트릭스 저하를 시각화를위한 형광 젤라틴으로 코팅 현미경 coverslips를 생산을위한 원형 방법을 설명합니다. 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 전산 기술이 혼합 된 인구 내에 전체 미세 필드를 포함한 다세포 그룹에 대한 하나의 세포 매트릭스 proteolysis의 결과 수준을 정량화를 위해 제공됩니다.

단일 및 다세포 상황에서 Invadopodia로 인한 세포 외 기질 Proteolysis의 양적 측정

이 동영상은 형질주입된 포유류 세포의 핵에서 발현되는 형광 표지된 잘못 접힌 루시페라제 돌연변이 단백질의 분해 역학을 연구하기 위한 체외 형광 기반 마이크로플레이트 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 형광 돌연변이 단백질을 발현하는 세포를 번역 억제제와 프로테아좀 억제제로 처리하여 잘못 접힌 단백질의 프로테아좀 매개 분해를 평가하는 것을 포함합니다.

형광 마이크로플레이트 기반 시클로헥시미드 추적 분석: 형광 핵 잘못 접힌 단백질의 분해 역학을 모니터링하는 기술

유동 세포 계측법 및 현미경에 따라 두 개의 보완적인 방법은 효모에서 MAPK 경로의 활성화에 의해 유도되는 유전자 발현의 역학의 단일 세포 수준에서 정량을, 가능하게하는 표시됩니다.

단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

여기에서는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의한 단백질 분해의 상대적 속도를 정량화하기 위한 강력한 생물학적 분석법을 설명합니다. 분석 판독은 액체 배양에서의 효모 성장 속도이며, 이는 필수 대사 마커에 융합된 분해 신호로 구성된 리포터 단백질의 세포 수준에 따라 달라집니다.

단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석

세포와 조직에서 단백질 수준은 종종 단단히 단백질 생산 및 통관의 균형에 의해 조절된다. 광 (FDAP) 후 형광 감쇄를 사용하면, 단백질의 클리어런스 동력학 실험적 생체 내에서 측정 할 수있다.

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

이 보고서는 웨스턴 블롯 또는 형광 기반 분석법으로 잘못 접힌 단백질의 분해 속도를 측정하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 잘못 접힌 다른 단백질의 분석 및 고처리량 스크리닝에 적용할 수 있습니다.

세포의 잘못 폴딩 된 단백질의 분해에 대한 분석

Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

이 프로토콜 중재-셀 상호 작용, 즉 단백질 세포 접합, 살아있는 세포에 직접에 단백질 간의 상호 작용을 조사 하는 형광 변동 분광학 기반 방식을 설명 합니다. 우리 악기 교정, 데이터 수집 및 분석, 보정 가능한 인 위 소스에 자세한 지침을 제공 합니다.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

우리는 autophagy및 마우스 간에서 proteasome를 통해 단백질 이화 작용에 있는 생물학 리듬을 측정하기 위한 우리의 프로토콜을 기술합니다.

자동 및 프로테아소말 플럭스에서 일주 리듬 측정

마이크로패턴 어레이를 사용하여 단일 세포로부터 형광 리포터 타임 코스를 취득하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 셀 어레이의 준비, 라이브 셀 스캐닝 시간 경과 현미경 검사법의 설정 및 작동 및 접착 부위당 세포 통합 형광 시간 과정의 자동화된 사전 선택, 시각적 제어 및 추적을 위한 오픈 소스 이미지 분석 도구에 대해 설명합니다.

세포 역학을 정량화하는 다목적 기술인 단세포 어레이(LISCA)의 라이브 셀 이미징

이 프로토콜은 펄스 SILAC를 사용한 노화 및 비분열 세포의 대사 표지, 비표적 질량 분석법 분석 및 단백질 반감기의 간소화된 계산을 위한 워크플로우를 설명합니다.

대사 표지 및 질량 분광법으로 노화 및 비분할 배양된 세포에서의 단백질 회전율 측정

배우세요 부착 세포 배양에서 SNAP-Tag와 형광 현미경을 이용한 단백질 반감기 측정법을. 단일 세포 수준에서 단백질 동역학을 정량화하여 세포 집단 내 이질성을 분석할 수 있습니다.

부착 세포 배양에서 시간 경과 형광 현미경 검사 법에 의해 단백질 저하의 단일 셀 정량화

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