꼬마 선 충 나이 연구 변화 내재 단백질 집계에 방법

이 실험의 전반적인 목표는 예쁜꼬마선충에서 나이에 따른 단백질 불용성의 변화를 감지하고 표적 유전자 녹다운이 이 노화 마커에 어떤 영향을 미치는지 평가하는 것입니다. 이 방법은 노화 및 단백질 단백질화 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어 유기체가 나이가 들어도 건강한 단백질체를 유지하지 못하는 이유와 같은 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 질병 과정이 없는 상태에서 정상적인 노화 동안 단백질 응집을 연구할 수 있는 기회입니다.

이 방법은 예쁜꼬마선충의 단백질 응집에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 예를 들어 마우스의 노화 관련 단백질 불용성을 연구하기 위해 다른 모델 유기체에도 적용할 수 있습니다. 처리를 시작하려면 207.45ml의 S Basal 배지를 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 추가 시약과 함께 2,800mL Fernbach 배양 플라스크에 추가합니다. 밀리리터당 50마이크로그램의 카르베니실린과 1밀리몰의 IPTG의 최종 농도를 추가하고 멤브레인 나사 캡으로 플라스크를 닫습니다.

섭씨 25도의 인큐베이터에서 L1을 꺼내 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. L1을 1, 900회 g에서 3분 동안 원심분리한다. 탈수 후 상층액을 제거하십시오.

현미경으로 2마이크로리터당 L1을 세고 최소 9방울에서 얻은 수치의 평균을 구합니다. 다음으로, 50, 젊은 벌레 수집을 위한 000마리의 벌레를 추가하고 100, 이전 단계에서 준비한 4개의 Fernbach 배양 플라스크에 노화된 벌레 수집을 위한 000마리의 벌레를 추가합니다. 그런 다음 관심 유전자에 대한 대조군 RNAi 박테리아와 RNAi 박테리아를 벌레의 수에 비례하여 추가합니다.

박테리아를 첨가한 후 S Basal로 지렁이 배양을 완료하여 총 부피를 300ml로 만듭니다. 채취 할 때까지 150rpm의 진탕 인큐베이터에서 섭씨 25도의 기생 배양을 배양합니다. 2일차 또는 3일차에 어린 지렁이를 수집하여 단백질 용해도의 기초 수준을 측정합니다.

한 플라스크의 지렁이를 분리 깔때기에 붓고 실온에서 10분 동안 지렁이를 침전시킵니다. 벌레가 침전된 후 스톱 콕을 열고 벌레를 하나의 50ml 튜브에 떨어뜨립니다. 다음으로, 웜 펠릿을 두 개의 15ml 튜브로 나눕니다.

튜브에 M9를 15ml까지 채우고 벌레를 원심 분리하십시오. 벌레를 씻으려면 상등액을 제거하고 튜브에 M9를 최대 15ml까지 채웁니다. 원심분리를 반복합니다. 세척이 완료되면 웜을 두 개의 50ml 튜브로 옮기고 얼음처럼 차가운 M9를 사용하여 총 부피를 20ml로 채웁니다.

박테리아와 죽은 벌레를 제거하려면 20밀리리터의 얼음처럼 차가운 60% 자당으로 채워진 2개의 50밀리리터 튜브에 2개의 20밀리리터 희석된 벌레 알갱이를 추가합니다. 튜브를 빠르게 원심분리하십시오. 25 밀리리터 피펫으로 상단 웜 층을 최대 15 밀리리터까지 조심스럽게 제거합니다.

얼음 위에 준비된 37ml의 M9와 옥톡시놀-9에 상단 웜 층을 직접 놓습니다. 그런 다음 2, 700 회 g에서 섭씨 4도 가속 9 및 감속 7에서 3 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 상등액을 버린 후 펠릿을 4개의 15ml 튜브에 옮기고 얼음처럼 차가운 M9와 옥톡시놀-9로 두 번 세척합니다.

그런 다음 튜브를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 얼음처럼 차가운 M9와 옥톡시놀-9로 튜브를 15ml 표시까지 채웁니다. 얼음처럼 차가운 M9로 벌레를 씻고 4개의 튜브를 2개의 튜브로 결합합니다.

튜브를 15ml로 채우고 원심분리기를 합니다. 상층액을 제거하고 실온에서 두 개의 튜브를 M9로 총 4ml까지 채운 다음 섭씨 25도의 너트 믹서에서 40분 동안 회전시킵니다. 너트 팅 후 얼음처럼 차가운 M9와 옥톡시놀-9로 벌레를 두 번 씻습니다.

그런 다음 M9로 두 번 씻고 벌레를 하나의 튜브로 옮깁니다. 채취 전에 억제제가 없는 재조립 또는 RAB 고염 추출 완충액에서 기생충을 세척합니다. 웜 펠릿 위에 액체가 없을 때까지 상등액을 제거합니다.

그런 다음 웜 펠릿의 부피를 추정하고 억제제와 함께 동일한 부피의 RAB를 추가합니다. 드라이 아이스에 액체 질소로 반쯤 채워진 50 밀리리터 튜브를 준비하고 파스퇴르 피펫을 사용하여 벌레를 끌어 올려 튜브에 천천히 떨어 뜨립니다. 액체 질소가 증발하도록 하고 추가 처리가 있을 때까지 냉동 벌레를 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

액체 질소로 모르타르를 식히고 드라이 아이스에서 동물 파괴를 수행합니다. 얼린 벌레를 미리 냉각된 모르타르에 옮기고 2.5분 동안 갈아줍니다. 분말에 액체 질소 100ml를 넣고 2.5분 더 분쇄합니다.

현미경을 사용하여 지렁이 몸체가 작은 조각으로 부서져 있는지 확인합니다. 그런 다음 분말을 2 밀리리터 튜브에 옮기고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 드라이아이스에서 시점당 350mg의 지상 지렁이와 RNAi 박테리아당 2배의 무게를 2개의 밀리리터 튜브에 넣습니다.

고염 용해성 단백질을 제거하려면 억제제가 포함된 이미 제조된 RAB의 중량당 2부피, 1밀리몰 PMSF, 밀리리터 DNase I당 200 단위 및 밀리리터 RNase A당 100 마이크로그램을 각 튜브에 추가하고 분말을 얼음에 용해시킵니다. 현탁액을 1ml 주사기에 15회 빨아 넣고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 18, 400 회 g에서 섭씨 4도에서 20 분 동안 원심 분리기.

지방층을 통과하여 고염 용해성 단백질을 함유한 상등액을 조건별 2밀리리터 튜브 1개에 모읍니다. 지방을 제거하고 버리십시오. 고염 용해성 단백질을 섭씨 영하 80도에서 동결하는 부분 표본.

지질을 버리려면 DNase I 및 RNase A가 없는 1개의 몰 자당을 포함하는 억제제로 펠릿을 700마이크로리터의 RAB로 가용화합니다.현탁액을 주사기에 10회 추출하고 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 반드시 상층액과 지질을 모두 제거하고 버리십시오. SDS 용해성 단백질을 제거하려면 펠릿을 700마이크로리터의 RIPA 완충액으로 용해시킵니다.

현탁액을 주사기에 10회 빨아 넣고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 18, 400g에서 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리기. SDS 용해성 단백질을 함유한 상등액과 영하 80도에서 동결하기 위한 분취액을 수집합니다.

각 펠릿을 500마이크로리터의 RIPA 완충액으로 가용화한 후 각 조건의 두 샘플을 함께 풀링하고 현탁액을 주사기에 10회 끌어올립니다. 상층액을 모두 제거하여 버리도록 주의하십시오. 불용성 단백질을 함유한 최종 펠릿을 400마이크로리터 70% 포름산으로 용해시키고 현탁액을 주사기로 20회 끌어올립니다.

얼음 위에서 20분 동안 현탁액을 배양합니다. 울트라 원심분리기 튜브의 현탁액을 원심분리하여 벌레 표피 파편을 제거합니다. 불용성이 높은 단백질을 함유한 상등액을 모아 영하 80도에서 얼립니다.

어린 기생충과 늙은 기생충의 불용성 단백질 함량을 전체적으로 염색한 결과, 장수 동물이 아닌 대조군 동물에서 고불용성 단백질 수치가 노화와 관련하여 크게 증가한 것으로 나타났습니다. 예측된 프리온 유사 도메인을 가진 RNA 결합 단백질인 PAB-1의 항체 염색을 통해 장수 동물이 나이가 들어도 PAB-1 용해성을 유지한다는 질량 분석 데이터를 확인했습니다. 인두근에서 tagRFP PAB-1을 발현하는 형질전환 동물에 대한 생체 내 분석을 수행했습니다.

어린 동물에서 tagRFP PAB-1은 주로 인두 전체에 분산되어 위치했습니다. 나이가 들면서 후인두구(posterior pharyngeal bulb)에서 시작하여 밝은 반점(puncta)에 점진적으로 축적됩니다. 노화 과정에서, 우리는 또한 점점 더 많은 수의 동물에서 전인두구(anterior pharyngeal bulb)의 응집

야생형 및 daf-2 돌연변이 배경의 연령에 따른 다양한 tagRFP PAB-1 응집 수준을 정량화하면 수명이 긴 동물에서 연령에 따라 크게 지연된 tagRFP PAB-1 응집이 나타납니다. 이 동영상을 시청한 후에는 단백질 추출을 위해 많은 수의 기생충을 수집하는 방법과 질량 분석기 또는 SDS 페이지에서 추가 분석을 위해 불용성이 높은 대형 응집체를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.