Name: 초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로에서 시 냅 스 전류의 초점 Macropatch 녹음 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: 배우세요 Drosophila 애벌레 신경근육 접합부에서 초점 Macropatch 기법을 이용한 시냅스 활동 측정 방법입니다. 이 기술은 개별 시냅스 단추에서 미시 흥분성 접합 전류를 기록하여 시냅스 단백질 돌연변이가 신경전달에 미치는 영향을 연구하는 데 활용됩니다.

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1. 제조의 기록 전극 microelectrode 끌어당기는 사람에 대 한 <ol><ol><li>사용 다음 유리 전극 당기 </li><li>프로토콜 (재료의 표 참조): <ol><li>1: 열 510 당겨-속도 30 시간 250; 2 호선: 열 490 풀-속도 30 250 시간. 
			참고: 단위; 당 0.5 ms에 해당 하는 시간 단위 다른 단위는 상대. 램프 테스트 수행 후 모든 필 라 멘 트에 대 한 열 값을 조정 한다.</li>
		</ol></li> <li>현미경 (35 x 배율)를 사용 하 여 가져온된 전극의 내경 ( 그림 1A) 7-10 µ m의 범위에 있는지 확인. 먼지 축적을 방지 하기 위해 단단히 닫힌된 용기에 모세를 저장.</li>
	</ol> <li>화재 연마 <ol><li>화재 폴란드어 모세 (1-2에 대 한 최대 열 값의 80-90%)는 마이크로-포지를 사용 하 여 (재료의 표 참조). 세련 된 전극의 최종 내부 직경은 5 µ m ( 그림 1A) 27 확인.</li>
	</ol></li> <li>굴곡 참고: 두 개의 굴절 높은 확대 목표 아래 근육 위에 전극 위치 하기 위해 만들어집니다.
	</li><li> 그림 1B에서 표시 하는 장치를 사용 하 여 <ol>. 조작자에 전극을 수정 하 고 필 라 멘 트, 아니라 그것을만 지는 팁 놓고</ol></li>
		<li>집합 열 값의 최대 60-70%를 누르고 1-2에 대 한 마이크로-포지의 페달 (재료의 표 참조)는 필 라 멘 트가 열. L 자 모양의 바늘을 사용 하 여 부드럽게 풀 ( 그림 1B 확대) 전극의 팁 다운. 약 90 o ( 그림 1C)에 굴곡을 만들어.</li>
		<li>전극 토치의 불꽃에 집게를 사용 하 여 손으로 누른 첫 번째 벤드에서 7-10 밀리미터의 거리에 두 번째 벤드 약 120 o ( 그림 1C)의 각도 확인.</li>
	</ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig1.jpg"> 그림 1. Micropipette 제조의 마지막 단계. (A) 전극 고 화재 연마 후 팁. (B.1) 팁 절곡에 대 한 설정. (B.2) 박스형된 영역 오른쪽에 확대 표시 됩니다. 전극과는 필 라 멘 트 전극 팁은 약간 와이어 위에 위치 하 고 감동 하지 있도록 고정 됩니다. (C.1) 기록 전극입니다. (C.2) 박스형된 영역 오른쪽에 확대 표시 됩니다. 첫 번째 벤드는 약 90 °의 각도 첫 번째 벤드와 전극의 끝 사이 거리가 약 1 m m. 규모 바 = 3 m m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig1large.jpg" target="_blank"> 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
 2. 추가 예비 단계 <ol><li>준비 (mM)에 heamolymph 같은 (HL3) 솔루션: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 트 레 할 로스, 115 자당, 5 HEPES, 및 1mm CaCl 2; pH 7.3-를 조정 7.4. 냉장고에 솔루션을 유지 하 고 매주 신선한 게.</li>
	<li>게 자극 pipets 같은 방법으로 녹음 유리 pipets, 그들을 구 부 필요가 없습니다 않습니다. 
	참고: 자극 전극의 준비는 28와 27에 자세히 설명 되어 있습니다. 마지막 지름 5-7 µ m의 범위에 있어야 화재 연마 후.</li>
	<li>삽입 주사기에 연결 된 microelectrode 홀더에서 자극 피 펫.</li>
	<li>작은 접시 (35 x 10 m m) 실리콘 고무 에폭시 코팅에서 제조 해 부 접시 (재료의 표 참조) 28에 설명 된 대로. 
	참고: 실리콘 고무 사용 하기 전에 완전히 경화 되어야 합니다.</li>
	<li>방황 3 탈피 애벌레를 선택 하 고 27 , 28 , , 29 30에 설명 된 대로 그것을 해 부. 
	참고: boutons를 시각화 하려면 비행 스트레인 CD8-GFP (재료의 표 참조) <ol><li>사용 집게 (재료의 표 참조), 선택 3 rd 탈피 애벌레는 유리병에서.</li>
		<li>핀 첫 번째 핀 후부 배치 애벌레와 다른 핀 앞쪽 (가까운 입 후크).</li>
		<li>추가 HL3 솔루션.</li>
		<li>애벌레의 등 쪽 측에 봄을가 위 (재료의 표 참조)에서 최고 핀 하단 하나를 사용 하 여 잘라 만들.</li>
		<li>애벌레 필렛, 애벌레의 왼쪽과 오른쪽에 2 추가 핀 배치를 핀.</li>
		<li>배 짱과 집게를 사용 하 여 tracheas 제거.</li>
		<li>봄이 위를 사용 하 여 복 부 신경 코드 밖에 신경을 잘라.</li>
	</ol></li></ol> 3. EJCs의 전기 레코딩 <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig2.jpg"> 그림 2. 녹음 설정. 샘플 NMJ 실리콘 코팅된 페 트리 접시 (화살표) epifluorescence 기능, 높은 확대 목표 및 2 개의 micromanipulators 수직 화합물 현미경의 이동식 무대 위에 위치에 고정. 현미경은 진동 방지 테이블에 배치 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<li>녹음 <ol><li>장소 현미경 단계 ( 그림 2)에 준비와 페 트리 접시 <ol>. 목욕에서 참조 전극 삽입.</ol></li>
		<li>기록 전극 HL3 솔루션을 작성합니다. 10 배 목표 아래 (재료의 표 참조), 전극은 욕조에 담가 고 6-7 2, 3, 또는 4는 micromanipulator를 사용 하 여 복 부 세그먼트의 근육 이상 (재료의 표 참조) ( 그림 3 A.1, A.2).</li>
		<li>60 x 목표 전환 (재료의 표 참조). 피-형광 또는 DIC 광학을 사용 하 여 관심사의 지역에 초점. 시 냅 시스 bouton ( 그림 3 B.1-3) 위에 전극의 끝을 놓습니다.</li>
		<li>근육에 매우 부드럽게 전극을 누릅니다. 과도 한 압력은 NMJ를 손상 또는 자발적 시 냅 시스 활동에 증가 일으킬 수 있습니다. 전극의 팁은 안 막힌-그것은, 그것을 대체 하는 경우 확인</li>
		<li>앰프, A/D 보드, 그리고 컴퓨터에 전환.</li>
		<li>앰프에 전압 클램프 모드를 선택 하십시오.</li>
		<li>수집 소프트웨어를 시작 하 고 선택은 ' 간격-무료 ' 모드.</li>
		<li>컴퓨터 화면에 mEJCs의 모양을 관찰.</li>
		<li>0.2-의 범위에는 mEJCs의 진폭은 없는지 0.7 없음. 
		참고: 작은 EJCs 나타냅니다 기록 전극 결함이 있다 또는 그것이 제대로 위치 하지은.</li>
	</ol></li> <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig3.jpg"> 그림 3. 시 냅 스 boutons의 시각화. Hemi-세그먼트 확대 (A.1)와 근육 6 및 7을 보여주는 확대 박스형된 영역 아래 10의 (A) A 명시 이미지 (A.2, 화살표 표시 기록 전극). 눈금 막대 = 50 µ m. (B) 시 냅 스 boutons는 유전으로 인코딩된 신경 마커 (CD8-GFP)와 초파리 라인에 시각 피 형광 이미징 (B.1) 또는 DIC 광학 (B.2)을 사용 하 여. 이미지는 객관적이 고 GFP 이미징에 대 한 필터 큐브 x 60 찍은 (재료의 표 참조). Synaptic boutons 화살표와 함께 표시 되 고 형광 및 DIC 이미지 오버레이 B.3에 표시 됩니다. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="2"> <li>자극 <ol><li>근처 복 부 세그먼트 2-4를 innervating 축 삭 자극 전극 배치 사용 시각적인 통제 micromanipulator.</li>
		<li>주사기의 피스톤을 당겨서 적용 부정적인 압력에 연결 전극 홀더, 그래서 축 삭 ( 그림 2) 전극의 내부 뽑아.</li>
		<li>는 자극에. 격리 단위에 노브를 설정 (재료의 표 참조) 제로 전류를 설정 하 여 다음 부드럽게 증가, EJCs 나타날 때까지 (또는 임계값에 도달할 때까지).</li>
		<li>현재 자극 suprathreshold 정권에서 자극 증가 약 두 번, EJCs의 관찰에 대 한 임계값에 비해 수행. 
		참고: 우리의 경험에서 이러한 자극 강도 실패 활동 전위와 활동 전위 발생을 피하기 위해 최적입니다. 예를 들어, EJCs 0.2의 자극 전류에 나타납니다 0.4의 전류를 사용 하는 엄마, 실험을 통해 엄마.</li>
	</ol></li> <li>물개 저항 <ol><li>앰프의 전극 저항 스위치를 설정 하 여 녹음 macropatch 전극의 인감 저항을 측정 " 테스트 봉인 " 위치. GΩ에 인감 저항의 값에 표시 됩니다 관찰 된 " 현재 " 창.</li>
		<li>인감 저항 0.5-2 M의 범위에 있는지 확인 Ω. 값이이 범위를 벗어난 표시 전극 제대로 광택 또는 하지 제대로 위치.</li>
		<li>인감 저항 녹음을 통해 모니터링, 실험을 통해 일정 하 게 유지 그것 다는 것을 확인.</li>
	</ol></li></ol> 4. 분석 분석용 소프트웨어 사용자 지정 <ol><li>분석 녹음 채용 (재료의 표 참조). 
	참고: 연구소 사내 소프트웨어 Quantan 31, EJCs 및 mEJCs focally 기록 ( 그림 4)의 검출에 대 한 사용자 지정을 사용 합니다. 이 소프트웨어 가우스 디지털 필터를 포함 하 고 겹치는 다중 quantal 이벤트 ( 그림 4A)에서 quantal 봉우리의 탐지를 허용 한다. 다른 접근 17에 설명 되어 있습니다.</li>
</ol> <img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig4.jpg"> 그림 4. Quantal 분석입니다. MEJCs (A)와 EJCs (B) Quantan 소프트웨어에 의해 감지. 이벤트 지역 녹색으로 표시 하 고 봉우리는 붉은 화살표에 의해 표시 된다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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<li>Huntwork, S., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complexin+fusion+clamp+regulates+spontaneous+neurotransmitter+release+and+synaptic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A complexin fusion clamp regulates spontaneous neurotransmitter release and synaptic growth.</a> Nat Neurosci. 10 (10), 1235-1237 (2007).</li>
<li>Zhong, Y., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+synaptic+plasticity+in+Drosophila+memory+mutants+with+a+defective+cyclic+AMP+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altered synaptic plasticity in Drosophila memory mutants with a defective cyclic AMP cascade.</a> Science. 251 (4990), 198-201 (1991).</li>
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<li>Melom, J. E., Akbergenova, Y., Gavornik, J. P., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+and+evoked+release+are+independently+regulated+at+individual+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous and evoked release are independently regulated at individual active zones.</a> J Neurosci. 33 (44), 17253-17263 (2013).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

초파리 는 공부 시 냅 스 전송에 유리한 모델 유기 체를 나타냅니다. 여러 녹음 구성 시 냅 스 전위, 시 냅 스 전류 두 전극 전압 클램프33,34, 및 초점 macropatch의 녹음의 세포내 녹음을 포함 한 애벌레 NMJ에 사용 되었습니다. 여기서 설명 하는 시 냅 스 전류 기록입니다. 후자의 방법을 시각화 된 boutons에 시 냅 시스 전송의 정확한 정량화를 허용합니다.
설명된 프로토콜의 성공을 비판적으로 관심의 영역을 명확 하 게 시각화 하 고 기록 전극의 준비를 사용자 지정 하는 기능에 따라 달라 집니다. 따라서, 품질 DIC 광학, 긴 작동 거리, 및 화재 연마 및 전극 녹음의 굽 힘에 대 한 사용자 지정 된 장비와 높은 확대 물 침수 목표는 매우 중요 하다.
이 방법의 장점은 기록 전극에서 위치...

초파리 는 시 냅 스 전송 제어 하는 분자 메커니즘을 연구 하는 우수한 모델 시스템입니다. 초파리 에서 신경 근육 학 시스템 glutamatergic, 이며 따라서 초파리 신경 근육 학 교차로 (NMJ) glutamatergic 자료의 보존된 기능을 공부를 사용할 수 있습니다. 1 월과 1 월의 연구1, 이후 세 번째 탈피 애벌레는 갖는 자발적 시 냅 스 전송 흥분 성의 접합 잠재력 (EJPs) 또는 전류 (EJCs)을 모니터링 하 여 공부 하 광범위 하 게 사용 되었습니다. EJPs는 일반적으로 기록 침 날카로운 유리 마이크로 전극, 그들은 주어진된 근육 섬유에서 시 냅 스를 만드는 모든 boutons를 포함 하 여 전체 NMJ의 활동을 반영 하 고.
대조적으로, 출시의 사이트의 제한 된 수의 활동 신경 터미널 또는 시 냅 스 varicosities 근처 micropipette 팁을 배치 하 여 focally 기록할 수 있습니다. 이 기술은 원래 캐츠와 Miledi2에 의해 고용 되었다 및 초점 세포 외 녹음 개구리3,,45, 마우스6 를 포함 한 여러 NMJ 준비에서 성공적으로 고용 되어 , 7 , 8, 갑각류9,10,11,12,13,,1415,16및 초파리17,18,19,20,21,,2223. 이 이렇게는 최적화 된 레코딩 전극24,25macropatch 누가 Dudel에 의해 더 개발 되었다. Dudel의 구현에서이 기술을 밀접 하 게 일치 하는 느슨한 패치 클램프 방법26.
초파리 애벌레 NMJ 시 냅 스 boutons, 명확 하 게 정의 하 고 유전자 인코딩된 신경 형광 태그 ( 테이블의 자료참조)와 유전자 변형 라인은 쉽게 사용할 수 있습니다. 이러한 장점이 우리 EJCs와 mEJCs는 선택 된 시 냅 시스 bouton20,,2122에서 기록를 활성화. 여기, 우리는이 기술을 자세히 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Sutter P-97</td><td>Sutter 기구</td><td>P-97</td><td>미세 전극 풀러</td></tr><tr><td>Narishige MF-830</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Microforge</td></tr><tr><td>WPI MF200</td><td>WPI</td><td>MF200</td><td>Microforge</td></tr><tr><td>Glass capilaries</td><td>WPI</td><td>B150-86-10</td><td>Glass capilaries</td></tr><tr><td>Microtorch 1WG61</td><td>Grainer</td><td>1WG61</td><td>Microtorch</td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>다우 코닝</td><td>SYLGARD 184</td><td>해부 플레이트 준비용 실리콘</td></tr><tr><td>해부 핀</td><td>아마존</td><td>B00J5PMPJA</td><td>애벌레 포지셔닝용 핀</td></tr><tr><td>핀셋</td><td>WPIINC</td><td>500342</td><td>핀셋 핀 배치, 내장 및 기관 제거용.</td></tr><tr><td>가위</td><td>WPIINC</td><td>501778</td><td>유충과 신경의 큐티큘러를 절단하기위한 가위.</td></tr><tr><td>올림푸스 BX61WI</td>, <td>올림푸스</td><td>BX61WI</td><td>정립 현미경</td></tr>, <tr><td>올림푸스 Lumplan FL N, 60x</td><td>올림푸스</td><td>UPLFLN 60X</td><td>현미경 대물렌즈, 60X</td></tr><tr><td>올림푸스 UPlan FL N, 10x</td><td>올림푸스</td><td>Uplanfl N 10X</td><td>현미경 대물렌즈, 10X</td></tr><tr><td>Narishige Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MHW-3</td><td>3축 수압 미세매니퓰레이터</td></tr><tr><td>npi Electronic GmbH ELC-03XS</td><td>npi Electronic GmbH</td><td>ELC-03XS</td><td>전기생리학 증폭기</td></tr><tr><td>A.M.P.I Master 8</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master 8</td><td>전기 자극기</td></tr><tr><td>A.M.P.I Iso-Flex</td><td>A.M.P.I.</td><td>Iso-Flex</td><td>자극 아이솔레이터</td></tr><tr><td>TMC 방진 테이블</td><td>TMC</td><td>63-9090</td><td>방진 테이블</td></tr><tr><td>TMC 패러데이 케이지</td><td>TMC</td><td>81-333-90</td><td>패러데이 케이지</td></tr><tr><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1322A</td><td>Digidata</td></tr><tr><td>컴퓨터</td><td>Dell</td><td>Dell Dimension 5150</td><td>Win XP OS</td></tr><tr><td>전극 홀더</td><td>WPI</td>가 있는 컴퓨터<td>MEH3SW</td><td>전극 홀더</td></tr><tr><td>광학 필터</td><td>Omega 광학</td><td>XF 115-2</td><td>녹색 형광 단백질(GFP) 감지용 필터 큐브</td></tr><tr><td>pCLAMP 8</td><td>Axon Instruments</td><td>8.0.0.81</td><td>신호 기록용 소프트웨어</td></tr><tr><td>Quantan</td><td>사내 소프트웨어</td><td>-</td><td>신호 처리용 소프트웨어</td></tr><tr><td>Canton-S (Wildtype)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>64349</td><td>Control fly line</td></tr><tr><td>cpx SH1</td><td>Generous Gift of J.T.</td> <td>Littleton-Complexin</td> <td>knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis</td></tr><tr><td>CD8-GFP</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>5137</td><td>뉴런 형광등(GFP) 태그가 있는 플라이 라인</td></tr></tbody></table>

초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로에서 시 냅 스 전류의 초점 macropatch 녹음

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila 신경 근육 학 교차로 (NMJ) glutamatergic 시 냅 스 전송 연구에 우수한 모델 시스템입니다. 초파리 애벌레 NMJ에 시각화 된 boutons 시 냅 스 전류 초점 macropatch 녹음 기술을 설명합니다. 이 기술은 micropipettes, 높은 배율, 장거리 물 침수 목표, 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 광학와 형광 화합물 현미경 녹음의 맞춤된 제작을 해야 합니다. 첨부 합니다. 기록 전극 선택된 시 냅 시스 bouton DIC 광학, epi-형광, 또는 둘 다 시각 위에 배치 됩니다. 이 기법의 장점은 릴리스의 사이트의 제한 된 수의 시 냅 스 활동을 모니터링을 허용 한다입니다. 기록 전극은 여러 미크론의 직경 그리고 전극 가장자리 밖에 배치 된 릴리스 사이트 크게 영향을 주지 않습니다 기록된 전류. 기록 된 시 냅 스 전류 빠른 속도 고 쉽게 해결 될 수 있습니다. 이러한 장점은 향상 된 자연 또는 비동기 시냅틱 활동 돌연변이 플라이 라인의 연구에 대 한 특히 중요 하다.

초점 macropatch 녹음 선택 된 시 냅 스 boutons (그림 5)에서 모니터링 시 냅 시스 활동 가능 전극 (그림 5A, 사이트 1) 시 냅 시스 bouton 위에 가져갈 때 기록 된 mEJCs (그림 5C, 사이트 1)는 진폭 잡음 레벨을 크게 초과 하 고 (하위 밀리초 범위)에서 단계 상승 날카로운. 때 기록 전극은 이동 시 냅 시스 bouton 멀리 몇 미크론 (그림 5A, 사이트 2), 기록 된 mEJCs 감소의 진폭에 의해 거의 소음 수준 (그림 5B, 2). 기록 된 EJCs 겨우 소음에서 구별 될 수 있다 그리고 그들은 단계 (그림 5C</stro...

시 냅 스 전류 초파리 3 탈피 애벌레 neuromuscular 접속점에 시각화 된 시 냅 스 boutons에서 focally 기록 될 수 있습니다. 이 기술은 단일 시 냅 시스 bouton의 활동을 모니터링 수 있습니다.

초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로에서 시 냅 스 전류의 초점 Macropatch 녹음

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

이 기술의 전반적인 목표는 초파리 유충 신경근 접합부에서 시각화된 시냅스 부톤의 시냅스 활동을 모니터링하는 것입니다. 유전자 조작에 쉽게 수정할 수 있는 우수한 모델 시스템. 이 기법은 과학의 핵심 질문을 해결할 수 있습니다.예를 들어, 시냅스 단백질의 돌연변이가 시냅스 전달을 조절하는 방법. 이 기술의 주요 장점은 제한된 수의 방출 부위의 활동을 모니터링하고 빠른 역학의 전류를 기록하고 쉽게 해결할 수 있다는 것입니다. 실험을 시작하려면: 미세 전극 풀러를 준비합니다.35X 배율에서 현미경을 사용하여 당겨진 전극의 내경이 7-10마이크로미터 범위에 있는지 확인합니다. 먼지가 쌓이지 않도록 단단히 밀폐된 용기에 모세관을 보관하십시오. 다음으로, 마이크로 단조를 사용하여 모세관을 화재 연마합니다.연마된 전극의 최종 내경이 5마이크로미터인지 확인합니다. 그런 다음 굽힘으로 이동합니다. 매니퓰레이터에 전극을 고정하고 팁을 필라멘트에 닿지 않도록 위에 놓습니다.열 값을 최대치의 60-70%로 설정하고 마이크로 포지의 페달을 1-2초 동안 눌러 필라멘트를 가열합니다. L자형 바늘을 사용하여 전극 끝을 부드럽게 아래로 당기고 약 90도로 구부립니다. 전극을 토치의 불꽃 위에 손으로 잡고 두 번째 굽힘은 첫 번째 굽힘에서 7-10mm로 약 120도 각도로 구부립니다.혈림프 유사 또는 HL3 용액을 준비합니다. 솔루션을 refigerator에 보관하고 매주 새로 만드십시오. 유리 피펫을 구부리지 않고 기록하는 것과 같은 방식으로 자극 피펫을 준비합니다.다음으로, 주사기에 연결된 미세 전극 홀더에 자극 피펫을 삽입합니다. 실리콘 고무 에폭시로 코팅된 작은 페트리 접시에서 제조된 해부 플레이트. 그런 다음 집게를 사용하여 바이알에서 떠돌이 세 번째 instar 유충을 선택합니다.유충을 고정하고 첫 번째 핀을 뒤쪽에 배치하고 다른 핀을 입 고리에 가깝게 앞쪽에 배치합니다. HL3 솔루션을 추가합니다. 유충의 등쪽은 스프링 가위를 사용하여 위쪽 핀에서 아래쪽 핀까지 자릅니다.유충의 왼쪽과 오른쪽에 두 개의 추가 핀을 배치하여 유충 필레를 고정합니다. 집게를 사용하여 내장과 기관을 제거합니다. 스프링 가위를 사용하여 복부 신경삭 바로 바깥쪽의 신경을 절단합니다.준비물과 함께 페트리 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다. 수조에 기준 전극을 삽입합니다. 기록 전극에 HL3 용액을 채웁니다.10X 대물렌즈 아래에서 전극을 수조에 담그고 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 2, 3 또는 4의 복부 돌출부 중 6, 7 근육 위에 놓습니다. 다음으로, 대물렌즈를 60X로 전환하고 epiflorescence 또는 DIC optics를 사용하여 관심 영역에 초점을 맞춥니다. 전극의 끝을 시냅스 부톤 위에 놓고 과도한 압력은 NMJ를 손상시키거나 자발적인 시냅스 활동을 증가시킬 수 있으므로 전극을 근육에 매우 부드럽게 누릅니다.그런 다음 증폭기, AD 보드 및 컴퓨터를 켭니다. 그런 다음 증폭기에서 전압 클램프 모드를 선택합니다. 수집 소프트웨어를 시작하고 갭 프리 모드를 선택한 다음 컴퓨터 화면에서 MEJC가 나타나는지 관찰합니다.MEJC의 진폭이 0.2 - 0.7 나노암페어 범위인지 확인합니다. 시각 제어 하에 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 자극 전극을 2번에서 4번까지 복부 분절에 신경을 분포시키는 축삭 근처에 놓습니다. 전극 홀더에 연결된 주사기의 피스톤을 당겨 축삭돌기가 전극 내부로 당겨지도록 음압을 가합니다.다음으로 자극기를 켭니다. 절연 장치의 손잡이를 돌려 제로 전류를 설정한 다음 EJC가 나타나거나 임계값에 도달할 때까지 부드럽게 증가시킵니다. superthreshold regi에서 자극을 수행합니다.자극 전류는 EJC의 관찰을 위한 임계값에 비해 약 2배 증가합니다. 증폭기의 전극 저항 스위치를 밀봉 테스트 위치로 돌려 기록 매크로 패치 전극의 밀봉 저항을 측정합니다. 현재 창에 표시될 밀봉 저항 값(기가 옴)을 관찰하십시오.Focal macro patch recordings를 사용하면 선택된 synaptic boutons에서 시냅스 활동을 모니터링할 수 있습니다. 전극이 시냅스 부톤 위에 위치할 때 기록된 MEJC는 노이즈 수준을 크게 초과하는 진폭과 밀리초 미만의 범위에서 급격한 상승 위상을 갖습니다. 기록 전극이 시냅스 부톤에서 수 미크론 정도 멀어지면 기록기 MEJC의 진폭이 거의 잡음 수준까지 감소합니다.기록된 EJC는 노이즈와 거의 구별할 수 없으며 상승 단계가 연장되었습니다. 초점 기록을 통해 복합체 및 그놈 돌연변이에서 MEJC를 정확하게 감지할 수 있습니다. 이 돌연변이의 세포 간 기록은 겹쳐서 신뢰할 수 있는 검출할 수 없는 사건을 방출합니다.전기 칩의 각도 조정은 전극의 위치에 매우 중요합니다. 이 절차에 따라 개별 방출 이벤트의 이미징 확인과 같은 다른 방법을 수행하여 개별 활성 영역의 활동 통합과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

focal-macropatch-recordings-synaptic-currents-from-drosophila-larval

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기 Drosophila의 유충의 신경근육학 교차점에서 시냅스 전송을 측정 electrophysiological 방법을 설명합니다. Evoked 릴리스는 모터 신경의 axons을 자극하여 인공적으로 시작되며, NMJ을 통해 전송은 근육에 evoked postsynaptic 반응에 의해 측정할 수 있습니다.

Drosophila의 애벌레의 NMJ에서 시냅틱 후보를 녹음 Electrophysiological 방법

접근 시냅스에 전기 생리학의 응용 프로그램 시냅스 돌연변이를 분석에 유용 시냅스 활동의 같지는 조치를 제공합니다. 이 문서 신경근육학 분기점 (NMJ)의 노출하는 데 사용되는 절개 방법을...

해부 및 C. 엘레간스 신경근육학 융티온에서 레코딩

에 Electrophysiological 녹음 Drosophila 엠브료

애벌레 zebrafish는 척수 모터 신경 세포 및 대상 골격근에서 동시 패치 클램프 녹음을 허용하는 최초의 척추 모델 시스템을 나타냅니다. 이 동영상은 segmental 캡 모터 신경 세포와 목표 근육 세포뿐 아니라 각 세포 유형에서 레코딩을위한 방법론을 식별하는 데 사용되는 미세한 방법을 보여줍니다.

모터 신경 세포의 이점 패치 클램프 레코딩과 Zebrafish의 대상 골격근

의 활성 영역의 해부 및 이미징 Drosophila 신경근육학 융티온

현장 패치에 클램프 녹음은 그대로 회로의 뉴런의 electrophysiological 특성에 사용됩니다. CNS는 작고 강력한 피복에 둘러싸여 있기 때문에 Drosophila 유전자 모델 패치를 고정으로 어렵습니다. 이 문서는 이후의 패치 클램프 녹음의 집과 깨끗한 뉴런을 제거 할 수있는 절차에 대해 설명합니다.

의 작성<em&gt; Drosophila</em에 대한&gt; 중부 뉴런<em&gt; 현장에서</em&gt; 패치 클램핑

초파리 신경근 접합부(NMJ)는 시냅스의 형태와 기능을 연구하기 위한 모델로 사용됩니다. 이 비디오는 연구자들이 NMJ를 특성화하기 위해 정량화하는 중요한 특징에 대해 설명합니다. 예제 프로토콜은 정량화를 자동으로 수행할 수 있는 소프트웨어를 보여줍니다.

초파리 신경근접합부(NMJ) 정량화: 시냅스 형태 및 기능을 평가하는 방법

이 비디오는 초파리 유충의 신경근 접합부에 있는 시냅스 부톤의 시냅스 전류를 기록하는 기술을 보여줍니다. 이 기술을 사용하면 단일 시냅스 부톤의 활동을 모니터링할 수 있으며, 이는 자발적 또는 비동기적 시냅스 활동이 향상된 돌연변이 파리 계통 연구에 중요합니다.

Drosophila larval neuromuscular junction에서 시냅스 전류 기록

우리는 zebrafish의 배아에서 MAUTHNER 뉴런과 다른 reticulospinal 세포 패치 클램프 녹음을 통해 전기적 활동을 기록하고 모니터링 할 수있는 그대로 뇌 - 척수 준비를 개발했습니다. 따라서, 우리는 배아의 주요 신경 세포에서 흥분성과 억제 성 시냅스 전류, 전압 문 채널 활동 및 활동 전위를 기록 할 수 있습니다.

배아 Zebrafish의 MAUTHNER 세포에서 패치 클램프 녹음

시냅스 전 방출 안면막에서 Ca2+ 전류를 기록하는 것은 Ca2+ 진입 및 신경전달물질 방출을 정확하게 이해하는 데 중요합니다. 우리는 기능적으로 고립된 망상척수 축삭돌기를 생성하는 lamprey 척수의 급성 해리를 제시하여 개별 시냅스전 말단의 방출면 막에서 직접 기록할 수 있습니다.

장어 Reticulospinal 축삭의 급성 해리는 개별 기능 시냅스 터미널의 릴리스 얼굴 막에서 녹음을 활성화하는

제브라피시 유충 신경근 접합부(jebrafish larval neuromuscular junction)는 시냅스 생리학을 연구하기 위한 매력적인 모델입니다. 전기 생리학 및 광학 이미징을 포함한 많은 실험 기술에 적용할 수 있습니다. 여기에서는 정립 형광 현미경 하에서 pHluorin 기반 프로브를 사용하여 시냅스 전달을 이미징하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

절개된 유충 제브라피쉬의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용의 라이브 이미징

배우세요 Drosophila 애벌레 신경근육 접합부에서 초점 Macropatch 기법을 이용한 시냅스 활동 측정 방법입니다. 이 기술은 개별 시냅스 단추에서 미시 흥분성 접합 전류를 기록하여 시냅스 단백질 돌연변이가 신경전달에 미치는 영향을 연구하는 데 활용됩니다.

초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로에서 시 냅 스 전류의 초점 Macropatch 녹음

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