애기 씨의 높은 처리 살 균에 대 한 표준화 된 방법

이 연구의 목적은 메 마른 매체에 성장 범위의 애기 genotypes의 종자 발 아에 표 백제와 염소 가스 살 균의 효과 확인 했다. 최적화 된 살 균 프로토콜 제공 만족 스러운 씨 생존 하면서 오염 물질을 미생물의 성장을 방지 하기 위해 개발 되었습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 미생물 성장을 방지하면서 많은 수의 애기장대 유전자형의 성공적인 종자 살균을 위한 표준화된 조건을 제공하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 한 번에 수백 개의 종자 샘플을 멸균할 수 있으므로 유전체학, 단백질체학, 대사체학 및 기타 고처리량 연구 분야에서 중요한 식물 물질 준비 단계를 단순화할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 효율적인 멸균이 많은 수의 종자 샘플에 대해 높은 발아율과 결합되는 조건을 제공한다는 것입니다.

시작하려면 증류수로 50% 표백제 용액을 준비합니다. 표백제 용액 200ml당 TWEEN 20 세제 50마이크로리터를 추가합니다. 표백제 용액은 멸균 상태에서만 개봉하는 한 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다.

다음으로, 100개의 씨앗을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 분취합니다. 이 작업은 수동으로 수행하거나 맞춤형 종자 로봇을 사용하여 수행할 수 있습니다. 이제 층류 후드에서 500 마이크로 리터의 50 % 표백제 용액을 씨앗에 첨가하십시오.

그런 다음 튜브를 회전기로 옮기고 10분 동안 가벼운 교반으로 표백제에 씨앗을 배양합니다. 10분 후 튜브에서 표백제 용액을 흡입하여 최대한 제거합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 멸균 증류수를 다시 넣고 튜브를 뒤집어 섞습니다.

씨앗이 가라앉을 때까지 기다린 다음 물을 흡인하고 다른 부분 표본으로 대체하여 씨앗을 다시 씻습니다. 멸균된 증류수로 총 6번의 세척을 수행합니다. 씨앗을 물로 완전히 씻은 후에는 도금하기 전에 1ml의 물에 매달아 두십시오.

멸균 과정을 시작하기 전에 염소 가스를 생산하는 데 필요한 표백제와 염산의 양을 계산하십시오. 제공된 방정식을 사용하여 권장되는 6% 염소 가스를 얻습니다. 성공적인 멸균을 보장하고 튀는 것을 방지하는 데 필요한 HCl의 양을 정확하게 계산해야 합니다.

이 프로토콜 동안 장갑과 실험복을 착용하고 산이나 표백제에 젖을 때마다 장갑을 교체하십시오. 흄 후드 아래에서 시드 바이알을 뚜껑이 열린 상태로 랙으로 옮깁니다. 그런 다음 멸균이 이루어질 수 있는 플라스틱 용기에 랙을 넣고 뚜껑을 용기에 밀봉하기 위해 파라핀 필름 스트립을 준비합니다.

이제 비커에 100ml의 표백제를 넣은 다음 내부에 250ml의 비커를 넣습니다. 과도한 표백제를 사용하는 것은 안전 기능이며 비커는 포함된 용액의 총 부피의 두 배 이상이어야 합니다. 또한 표백제와 산은 항상 분리하여 취급하십시오.

다음으로, 비커에 3 밀리리터의 염산을 첨가 한 다음 즉시 용기를 닫고 파라 필름으로 밀봉하십시오. 1시간 동안 용기를 모니터링하여 멸균 중에 가스가 축적되고 있는지 확인합니다. 염소 가스는 용기 내부에서 희미한 노란색 안개로 보이거나 용액이 노란색으로 변하는지 확인할 수 있습니다.

용기의 밀봉을 주기적으로 확인하십시오. 뚜껑이 닫히지 않거나 파라핀 밀봉이 헐거워지기 시작하면 파라핀 필름을 추가로 덮어 뚜껑을 단단히 다시 밀봉하십시오. 1시간 살균 후 용기의 모서리를 열어 3시간 동안 가스를 배출합니다.

3시간 동안 환기시킨 후 모든 튜브의 뚜껑을 닫고 멸균된 씨앗이 플레이팅될 때까지 건조한 상태로 보관하십시오. 이제 중탄산나트륨 분말 1.5g을 천천히 첨가하면서 유리 막대로 저어 고체를 용해시켜 반응을 중화합니다. 이산화탄소 가스 거품이 형성을 멈출 때까지 중탄산나트륨을 계속 첨가하십시오.

그런 다음 용액의 pH를 측정하고 필요한 경우 pH가 중성이 될 때까지 중탄산나트륨을 추가로 첨가합니다. 용액에서 냄새가 나지 않으면 폐기할 수 있습니다. 그렇지 않으면 모든 냄새가 사라질 때까지 기다리십시오.

가스 멸균된 씨앗의 각 튜브에 500마이크로리터의 멸균된 증류수를 추가합니다. 그런 다음 씨앗을 MS 플레이트에 붓고 멸균 일회용 접종 루프 또는 멸균 피펫 팁을 사용하여 균일하게 펴 바릅니다. 섭씨 4도에서 3일 동안 종자 층화를 한 후 16시간 동안 매일 빛에 노출되어 플레이트를 섭씨 23도로 옮깁니다.

뿌리가 매체로 자랄 수 있도록 뚜껑을 위에 두십시오. 8일 동안 자란 후 발아한 씨앗의 비율을 점수화합니다. 발아는 라디칼이 종피 밖으로 돌출되고 두 개의 자엽이 보일 때 계산됩니다.

또한 곰팡이의 영향을 받는 씨앗의 수를 세어 살균 조건의 효과를 확인하십시오. 5 가지 다른 노출 시간에서 4 가지 농도의 표백제를 Columbia 야생형 종자에 대해 테스트했습니다. 높은 표백제 농도는 너무 많이 노출되면 발아에 악영향을 미쳤습니다.

그러나 모든 노출 시간에서 40% 및 50%의 표백제에서 높은 발아율이 관찰되었습니다. 높은 농도의 표백제로 멸균된 종자는 폐사율이 높았고 종종 성장 결함이 보였지만 일반적으로 곰팡이가 전혀 없었습니다. 50% 표백제를 10분 동안 살균하면 곰팡이 억제와 건강한 발아가 최적의 균형을 이루는 것으로 확인되었습니다.

염소 가스 멸균 조건을 최적화하기 위해 세 가지 농도의 염소 가스를 사용하여 두 가지 다른 시간에 걸쳐 Columbia 야생형 종자를 멸균했습니다. 시간과 가스 농도 사이에는 상당한 상호 작용이 있었습니다. 1시간에는 발아에 영향을 미치지 않았지만 가장 높은 가스 농도는 3시간에 해로웠습니다.

따라서 1시간의 살균 기간이 선택되었습니다. 곰팡이 성장은 3 시간 가스 노출 또는 6 % 또는 17 % 가스를 사용하여 1 시간 노출에 의해 효과적으로 억제되었습니다. 따라서 1시간 동안 6%의 가스 농도가 발아 및 곰팡이 억제에 최적인 것으로 결정되었습니다.

일단 숙달되면, 이 기술은 적절하게 수행된다면 하루에 수백 개의 종자 라인을 성공적으로 멸균하는 데 사용할 수 있습니다. 가스 멸균 된 종자는 건조한 조건에서 장기간 보관할 수도 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 제공된 방정식을 사용하여 필요한 HCl 및 표백제 부피를 계산하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 다양한 유전자형과 관심 표현형을 연결하기 위해 게놈 전체 연관 연구와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 실험에 행운을 빕니다.