CometChip : Microarrayed 인간의 세포에서 DNA 손상을 측정하기위한 높은 처리량 96 글쎄 플랫폼

이 절차의 전반적인 목표는 COMET 칩을 사용하여 포유류 세포에서 고처리량 DNA 손상 측정을 수행하는 방법을 시연하는 것입니다. 이는 먼저 포유류 세포를 COMET 칩에 로딩함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 DNA 손상을 일으키는 것으로 알려진 화학 물질로 세포를 처리하는 것입니다.

다음으로, 전통적인 COMET 분석 프로토콜을 사용하여 세포를 용해하고 전기영동을 수행합니다. 마지막 단계는 손상된 DNA의 이동을 시각화하기 위해 세포 DNA의 형광 이미징을 진행하는 것입니다. 최종적으로 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 DNA 손상 정도를 정량화합니다.

COMET 분석법은 아주 오래전부터 사용되어 왔으며, 다양한 종류의 DNA 손상을 관찰하는 데 매우 유용한 분석법입니다. 하지만 처리량이 매우 낮고 민감도가 부족하다는 문제점이 있었습니다. 이에 따라 저희는 COMET 칩을 개발하였는데, 이는 기본적으로 COMET 분석법의 초고처리량 버전으로, 예를 들어 약물 스크리닝이나 역학 연구를 위한 고처리량 스크리닝을 가능하게 합니다.

저희 연구실의 대학원생인 Jing GA가 실험 절차를 시연하겠습니다. coma 칩은 미세 가공된 스탬프를 통해 제작된 젤로, 단일 세포의 크기만큼 작은 직경의 마이크로 포스트(micro post)들로 구성된 마이크로 웰(micro well) 어레이가 형성되어 있으며, 이를 젤 본드 면이 아래로 향하게 하여 1웰 직사각형 플레이트에 배치합니다. 25 mL의 1X PBS로 젤을 두 번 세척한 후, coma 칩을 유리 플레이트 위에 올리고 젤의 방향을 그에 맞게 표시합니다.

이제 바닥이 없는 96-웰 플레이트를 뒤집어 젤 위에 조심스럽게 눌러, 96개 웰 전체가 젤 영역 내에 들어오도록 합니다. 그다음 1.5인치 바인더 클립을 사용하여 96-웰 플레이트의 양쪽을 유리판에 고정하십시오. 마지막으로, 각 웰에서 남은 과잉 PBS를 흡입하여 제거합니다.

표준 절차에 따라 부유 세포 또는 부착 세포를 수확하고, 배지를 사용하여 세포를 mL당 100,000에서 1,000,000 cells의 최종 농도로 희석합니다. 필요한 경우 세포 필터에 통과시켜 단일 세포 현탁액이 되었는지 확인하십시오. 준비된 CometChip 96-well 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 100 µL를 피펫으로 분주합니다.

증발을 방지하기 위해 플레이트를 젤 본드 필름으로 덮은 다음, 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 37 °C로 설정된 인큐베이터에 30분 동안 보관하십시오. 30분이 경과하면 각 웰에서 배지를 흡입하여 제거한 후, 바인더 클립과 바닥이 없는 96-웰 플레이트를 제거하십시오. 유리 플레이트가 기울어진 상태로 코멧 칩을 잡고 1x PBS로 부드럽게 헹구어 agarose 상단의 과잉 세포를 제거하십시오. 이제 명시야 현미경의 4x 대물렌즈를 통해 플레이트를 관찰하여 세포 로딩 상태가 최적인지 확인하십시오. 세포가 충분히 로딩되었다면, 코멧 칩을 평평한 표면에 놓고 37 °C로 예열된 1% 저융점 agarose를 오버레이하십시오.

오버레이가 상온에서 3분 동안 굳도록 둔 다음, 관심 화학 물질로 세포를 처리하기 위해 4 °C에서 5분 동안 두어 완전히 고정시킵니다. 먼저, 코멧 칩의 웰을 바닥이 없는 새 96-웰 플레이트의 웰과 조심스럽게 맞춘 다음 아래로 누릅니다. 이전과 같이 바인더 클립을 사용하여 96-웰 플레이트를 유리 플레이트에 고정합니다.

그 다음 플레이트를 얼음에 두고, 각 웰에 원하는 용량의 관심 화학 물질 100 microliters를 첨가합니다. 투여 후 원하는 시간 동안 조사 대상 화학 물질을 세포에 처리한 다음, 각 웰에서 화학 물질 용액을 흡입하여 제거하고 필요한 경우 XPBS로 한 번 헹굽니다. 겔을 각각의 조각으로 자릅니다. 그 후 수선 역학을 연구하기 위해 웰에 배양액을 넣고 배양한 다음, 특정 시점에 세포 용해를 진행하여 알칼리 혜성 분석(alkaline comet assay)을 위해 세포를 용해합니다.

알칼리 용해 스톡 용액에 1% Triton X 100을 첨가하여 칩당 약 25 milliliters의 작동 알칼리 용해 버퍼를 준비합니다. 그다지 4 °C에서 미리 냉각합니다. 코멧 칩보다 약간 더 큰 용기에 알칼리 용해 버퍼를 붓습니다.

그 다음, 알칼리 칩을 냉장 보관된 작업용 알칼리 용해 버퍼에 담가 냉장고에 넣고 4 °C에서 밤새 용해가 진행되도록 둡니다. 다음 날, 용해 버퍼에서 코멧 칩을 꺼내 1x PBS로 빠르게 헹굽니다. 그런 다음 칩의 겔 필름 면이 아래를 향하도록 전기영동 챔버에 배치하고 양면 테이프로 고정합니다.

챔버를 4 °C 저온실로 옮기고, 젤이 겨우 잠길 정도의 높이까지 차가운 알칼리 전기영동 버퍼를 채웁니다. 그런 다음, 알칼리 변성을 위해 칩을 4 °C에서 40분 동안 둡니다. 마지막으로, 1 V/cm 및 300 mA 조건에서 젤을 30분 동안 전기영동합니다.

저온실에서, 원하는 전행 전류를 얻기 위해 챔버 내 전기영동 완충액의 부피를 조절합니다. 중성 코멧 분석(neutral comet assay)의 경우, 중성 용해 스톡 용액(neutral lysis stock solution)에 1% Triton X 100 및 1% DMSO를 첨가하여 작동 중성 용해 완충액을 조제합니다. 이때, 칩당 약 25 milliliters의 작동 용해 완충액을 준비합니다.

작업용 중성 용해 버퍼를 43°C로 설정된 인큐베이터에 넣어 예열합니다. 중성 용해 버퍼가 가열되면, 콤마 칩을 중성 용해 버퍼에 담근 후 40°C 인큐베이터에서 하룻밤 동안 둡니다. 다음 날, 중성 용해 버퍼를 제거한 후 4°C에서 15분 동안 중성 전기영동 버퍼로 두 번 세척합니다. 매 세척 시마다 칩을 전기영동 챔버에 고정하고 저온실로 옮깁니다.

이전과 마찬가지로, 전기영동 챔버에 차가운 중성 전기영동 완충액을 겔이 겨우 잠길 정도로 채운 뒤 냉장실에서 60분 동안 방치합니다. 이후 냉장실에서 센티미터당 0.6 V, 6 mA의 조건으로 60분 동안 겔을 전기영동합니다. 필요한 경우, 원하는 전류값이 나오도록 챔버 내 전기영동 완충액의 부피를 다시 조정하십시오. 냉장실에서 com 칩을 꺼낸 후, 4 °C에서 중화 완충액으로 15분씩 두 번 세척하여 겔을 중화합니다.

Cyberg gold 또는 iridium bromide와 같은 형광 DNA 염색액을 사용하여 칩 상태를 유지하십시오. 제조사의 지침에 따라 염색한 후 형광 현미경으로 촬영한 이미지에서, 상단 패널은 처리되지 않은 TK six 림프모구에서 관찰되는 대표적인 마이크로웰 혜성(microwell comets)을 보여줍니다. 중간 패널은 50 micromolar hydrogen peroxide에 노출된 TK six 세포를, 하단 패널은 100 micromolar hydrogen peroxide에 노출된 세포를 나타냅니다.

모든 노출은 4°C에서 20분 동안 진행되었습니다. 이 선 그래프는 TK6 세포의 과산화수소 용량 반응을 보여줍니다. 각 데이터 포인트는 3회의 독립적인 실험 평균값이며, 각 실험당 최소 50개의 개별 코멧(comet)에서 얻은 꼬리 DNA의 중앙값 백분율을 산출하였습니다.

이 그래프는 과산화수소에 노출된 TK six 세포를 이용한 코마 칩 분석의 샘플 간 변동을 보여주며, 각 웰의 % tail DNA 데이터가 여기에 표시되어 있습니다. 각 상자는 각 웰에서 최소 50개의 개별 코멧의 중앙값을 나타냅니다. 12개 웰의 평균은 77.53%이며, 표준편차는 3.99%, 변동계수는 5.2%입니다. 이 그래프는 실험 간 변동을 보여줍니다.

동일한 과산화수소 노출을 6회 반복하였으며, 각 반복 실험의 데이터는 회색 막대로 표시되었습니다. 각 상자는 각 반복 실험에서 최소 100개의 개별 코멧(comet)으로부터 얻은 꼬리 DNA 백분율의 중앙값을 나타냅니다. 6회 반복 실험의 평균값은 49.57%이며, 여기서는 검은색 막대로 표시되었습니다.

6회 반복 실험의 표준 편차는 4.99%이며, 평균의 오차 막대는 일반적인 전통적 분석법과 마찬가지로 그림의 오차 막대로 표시된 2.04%입니다. 연구자는 이 절차를 수정하거나, 세포 내에서 생성된 DNA 손상 유형에 관한 추가적인 의문점을 해결하기 위해 정제된 병변 특이적 효소를 포함하는 등 다른 방법을 자유롭게 사용할 수 있습니다. 코멧 칩 기술은 포유류 세포 연구의 길을 열어 DNA 손상 및 복구에 관한 이해를 도왔습니다.

또한, 고처리량 방식이기 때문에 이전에는 샘플 수의 제한으로 인해 불가능했던 임상 및 역학 연구를 수행하는 것이 가능해졌습니다.