CometChip : Microarrayed 인간의 세포에서 DNA 손상을 측정하기위한 높은 처리량 96 글쎄 플랫폼

이 절차의 전반적인 목표는 COMET 칩을 사용하여 포유류 세포에서 고처리량 DNA 손상 측정을 수행하는 방법을 시연하는 것입니다. 이것은 먼저 포유류 세포를 COMET 칩에 로드함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 DNA 손상을 일으키는 것으로 알려진 화학 물질로 세포를 처리하는 것입니다.

다음으로, 세포를 용해시키고 전통적인 COMET 분석 프로토콜을 사용하여 Electro East를 사용합니다. 마지막 단계는 손상된 DNA의 이동을 시각화하기 위해 세포 DNA의 형광 이미징입니다. 궁극적으로 이미지 분석 소프트웨어는 DNA 손상 정도를 정량화하는 데 사용됩니다.

com assay는 정말 오랫동안 사용되어 왔으며 다양한 종류의 DNA 손상을 살펴보는 데 매우 유용한 분석법입니다. 그러나 문제는 처리량이 정말 낮고 감도가 부족하다는 것입니다. 그래서 우리는 COMET 칩을 만들었는데, 이 칩은 기본적으로 COMET 분석법의 매우 높은 처리량 버전으로, 예를 들어 약물 스크리닝과 역학 연구를 위한 고처리량 스크리닝을 가능하게 합니다.

제 연구실의 Jing GA 대학원생이 절차를 시연할 예정입니다. 혼수 상태 칩은 1개의 좋은 직사각형 판 젤 노예 영화 측으로 아래로 장소로 장소를 시작하기 위하여 단 하나 세포의 그것 처럼 작은 직경을 가진 마이크로 포스트를 가진 마이크로 날조된 우표에서 생성한 마이크로 우물의 배열을 가진 젤입니다. 한 XPBS에서 25ml로 젤을 두 번 세척한 후 유리판에 쉼표 칩을 놓고 그에 따라 젤의 방향에 라벨을 붙입니다.

이제 뒤집힌 바닥이 없는 96웰 플레이트를 젤에 부드럽게 눌러 96웰이 모두 젤 영역 내에 있도록 합니다. 그런 다음 96웰 플레이트의 양쪽을 1.5인치 바인더 클립으로 유리판에 끼웁니다. 마지막으로, 각각에서 과도한 PBS를 흡인합니다.

표준 절차에 따라 현탁액 또는 부착 세포를 잘 수확하고 배지로 세포를 100, 000에서 밀리리터당 100만 개의 세포의 최종 농도로 희석합니다. 필요한 경우 셀 필터를 통과하여 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있는지 확인합니다. 피펫 100 마이크로 리터의 세포 현탁액을 각 웰에 넣고, 완성되면 혜성 칩 96 웰 플레이트를 만듭니다.

증발을 방지하기 위해 플레이트를 젤 본드 필름으로 덮은 다음 인큐베이터에서 플레이트를 제거한 후 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다. 30분이 경과하면 각각에서 매체를 흡인하고 바인더 클립과 바닥이 없는 96 웰 플레이트를 제거합니다. 유리판이 있는 혜성 칩을 비스듬히 잡고 하나의 XPBS로 부드럽게 헹구어 aros 상단의 여분의 세포를 제거합니다. 이제 명시야 현미경의 4x 대물 렌즈를 통해 플레이트를 보고 최적의 세포 로딩을 확인합니다.충분한 세포가 로드된 후 섭씨 37도로 예열된 1%의 낮은 융점 아그로스가 있는 오버레이인 평평한 표면에 com 칩을 놓습니다.

오버레이가 실온에서 3분 동안 응고되도록 한 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 배치하여 관심 화학 물질로 세포를 투여합니다. 먼저, 혜성 칩의 웰을 바닥이 없는 새로운 96 웰 플레이트의 웰에 조심스럽게 정렬하고 아래로 누릅니다. 이전과 같이 바인더 클립으로 96웰 플레이트를 유리판에 고정합니다.

그런 다음 플레이트를 얼음 위에 놓고 원하는 용량으로 관심 화학 물질 100마이크로리터를 추가합니다.각 웰에 조사 중인 화학 물질이 투여 후 원하는 기간 동안 세포에 남아 있도록 하고 각 웰에서 화학 용액을 흡인하고 필요한 경우 하나의 XPBS로 헹굽니다. 젤을 별도의 조각으로 자릅니다. 그런 다음 복구 동역학을 연구하기 위해 웰에 배양 배지를 추가하고, 배양하고, 알칼리 혜성 분석을 위해 특정 시점에서 LY 세포에 대한 세포 용해를 진행합니다.

알칼리 용해 원액에 1%Triton X 100을 첨가하여 각 칩에 대해 약 25mL의 작동 알칼리 용해 완충액을 준비합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 미리 식힙니다. 알칼리성 용해 완충액을 혜성 칩보다 조금 큰 용기에 디캔팅합니다.

그런 다음 알칼리 칩을 냉장고의 냉장 작업 알칼리 용해 완충액 장소에 담그고 섭씨 4도에서 밤새 용해를 진행하도록 합니다. 다음 날, lysis buffer에서 혜성 칩을 제거하고 하나의 XPBS로 빠르게 rens합니다. 그런 다음 겔 필름 면이 아래를 향하도록 하여 칩을 전기영동 챔버에 넣고 양면 테이프로 고정합니다.

챔버를 섭씨 4도의 냉장실로 가져가 겔을 덮는 수준까지 차가운 알칼리 전기영동 버퍼로 챔버를 채웁니다. 그런 다음 칩을 섭씨 4도에서 40분 동안 그대로 두어 알칼리성이 풀릴 수 있도록 합니다. 마지막으로 젤을 센티미터당 1볼트와 300밀리암페어에서 30분 동안 실행합니다.

냉장실에서 챔버의 전기영동 버퍼의 부피를 조정하여 원하는 작동 전류를 달성하십시오. 중성 혜성 분석의 경우 중성 용해 원액에 1%Triton X 110%DMSO를 첨가하여 작동하는 중성 용해 완충액을 만듭니다. 다시 말하지만, 각 칩에 대해 약 25ml의 작동 용해 버퍼를 준비합니다.

작동 중성 용해 버퍼를 섭씨 43도로 설정된 인큐베이터에 넣어 예열합니다. 중성 용해 완충액이 가열된 후 쉼표 칩을 중성 용해 완충액에 담그고 섭씨 40도의 인큐베이터에 밤새 넣습니다. 다음날, 중립 lysis 완충액을 제거하고 그 후에 4 섭씨 온도에 15 분 동안 중립 전기 이동법 완충액으로 두번 res, 전기 이동법 약실에 있는 칩을 장악하고 찬 방에 옮깁니다.

이전과 같이, 전기 영동 챔버를 차가운 중성 전기 영동 버퍼로 겔을 덮는 수준까지 채우고 겔을 60 분 동안 차가운 방에 앉아있게 한 다음 차가운 방에서 60 분 동안 센티미터당 0.6 볼트와 6 밀리 암페어로 겔을 실행합니다. 다시 말하지만, 필요한 경우 원하는 작동 전류를 얻을 수 있도록 챔버 내 전기영동 버퍼의 부피를 조정합니다. 냉장실에서 컴칩을 꺼낸 후 섭씨 4도에서 각각 15분씩 두 번씩 세척 및 중화 버퍼를 사용하여 젤을 중화합니다.

cyberg gold 또는 iridium bromide와 같은 형광 DNA 염색으로 칩에 남아 있습니다. 제조업체의 지침과 형광 현미경을 사용한 이미지에 따르면 처리되지 않은 TK의 대표적인 Microwell 혜성이 이 다이어그램의 상단 패널에 표시되어 있습니다. TK 6 개의 세포에서 중간 패널에 50 마이크로 몰의 과산화수소와 하단 패널에 100 마이크로 몰의 과산화수소에 노출

모든 노출은 섭씨 4도에서 20분 동안 이루어졌습니다. 이 선 그래프는 TK 6 세포의 과산화수소 용량 반응을 보여줍니다. 각 데이터 포인트는 각 실험에서 최소 50개의 개별 혜성의 중간 백분율 꼬리 DNA를 얻은 세 가지 독립적인 실험의 평균입니다.

이 그래프는 각 웰의 TK 6개 세포에 노출된 과산화수소 퍼센트 꼬리 DNA 데이터에 대한 쉼표 칩 분석의 샘플 대 샘플 변동을 보여줍니다. 각 상자는 각 우물에서 최소 50개의 개별 혜성의 중앙값을 나타냅니다. 12웰의 평균은 77포인트, 53%, 표준편차는 3.99%, 변동계수는 5.2%입니다.이 그래프는 실험 간 변동을 보여줍니다.

동일한 과산화수소 노출을 6번 반복했으며 각 반복의 데이터는 회색 막대로 표시됩니다. 각 상자는 각 반복에서 최소 100개의 개별 혜성의 중간 퍼센트 꼬리 DNA를 나타냅니다. 6회 반복의 평균은 49.57%입니다.여기에서 백 바에 표시됩니다.

6개 반복의 표준 편차는 4.99%이고 평균의 오차 막대기는 2.04%이며 전통적인 일반적인 분석실험과 같은 그림에서 에어 바입니다. 연구자들은 이 절차를 자유롭게 수정하거나 정제된 병변 특정 효소를 포함하는 것과 같은 다른 엉망진창을 사용하여 세포에서 생성된 DNA 손상 유형에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 혜성 칩 기술은 DNA 손상과 복구에 대해 배울 수 있는 포유류 세포 연구의 길을 열었습니다.

또한 처리량이 많기 때문에 이전에는 샘플 수로 인해 불가능했던 임상 및 역학 연구를 수행할