DNA 손상 생체 외에서 혜성 분석 결과 사용 하 여 평가

이 실험의 전반적인 목표는 혜성 분석이라고도 하는 단일 세포 전기영동 분석을 사용하여 암세포에서 유전독성 물질의 효과를 조사하는 것입니다. 이 절차는 4가지 유전 독성 연구를 측정하는 의미입니다. 또한 조기 약물 후보 물질 선정 및 DNA 손상 및 복구에 대한 기초 연구와 같은 다양한 평가에 적용할 수 있습니다.

이 기술은 DNA 손상을 정량적으로 평가하는 직접적인 방법을 제공합니다. 또한 효율적이고 수행하기 쉬우며 상대적으로 저렴합니다. 1% 아가로스를 전자레인지에 2-3분 동안 또는 아가로스가 완전히 녹을 때까지 녹여 슬라이드 코팅을 위해 아가로스를 준비합니다.

유리 현미경 슬라이드를 아가로스에 담그고 보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 슬라이드의 한쪽 면을 닦습니다. 슬라이드를 평평한 표면에 놓고 자연 건조하십시오. 건조 후 투명한 아가로스 필름을 형성해야 합니다.

사용하기 전에 코팅된 슬라이드를 섭씨 37도에 두십시오. 화학요법의 치료 효과는 10% FBS, 페니실린 밀리리터당 100단위, 스트렙토마이신 밀리리터당 10마이크로그램이 보충된 DMEM/Ham F-12 배지에서 배양된 U251 신경교종 세포에서 평가됩니다. 1ml의 트립신을 사용하여 세포를 3분 동안 소화한 다음 FBS와 함께 DMEM/Ham F-12 배지를 사용하여 트립신을 중화합니다.

15ml 튜브에 세포를 모으십시오. 그리고 4분 동안 300회 G로 돌립니다. 매체를 흡입합니다.

그리고 1x PBS에서 밀리리터당 5번째 세포의 2배 10으로 세포를 현탁시킵니다. 세포와 분석은 시작하기 직전에 준비해야 합니다. 그리고 어둠 속에서 다루어야합니다.

손상을 방지하기 위해 모두 어두운 조명에서 촬영합니다. 세포 현탁액을 1%의 용융, 저융점 아가로스와 1:10의 부피 비율로 결합합니다. 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.

그리고 즉시 30 마이크로 리터를 슬라이드에 피펫으로 넣습니다. 피펫 팁의 슬라이드를 사용하여 아가로스 혼합물을 펴서 얇은 층을 형성합니다. 슬라이드를 섭씨 4도의 어두운 곳에서 10분 동안 평평하게 놓습니다.

슬라이드를 섭씨 4도의 용해 용액에 담그고 밤새 1시간 동안 어둠 속에서 담그십시오. 알칼리성 혜성 분석의 경우 용해 용액에서 슬라이드를 부드럽게 제거하고 과도한 액체를 배출한 다음 슬라이드를 섭씨 4도의 어둠 속에서 1시간 동안 AES에 부드럽게 담가 DNA가 풀릴 수 있도록 합니다. 전기영동 슬라이드 트레이에 미리 냉각된 AES를 추가합니다.

슬라이드 위로 0.5cm를 초과하지 마십시오. 슬라이드를 안에 넣고 캡으로 덮습니다. 전원 공급 장치 전압을 센티미터당 1볼트로 설정하고 섭씨 4도에서 30분 동안 작동합니다.

전기영동이 완료되면 슬라이드에서 과도한 AES를 배출합니다. 슬라이드를 실온의 증류수에 두 번 부드럽게 두 번 5분 동안 부드럽게 담그십시오. 그 후, 실온에서 5분 동안 슬라이드를 70% 에탄올에 부드럽게 담그십시오.

중성 혜성 분석의 경우 용해 용액에서 슬라이드를 부드럽게 제거하고 과도한 액체를 배출한 다음 섭씨 4도의 어둠 속에서 30분 동안 NES에 부드럽게 담그십시오. 전기영동 슬라이드 트레이에 미리 냉각된 NES를 슬라이드 위로 0.5cm 높이에서 추가합니다. 슬라이드를 안에 넣고 캡으로 덮습니다.

전원 공급 장치 전압을 센티미터당 1볼트로 설정하고 섭씨 4도에서 45분 동안 실행합니다. 슬라이드에서 초과 버퍼를 배출합니다. 30분 동안 실온에서 DNA 침전 용액에 슬라이드를 부드럽게 담그십시오.

30분 후, 30분 동안 온화한 실온에서 70% 에탄올에 슬라이드를 부드럽게 담그십시오. 섭씨 37도의 어둠 속에서 10-15분 동안 슬라이드를 건조하여 이 절차를 시작합니다. 다음으로, 각 슬라이드의 건조된 아가로스에 50-100마이크로리터의 녹색 형광 핵산 염색 용액을 놓고 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 염색합니다.

슬라이드를 증류수로 잠시 헹구고 어둠 속에서 섭씨 37도에서 완전히 건조시킵니다. 혜성 슬라이드를 염색한 직후 이미지 획득 및 분석을 수행합니다. 슬라이드 홀더가 있는 형광 현미경 아래에 슬라이드를 놓습니다.

10X 대물렌즈를 선택하고 아가로스 젤이 대물렌즈를 향하고 있는지 확인합니다. 각 염색된 혜성 슬라이드에서 이미지를 무작위로 캡처합니다. 가장자리와 기포 주변 영역을 피하십시오.

각 혜성 꼬리가 수평으로 분포되어 있는지 확인하십시오. 혜성의 머리는 왼쪽에서, 꼬리는 오른쪽에서 시작되어야 합니다. 각 사진을 밝은 DNA 염색과 어두운 배경의 바이너리 형식으로 저장하십시오.

이미지 분석을 위해 먼저 도구 모음 왼쪽에 있는 Select Files to Analyze 버튼을 사용하여 모든 이미지를 Comet 분석 소프트웨어에 로드합니다. 이미지 뷰 창이 나타나야 합니다. 화면에 측정 프레임을 그리고 세포의 혜성에 따라 크기를 조정합니다.

이미지에 따라 조정을 클릭하여 머리, 혜성 및 꼬리의 임계값을 설정합니다. 그런 다음 측정 시작을 클릭합니다. 프레임을 사용하여 셀을 선택하고 Assay the Comet 버튼을 클릭하여 측정을 활성화합니다.

강도 이미지가 선택한 측정 매개변수와 함께 프로필 창에 표시됩니다. Store Results 버튼을 클릭하여 결과를 저장합니다. 처리당 최소 50개의 세포를 분석합니다.

알칼리성 및 중성 혜성 분석 결과는 독소루비신으로 처리된 UT51 세포의 혜성 꼬리가 더 길고 DNA 강도가 더 높았음을 보여주며, 이는 단편화된 DNA가 상당히 축적되었음을 시사합니다. 알칼리성 또는 중성 혜성 분석에 대한 정량 분석은 독소루비신 처리 후 혜성 꼬리 형성이 크게 증가했음을 보여주었으며 이는 DNA 손상을 나타냅니다. PARP 억제제인 올라포립(olaporib)과 알킬화제인 테모졸로마이드(temozolomide)를 병용한 결과, 신경교종 세포의 DNA 손상이 크게 향상되었으며, 이는 혜성 꼬리 신호의 길이와 강도 증가에 의해 반영되었습니다.

올라포립(Olaporib) 단독으로는 DNA 손상이 발생하지 않았다. 그것이 temozolomide의 genotoxic 효력을 강화하는 곳에. 단일 및 복합 치료에서 신경교종 세포의 대표적인 이미지는 테모졸로마이드와 올라포립으로 처리된 세포의 더 길고 더 높은 강도의 혜성 꼬리를 보여주었습니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 5시간 안에 완료할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 유전독성 분야의 연구자들이 다양한 유형의 핵세포에서 DNA 끈 절단을 측정할 수 있는 길을 열었습니다. 배양된 세포 또는 유기체에서 분리된 세포와 같은.

이 비디오를 시청한 후에는 단일 세포 수준에서 유전독성 제제의 효과를 조사하기 위해 혜성 분석을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 손상 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 그리고 이 절차를 수행하는 동안 항상 실험복과 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.