꼬마 선 충 나이 연구 변화 내재 단백질 집계에 방법
2017년 11월 26일
여기에 제시 된 방법의 목표는 단백질 집계 모델 유기 체 C. 선 충에서 정상적인 노화 과정을 탐구. 프로토콜 나이 형성 하는 매우 불용 성 큰 집계를 공부 하 고 proteostasis에 변화 단백질 집계에 미치는 영향을 결정 하는 강력한 도구를 나타냅니다.
이 실험의 전반적인 목표는 예쁜꼬마선충에서 나이에 따른 단백질 불용성의 변화를 감지하고 표적 유전자 녹다운이 이 노화 마커에 어떤 영향을 미치는지 평가하는 것입니다. 이 방법은 노화 및 단백질 단백질화 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어 유기체가 나이가 들어도 건강한 단백질체를 유지하지 못하는 이유와 같은 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 질병 과정이 없는 상태에서 정상적인 노화 동안 단백질 응집을 연구할 수 있는 기회입니다.
이 방법은 예쁜꼬마선충의 단백질 응집에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 예를 들어 마우스의 노화 관련 단백질 불용성을 연구하기 위해 다른 모델 유기체에도 적용할 수 있습니다. 처리를 시작하려면 207.45ml의 S Basal 배지를 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 추가 시약과 함께 2,800mL Fernbach 배양 플라스크에 추가합니다. 밀리리터당 50마이크로그램의 카르베니실린과 1밀리몰의 IPTG의 최종 농도를 추가하고 멤브레인 나사 캡으로 플라스크를 닫습니다.
섭씨 25도의 인큐베이터에서 L1을 꺼내 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. L1을 1, 900회 g에서 3분 동안 원심분리한다. 탈수 후 상층액을 제거하십시오.
현미경으로 2마이크로리터당 L1을 세고 최소 9방울에서 얻은 수치의 평균을 구합니다. 다음으로, 50, 젊은 벌레 수집을 위한 000마리의 벌레를 추가하고 100, 이전 단계에서 준비한 4개의 Fernbach 배양 플라스크에 노화된 벌레 수집을 위한 000마리의 벌레를 추가합니다. 그런 다음 관심 유전자에 대한 대조군 RNAi 박테리아와 RNAi 박테리아를 벌레의 수에 비례하여 추가합니다.
박테리아를 첨가한 후 S Basal로 지렁이 배양을 완료하여 총 부피를 300ml로 만듭니다. 채취 할 때까지 150rpm의 진탕 인큐베이터에서 섭씨 25도의 기생 배양을 배양합니다. 2일차 또는 3일차에 어린 지렁이를 수집하여 단백질 용해도의 기초 수준을 측정합니다.
한 플라스크의 지렁이를 분리 깔때기에 붓고 실온에서 10분 동안 지렁이를 침전시킵니다. 벌레가 침전된 후 스톱 콕을 열고 벌레를 하나의 50ml 튜브에 떨어뜨립니다. 다음으로, 웜 펠릿을 두 개의 15ml 튜브로 나눕니다.
튜브에 M9를 15ml까지 채우고 벌레를 원심 분리하십시오. 벌레를 씻으려면 상등액을 제거하고 튜브에 M9를 최대 15ml까지 채웁니다. 원심분리를 반복합니다. 세척이 완료되면 웜을 두 개의 50ml 튜브로 옮기고 얼음처럼 차가운 M9를 사용하여 총 부피를 20ml로 채웁니다.
박테리아와 죽은 벌레를 제거하려면 20밀리리터의 얼음처럼 차가운 60% 자당으로 채워진 2개의 50밀리리터 튜브에 2개의 20밀리리터 희석된 벌레 알갱이를 추가합니다. 튜브를 빠르게 원심분리하십시오. 25 밀리리터 피펫으로 상단 웜 층을 최대 15 밀리리터까지 조심스럽게 제거합니다.
얼음 위에 준비된 37ml의 M9와 옥톡시놀-9에 상단 웜 층을 직접 놓습니다. 그런 다음 2, 700 회 g에서 섭씨 4도 가속 9 및 감속 7에서 3 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 상등액을 버린 후 펠릿을 4개의 15ml 튜브에 옮기고 얼음처럼 차가운 M9와 옥톡시놀-9로 두 번 세척합니다.
그런 다음 튜브를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 얼음처럼 차가운 M9와 옥톡시놀-9로 튜브를 15ml 표시까지 채웁니다. 얼음처럼 차가운 M9로 벌레를 씻고 4개의 튜브를 2개의 튜브로 결합합니다.
튜브를 15ml로 채우고 원심분리기를 합니다. 상층액을 제거하고 실온에서 두 개의 튜브를 M9로 총 4ml까지 채운 다음 섭씨 25도의 너트 믹서에서 40분 동안 회전시킵니다. 너트 팅 후 얼음처럼 차가운 M9와 옥톡시놀-9로 벌레를 두 번 씻습니다.
그런 다음 M9로 두 번 씻고 벌레를 하나의 튜브로 옮깁니다. 채취 전에 억제제가 없는 재조립 또는 RAB 고염 추출 완충액에서 기생충을 세척합니다. 웜 펠릿 위에 액체가 없을 때까지 상등액을 제거합니다.
그런 다음 웜 펠릿의 부피를 추정하고 억제제와 함께 동일한 부피의 RAB를 추가합니다. 드라이 아이스에 액체 질소로 반쯤 채워진 50 밀리리터 튜브를 준비하고 파스퇴르 피펫을 사용하여 벌레를 끌어 올려 튜브에 천천히 떨어 뜨립니다. 액체 질소가 증발하도록 하고 추가 처리가 있을 때까지 냉동 벌레를 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.
액체 질소로 모르타르를 식히고 드라이 아이스에서 동물 파괴를 수행합니다. 얼린 벌레를 미리 냉각된 모르타르에 옮기고 2.5분 동안 갈아줍니다. 분말에 액체 질소 100ml를 넣고 2.5분 더 분쇄합니다.
현미경을 사용하여 지렁이 몸체가 작은 조각으로 부서져 있는지 확인합니다. 그런 다음 분말을 2 밀리리터 튜브에 옮기고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 드라이아이스에서 시점당 350mg의 지상 지렁이와 RNAi 박테리아당 2배의 무게를 2개의 밀리리터 튜브에 넣습니다.
고염 용해성 단백질을 제거하려면 억제제가 포함된 이미 제조된 RAB의 중량당 2부피, 1밀리몰 PMSF, 밀리리터 DNase I당 200 단위 및 밀리리터 RNase A당 100 마이크로그램을 각 튜브에 추가하고 분말을 얼음에 용해시킵니다. 현탁액을 1ml 주사기에 15회 빨아 넣고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 18, 400 회 g에서 섭씨 4도에서 20 분 동안 원심 분리기.
지방층을 통과하여 고염 용해성 단백질을 함유한 상등액을 조건별 2밀리리터 튜브 1개에 모읍니다. 지방을 제거하고 버리십시오. 고염 용해성 단백질을 섭씨 영하 80도에서 동결하는 부분 표본.
지질을 버리려면 DNase I 및 RNase A가 없는 1개의 몰 자당을 포함하는 억제제로 펠릿을 700마이크로리터의 RAB로 가용화합니다.현탁액을 주사기에 10회 추출하고 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 반드시 상층액과 지질을 모두 제거하고 버리십시오. SDS 용해성 단백질을 제거하려면 펠릿을 700마이크로리터의 RIPA 완충액으로 용해시킵니다.
현탁액을 주사기에 10회 빨아 넣고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 18, 400g에서 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리기. SDS 용해성 단백질을 함유한 상등액과 영하 80도에서 동결하기 위한 분취액을 수집합니다.
각 펠릿을 500마이크로리터의 RIPA 완충액으로 가용화한 후 각 조건의 두 샘플을 함께 풀링하고 현탁액을 주사기에 10회 끌어올립니다. 상층액을 모두 제거하여 버리도록 주의하십시오. 불용성 단백질을 함유한 최종 펠릿을 400마이크로리터 70% 포름산으로 용해시키고 현탁액을 주사기로 20회 끌어올립니다.
얼음 위에서 20분 동안 현탁액을 배양합니다. 울트라 원심분리기 튜브의 현탁액을 원심분리하여 벌레 표피 파편을 제거합니다. 불용성이 높은 단백질을 함유한 상등액을 모아 영하 80도에서 얼립니다.
어린 기생충과 늙은 기생충의 불용성 단백질 함량을 전체적으로 염색한 결과, 장수 동물이 아닌 대조군 동물에서 고불용성 단백질 수치가 노화와 관련하여 크게 증가한 것으로 나타났습니다. 예측된 프리온 유사 도메인을 가진 RNA 결합 단백질인 PAB-1의 항체 염색을 통해 장수 동물이 나이가 들어도 PAB-1 용해성을 유지한다는 질량 분석 데이터를 확인했습니다. 인두근에서 tagRFP PAB-1을 발현하는 형질전환 동물에 대한 생체 내 분석을 수행했습니다.
어린 동물에서 tagRFP PAB-1은 주로 인두 전체에 분산되어 위치했습니다. 나이가 들면서 후인두구(posterior pharyngeal bulb)에서 시작하여 밝은 반점(puncta)에 점진적으로 축적됩니다. 노화 과정에서, 우리는 또한 점점 더 많은 수의 동물에서 전인두구(anterior pharyngeal bulb)의 응집
(aggregation)을 관찰했다.야생형 및 daf-2 돌연변이 배경의 연령에 따른 다양한 tagRFP PAB-1 응집 수준을 정량화하면 수명이 긴 동물에서 연령에 따라 크게 지연된 tagRFP PAB-1 응집이 나타납니다. 이 동영상을 시청한 후에는 단백질 추출을 위해 많은 수의 기생충을 수집하는 방법과 질량 분석기 또는 SDS 페이지에서 추가 분석을 위해 불용성이 높은 대형 응집체를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
본 연구는 모델 유기체인 C. elegans의 정상 노화 중 단백질 집합체를 탐구합니다. 이 방법은 불용성 단백질 집합체와 노화에 대한 단백질 항상성의 영향을 검토할 수 있게 합니다.
주요 연구 구성요소
과학 분야
- 신경과학
- 생물학
- 노화 연구
배경
- 단백질 집합체는 노화의 주요 지표입니다.
- C. elegans는 노화를 연구하는 데 귀중한 모델 유기체로 작용합니다.
- 단백질 항상성의 이해는 연령 관련 질병에 대한 통찰력을 얻는 데 중요합니다.
- 이 방법은 마우스와 같은 다른 유기체에 사용하도록 적응될 수 있습니다.
연구 목적
- C. elegans의 나이에 따른 단백질 불용성 변화를 검출하기 위해.
- 단백질 집합체에 대한 표적 유전자 억제의 영향을 평가하기 위해.
- 유기체가 나이가 들어감에 따라 건강한 단백질체를 유지하는 데 어려움을 겪는 이유를 해결하기 위해.
사용된 방법
- 특정 시약을 사용하여 S 기본 배지를 준비합니다.
- 배양 과정에서 Carbenicillin과 IPTG를 사용합니다.
- 시간에 따른 단백질 집합체를 모니터링합니다.
- 노화 마커에 미치는 영향을 평가하기 위해 유전자 억제 기술을 적용합니다.
주요 결과
- 노화된 C. elegans의 단백질 집합체 패턴 식별.
- 유전자 억제가 단백질 용해도를 어떻게 변화시키는지 평가합니다.
- 나이에 따른 단백질 항상성 실패의 메커니즘에 대한 통찰력.
- 종에 걸친 노화 연구에서의 더 광범위한 응용 가능성.
결론
- 이 방법은 노화 관련 단백질 집합체 연구를 위한 튼튼한 틀을 제공합니다.
- 연구 결과는 노화 과정과 단백질 항상성에 대한 이해에 기여합니다.
- 미래 연구는 이 접근 방식을 다른 모델 유기체로 확장할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Studying inherent protein aggregation during normal aging provides a disease-agnostic framework for evaluating proteostasis mechanisms relevant to neurodegenerative target validation. This approach enables mechanistic de-risking of hypotheses linking protein solubility to functional decline in aging populations. Insights support early discovery decisions by identifying genetic modifiers that maintain proteome integrity without relying on ectopic disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses about genes that promote or prevent age-dependent protein insolubility.
- Operational Value: Use quantitative mass spectrometry or antibody-based analysis to dissect gene function in aggregation pathways.
- Predictive Value: Identify targets whose modulation delays aggregation, supporting portfolio triage based on mechanistic confidence.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepare age-synchronized worm populations to generate reproducible insoluble protein fractions for compound screening.
- Quantitative Output: Measure changes in highly insoluble large aggregates as a functional readout of proteostasis modulation.
- Scalability: Enable large-scale worm culture and biochemical isolation for consistent compound evaluation across conditions.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Link inherent aggregation mechanisms to age-associated proteinopathies without confounding disease transgene expression.
- Translational Continuity: Validate findings in vivo using fluorescent-tagged aggregation-prone proteins to confirm biochemical results.
- Risk-Adjusted Advancement: Use aggregation delay in long-lived mutants as a biomarker for target engagement and proteostasis enhancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows by providing a quantitative, genetically tractable readout of proteostasis decline that informs lead identification and target prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene knockdown effects on inherent aggregation, clarifying pathway involvement in aging-related insolubility.
- Screening: Enables assay development based on insoluble protein isolation, offering a standardized, quantitative phenotype for compound or genetic modulator evaluation.
- Analytics: Generates mass spectrometry and immunoblot data to compare insoluble protein profiles across conditions, enabling objective comparison of interventions.
- Translational Research: Connects biochemical aggregation data to in vivo puncta formation in transgenic models, supporting biomarker alignment and mechanistic validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing proteostasis modifiers across multiple targets and therapeutic areas related to aging.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by distinguishing aggregation-promoting from aggregation-preventing genetic factors.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible isolation of highly insoluble proteins enabling cross-functional data comparison.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in proteostasis-targeted programs.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on their ability to maintain protein solubility during aging.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans culture, age synchronization, and biochemical fractionation techniques.
- Depends on access to ultracentrifugation, mass spectrometry, and fluorescence microscopy for aggregate analysis.
- Necessitates standardization of worm harvesting and lysis protocols across labs to ensure reproducible insoluble protein yields.
- Involves adaptation considerations when transferring the biochemical fractionation to other model systems like mouse tissue.
- Limited by the need for large worm numbers and extended culture times for aged collections, affecting throughput.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Liquid Culture for Treatment with RNAi Starting at L1
2:40
Collection of Young and Aged Worms Subjected to RNAi in Liquid Culture
6:14
Disruption of Animals
6:58
Isolation of SDS-insoluble Proteins for Mass Spectrometry
10:03
Results: Reduced IIS Prevents Age-dependent Protein Aggregation
11:26
Conclusion
