초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로에서 시 냅 스 전류의 초점 Macropatch 녹음

이 기술의 전반적인 목표는 초파리 유충 신경근 접합부에서 시각화된 시냅스 부톤의 시냅스 활동을 모니터링하는 것입니다. 유전자 조작에 쉽게 수정할 수 있는 우수한 모델 시스템. 이 기법은 과학의 핵심 질문을 해결할 수 있습니다.

예를 들어, 시냅스 단백질의 돌연변이가 시냅스 전달을 조절하는 방법. 이 기술의 주요 장점은 제한된 수의 방출 부위의 활동을 모니터링하고 빠른 역학의 전류를 기록하고 쉽게 해결할 수 있다는 것입니다. 실험을 시작하려면: 미세 전극 풀러를 준비합니다.

35X 배율에서 현미경을 사용하여 당겨진 전극의 내경이 7-10마이크로미터 범위에 있는지 확인합니다. 먼지가 쌓이지 않도록 단단히 밀폐된 용기에 모세관을 보관하십시오. 다음으로, 마이크로 단조를 사용하여 모세관을 화재 연마합니다.

연마된 전극의 최종 내경이 5마이크로미터인지 확인합니다. 그런 다음 굽힘으로 이동합니다. 매니퓰레이터에 전극을 고정하고 팁을 필라멘트에 닿지 않도록 위에 놓습니다.

열 값을 최대치의 60-70%로 설정하고 마이크로 포지의 페달을 1-2초 동안 눌러 필라멘트를 가열합니다. L자형 바늘을 사용하여 전극 끝을 부드럽게 아래로 당기고 약 90도로 구부립니다. 전극을 토치의 불꽃 위에 손으로 잡고 두 번째 굽힘은 첫 번째 굽힘에서 7-10mm로 약 120도 각도로 구부립니다.

혈림프 유사 또는 HL3 용액을 준비합니다. 솔루션을 refigerator에 보관하고 매주 새로 만드십시오. 유리 피펫을 구부리지 않고 기록하는 것과 같은 방식으로 자극 피펫을 준비합니다.

다음으로, 주사기에 연결된 미세 전극 홀더에 자극 피펫을 삽입합니다. 실리콘 고무 에폭시로 코팅된 작은 페트리 접시에서 제조된 해부 플레이트. 그런 다음 집게를 사용하여 바이알에서 떠돌이 세 번째 instar 유충을 선택합니다.

유충을 고정하고 첫 번째 핀을 뒤쪽에 배치하고 다른 핀을 입 고리에 가깝게 앞쪽에 배치합니다. HL3 솔루션을 추가합니다. 유충의 등쪽은 스프링 가위를 사용하여 위쪽 핀에서 아래쪽 핀까지 자릅니다.

유충의 왼쪽과 오른쪽에 두 개의 추가 핀을 배치하여 유충 필레를 고정합니다. 집게를 사용하여 내장과 기관을 제거합니다. 스프링 가위를 사용하여 복부 신경삭 바로 바깥쪽의 신경을 절단합니다.

준비물과 함께 페트리 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다. 수조에 기준 전극을 삽입합니다. 기록 전극에 HL3 용액을 채웁니다.

10X 대물렌즈 아래에서 전극을 수조에 담그고 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 2, 3 또는 4의 복부 돌출부 중 6, 7 근육 위에 놓습니다. 다음으로, 대물렌즈를 60X로 전환하고 epiflorescence 또는 DIC optics를 사용하여 관심 영역에 초점을 맞춥니다. 전극의 끝을 시냅스 부톤 위에 놓고 과도한 압력은 NMJ를 손상시키거나 자발적인 시냅스 활동을 증가시킬 수 있으므로 전극을 근육에 매우 부드럽게 누릅니다.

그런 다음 증폭기, AD 보드 및 컴퓨터를 켭니다. 그런 다음 증폭기에서 전압 클램프 모드를 선택합니다. 수집 소프트웨어를 시작하고 갭 프리 모드를 선택한 다음 컴퓨터 화면에서 MEJC가 나타나는지 관찰합니다.

MEJC의 진폭이 0.2 - 0.7 나노암페어 범위인지 확인합니다. 시각 제어 하에 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 자극 전극을 2번에서 4번까지 복부 분절에 신경을 분포시키는 축삭 근처에 놓습니다. 전극 홀더에 연결된 주사기의 피스톤을 당겨 축삭돌기가 전극 내부로 당겨지도록 음압을 가합니다.

다음으로 자극기를 켭니다. 절연 장치의 손잡이를 돌려 제로 전류를 설정한 다음 EJC가 나타나거나 임계값에 도달할 때까지 부드럽게 증가시킵니다. superthreshold regi에서 자극을 수행합니다.

자극 전류는 EJC의 관찰을 위한 임계값에 비해 약 2배 증가합니다. 증폭기의 전극 저항 스위치를 밀봉 테스트 위치로 돌려 기록 매크로 패치 전극의 밀봉 저항을 측정합니다. 현재 창에 표시될 밀봉 저항 값(기가 옴)을 관찰하십시오.

Focal macro patch recordings를 사용하면 선택된 synaptic boutons에서 시냅스 활동을 모니터링할 수 있습니다. 전극이 시냅스 부톤 위에 위치할 때 기록된 MEJC는 노이즈 수준을 크게 초과하는 진폭과 밀리초 미만의 범위에서 급격한 상승 위상을 갖습니다. 기록 전극이 시냅스 부톤에서 수 미크론 정도 멀어지면 기록기 MEJC의 진폭이 거의 잡음 수준까지 감소합니다.

기록된 EJC는 노이즈와 거의 구별할 수 없으며 상승 단계가 연장되었습니다. 초점 기록을 통해 복합체 및 그놈 돌연변이에서 MEJC를 정확하게 감지할 수 있습니다. 이 돌연변이의 세포 간 기록은 겹쳐서 신뢰할 수 있는 검출할 수 없는 사건을 방출합니다.

전기 칩의 각도 조정은 전극의 위치에 매우 중요합니다. 이 절차에 따라 개별 방출 이벤트의 이미징 확인과 같은 다른 방법을 수행하여 개별 활성 영역의 활동 통합과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.