Name: DNA 손상 생체 외에서 혜성 분석 결과 사용 하 여 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 학습하세요 혜성 분석법을 이용한 암세포 DNA 손상 평가 방법을. 알칼리성 및 중성 조건에서 단일세포 수준의 DNA 파손을 정량적으로 측정하여 항암화학요법의 유전독성 효과를 연구할 수 있습니다.

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이 연구는 NIH, NCI, CCR의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다. 모든 저자는 NIH, NCI, 및 CCR에서 교내 연구 보조금을 받았다.

1. 시 약 준비 <ol><li>1 x PBS <ol><li>900 mL dH 2 O 100 mL 10 x PBS를 희석 하 고 pH 미터를 사용 하 여 7.4에 pH를 조정. 실내 온도에 상점.</li>
	</ol></li> <li>세포 솔루션 (LS) <ol><li>2.5 M NaCl, 100 m m disodium EDTA, 10 mM Tris 자료, 및 900 mL dH 2 O 200 m m NaOH 준비, 그것은 일반적으로 완전 해산을 혼합 수 있도록 약 20 분 걸립니다. 10 pH 미터를 사용 하 여 pH를 조정 합니다. 추가 1% 나트륨 lauryl sarcosinate 및 1% 트라이 톤 X-100 1000 mL를 최종 볼륨을 조정. 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 4 ° C에 쿨.</li>
	</ol></li> <li>알칼리 성 전기 이동 법 솔루션 (AES), pH &gt; 13 <ol><li>200 m m NaOH와 1 m m disodium EDTA 800 mL dH 2 O. 조정 산도 준비 하 고 pH는 &gt; 13. 1000 mL를 최종 볼륨을 조정 합니다. 사용 하기 전에 신선한 확인 하 고 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 4 ° C에 냉각.</li>
	</ol></li> <li>중립 전기 sollution (NES) <ol><li>빙 초 산 100 mM Tris 기지와 300 mM 아세트산 나트륨 1000 mL dH 2 O. 조절 pH 9.0 혼합 하 여 준비 1000 mL 중립 전기 이동 법 버퍼. 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 4 ° C에 쿨.</li>
	</ol></li> <li>DNA 강수량 솔루션 (DPS) <ol><li>10 mL 7.5 M 암모늄 아세테이트 주식의 준비. DNA 강수량 솔루션 50 ml, 6.7 mL 7.5 M 염화 아세테이트 43.3 mL 95% 에탄올 혼합. 실내 온도에 상점.</li>
	</ol></li> <li>얼룩 솔루션 <ol><li>추가 1 µ L 10000 녹색 형광 핵 산 얼룩 (예를 들어, SYBR 녹색) 30 mL 트리 스-EDTA 버퍼 (10 mM Tris HCl, 1 m m disodium EDTA, pH 7.4)에 게 x 4 ° C. 보호에서 빛.</li>
	</ol></li> <li>1% 낮은 녹는 agarose <ol><li>1% 낮은 녹는 포인트 agarose (1 g 100 mL dH 2 O) 전자 레인지에 녹여. 모든 15-20 s는 agarose는 완전히 녹은 것을 확인 하는 agarose를 소용돌이 친다. 사용 하기 전에 적어도 20 분 동안 37 ° C 물 목욕에는 agarose를 놓습니다.</li>
	</ol></li> <li>미리 따뜻한 피 펫 팁 <ol><li>P200 피 펫 팁의 좁은 끝 3 mm와 37 ° C에서 따뜻한 agarose를 pipetting 전에 잘라.</li>
	</ol></li></ol> 2. 혜성 슬라이드 준비 <ol><li>코팅 슬라이드 <ol><li>는 agarose는 완전히 녹은 때까지 또는 2-3 분 동안 전자 레인지에 녹여 1 %agarose (1 g 100 mL dH 2 O). 유리 현미경 슬라이드는 agarose 찍어와 보풀 지우기를 사용 하 여 슬라이드의 한 면을 닦아 내십시오.</li>
		<li>누워 건조 또는 빠른 건조를 위해 50 ° C에가 열 하는 평평한 표면에 슬라이드; 건조 후 투명 agarose 필름을 형성 한다. 사용 하기 전에 37 ° C에 코팅된 슬라이드 배치.</li>
	</ol></li> <li>단일 셀 정지의 준비 <ol><li>문화와 치료 glioma 셀 <ol><li>&amp;</li><li> </li><li><li><li></ol></li></ol></li></ol><ol><li><li><ol><li><li><li></li><li></ol></li><li><ol><li><li><li><li></ol></li></ol><ol><li><li><li></li></ol><ol><li><li><li></li><li></li><li> <img alt="TM 계산 방정식, DNA 분석, DNA 손상 평가의 꼬리 모멘트 공식." src="/files/ftp_upload/56450/56450eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> <img alt="OTM 계산 공식; 혜성 분석에서 DNA 손상 분석을 위한 방정식." src="/files/ftp_upload/56450/56450eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"></li><li></ol>

<ol><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Tice, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+gel%2Fcomet+assay%3A+guidelines+for+in+vitro+and+in+vivo+genetic+toxicology+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.</a> Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).</li>
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<li>Weston, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PARP+inhibitor+olaparib+induces+significant+killing+of+ATM-deficient+lymphoid+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo.</a> Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).</li>
<li>Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+Repair+in+Cancer%3A+Beyond+PARP+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors.</a> Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensitivity+of+IDH1-Mutated+Gliomas+Due+to+an+Impairment+in+PARP1-Mediated+DNA+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair.</a> Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).</li>
<li>Konca, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-platform+public+domain+PC+image-analysis+program+for+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay.</a> Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).</li>
<li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+the+high-throughput+processing+of+slides+for+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay.</a> Sci Rep. 4, 7200(2014).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

혜성 분석 결과 세포 수준에서 단일 및 이중 가닥 DNA 나누기를 측정 하는 효율적인 도구 이다. 분석 결과 연구에 관한 genotoxicity 및 biomonitoring13, 기본 병 변, DNA crosslinks, 약물 개발 및 알칼리 민감한 사이트에서까지 "황금 표준"으로 널리 적용 되었습니다. 현재 연구에서 우리가 알칼리와 중립 혜성 분석 실험에 대 한 두 가지 단계별 프로토콜 각각 보였다. 결합 하 여 단일 셀 전기 이동 법, 형광 현미경 검사 법, 및 이미지 해석, 모두 알칼리와 중립 혜성 분석 실험 생체 외에서손상 DNA의 정도 평가 하는 양적 접근을 제공 합니다.
몇 가지 주요 단계는 혜성 분석 결과의 성공적인 실행을 위해 필수적입니다. 예를 들어 치료 시 약 준비의 단계에 취해야 한다. 각 솔루션을 갓 준비 하 고 내 생 적인 DNA 손상을 방지 하거나 샘플 준비 하는 동안 복구를 사용 하기 전에 적어...

혜성 분석 결과 처음 개발 되었다 Ostling와 요한슨에 의해 1984 년에 DNA의 마이그레이션 중립 조건1아래 핵에서 조각으로. 기술은 나중 싱 외., 보여주는 알칼리 상태를 실질적으로 특이성 및 재현성 분석 결과2의 증가 의해 개발 되었다. 그 이후, 중립 혜성 분석 결과 주로 데 반면에 알칼리 성 혜성 분석 결과 DNA 손상, 싱글 등의 작은 금액에 대 한 더 민감한 이중 가닥 DNA 틈, 알칼리 정한 사이트, DNA-DNA 이중 가닥 DNA 틈, 검색 또는 DNA-단백질 cross-linking 그리고 DNA 단일 가닥 나누기 불완전 절단과 관련 된 사이트3,4복구. 두 분석 된 DNA의 시각화를 허용 하 고 양적 DNA 손상을 평가 하는 간단한 방법을 제공. 혜성 분석 결과 생체 외에서 그리고 vivo에서 유전 독성 연구를 위한 중요 한 방법으로 간주 되 고 초기 약물 후보 선택, 환경 모니터링, 인간의 biomonitoring 다른 연구 분야에 적용 됩니다. 그리고 기본 DNA 손상에 연구 하 고5를 복구.
분석 결과의 원리가 이다 전기 분야에서 조각난된 DNA는 핵양체 몸에서 (일컬어 "혜성 머리") 마이그레이션합니다와 agarose 젤 (일컬어 "혜성 꼬리")에서 DNA 얼룩을 형성. 뉴클레오티드 얼룩과 DNA 손상의 범위 "혜성"이 단일 셀 전기 이동 법에 의해 형성을 분석 하 여 측정할 수 있습니다. 꼬리 순간의 계산 더 비교 다른 실험적인 그룹 간의 DNA 손상 시킬 수 있습니다. DNA 손상 탐지의 전통적인 방법에 비해, 혜성 분석 결과 이며 직접, 민감한, 저렴 한, 상대적으로 간단한.
방사선 치료와 chemotherapies 단일 가닥을 생성 하 여 암 치료에 대 한 일반적인 전략은와 이중 가닥 DNA는 염색체6에 나누기. DNA 복구 억제제의 최근 발전 조합 화학요법에 의해 더 효과적인 차적인 효과 허용 하 고 따라서 잠재적으로 빈 혈, 감염, 골 수 억제7, 같은 조직의 부작용을 감소 8.이 연구에서 우리는 많은 (ADP-ribose) (PARP) 억제제, olaparib (Ola)9의 조사 했다. PARP 풍부한 핵 단백질 이며 많은 (ADP-ribose) 폴리머10을 형성 하 여 DNA 기본 절단 복구에 대 한 책임입니다. Temozolomide (TMZ)는 구두로 사용 가능한 alkylating 에이전트 이며 glioma 환자 치료를 위해 널리 이용 되는. DNA 손상 척도를 혜성 분석 결과 사용 하 여 우리는 olaparib/temozolomide 조합 치료 glioma, 치료 하는 효과적인 전략을 제안 glioma 세포에서 DNA 손상 향상 결합 olaparib temozolomide 깊이 설명 temozolomide 혼자11와 비교.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS(Ca++, Mg++ free)</td><td>TEKnova</td><td>P0196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>TEKnova</td><td>E0308</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 라 우릴 사르코시 네이</td>트 <td>시그마</td><td>L7414</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 아세테이</td>트 <td>시그마</td><td>32318</td><td></td></tr><tr><td>빙초 산</td><td>시그마</td><td></td> 695092 <td></td></tr><tr><td>암모늄 아세테이</td>트 <td>시그마</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>SYBR 그린</td><td>인비트로겐</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>낮음 융점 아가로스</td><td>인비트로젠</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>인비트로겐</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>95% 에탄올</td><td>WARNER-GRAHAM#</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>GIBICO</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>소모품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 조직 슬라이드</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>63422-11</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>KIMberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>DENVILLE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>SHARP</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</strong</td><td>>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Avanti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>PRECISION</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수평 전기영동 챔버</td><td>TREVIGEN</td><td>Cometassay ES II</td><td></td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Quincy Lab</td><td>모델 12-140E</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dna 손상 생체 외에서 혜성 분석 결과 사용 하 여 평가

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

DNA 손상의 수명 동안은 각 셀에 대 한 일반적인 현상이 며 genomic DNA의 화학 구조에의 한 변경으로 정의 됩니다. 암 치료, 라디오-및 화학 요법 같은 엄청난 양의 추가 DNA 손상, 세포 주기 검거와 apoptosis 제한 암 진행을 이끌어 소개. 실험적인 암 치료 기간 동안 DNA 손상의 정량적 평가 차적인 에이전트의 효율성을 정당화 하기 위해 중요 한 단계입니다. 이 연구에서 우리는 단일 셀 전기 이동 법 분석 결과, 일컬어 혜성 분석 결과, 단일 계량 수 있는에 집중 하 고 이중 가닥 DNA 생체 외에서휴식. 혜성 분석 결과 DNA 손상 부 량 효율적이 고, 실행 하기 쉬운 낮은 시간/예산 요구 및 높은 재현성. 여기, 우리 U251 glioma 셀에 olaparib/temozolomide 조합 치료의 차적인 효과 평가 하 여 전 임상 연구에 대 한 혜성 분석 결과의 유틸리티를 강조 표시 합니다.

현재 프로토콜 혜성 분석 결과 실행 및 데이터 분석 (그림 1)에 대 한 단계별 워크플로 설명합니다. 알칼리와 중립 혜성 분석 실험 결과 나타났다 U251 세포 독 소 루비 취급 (1 µ M, 20 h)의 혜성 꼬리 더 오래 되었고 더 높은 DNA 강도, 화학 요법 (그림 2)으로 조각난된 DNA의 상당한 축적을 제안 했다.
중 알칼리 성 또는 중성 혜성 분석 결과 대 한 정량 분석 독 소 루비 치료 (그림 3A) DNA 손상을 나타내는 후 크게 증가 혜성 꼬리 형성을 했다. 결과 평균 ± SEM 및 t으로 제시-테스트 통계 비교를 위해 사용 되었다. 두 분석 실험에서 꼬리 순간의 부 량 ...

혜성 분석 결과 단일과 이중 가닥 DNA를 포함 하 여 DNA 손상 나누기를 검색 하는 효율적인 방법입니다. 알칼리와 중립 혜성 분석 실험 화학 요법의 치료 효과 평가 하기 위해 암 세포의 DNA 손상을 측정을 설명 합니다.

DNA 손상 생체 외에서 혜성 분석 결과 사용 하 여 평가

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

이 실험의 전반적인 목표는 혜성 분석이라고도 하는 단일 세포 전기영동 분석을 사용하여 암세포에서 유전독성 물질의 효과를 조사하는 것입니다. 이 절차는 4가지 유전 독성 연구를 측정하는 의미입니다. 또한 조기 약물 후보 물질 선정 및 DNA 손상 및 복구에 대한 기초 연구와 같은 다양한 평가에 적용할 수 있습니다.이 기술은 DNA 손상을 정량적으로 평가하는 직접적인 방법을 제공합니다. 또한 효율적이고 수행하기 쉬우며 상대적으로 저렴합니다. 1% 아가로스를 전자레인지에 2-3분 동안 또는 아가로스가 완전히 녹을 때까지 녹여 슬라이드 코팅을 위해 아가로스를 준비합니다.유리 현미경 슬라이드를 아가로스에 담그고 보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 슬라이드의 한쪽 면을 닦습니다. 슬라이드를 평평한 표면에 놓고 자연 건조하십시오. 건조 후 투명한 아가로스 필름을 형성해야 합니다.사용하기 전에 코팅된 슬라이드를 섭씨 37도에 두십시오. 화학요법의 치료 효과는 10% FBS, 페니실린 밀리리터당 100단위, 스트렙토마이신 밀리리터당 10마이크로그램이 보충된 DMEM/Ham F-12 배지에서 배양된 U251 신경교종 세포에서 평가됩니다. 1ml의 트립신을 사용하여 세포를 3분 동안 소화한 다음 FBS와 함께 DMEM/Ham F-12 배지를 사용하여 트립신을 중화합니다.15ml 튜브에 세포를 모으십시오. 그리고 4분 동안 300회 G로 돌립니다. 매체를 흡입합니다.그리고 1x PBS에서 밀리리터당 5번째 세포의 2배 10으로 세포를 현탁시킵니다. 세포와 분석은 시작하기 직전에 준비해야 합니다. 그리고 어둠 속에서 다루어야합니다.손상을 방지하기 위해 모두 어두운 조명에서 촬영합니다. 세포 현탁액을 1%의 용융, 저융점 아가로스와 1:10의 부피 비율로 결합합니다. 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.그리고 즉시 30 마이크로 리터를 슬라이드에 피펫으로 넣습니다. 피펫 팁의 슬라이드를 사용하여 아가로스 혼합물을 펴서 얇은 층을 형성합니다. 슬라이드를 섭씨 4도의 어두운 곳에서 10분 동안 평평하게 놓습니다.슬라이드를 섭씨 4도의 용해 용액에 담그고 밤새 1시간 동안 어둠 속에서 담그십시오. 알칼리성 혜성 분석의 경우 용해 용액에서 슬라이드를 부드럽게 제거하고 과도한 액체를 배출한 다음 슬라이드를 섭씨 4도의 어둠 속에서 1시간 동안 AES에 부드럽게 담가 DNA가 풀릴 수 있도록 합니다. 전기영동 슬라이드 트레이에 미리 냉각된 AES를 추가합니다.슬라이드 위로 0.5cm를 초과하지 마십시오. 슬라이드를 안에 넣고 캡으로 덮습니다. 전원 공급 장치 전압을 센티미터당 1볼트로 설정하고 섭씨 4도에서 30분 동안 작동합니다.전기영동이 완료되면 슬라이드에서 과도한 AES를 배출합니다. 슬라이드를 실온의 증류수에 두 번 부드럽게 두 번 5분 동안 부드럽게 담그십시오. 그 후, 실온에서 5분 동안 슬라이드를 70% 에탄올에 부드럽게 담그십시오.중성 혜성 분석의 경우 용해 용액에서 슬라이드를 부드럽게 제거하고 과도한 액체를 배출한 다음 섭씨 4도의 어둠 속에서 30분 동안 NES에 부드럽게 담그십시오. 전기영동 슬라이드 트레이에 미리 냉각된 NES를 슬라이드 위로 0.5cm 높이에서 추가합니다. 슬라이드를 안에 넣고 캡으로 덮습니다.전원 공급 장치 전압을 센티미터당 1볼트로 설정하고 섭씨 4도에서 45분 동안 실행합니다. 슬라이드에서 초과 버퍼를 배출합니다. 30분 동안 실온에서 DNA 침전 용액에 슬라이드를 부드럽게 담그십시오.30분 후, 30분 동안 온화한 실온에서 70% 에탄올에 슬라이드를 부드럽게 담그십시오. 섭씨 37도의 어둠 속에서 10-15분 동안 슬라이드를 건조하여 이 절차를 시작합니다. 다음으로, 각 슬라이드의 건조된 아가로스에 50-100마이크로리터의 녹색 형광 핵산 염색 용액을 놓고 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 염색합니다.슬라이드를 증류수로 잠시 헹구고 어둠 속에서 섭씨 37도에서 완전히 건조시킵니다. 혜성 슬라이드를 염색한 직후 이미지 획득 및 분석을 수행합니다. 슬라이드 홀더가 있는 형광 현미경 아래에 슬라이드를 놓습니다.10X 대물렌즈를 선택하고 아가로스 젤이 대물렌즈를 향하고 있는지 확인합니다. 각 염색된 혜성 슬라이드에서 이미지를 무작위로 캡처합니다. 가장자리와 기포 주변 영역을 피하십시오.각 혜성 꼬리가 수평으로 분포되어 있는지 확인하십시오. 혜성의 머리는 왼쪽에서, 꼬리는 오른쪽에서 시작되어야 합니다. 각 사진을 밝은 DNA 염색과 어두운 배경의 바이너리 형식으로 저장하십시오.이미지 분석을 위해 먼저 도구 모음 왼쪽에 있는 Select Files to Analyze 버튼을 사용하여 모든 이미지를 Comet 분석 소프트웨어에 로드합니다. 이미지 뷰 창이 나타나야 합니다. 화면에 측정 프레임을 그리고 세포의 혜성에 따라 크기를 조정합니다.이미지에 따라 조정을 클릭하여 머리, 혜성 및 꼬리의 임계값을 설정합니다. 그런 다음 측정 시작을 클릭합니다. 프레임을 사용하여 셀을 선택하고 Assay the Comet 버튼을 클릭하여 측정을 활성화합니다.강도 이미지가 선택한 측정 매개변수와 함께 프로필 창에 표시됩니다. Store Results 버튼을 클릭하여 결과를 저장합니다. 처리당 최소 50개의 세포를 분석합니다.알칼리성 및 중성 혜성 분석 결과는 독소루비신으로 처리된 UT51 세포의 혜성 꼬리가 더 길고 DNA 강도가 더 높았음을 보여주며, 이는 단편화된 DNA가 상당히 축적되었음을 시사합니다. 알칼리성 또는 중성 혜성 분석에 대한 정량 분석은 독소루비신 처리 후 혜성 꼬리 형성이 크게 증가했음을 보여주었으며 이는 DNA 손상을 나타냅니다. PARP 억제제인 올라포립(olaporib)과 알킬화제인 테모졸로마이드(temozolomide)를 병용한 결과, 신경교종 세포의 DNA 손상이 크게 향상되었으며, 이는 혜성 꼬리 신호의 길이와 강도 증가에 의해 반영되었습니다.올라포립(Olaporib) 단독으로는 DNA 손상이 발생하지 않았다. 그것이 temozolomide의 genotoxic 효력을 강화하는 곳에. 단일 및 복합 치료에서 신경교종 세포의 대표적인 이미지는 테모졸로마이드와 올라포립으로 처리된 세포의 더 길고 더 높은 강도의 혜성 꼬리를 보여주었습니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 5시간 안에 완료할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 유전독성 분야의 연구자들이 다양한 유형의 핵세포에서 DNA 끈 절단을 측정할 수 있는 길을 열었습니다. 배양된 세포 또는 유기체에서 분리된 세포와 같은.이 비디오를 시청한 후에는 단일 세포 수준에서 유전독성 제제의 효과를 조사하기 위해 혜성 분석을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 손상 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 그리고 이 절차를 수행하는 동안 항상 실험복과 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오에서는 독소루비신 처리된 세포에서 단일 및 이중 가닥 DNA 절단을 모두 정량화하는 알칼리 단일 세포 전기영동 분석을 시연합니다. 알칼리성 조건은 DNA 염기쌍 사이의 수소 결합을 방해하여 DNA 가닥의 완전한 풀림 및 분리를 초래합니다. 이를 통해 전기영동 시 아가로스 겔에서 손상되지 않은 DNA 단편과 손상된 DNA 단편의 차등 이동을 가능하게 하여 손상되지 않은 DNA가 원형 혜성 머리를 형성하고 손상된 DNA 단편이 빠르게 이동하는 혜성 모양의 구조를 드러낼 수 있습니다.

알칼리성 단세포 겔 전기영동: 화학요법 후 개별 암세포의 DNA 손상을 정량적으로 추정하기 위한 민감한 기술

이 비디오는 유해 물질에 노출된 후 DNA 손상을 감지하기 위한 혜성 분석을 보여줍니다. 알칼리성 조건에서는 DNA가 풀리고 변성되며, 전기영동에 따라 손상되지 않은 DNA와 손상된 DNA가 아가로스 겔에서 다르게 이동하여 혜성 모양의 구조를 형성합니다. 천천히 이동하는 손상되지 않은 DNA는 원형 혜성 머리를 형성하고, 빠르게 이동하는 손상된 DNA 조각은 길쭉한 혜성 꼬리를 형성합니다.

세포의 DNA 손상 감지를 위한 Comet Assay

혜성 분석은 알칼리 불안정한 사이트와 hippocampal 뉴런을 포함한 모든 세포의 DNA에 DNA-DNA/DNA-protein 상호 링크 등 단일 및 이중 가닥 휴식을 검출 효율적인 방법입니다. 방법은 DNA 손상의 양의 차이로 인해 전기 분야에서 DNA의 차동 마이그레이션을 활용합니다.

혜성 분석을 사용하여 Hippocampal 뉴런의 DNA 손상을 시금

여기서 전례 처리량 DNA 손상 혜성 분석 검출 할 수있는 플랫폼을 설명한다. 장치 패턴 마이크로 어레이에 포유 동물 세포와는 96 샘플의 병렬 처리를 할 수 있습니다. 접근법은 기본 레벨 DNA 손상, 노출 유도 DNA 손상 및 DNA 수선의 동력학 분석을 용이하게한다.

CometChip : Microarrayed 인간의 세포에서 DNA 손상을 측정하기위한 높은 처리량 96 글쎄 플랫폼

혜성 분석은 다른 요인에 의해 유도 된 DNA 나누기를 측정한다. DNA 손상을 유발 (산화 스트레스를 제외한) 모든 요인들이 일정하게 유지되는 경우, DNA 손상의 양이 산화 스트레스 좋은 간접 파라미터이다. 이 프로토콜의 목적은 산화 적 스트레스의 간접적 인 측정에 혜성 분석을 사용하는 것이다.

전신 산화 스트레스의 간접 측정으로 혜성 분석

알칼리 혜성 분석은 진핵 세포에서 DNA 가닥 절단을 측정합니다. Endonuclease III 또는 human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step을 추가함으로써 이 분석은 산화적 DNA 손상을 효율적으로 검출할 수 있습니다. 우리는 쥐 간에서 DNA 손상을 검출하기 위하여 이 분석을 사용하는 방법을 기술한다.

쥐 간에서 DNA 가닥 나누기 및 산화 적 DNA 손상을 측정하기위한 생체 알카라인 혜성 분석 및 효소 수정 알카라인 혜성 분석에서

이 프로토콜은 DNA 손상을 평가하기 위해 혜성 분석실험에 사용하기 위해 부검 시 고품질 냉동 조직 샘플을 준비하기 위한 몇 가지 절차를 설명합니다: 1) 다진 조직, 2) 위장관에서 긁힌 상피 세포, 3) 큐브 조직 조직 다진 장치를 사용하여 균질화를 요구하는 샘플.

DNA 손상의 평가를 위한 혜성 분석에서 냉동 조직의 사용

혜성 분석은 DNA 손상을 감지하는 널리 사용되는 수단입니다. 이 연구는 혜성 분석의 대표적인 변형에서 슬라이드를 실행하는 접근 방식을 설명합니다. 이 접근 방식은 샘플 수를 크게 늘리는 동시에 분석 실행 시간, 슬라이드 조작 횟수 및 젤 손상 위험을 줄였습니다.

세포 DNA 손상 평가를 위한 고처리량 혜성 분석 접근법

이 프로토콜은 혜성 분석의 적용을 통해 FLT3 돌연변이 세포에서 유형 I 및 유형 II 억제제에 의해 유도된 DNA 손상의 차이를 정량화하는 효과적인 방법을 설명합니다.

유형 I 및 유형 II FLT3 억제제에 노출된 후 FLT3 돌연변이 발현 32D 세포에서 DNA 손상을 정량화하기 위한 혜성 분석

이 프로토콜 셀 셀 microenvironment를 유지 하면서 3 차원 설정의 마이그레이션 및 침입 기능을 계량 하는 데 사용할 수 있는 반전된 세로 침공 분석 결과를 설명 합니다. 이 분석 결과 희소 한 또는 민감한 세포에 적합 합니다.

위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

학습하세요 혜성 분석법을 이용한 암세포 DNA 손상 평가 방법을. 알칼리성 및 중성 조건에서 단일세포 수준의 DNA 파손을 정량적으로 측정하여 항암화학요법의 유전독성 효과를 연구할 수 있습니다.

DNA 손상 생체 외에서 혜성 분석 결과 사용 하 여 평가

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