Name: 꼬마 선 충 나이 연구 변화 내재 단백질 집계에 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 배우세요 C. elegans를 이용한 노화 관련 단백질 불용성 변화 분석 방법입니다. 유전자 녹다운 기법으로 프로테오스타시스 메커니즘을 연구하고 노화 마커를 평가할 수 있습니다.

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이 작품은 DZNE와 마리 퀴리 국제 재통합 그랜트 (D.C.D.에 322120)에서 기금에 의해 지원 되었다

<ol><li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+proteostasis+for+disease+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li>
<li>David, D. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23181070">Aging and the aggregating proteome.</a> Frontiers in genetics. 3, 247(2012).</li>
<li>Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperones+in+protein+folding+and+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperones in protein folding and proteostasis.</a> Nature. 475, 324-332 (2011).</li>
<li>Ayyadevara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-+and+Hypertension-Associated+Protein+Aggregates+in+Mouse+Heart+Have+Similar+Proteomic+Profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles.</a> Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).</li>
<li>David, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+protein+aggregation+as+an+inherent+part+of+aging+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans.</a> PLoS biology. 8, 1000450(2010).</li>
<li>Demontis, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO%2F4E-BP+signaling+in+Drosophila+muscles+regulates+organism-wide+proteostasis+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging.</a> Cell. 143, 813-825 (2010).</li>
<li>Lechler, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Insulin%2FIGF-1+Signaling+Restores+the+Dynamic+Properties+of+Key+Stress+Granule+Proteins+during+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging.</a> Cell reports. 18, 454-467 (2017).</li>
<li>Reis-Rodrigues, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+age-dependent+changes+in+protein+solubility+identifies+genes+that+modulate+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+cell%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan.</a> Aging cell. 11, 120-127 (2012).</li>
<li>Tanase, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Carbonyl+Modifications+on+Aging-Associated+Protein+Aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation.</a> Scientific reports. 6, 19311(2016).</li>
<li>Walther, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+Proteome+Remodeling+and+Aggregation+in+Aging+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans.</a> Cell. 161, 919-932 (2015).</li>
<li>Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+paired+helical+filament+tau+and+normal+tau+from+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue.</a> Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).</li>
<li>Goudeau, J., Aguilaniu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonylated+proteins+are+eliminated+during+reproduction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+cell%22%5BJournal%5D)">Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans.</a> Aging cell. 9, 991-1003 (2010).</li>
<li>Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+Aging+Drives+Protein+Accumulation+in+the+Uterus+and+Limits+Lifespan+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans.</a> PLoS genetics. 11, 1005725(2015).</li>
<li>Uno, M., Nishida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan-regulating+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Npj+Aging+And+Mechanisms+Of+Disease%22%5BJournal%5D)">Lifespan-regulating genes in C. elegans.</a> Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010(2016).</li>
<li>Sulston, J. H. <a target="_blank" href="NULL">The Nematode Caenorhabditis elegans</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).</li>
<li>Maine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+As+a+tool+for+understanding+germline+development+in+Caenorhabditis+elegans%3A+uses+and+cautions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions.</a> Developmental biology. 239, 177-189 (2001).</li>
<li>Rauniyar, N., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isobaric+labeling-based+relative+quantification+in+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteome+research%22%5BJournal%5D)">Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics.</a> Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).</li>
<li>Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+polyglutamine+pathogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans.</a> Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).</li>
<li>Fay, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+genetic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Classical genetic methods.</a> WormBook. , 1-58 (2013).</li>
<li>Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+enhances+the+heat+shock+response+and+decreases+polyglutamine+aggregation+in+an+HSF-1-dependent+manner+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).</li>
<li>Angeli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+synthesis+inhibitor+is+protective+against+proteotoxic+stressors+via+modulation+of+fertility+pathways+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).</li>
<li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9, 85964(2014).</li>
<li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li>
<li>Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+and+insulin+signaling+regulate+reproductive+aging+via+oocyte+and+germline+quality+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance.</a> Cell. 143, 299-312 (2010).</li>
<li>Andux, S., Ellis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+maintains+oocyte+quality+in+aging+Caenorhabditis+elegans+females%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females.</a> PLoS genetics. 4, 1000295(2008).</li>
<li>Vilchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPN-6+determines+C.+elegans+longevity+under+proteotoxic+stress+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions.</a> Nature. 489, 263-268 (2012).</li>
<li>Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+elongation+factor+that+links+signals+from+the+reproductive+system+to+lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 5, 1000639(2009).</li>
<li>Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+the+Trade-Off+between+Somatic+Proteostasis+and+Reproduction+in+Caenorhabditis+elegans+Models+of+Polyglutamine+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases.</a> Front Mol Neurosci. 10, 101(2017).</li>
<li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+adult+neuronal+IIS%2FFOXO+transcriptome+reveals+adult+phenotype+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators.</a> Nature. 529, 92-96 (2016).</li>
<li>Kawarabayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+brain%2C+CSF%2C+and+plasma+amyloid+%28beta%29+protein+in+the+Tg2576+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).</li>
<li>Kraemer, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+and+defective+neurotransmission+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리는 매우 불용 성 단백질 질량 분석 및 서쪽 blotting에 의해 분석을 위한 RNAi를 받게 되는 선 충 C. 노화에서 집계를 분리 하는 방법을 보고 합니다. 우리는 그 연령에 따라 단백질 집계 방지 proteostasis IIS를 크게 줄임으로써 향상을 보여줍니다. 특정 집계 경향이 단백질 C. 선 충에서 overexpress을 선택 하 여 추가 고유의 단백질 집계를 변조 하는 메커니즘을 해 부 수는.
질병 관련 단백질 집계 대 고유의 연령에 따라 단백질 집계 이 현재 작업 단백질 집계는 질병의 맥락에서 집계 하는 특정 단백질을 제한 하는 이전 연구 결과 기반으로 합니다. Ectopically 표현된 질병 관련 단백질 보다는 내 생 집계 경향이 단백질에 집중 함으로써, 기대 집계 과정의 생리 규제에 새로운 통찰력을 제공 하는. 연령에 따라 단백질 집계는 서로 다른 세포 위치<sup class="xr...

단백질 misfolding 및 집계 AD, PD, 루 경화 증 (ALS), frontotemporal 치 매 (FTD), 그리고 많은 다른 같은 여러 신경 퇴행 성 질환의 특징으로 인식 됩니다. 예를 들어, 녹말 체 소에 α-synuclein 어셈블리는 악화 모터 신경에 있는 양식 세포질 집계에 ALS 환자 TDP-43 또는 FUS misfold에 PD 환자의 substantia nigra에 특히 Lewy 몸으로 축적. 각 이러한 신경 퇴행 성 질환, 단백질 항상성 또는 proteostasis를 유지 하는 메커니즘 질병에 따라서 선도 misfolded 단백질의 축적을 방지 하기 위해 실패 합니다.
Proteostasis 세포 기능을 보장 하기 위해 중요 한 이며, 정상적인 조건 하에서 이러한 규제 메커니즘 단단히 단백질 합성, 접는, 그리고 성능 저하의 속도 제어 합니다. 여러 연구 결과 입증 노화, 수 많은 세포와 장기의 단백질 항상성 유지가 점차적으로 손상 된과 나이 proteostasis 네트워크의 생리 적 저하는에 대 한 중요 한 악화 요인 신경 퇴행 성 질병 (참조1,2,3검토). 사실 단백질 품질 관리 및 펼친된 단백질 스트레스 세포 응답 나이 손상 단백질 misfolding 및 집계 노화의 일반적인 결과 수 제안 합니다. 사실, 우리와 다른 증명 단백질 집계는 질병을 제한 하 고 대신는 프로테옴의 일부 세 동물4,,56,7 세제 불용 성 높게 된다 ,8,,910. 계산 그리고 vivo에서 분석 이러한 생리 연령 관련 집계 여러 측면5질병 집계 닮은 밝혔다. 내 인 성, 연령에 따라 단백질 집단의 발견 우리 ectopically 표현된 인간의 질병 관련 단백질을 사용 하지 않고 단백질 집계, 조절 분자 및 세포 메커니즘을 해 부를 기회를 제공 합니다. 현재, 제한 된 정보만 광범위 한 단백질 용해성의 규칙에 대 한 고 생물의 건강에이 dysregulation의 효과 대 한 존재합니다.
선 충 C. 선 충 이 동물 상대적으로 짧은 수명이 있고 더 높은 유기 체에서 관찰 된 많은 특성 에이징 기능을 표시 조사를 노화에서 가장 광범위 하 게 연구 모형 유기 체 중 하나입니다. 용해성 단백질에 노화의 효과 추출 질병 집계 neurodegeneration 연구11의 분야에서 널리 이용 되는 차동 용 해도에 따라 순차 생 화 확 적인 분류에 의해 C. 선 충 에서 연구 . 양이 많은 질량 분석에 의해 몇 백 단백질 집계-경향이 된다 C. 선 충 에 질병5의 부재를 보였다. 여기 우리가 자세히 설명 액체 문화와 서쪽 오 점 하 여 질량 분석 및 분석 하 여 정량화에 대 한 집계 된 단백질을 순차 추출에 벌레의 많은 수를 성장 하는 프로토콜. 집계 하기 쉬운 단백질을 misfolded 세에 축적 하기 때문에 다른 체세포 조직5,,1213에 선 충 C. 생식 선 및 마스크 변경, 우리를 사용 하 여 생식이 돌연변이 단백질 분석 초점 비 생식 조직에 용해성입니다. 제시 하는 방법에는 0.5 %SDS 불용 성 및 상대적으로 낮은 원심 속도 의해 수송과 매우 불용 성, 큰 집계 분석 수 있습니다. 또한 작고 더 녹는 집계 수집 하 덜 엄격한 추출 프로토콜 또는 되었습니다 다른 곳에서10출판. 또한, 집계에서 vivo에서 C. 선 충에 평가 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다.
전반적으로, RNA 간섭 (RNAi)와 함께에서 이러한 메서드는 연령에 따라 단백질 집계 변조에 관심사의 유전자의 역할을 평가할 수 있다. 이 대 한 우리와 RNAi를 사용 하 여 관심사의 특정 단백질의 분해 없이 젊고 세 벌레에서 추출의 분석을 설명 합니다. 이러한 메서드는 단백질 용해성을 조절 하는 proteostasis 네트워크의 구성 요소를 결정 하는 강력한 도구 이어야 한다. 여러 중재와 같은 감소 인슐린/인슐린 같은 성장 인자 (IGF)을 극적으로 선 충 C. 노화14지연 표시 1 신호 (IIS). 장 수 경로 종종 단백질 품질 관리 메커니즘을 유발 하 고 따라서 이러한 경로 수 적극적으로 영향을 미치는 수 단백질 집단의 속도. 예를 들어, IIS 경로7의 억제에 따라 수명이 긴 동물에 감소 고유의 단백질 집합을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Fernbach 문화 플라스크&nbsp;</td><td>Corning</td><td>4425-2XL</td><td>Pyrex, 용량 2,800 ml, 3개의 배플 인덴트</td></tr><tr><td>포함 멤브레인 스크류 캡&nbsp;</td><td>Schott</td><td>1088655</td><td>GL45</td></tr><tr><td>Nutating Mixer</td><td>VWR</td><td>444-0148</td><td></td></tr><tr><td>분리 퍼넬</td><td>Nalgene</td><td>4300-1000</td><td>용량 1,000 ml</td></tr><tr><td>1 ml 주사기&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>회색 바늘, 27 G x &frac12; ", 0.4 mm x 13 mm</td><td>BD Microlance 3</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>멤브레인 필터 0.025 &마이크로; M</td><td>Millipore</td><td>VSWP04700</td><td></td></tr><tr><td>pH 스트립</td><td>Machery-Nagel</td><td>92110</td><td>pH-Fix 0-14</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>완전한 미니 EDTA-무료 정제&nbsp;</td></tr><tr><td>옥톡시놀-9&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1388</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1317</td><td></td></tr><tr><td>Nonylphenylpolyethylenglycol</td><td>Applichem</td><td>A1694</td><td>Nonidet P40 (NP40)</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Roche</td><td>04716728001</td><td>재조합, RNase free</td></tr><tr><td>RNaseA</td><td>Promega</td><td>A7973</td><td>용액</td></tr><tr><td>총 단백질 블롯 염색</td><td>Thermofisher</td><td>S11791</td><td>Sypro Ruby 단백질 블롯 염색</td></tr><tr><td>총 단백질 겔 염색</td><td>Thermofisher</td><td>S12001</td><td>Sypro Ruby 단백질 겔 염색</td></tr><tr><td>TCEP (트리스 (2-카르복시에틸) 포스핀 염산염)</td> <td>Serva</td><td>36970</td><td></td></tr><tr><td>요오드 아세트 아미드</td><td>Serva</td><td>26710</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 바이 카보네이</td>트 <td>시그마 - 알드리치</td><td>09830</td><td></td></tr><tr>상대 및 절대 정량 분석을 위한 염<td>기서열분석 등급 변형 Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>등압 태그</td><td>Sciex</td><td>4352135</td><td>iTRAQ 시약 멀티플렉스 키트</td></tr><tr><td>원심분리기 Avanti J-26XP</td><td>Beckmann Coulter</td><td>393126</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Optima Max-XP</td><td>Beckmann Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>5404000413</tr><tr><td>Centrifuge 5702</td><td>Eppendorf</td><td>5702000329</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Megafuge 40R</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004518</td><td></td></tr><tr><td>Concentrator Plus</td><td>Eppendorf</td><td>5305000304</td><td>Centrifugal ecentrator</td></tr><tr><td>형광 실체 현미경 M165 FC&nbsp;</td><td>라이카</td><td></td><td>플라나포 2.0x 대물</td></tr><tr><td>박부 해부 현미경</td><td>라이카&nbsp;</td><td></td><td>Leica S6E</td></tr><tr><td>고배율 현미경 Zeiss Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>with PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analysis of mass spectrometry data Protein</td><td>Prospector</td><td></td><td></td></tr><tr><td>http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htmE.coli strain</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAi bacteria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L4440</td><td>Julie Ahringer RNAi library</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. elegans mutants</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CF2253</td><td>CGC, 균주 이름: EJ1158&nbsp;</td><td></td><td>유전자형: gon-2(q388)</td></tr><tr><td>C. elegans transgenics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DCD214</td><td>DZNE T&uuml의 Della David의 연구실; bingen</td><td></td><td>유전자형: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]</td></tr><tr><td>DCD215</td><td>DZNE T&uuml의 Della David의 연구실; bingen</td><td></td><td>유전자형: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]</td></tr></tbody></table>

꼬마 선 충 나이 연구 변화 내재 단백질 집계에 방법

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

마지막 십 년간에서 Alzheimer의 질병 (광고) 등 파 킨 슨 병 (PD), 신경 장애의 보급은 성장 했다. 이 나이 관련 무질서는이 환자의 두뇌에 있는 fibrillary 구조 단백질의 모양 특징. 일반적으로 수용 성 단백질을 받을 이유는 정확 하 게 집계 프로세스를 제대로 이해 남아 있습니다. 발견 단백질 집계 질병 프로세스에 국한 되지 않습니다 정상적인 노화 과정의 일부 단백질 집계, ectopically를 사용 하지 않고 조절 분자 및 세포 메커니즘의 연구를 활성화 하는 대신 인간의 표현 질병 관련 단백질입니다. 여기는 상호 보완적인 접근 방식을 통해 꼬마 선 충 에서 고유의 단백질 집계를 검토 하는 방법론에 설명 합니다. 첫째, 우리 세 동물을 얻을 나이 동기화 C. 선 충 의 많은 성장 하는 방법을 검토 하 고 우리는 매우 불용 성-큰 집계 분리 하 생 화 확 적인 절차를 제시. 대상된 유전 최저와 함께, 그것은 홍보 또는 양이 많은 질량 분석 어느 포괄적인 분석을 사용 하 여 연령에 따라 단백질 집계 방지에 관심사의 유전자의 역할을 해 부 수 또는 후보-기반 항 체와 분석입니다. 이러한 결과 다음 형광 태그 집계 하기 쉬운 단백질을 표현 하는 유전자 변형 동물 vivo에서 분석에 의해 확인 됩니다. 이러한 메서드는 특정 단백질은 나 이와 함께 집계 및 궁극적으로 완전 한 기능이 단백질을 유지 하는 방법 하는 경향이 이유를 명확히 하는 데 도움이 됩니다.

우리가 사용 하는 방법 여기 어떻게 수명이 긴 동물을 평가 하 여 감소 IIS 변조 연령에 따라 단백질 집계. 서쪽으로 오 점 (단계를 참조 하십시오 2.2, 빨리 서쪽 오 점 분석에 대 한 불용 성 단백질 추출), 우리는 총 영 (성년의 날 3)의 불용 성 단백질 함량을 분석 (성년의 날 18) 웜 제어 RNAi와 RNAi는 인슐린을 대상으로 세 / IGF-1-같은 수용 체 daf-2. RNAi 조건 (그림 2A) 총 단백질 수준의 나이 또는 제어와 daf-2 사이 큰 변경 없이 관찰합니다. 예상 대로, 우리는 제어 동물 (그림 2B) 매우 불용 성 단백질의 수준에 강한 나이 관련 된 증가 감지. Daf-2 RNAi에 수명이 긴 동물에 비교, 집계 성향 크...

여기에 제시 된 방법의 목표는 단백질 집계 모델 유기 체 C. 선 충에서 정상적인 노화 과정을 탐구. 프로토콜 나이 형성 하는 매우 불용 성 큰 집계를 공부 하 고 proteostasis에 변화 단백질 집계에 미치는 영향을 결정 하는 강력한 도구를 나타냅니다.

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

이 실험의 전반적인 목표는 예쁜꼬마선충에서 나이에 따른 단백질 불용성의 변화를 감지하고 표적 유전자 녹다운이 이 노화 마커에 어떤 영향을 미치는지 평가하는 것입니다. 이 방법은 노화 및 단백질 단백질화 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어 유기체가 나이가 들어도 건강한 단백질체를 유지하지 못하는 이유와 같은 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 질병 과정이 없는 상태에서 정상적인 노화 동안 단백질 응집을 연구할 수 있는 기회입니다.이 방법은 예쁜꼬마선충의 단백질 응집에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 예를 들어 마우스의 노화 관련 단백질 불용성을 연구하기 위해 다른 모델 유기체에도 적용할 수 있습니다. 처리를 시작하려면 207.45ml의 S Basal 배지를 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 추가 시약과 함께 2,800mL Fernbach 배양 플라스크에 추가합니다. 밀리리터당 50마이크로그램의 카르베니실린과 1밀리몰의 IPTG의 최종 농도를 추가하고 멤브레인 나사 캡으로 플라스크를 닫습니다.섭씨 25도의 인큐베이터에서 L1을 꺼내 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. L1을 1, 900회 g에서 3분 동안 원심분리한다. 탈수 후 상층액을 제거하십시오.현미경으로 2마이크로리터당 L1을 세고 최소 9방울에서 얻은 수치의 평균을 구합니다. 다음으로, 50, 젊은 벌레 수집을 위한 000마리의 벌레를 추가하고 100, 이전 단계에서 준비한 4개의 Fernbach 배양 플라스크에 노화된 벌레 수집을 위한 000마리의 벌레를 추가합니다. 그런 다음 관심 유전자에 대한 대조군 RNAi 박테리아와 RNAi 박테리아를 벌레의 수에 비례하여 추가합니다.박테리아를 첨가한 후 S Basal로 지렁이 배양을 완료하여 총 부피를 300ml로 만듭니다. 채취 할 때까지 150rpm의 진탕 인큐베이터에서 섭씨 25도의 기생 배양을 배양합니다. 2일차 또는 3일차에 어린 지렁이를 수집하여 단백질 용해도의 기초 수준을 측정합니다.한 플라스크의 지렁이를 분리 깔때기에 붓고 실온에서 10분 동안 지렁이를 침전시킵니다. 벌레가 침전된 후 스톱 콕을 열고 벌레를 하나의 50ml 튜브에 떨어뜨립니다. 다음으로, 웜 펠릿을 두 개의 15ml 튜브로 나눕니다.튜브에 M9를 15ml까지 채우고 벌레를 원심 분리하십시오. 벌레를 씻으려면 상등액을 제거하고 튜브에 M9를 최대 15ml까지 채웁니다. 원심분리를 반복합니다. 세척이 완료되면 웜을 두 개의 50ml 튜브로 옮기고 얼음처럼 차가운 M9를 사용하여 총 부피를 20ml로 채웁니다.박테리아와 죽은 벌레를 제거하려면 20밀리리터의 얼음처럼 차가운 60% 자당으로 채워진 2개의 50밀리리터 튜브에 2개의 20밀리리터 희석된 벌레 알갱이를 추가합니다. 튜브를 빠르게 원심분리하십시오. 25 밀리리터 피펫으로 상단 웜 층을 최대 15 밀리리터까지 조심스럽게 제거합니다.얼음 위에 준비된 37ml의 M9와 옥톡시놀-9에 상단 웜 층을 직접 놓습니다. 그런 다음 2, 700 회 g에서 섭씨 4도 가속 9 및 감속 7에서 3 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 상등액을 버린 후 펠릿을 4개의 15ml 튜브에 옮기고 얼음처럼 차가운 M9와 옥톡시놀-9로 두 번 세척합니다.그런 다음 튜브를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 얼음처럼 차가운 M9와 옥톡시놀-9로 튜브를 15ml 표시까지 채웁니다. 얼음처럼 차가운 M9로 벌레를 씻고 4개의 튜브를 2개의 튜브로 결합합니다.튜브를 15ml로 채우고 원심분리기를 합니다. 상층액을 제거하고 실온에서 두 개의 튜브를 M9로 총 4ml까지 채운 다음 섭씨 25도의 너트 믹서에서 40분 동안 회전시킵니다. 너트 팅 후 얼음처럼 차가운 M9와 옥톡시놀-9로 벌레를 두 번 씻습니다.그런 다음 M9로 두 번 씻고 벌레를 하나의 튜브로 옮깁니다. 채취 전에 억제제가 없는 재조립 또는 RAB 고염 추출 완충액에서 기생충을 세척합니다. 웜 펠릿 위에 액체가 없을 때까지 상등액을 제거합니다.그런 다음 웜 펠릿의 부피를 추정하고 억제제와 함께 동일한 부피의 RAB를 추가합니다. 드라이 아이스에 액체 질소로 반쯤 채워진 50 밀리리터 튜브를 준비하고 파스퇴르 피펫을 사용하여 벌레를 끌어 올려 튜브에 천천히 떨어 뜨립니다. 액체 질소가 증발하도록 하고 추가 처리가 있을 때까지 냉동 벌레를 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.액체 질소로 모르타르를 식히고 드라이 아이스에서 동물 파괴를 수행합니다. 얼린 벌레를 미리 냉각된 모르타르에 옮기고 2.5분 동안 갈아줍니다. 분말에 액체 질소 100ml를 넣고 2.5분 더 분쇄합니다.현미경을 사용하여 지렁이 몸체가 작은 조각으로 부서져 있는지 확인합니다. 그런 다음 분말을 2 밀리리터 튜브에 옮기고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 드라이아이스에서 시점당 350mg의 지상 지렁이와 RNAi 박테리아당 2배의 무게를 2개의 밀리리터 튜브에 넣습니다.고염 용해성 단백질을 제거하려면 억제제가 포함된 이미 제조된 RAB의 중량당 2부피, 1밀리몰 PMSF, 밀리리터 DNase I당 200 단위 및 밀리리터 RNase A당 100 마이크로그램을 각 튜브에 추가하고 분말을 얼음에 용해시킵니다. 현탁액을 1ml 주사기에 15회 빨아 넣고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 18, 400 회 g에서 섭씨 4도에서 20 분 동안 원심 분리기.지방층을 통과하여 고염 용해성 단백질을 함유한 상등액을 조건별 2밀리리터 튜브 1개에 모읍니다. 지방을 제거하고 버리십시오. 고염 용해성 단백질을 섭씨 영하 80도에서 동결하는 부분 표본.지질을 버리려면 DNase I 및 RNase A가 없는 1개의 몰 자당을 포함하는 억제제로 펠릿을 700마이크로리터의 RAB로 가용화합니다.현탁액을 주사기에 10회 추출하고 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 반드시 상층액과 지질을 모두 제거하고 버리십시오. SDS 용해성 단백질을 제거하려면 펠릿을 700마이크로리터의 RIPA 완충액으로 용해시킵니다.현탁액을 주사기에 10회 빨아 넣고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 18, 400g에서 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리기. SDS 용해성 단백질을 함유한 상등액과 영하 80도에서 동결하기 위한 분취액을 수집합니다.각 펠릿을 500마이크로리터의 RIPA 완충액으로 가용화한 후 각 조건의 두 샘플을 함께 풀링하고 현탁액을 주사기에 10회 끌어올립니다. 상층액을 모두 제거하여 버리도록 주의하십시오. 불용성 단백질을 함유한 최종 펠릿을 400마이크로리터 70% 포름산으로 용해시키고 현탁액을 주사기로 20회 끌어올립니다.얼음 위에서 20분 동안 현탁액을 배양합니다. 울트라 원심분리기 튜브의 현탁액을 원심분리하여 벌레 표피 파편을 제거합니다. 불용성이 높은 단백질을 함유한 상등액을 모아 영하 80도에서 얼립니다.어린 기생충과 늙은 기생충의 불용성 단백질 함량을 전체적으로 염색한 결과, 장수 동물이 아닌 대조군 동물에서 고불용성 단백질 수치가 노화와 관련하여 크게 증가한 것으로 나타났습니다. 예측된 프리온 유사 도메인을 가진 RNA 결합 단백질인 PAB-1의 항체 염색을 통해 장수 동물이 나이가 들어도 PAB-1 용해성을 유지한다는 질량 분석 데이터를 확인했습니다. 인두근에서 tagRFP PAB-1을 발현하는 형질전환 동물에 대한 생체 내 분석을 수행했습니다.어린 동물에서 tagRFP PAB-1은 주로 인두 전체에 분산되어 위치했습니다. 나이가 들면서 후인두구(posterior pharyngeal bulb)에서 시작하여 밝은 반점(puncta)에 점진적으로 축적됩니다. 노화 과정에서, 우리는 또한 점점 더 많은 수의 동물에서 전인두구(anterior pharyngeal bulb)의 응집(aggregation)을 관찰했다.야생형 및 daf-2 돌연변이 배경의 연령에 따른 다양한 tagRFP PAB-1 응집 수준을 정량화하면 수명이 긴 동물에서 연령에 따라 크게 지연된 tagRFP PAB-1 응집이 나타납니다. 이 동영상을 시청한 후에는 단백질 추출을 위해 많은 수의 기생충을 수집하는 방법과 질량 분석기 또는 SDS 페이지에서 추가 분석을 위해 불용성이 높은 대형 응집체를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 노화로 인한 단백질 단백 감소를 결정하기 위한 생체 내 이미징 기반 분석을 보여줍니다. 이 분석은 체벽 근육에서 폴리글루타민 YFP-융합 단백질을 발현하는 Caenorhabditis elegans를 사용하여 폴리글루타민의 연령 관련 응집과 단백질 독성 유도를 측정하여 마비를 유발합니다.

형광 리포터 기반 마비 분석: 예쁜꼬마선충에서 폴리글루타민 형광 리포터의 연령 관련 진행성 형성 및 관련 마비를 평가하는 기술

단백질 항상성, 스트레스 및 노화 사이의 관계를 연구하기 위해 유전적으로 다루기 쉬운 후생동물인 Caenorhabditis elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 기능 장애, 세포 내 단백질 국소화 및 유기체, 세포 및 단백질 수준에서의 단백질 안정성을 추적하여 단백질 접힘의 변화를 모니터링했습니다.

사용 예쁜 꼬마 선충 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

형광 일생 화상 진찰은 생활, 노화 및 응력 C. elegans 질병 모형에 있는 단백질의 집합 경향을 정량화하고 구별합니다.

형광 일생 화상 진찰을 사용하여 노화 C. Elegans에 있는 아밀로이드 구조물의 특성화

전립선성 감소는 노화의 특징입니다, 신경 퇴행성 질환의 발병을 촉진. 우리는 형광 기자에게 융합 된 폴리 글루타민 반복의 이종 발현을 통해 두 가지 다른 Caenorhabditis elegans 조직에서 프로테오스타시스를 정량적으로 측정하는 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 프로테오스타증의 생체 내 유전 적 분석을 빠르게 허용합니다.

Caenorhabditis 예인단에서 조직 특정 전립선 성 감소를 정량화

여기에서, 우리는 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환의 세포 및 분자 기초를 모니터링하고 해부하기 위해 과활성화 이온 채널 유도 괴사 및 단백질 골재 유도 신경 독성을 포함하여 일부 다목적 선충 모델을 활용하여 널리 접근 할 수있는 방법론을 소개하고 설명합니다.

카노르하비티스 예르간에서 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환 모델링

다음 프로토콜은 프로테오스타시스의 변화 평가로서 폴리글루타민 응집체를 정량화하기 위한 웜 배양, 형광 이미징 및 자동화된 이미지 처리를 위한 고처리량 워크플로우의 개발 및 최적화를 설명합니다.

Caenorhabditis elegans의 집계 정량화 자동화

여기에서, 선충류 예쁜꼬마선충에서의 단백질 응집 동역학의 분석을 위한 방법이 제시 된다. 연령 동기화 된 집단의 동물은 서로 다른 시점에서 이미지화되고 CellProfiler에서 반자동 포함 계수가 수행되고 AmyloFit의 수학적 모델에 적합합니다.

Caenorhabditis elegans에서 자동 포함 계수를 사용하여 생체 내에서 단백질 응집 동역학 모니터링

우리의 특별 표현하는 소설 빨간색 형광 단백질 (RFP) 기자를...

에있는 아이 Imaginal 디스크의 시각화에 도움을 소설 RFP 리포터 Drosophila</em

여기에 단단한 판 기반식이 제한을 수행하는 프로토콜을...

솔리드 플레이트 기반식이 제한에 Caenorhabditis 엘레간스</em

이 문서는 선충류에 embryogenesis의 초기 이벤트의 시각화를위한 기술을...

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

배우세요 C. elegans를 이용한 노화 관련 단백질 불용성 변화 분석 방법입니다. 유전자 녹다운 기법으로 프로테오스타시스 메커니즘을 연구하고 노화 마커를 평가할 수 있습니다.

꼬마 선 충 나이 연구 변화 내재 단백질 집계에 방법

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