Name: 애기 씨의 높은 처리 살 균에 대 한 표준화 된 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 배우세요 Arabidopsis 씨의 효율적인 살균 방법으로 50% 표백제 또는 6% 염소 가스를 사용하여 오염을 방지하고 높은 발아율을 유지하는 기술입니다. 이 방법은 대규모 유전체학 연구에 필수적입니다.

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우리는 실험 재료 준비에서 그녀의 지원을 Gauri Datta 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 베티 Wittler과 제임스만 원고의 중요 한 검토를 위해 감사입니다. 이 작품은 NSF 보조금 DBI-1049341 인 m c B-1143813에 의해 지원 되었다.

1. Skoog (MS)와 村 重 매체 x 1의 준비 <ol><li>추가 4.31 g 10 g 자당 기저 소금 혼합물 MS, 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic의 0.5 g의 산 (MES) 증류수와 해산 저 어 0.8 L를 포함 하는 비 커. 확인 하 고 1m 수산화 칼륨 (KOH)를 사용 하 여 5.7에 pH를 조정. 1 수 있도록 증류수를 추가 L.</li>
	<li>1 L 병, 500ml 각 미디어를 나눕니다. 각 병에의 한 천 5 g을 추가 합니다. 뚜껑을 느슨하게 유지.</li>
	<li>121 ° C, 병에 자기 볶음 바 15 psi에서 20 분 압력솥.</li>
	<li>압력가 마로 소독, 후 병 낮은 속도로 저 어 접시에 놓고 (때까지 병 맨 손으로 개최 될 수 있습니다) 45-50 ° C에 냉각 MS 매체 허용.</li>
	<li>층 류 두건에 있는 메 마른 조건에서 모든 단계를 수행 하는이 단계에서 시작 하십시오. 500 µ L를 추가 Gamborg ' s 각 병을 균일 하 게 배포 비타민 솔루션 MS 매체를 저 어 비타민 솔루션.</li>
	<li>약 접시의 깊이의 절반을 커버 하는 접시로 충분 한 미디어를 부 어.</li>
	<li>허용을 공고히 한 천 수 있도록 약 1 시간에 대 한 실 온에서 냉각 판. 
	참고: 경우 판 하지 즉시 사용할 수, 플라스틱에 그들을 포장 하 고 4 ° C (냉장고 온도)에서 저장 합니다. 커버 플레이트, 상자, 또는 응고 한 튜브를 밀폐 용기에 4 ° C에서 몇 주 동안 저장 될 수 있다.</li>
</ol> 2. 살 균 표 백제와 애기 씨의 <ol><li>섹션 1 프로토콜의 준비는 MS 판. MS 미디어로 동시에 증류수 100 mL 압력솥. 사용 하 여이 나중에 린스 물과 씨앗을 중단할 수 있도록 도금에 도움. 
	참고: 원하는 경우 0.8 %agar 블렌드 (w/v) (예: phytagar) 또한 수 압력가 마로 소독이 단계에서. 한 천 혼합 도금 동안 증류수에 대 한 교체 될 수 있습니다 (단계 2.5.3.). 한 혼합의 추가 점도 쉽게 접시 또는 공장에 공간 씨 행에 필요한 경우.</li>
	<li>준비 50% (v/v) 씨앗을 살 균 하는 데 사용할 솔루션을 표 백제. 표 백제를 희석, 백제의 100 mL 증류수 100 mL를 추가 합니다. 50 µ L 트윈 20 세제의 표 백제 솔루션에 추가. 
	참고: 준비 표 백제 솔루션에 대 한 저장 될 수 있다 그것은 단지 무 균 조건에서 열로 한 달에 최대.</li>
	<li>1.5 mL microcentrifuge 튜브에 aliquot 100 씨.</li>
	<li>50% 표 백제 솔루션을 사용 하 여 씨앗 소독.
	<ol><li>층 류 두건에 추가 50% 표 백제 솔루션의 500 µ L 씨를 포함 하는 microcentrifuge 튜브. 표 백제 솔루션에서 씨앗을 중단 튜브의 아래쪽을 누릅니다. 
		참고: 또는, 회전 또는 플랫폼 통 사용할 수 있습니다 중단 씨앗을 유지.</li>
	</ol></li> <li>튜브에서 표 백제 솔루션을 씻어 내어 주세요.
	<ol><li>10 분 후에 피 펫 또는 끝에 피 펫 팁을 장착 한 흡 인기를 사용 하 여 microcentrifuge 튜브에서 표 백제 솔루션 제거.</li>
		<li>추가 500 µ L의 무 균 튜브에 증류수. 튜브를 닫고 혼합을 반전 합니다. 씨앗은 튜브의 하단에 정착을 허용 합니다. 일단 씨앗 신중 하 게 튜브의 하단에 정착 pipetting으로 표 백제 솔루션을 제거 합니다. 반복이 6 번 과정을 rinsing.</li>
		<li>씨앗 중단 튜브에 압력가 증류수 1 mL을 추가.</li>
	</ol></li> <li>MS 접시에 소독된 씨앗 판.
	<ol><li>층 흐름 후드에서 재고 이름과 현재 날짜와 MS 판의 하단 라벨.</li>
		<li>MS 플레이트에 microcentrifuge 튜브에서 씨앗을 부 어. 멸 균, 일회용 inoculating 루프 또는 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 MS 플레이트 주위 씨앗을 확산. 
		참고: 지금까지 씨앗 행에 뿌려 져야 하는, 경우에 200 µ L 팁 피펫은 개별적으로 원하는 위치에 씨앗을 배치 하 사용할 수 있습니다. 씨앗의 흐름을 개선 하기 위해, 피 펫 팁의 끝 3-5 m가 위를 사용 하 여 트리밍 수 있습니다. 어떤 잘못된 씨앗이 나 씨앗의 클러스터 다음 위치를 변경할 수 또는 멸 균 일회용 inoculating 루프를 사용 하 여 분리.</li>
		<li>배치 MS 격판덮개의 뒤에 층 류 두건 절반 닫힌 뚜껑의. MS 판에서 증발을 초과 하는 물을 허용.</li>
		<li>MS 접시에 뚜껑을 배치. 인감 외과 미소 한 구멍이 있는 종이 접시를 포장 하 여 MS 판 테이프 (재료의 표 참조).</li>
	</ol></li></ol> 3. 염소 가스와 애기 씨의 살 균 <ol><li>섹션 1 프로토콜의 준비는 MS 판. 압력솥 MS 미디어; 동시에 증류수 100 mL 이 나중 도금에 도움 씨앗을 일시 중단 하려면 사용 됩니다. 
	참고: 원하는 경우 0.8 %agar 블렌드 (w/v) (예: phytagar) 또한 수 압력가 마로 소독이 단계에서. 한 천 혼합 도금 동안 증류수에 대 한 교체 될 수 있습니다 (단계 3.6.2.). 한 혼합의 추가 점도 쉽게 접시 또는 공장에 공간 씨 행에 필요한 경우.</li>
	<li>시작 하기 전에 살 균, 염소 가스를 생산 하는 데 필요한 표 백제 및 염 산 (HCl)의 양을 계산.
	<ol><li>6.1% Cl 2 살 균을 위한 필요를 생산 하기 위해 필요한 HCl의 양을 계산.</li>
		<li>다음 수식을 사용 하 여: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq1.jpg"> 6.1% Cl 2;로 살 균 컨테이너의 볼륨으로 7000 mL와 HCl의 볼륨은 계산 3 mL. 
		참고: 컨테이너 및 % Cl 2의 다른 볼륨에 대 한 계산을 수행 하는 프로그램 스프레드시트 추가 표 1로 제공 됩니다.</li>
	</ol></li> <li>0.5 mL microcentrifuge 튜브에 aliquot 100 씨앗. 각 유리병의 뚜껑을 닫고, 튜브에 플라스틱 랙 하 고 따로 설정. 
	참고: 씨앗 만큼 그들은 적절 한 조건에 저장 된이 시점에서 시간의 오랜된 기간 동안 저장할 수 있습니다. 저장 조건 Rivero, 동료 4 섹션 3.3.2 프로토콜의에서 찾을 수 있습니다. 96 잘 접시 포맷을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>염소 가스 살 균을 수행 하는 데 필요한 자료를 준비.
	<ol><li>표 백제와 HCl 저장소 위치에서 얻기.</li>
		<li>대형 파라핀의 스트립 영화 (재료의 표 참조) 단계 3.5.3에서에서 사용 하는 컷. 살 균 컨테이너를 봉인 하.</li>
		<li>있는 살 균 열린다 증기 두건 안쪽 뚜껑을 가진 플라스틱 컨테이너를 놓습니다. 모든 씨앗 튜브에 열고 플라스틱 컨테이너 안에 전체 씨앗 랙 배치.</li>
	</ol></li> <li>수행 상 온에서 염소 가스 살 균. 
	주의: 표 백제와 산 별도로 작동 합니다. 유출의 위험을 줄이기 위해 세척제 중 병을 두지 마십시오. 적절 한 개인 보호 장비 (PPE) 장갑과 실험실 외 투를 포함 하 여 사용 합니다. 표 백제 또는 산 장갑에 밝아진, 다른 자료를 취급 하기 전에 장갑을 변경 합니다. 항상 장갑의 경우에 표 백제 또는 산 오염 증기 두건에서 제거.
	<ol><li>컨테이너 안에 250 mL 비 커를 배치 하 고 백제의 100ml 추가. 
		참고: 표 백제와 HCl 사이의 반응 백제의 적어도 22 볼륨 초과를 필요합니다. 반응은 HCl을 사용 하 고 부산물으로 염화 나트륨 (NaCl)와 물 Cl 2 가스를 방출 하 여 표 백제. 블리치의 큰 과잉을 사용 하면 추가 HCl d의 소비uring 나트륨 중 탄산염 (NaHCO 3) 양이 감소 배기 기간 처리를 위한 솔루션을 무력화 하는 데 필요한. 
		주의: 비 커 표 백제 + HCl의 총 액체 볼륨을 두 번 이상 이어야 한다. 그러면 씨앗 손상, 옷, 표 백제 또는 노출 된 피부를 구울 수 있는 다음 단계는 비 커를 탈출 밝아진.</li>
		<li>표 백제를 포함 하는 비이 커에 HCl 3 mL을 추가. 
		주의: 초기 반응 가스 농도 보다 높은 6.1%에서 특히 거품을 생산할 예정 이다. 긴 팔 랩 코트는이 단계에 대 한 필요.</li>
		<li>살 균 컨테이너를 닫고 즉시 파라핀 영화와 함께 인감.</li>
		<li>가스 축적 되도록 살 균 시간 동안 살 균 컨테이너 모니터링, 염소 가스의 축적은 컨테이너 안의 희미 한 노란색 연 무로 표시 되어야 합니다. 
		주의: 정기적으로 확인 하는 내부 압력 뚜껑 대통령직 하지는 보장 하기 위해 살 균 컨테이너 또는 파라핀 영화. 뚜껑 unseated 왔다 또는 파라핀 영화 느슨한 왔다, 뚜껑 닫고 파라핀 영화의 추가 층으로 컨테이너를 신중 하 게 포장.</li>
		<li>1 후 h-살 균 기간, 파라핀 필름을 제거 하 고 한 모서리에 뚜껑을 열고 여 컨테이너를 엽니다. 3 h 반응 완료 하 고 염소 가스 제거를 위한 환기 컨테이너 허용.</li>
		<li>닫고는 모든 microcentrifuge 튜브의 씨앗 랙에 모자. 
		참고: 멸 균된 씨는 건조 상태에서 저장으로 도금의 시간까지 저장할 수 있습니다.</li>
		<li>시드 랙 제거 하 고 층 류 두건에.</li>
		<li>염소 가스 반응 <ol><li>추가 1.5 g NaHCO 3 분말 표 백제/HCl 솔루션을 포함 하는 비이 커에 천천히 중화 고 NaHCO 3 솔루션으로 분해 하는 유리 막대와 저 어. NaHCO 3 때까지 계속 추가 이산화탄소 (CO 2) 가스 거품 형성 중지. 
			주의: 천천히 밝아진을 방지 하기 위해 추가 합니다. 장갑 및 실험실 외 투를 포함 하 여 적절 한 보호구를 사용 하 여.</li>
			<li>산도 스트립 또는 pH 미터를 사용 하 여 솔루션의 산도 테스트 합니다. 솔루션의 pH까지 필요한 중립 이면 추가 NaHCO 3 추가 (pH 7.0). 솔루션을 증기 두건에서 제거 하 고 모든 적용 가능한 처리 지침에 따라 폐기 수 있습니다이 시점에서. 
			주의: 처리 하는 동안 어떤 냄새를 발견 하는 경우 다음 솔루션 즉시에 반환 되어야 증기 두건.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>MS 접시에 소독된 씨앗 판.
	<ol><li>층 흐름 후드에서 재고 이름과 현재 날짜와 MS 판의 하단 라벨.</li>
		<li>추가 500 µ L 씨를 일시 중단 하려면 각 microcentrifuge 튜브에 멸 균된 증류수의. MS 판에 씨앗을 부 어 하 고 멸 균, 일회용 inoculating 루프 또는 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 접시 주위에 균등 하 게 씨앗을 확산.</li>
		<li>배치 MS 격판덮개의 뒤에 층 류 두건 절반 닫힌 뚜껑의. MS 판에서 증발을 초과 하는 물을 허용.</li>
		<li>MS 접시에 뚜껑을 배치. 미소 한 구멍이 있는 종이 수술 테이프와 플레이트를 포장 하 여 MS 접시를 봉인.</li>
	</ol></li></ol> 4. MS 판에 애기의 성장 <ol><li>4 ˚C와 주위 습도에서 3 일 동안 위에 뚜껑 접시를 놓습니다. 
	참고:이 프로세스 계층 이라고 하 고 개별 씨앗의 발 아를 동기화 하는 역할.</li>
	<li>성장 환경에 격판덮개 전송.
	<ol>23 ° C에서 유지 온도 빛의 강도 120-150 µ / m 2 s 16 h 빛 / 8 h 어두운 <li>photoperiod. 뿌리 성장 매체에 접시 위에 뚜껑 성장 환경에 평면 배치.</li>
	</ol></li> <li>접시에 모 종 8 일 동안 성장 하자. 
	참고: 8 주 성장 기간 늦게 발 아 씨앗을 출 수 있습니다. 모든 씨는 출 아 했다 경우 접시 8 일 보다 빨리 득점 될 수 있습니다.</li>
	<li>발 아 속도 점수.
	</li><li>레코드 수가 씨를 출 아 했다 그리고 그가 안 출 아 했다 <ol>. 출 아 했다 종자의 수를 분할 하 여 발 아 율을 계산 판에 씨앗의 총 수. 
		주: 발 아는 radicle 씨 코트 밖에 서 예상은 하 고 두 cotyledons 표시 계산 됩니다.</ol></li>
		<li>종자 살 균 조건의 효과 결정 하는 형에 의해 영향을의 수를 계산 하는 또한.</li>
	</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

메 마른 매체에 애기 씨, 성장 하는 때 살 균의 일종이 적용 되어야 한다. 표 백제와 염소 가스 살 균 치료 결과 비슷한 발 아 율 및 금형 성장 저해. 어느 살 균 방법 잠재적인; 높은 발 아 씨앗 발 아 율에 상당한 감소를 발생 그러나, 표 백제 살 균 것이 좋습니다 줄 때문에 소형, 낮은 발 아 가능성 (20-70%), 비-중요 한, 발 아 율 향상 (그림 3A) 가스 살 균에 비해 이기는 하지만.
애기 씨 최대 10 분 동안 40-100%에서 표 백제 농도와 살 균 만족 발 아 비율 및 효과적인 몰드 억제를 제공 한다. 비록 40% 미만 표 백제 농도 40%의 농도 또는 제비 조차 무 겁 게 오염 된 씨앗의 높은 보장 효과적인 살 균을 사용 하 여 대부분 씨앗 많은 대 한 적절 한 살 균을 제공. 그것은 살 균의 10 분을 초과 하는 표 백제 농도 동등한을 사용 하는 경우 중요 또는 높은 씨 사망률과 종묘 개발에 결함을 피하기 위해 80% 보다 더 높은.
6.1% 나 높은 발 아 속도 적절 한 금형 제거에 1 h 결과 16.5%의 염소 가스 농도와 애기 씨를 치료. 살 균 3 h의 기간을 증가 시켜 낮은 염소 가스 농도 (2.1%)을 성공적으로 사용할 수 있습니다.
몇 줄 소독 될 필요가 있다, 10 분에 대 한 50% 표 백제의 솔루션에 액체 살 균 것이 좋습니다. 라인의 큰 숫자, 1 h 6.1%의 가스 농도와 살 균 가스 때문에 많은 라인 수 멸 균 수 신속 하 고 쉽게 적은 조작으로 더 나은 옵션입니다.
우리의 결과 다른 genotypes의 씨앗의 많은 수와 잠재적인 낮은 발 아 된 씨앗을 살 균에 대 한 표준화 조건을 제공 합니다. 이러한 살 균 기술에 대 한 유일한 제한은 그들이 씨앗 발 아 률 광범위 한 씨 사망으로 인해 20% 미만에 적용할 수 없습니다입니다. 쥡니다17, 살 균의 부재에 발 아 율을 높이기 위해 같은 대체 방법, 이러한 경우에 도움이 될 수 있습니다.

애기 thaliana (애기) 식물 생물학1,,23기초 및 응용 연구에 대 한 주요 모델 생물 이다. 동안 애기 성장에 대 한 표준 조건 잘 설립된4, 씨앗 씨앗 생존에 살 균의 효과 엄격 하 게 테스트 되지. 단단한 미디어 판 또는 상자에 정기적으로 레이어에서 인구, 초기에 촬영 및 루트 고기의 관찰에서에서 homozygous 치명적인 돌연변이의 식별 등 많은 실험적인 응용 프로그램에 대 한 애기 묘의 성장을 촉진 하 사용 단계, 병원 체 자유로운 조직, 많은 양의 묘 종 조직, transformants 또는 약물 내성 식물의 선택과 발 아1,2,3,4의 평가의 컬렉션의 격리 . 온실에서 자란 식물에서 수확 한 씨앗 또는 성장 챔버는 때때로 미생물과 먼지 오염. 메 마른 매체의 종류에 애기 묘의 성장 이전 종자 살 균을 곰 팡이 씨앗 표면에 박테리아 등 미생물 오염 물질을 제거 하 요구 한다. 효과적인 종자 살 균 정권의 사용이 높은 발, 최소 오염, 그리고 활기찬 식물의 성장을의 균형에 대 한 중요 합니다.
애기 씨 살 균을 위해 사용 하는 두 가장 일반적인 방법 상업적인 표 백제 (액체 상)와 염소 가스 (기상)를 기반으로 합니다. 다양 한 절차 두 액체 단계 살 균1,4,5,6,7,,89 고용 되었습니다. , 애기의 10 및 증기 위상 살 균 씨8,10,11,12,13,,1415 16. 그러나,이 절차 사용된 genotypes의 종자 살 균 달성에 효과가 있다, 하는 동안 다른 genotypes의 씨앗에 다른 살 균 처리의 효과 대 한 상세한 분석 되지 보고 되었습니다. 따라서, 이러한 살 균 절차의 최적화 효율적인 살 균 높은 발 아 속도와 결합 하는 조건을 정의 해야 합니다.
애기 생물 자원 센터 (ABRC)는 고유) 테스트의 다양 한 다른 genotypes 씨 생존 컬렉션 및 b) 활용 품질 관리 절차를 내부적으로 적용 및 사용자 피드백에 대응에서 하는 위치 씨 발 아에 대 한. 여기에 제시 된 실험의 목표 범위의 애기 genotypes의 종자 발 아에는 다양 한 살 균 방법의 효과 확인 했다. 최소한의 병원 체 오염 유지 하면서 높은 종자 발 아 율에서을 최적화 된 살 균 절차는 표 백제와 염소 가스 살 균에 대 한 표시 됩니다.

애기 씨의 높은 처리 살 균에 대 한 표준화 된 방법

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

애기 thaliana (애기) 묘는 종종 메 마른 매체에 성장 될 필요가 있다. 이 사전 종자 소독 씨앗 표면에 오염 물질을 미생물의 성장을 방지 하기 위해 필요 합니다. 현재, 애기 씨는 실험실 사이 다를 약간 하 고 표준화 되지 조건에서 두 가지 살 균 기술을 사용 하 여, 자주 발생 하는 과도 한 씨 사망 또는 유일 하 게 부분적으로 효과적인 살 균에 살 균. 이러한 방법 중 대부분은도 쉽게 확장 가능한 다양 한 genotypes의 씨앗 라인의 다 수 없습니다. 애기의 높은 처리량 분석을 위한 기술 확산을 계속, 다 수 다른 genotypes의 씨앗의 살 균에 대 한 표준화 된 기술을 이러한 유형의 실험 수행을 위한 필수 되고있다. 두 개의 다른 살 균 기술 애기 줄 수의 응답 종자 발 아 율 및 씨앗 오염 미생물와 다른 병원 체의 수준에 따라 평가 했다. 치료 요원과 결합 애기 씨 살 균에 대 한 최적의 조건을 확인 하 여 노출의 시간을 살 균의 다른 농도 포함. 최적화 된 프로토콜 개발 되었으며, 두 가지 다른 살 균 방법: 표 백제 (액체 상)과 염소 (Cl2) 가스 (기상), 둘 다의 결과로 높은 씨앗 발 아 속도 최소한의 미생물 오염. 이러한 프로토콜의 유틸리티 야생 유형 및 돌연변이 씨앗의 발 아 전위의 범위 테스트를 통해 설명 했다. 우리의 결과 씨앗 수 있습니다 효과적으로 살 균 될 과도 한 씨 사망 하지 않고 메서드 중 하나를 사용 하 여 살 균의 해로운 효과와 최적의 발 아 가능성 보다는 더 낮은 씨를 위해 관찰 했다 비록 표시 됩니다. 또한, 방정식 연구원은 다양 한 크기의 밀폐 용기에 표준화 된 염소 가스 살 균 조건을 적용할 수 있도록 개발 되었다. 여기에 설명 된 프로토콜 애기 라인의 많은 수를 위해 쉽게, 효율적이 고 저렴 한 종자 살 균을 수 있습니다.

애기 씨 오픈 필드, 온실 또는 성장 챔버 로부터 수집 때로는 곰 팡이 및 박테리아1,4처럼 다양 한 미생물에 의해 오염. 따라서, 메 마른 매체에 씨를 출 아 특히 도전 수는 접시의 오염으로 인해 씨앗 공급이 제한 하는 경우에 특히. 표 백제와 염소 가스 살 균을 위해, 결과 아래 제공 됩니다, 최적화 된 프로토콜이이 문제를 최소화 하 고 높은 처리 응용 프로그램에 필요한 씨앗의 생존 능력을 유지.
애기 열 0 씨앗의 발 아에 표 백제 살 균의 효과
표 백제는 수많은 식물 종의 살 균 씨에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 에이전트입니다. 노출 시간과 살 균 에이전트의 최적 농도 종 사이 변화 한다. 애기 씨1,,45,6,7,,89 의 살 균을 위해 표 백제를 사용 하 여 여러 프로토콜 고용 되었습니다. , 10. 표 백제 5 다른 노출 시간 기간 테스트와 결과의 4 개의 다른 농도에 선물 된다 그림 1. 치료는 컬럼비아 야생-타입 (열 0) 씨앗에 적용 했다. 표 백제 농도 살 균의 시간 사이 중요 한 상호 작용에 의해 증명으로 Col 0 씨앗의 발 아에 표 백제 농도의 효과 살 균에 따라 다양 한 (그림 1, P &lt; 0.001, ANOVA-분산 분석).
5 그리고 10 분 사이 살 균 시간을 가진 실험에서 모든 표 백제 농도와 치료 열 0 씨앗 (그림 1)의 동등 하 게 높은 발 아 율 귀착되는. 높은 발 아 율 또한 항상 살 균에 대 한 40% 및 50% 가구 표 백제 농도 대 한 관찰 되었다. 80%와 100% 표백 치료 10 분 보다 더 긴 기간 결과 중요 한에 대 한 짧은 몸을 담글 시간에 비해 발 아 비율 감소 (P &lt; 0.01, ANOVA). 또한, 80%와 100 분에 대 한 치료, 표 백제에 대 한 발 아 크게 감소 했다 해당 40%와 50% 표 백제 치료에 비해 (P &lt; 0.001, ANOVA).
씨앗의 표백 및 shriveling 높은 표 백제 농도 15 분 이상 사용 하는 경우 다양 한 수준의 표시. 또한 상대적으로 높은 (최대 32%까지) 씨 사망, 세균된 씨 자주 cotyledons 전개 및 연장, hypocotyls의 실패에 반영 성장 결함을 보여 이러한 조건에서 살 균 개발 체포 결과. 대부분 치료 (14 중에 20)은 완전히 형 무료, 전체 몰드 레벨 평균 0.21% ± 0.003의 (표 1)의 결과로.
50% 표 백제와 몸을 담글 시간 10 분을 치료 하기 때문에 그것은 높은 발 아 비율 함께 표면 병원 체 성장의 좋은 억제 최고의 살 균 정권으로 선정 됐다. 이 치료는 아래 설명 된 대로 다른 돌연변이 라인에 표 백제 살 균의 효과 테스트 선정 됐다.
Col 0 씨앗의 발 아에 염소 가스 살 균의 효과
염소 가스 살 균 조건 최적화, 염소 가스의 3 개의 다른 농도 두 기간 (표 2)에 대 한 열-0 씨앗 소독 하 사용 되었다. 가스 농도 집중된 HCl의 볼륨에 다음과 같은 수식을 사용 하 여 살 균 컨테이너의 볼륨을 기준으로 계산 했다:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq2.jpg">
이 방정식은 12.3 M HCl, 23 ° C의 온도, 표준 기 압 101.3 kPa의 가정 이상 기체 법칙을 사용 하 여 파생 되었다.
Col 0 씨앗의 발 아에 염소 가스 농도의 효과 시간과 농도 요인 사이의 중요 한 상호 작용에 의해 표시 된 대로 살 균의 시간에 따라 표시 했다 (그림 2A, P &lt; 0.01, ANOVA) . 염소 가스 농도 1 시간 살 균 대상이 열 0 씨앗의 발 아에 더 큰 영향을 했다. 이 살 균 시간으로 염소 가스의 모든 농도 승진 마찬가지로 85% 이상의 발 아의 높은 수준 (P &gt; 0.05, ANOVA). 다른 한편으로, 3 h 긴 살 균 귀착되 었 다 두 더 낮은 가스 농도와 비교 하는 염소 가스의 최고 농도 대 한 발 아 율에 큰 감소 (P &lt; 0.05, ANOVA). 이 결과 나타냅니다 애기 씨앗 1 h에 대 한 테스트 염소 가스 농도 또는 3 h 16.5% 아래 가스 농도의 치료 때문에 발 아 율은 항상 큰 씨앗 생존을 보존에 동등 하 게 효과적인 보다 82%. 그러나, 16.5% 가스 3 h에 대 한 씨앗을 살 균 했다 씨앗 발 아에 해로운.
금형의 발생률 또한 가스 농도 및 노출 시간에 의존 했다. 1 h 동안 치료에 대 한 염소 가스를 6.1%와 16.5%의 상대적으로 높은 농도 3 h (그림 2B)에 대 한 모든 가스 농도 효과적으로 형 성장을 저해 했다.
1 h (표 2) 6.1%의 가스 농도와 치료 최고의 기상 살 균 조건으로 선정 되었다 높은 발 아 율 (결합 이후 다른 돌연변이 선에 가스 살 균의 효과 테스트 이러한 결과 바탕으로, 85%) 금형 오염 (0.02%)의 매우 낮은 수준.
잠재적인 다른 발 아 씨앗에 표 백제와 염소 가스 살 균의 효과
통계 분석 했다 살 균 방법 발 아 응답 라인의 발 아 가능성에 의존 했다 (그림 3A, P &lt; 0.01, ANOVA). 표 백제도 염소 가스 살 균 높은 발 아 잠재적인 (그룹 4와 5)와 씨앗의 발 아 율 감소. 어느 치료가 했다 최저 발 아와 그룹의 이미 낮은 발 아 율에 영향을잠재력 (그룹 1)입니다. 반면, 염소 가스 살 균 결과 상당한 감소 약 12-18% (P &lt; 0.01, ANOVA) 중간 발 아 가능성 (그룹 2와 3) 종자의 발 아에. 표 백제 살 균 또한 그룹 2의 13% 발 아 속도 감소 하지만 그룹 3의 발 아 율을 감소 하지 않았다. 비록 어떤 발 아 그룹에서 가스 치료 표 백제와 염소 사이의 발 아 속도에 큰 차이 없었다 (그림 3A, P &gt; 0.442, ANOVA), 씨앗 소독 표 백제를 사용 하 여 약간 더 높은 있었나요 모든 발 그룹에 가스 소독 씨앗 보다 발 아 속도입니다.
크게 변경 하는 살 균 처리 (P &lt; 0.001, ANOVA) 씨앗 형 (그림 3B)에 의해 영향을의 %. 적은 금형 성장 귀착되 었 다 두 염소 가스와 표 백제 살 균 (P &lt; 0.05, ANOVA) 아무 살 균에 비해. 어떤 그룹에서 가스와 표 백제 살 균 사이 감지 형 수준에 차이가 없었다 (그림 3B, P &gt; 0.4, ANOVA).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig1.jpg"> 
그림 1: 애기 열 0 씨앗의 발 아에 표 백제 농도 살 균의 효과. 값은 수단 ± SD 5 독립 복제 실험에서 얻은입니다. 표 백제 농도의 범위에 대 한 기간을 몸을 담근 채 5 분을 기준으로 상당한 차이 나타냅니다 (P &lt; 0.01, ANOVA). #기간 80%와 40% 및 20 분에 대 한 50% 100% 표 백제 농도의 중요 한 차이 나타냅니다 (P &lt; 0.01, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig2.jpg"> 
그림 2: 염소의 효과 가스 농도 살 균 시간 애기 열 0 씨에. (A) 발 아 율 및 (B) 형 수준. 오차 막대 수단 ±를 SD 5 생물학 및 실험의 5 기술 복제에서 가져온 나타냅니다. 편지를 공유 하지 않는 의미는 크게 다른 (P &lt; 0.05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig3.jpg"> 
그림 3: 잠재적인 다른 발 아 씨앗에 표 백제와 염소 가스 살 균의 효과. (A) 발 아 율 및 (B) 형 수준. 100 솔 크 T DNA 라인은 어떤 살 균 제의 부재에 발 아 율으로 정의 잠재적인 그들의 발에 따라 5 개의 그룹으로 분류 했다. 발 아 율에 따라 그룹은 다음과 같습니다: 그룹 1 (0-20%), 그룹 2 (21-50%), 그룹 3 (51-70%), 그룹 4 (71-90%)와 그룹 5 (91-100%). 라인 무작위로 선택 했다 고 그들의 발 아 잠재적인 유전자 형에 의존 하지 않았다. 값은 수단 ± SD 3 개의 독립적인 복제 실험에서 얻은입니다. 각 값 위에 문자 ("a", "ab", "c", 등등) 분류 방법의 통계 그룹을 나타냅니다. 편지를 공유 하지 않는 의미는 크게 다른 (P &lt; 0.05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">살 균 시간 (분)</td>
			<td colspan="4">표 백제 농도 (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
			<td>80</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>2.13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.50%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.36%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.68%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>0.19%</td>
			<td>0.28%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 표 백제 살 균 열-0 씨의 금형 수준.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>표 백제</td>
			<td>HCl</td>
			<td>시간</td>
			<td rowspan="2">% 염소 가스 (Cl2/mol 총 가스 몰)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(mL)</td>
			<td>(mL)</td>
			<td>(h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>1</td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>3</td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2: 염소 (Cl2) 컬럼비아 야생-타입 씨앗 7 L 컨테이너를 사용 하 여 살 균 처리 가스.
보충 표 1: 스프레드 시트 컨테이너 및 % Cl2의 다른 볼륨에 대 한 계산을 수행 하는 프로그램. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/Supplemental_Table%20_1.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 연구의 목적은 메 마른 매체에 성장 범위의 애기 genotypes의 종자 발 아에 표 백제와 염소 가스 살 균의 효과 확인 했다. 최적화 된 살 균 프로토콜 제공 만족 스러운 씨 생존 하면서 오염 물질을 미생물의 성장을 방지 하기 위해 개발 되었습니다.

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

이 절차의 전반적인 목표는 미생물 성장을 방지하면서 많은 수의 애기장대 유전자형의 성공적인 종자 살균을 위한 표준화된 조건을 제공하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 한 번에 수백 개의 종자 샘플을 멸균할 수 있으므로 유전체학, 단백질체학, 대사체학 및 기타 고처리량 연구 분야에서 중요한 식물 물질 준비 단계를 단순화할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 효율적인 멸균이 많은 수의 종자 샘플에 대해 높은 발아율과 결합되는 조건을 제공한다는 것입니다.시작하려면 증류수로 50% 표백제 용액을 준비합니다. 표백제 용액 200ml당 TWEEN 20 세제 50마이크로리터를 추가합니다. 표백제 용액은 멸균 상태에서만 개봉하는 한 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다.다음으로, 100개의 씨앗을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 분취합니다. 이 작업은 수동으로 수행하거나 맞춤형 종자 로봇을 사용하여 수행할 수 있습니다. 이제 층류 후드에서 500 마이크로 리터의 50 % 표백제 용액을 씨앗에 첨가하십시오.그런 다음 튜브를 회전기로 옮기고 10분 동안 가벼운 교반으로 표백제에 씨앗을 배양합니다. 10분 후 튜브에서 표백제 용액을 흡입하여 최대한 제거합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 멸균 증류수를 다시 넣고 튜브를 뒤집어 섞습니다.씨앗이 가라앉을 때까지 기다린 다음 물을 흡인하고 다른 부분 표본으로 대체하여 씨앗을 다시 씻습니다. 멸균된 증류수로 총 6번의 세척을 수행합니다. 씨앗을 물로 완전히 씻은 후에는 도금하기 전에 1ml의 물에 매달아 두십시오.멸균 과정을 시작하기 전에 염소 가스를 생산하는 데 필요한 표백제와 염산의 양을 계산하십시오. 제공된 방정식을 사용하여 권장되는 6% 염소 가스를 얻습니다. 성공적인 멸균을 보장하고 튀는 것을 방지하는 데 필요한 HCl의 양을 정확하게 계산해야 합니다.이 프로토콜 동안 장갑과 실험복을 착용하고 산이나 표백제에 젖을 때마다 장갑을 교체하십시오. 흄 후드 아래에서 시드 바이알을 뚜껑이 열린 상태로 랙으로 옮깁니다. 그런 다음 멸균이 이루어질 수 있는 플라스틱 용기에 랙을 넣고 뚜껑을 용기에 밀봉하기 위해 파라핀 필름 스트립을 준비합니다.이제 비커에 100ml의 표백제를 넣은 다음 내부에 250ml의 비커를 넣습니다. 과도한 표백제를 사용하는 것은 안전 기능이며 비커는 포함된 용액의 총 부피의 두 배 이상이어야 합니다. 또한 표백제와 산은 항상 분리하여 취급하십시오.다음으로, 비커에 3 밀리리터의 염산을 첨가 한 다음 즉시 용기를 닫고 파라 필름으로 밀봉하십시오. 1시간 동안 용기를 모니터링하여 멸균 중에 가스가 축적되고 있는지 확인합니다. 염소 가스는 용기 내부에서 희미한 노란색 안개로 보이거나 용액이 노란색으로 변하는지 확인할 수 있습니다.용기의 밀봉을 주기적으로 확인하십시오. 뚜껑이 닫히지 않거나 파라핀 밀봉이 헐거워지기 시작하면 파라핀 필름을 추가로 덮어 뚜껑을 단단히 다시 밀봉하십시오. 1시간 살균 후 용기의 모서리를 열어 3시간 동안 가스를 배출합니다.3시간 동안 환기시킨 후 모든 튜브의 뚜껑을 닫고 멸균된 씨앗이 플레이팅될 때까지 건조한 상태로 보관하십시오. 이제 중탄산나트륨 분말 1.5g을 천천히 첨가하면서 유리 막대로 저어 고체를 용해시켜 반응을 중화합니다. 이산화탄소 가스 거품이 형성을 멈출 때까지 중탄산나트륨을 계속 첨가하십시오.그런 다음 용액의 pH를 측정하고 필요한 경우 pH가 중성이 될 때까지 중탄산나트륨을 추가로 첨가합니다. 용액에서 냄새가 나지 않으면 폐기할 수 있습니다. 그렇지 않으면 모든 냄새가 사라질 때까지 기다리십시오.가스 멸균된 씨앗의 각 튜브에 500마이크로리터의 멸균된 증류수를 추가합니다. 그런 다음 씨앗을 MS 플레이트에 붓고 멸균 일회용 접종 루프 또는 멸균 피펫 팁을 사용하여 균일하게 펴 바릅니다. 섭씨 4도에서 3일 동안 종자 층화를 한 후 16시간 동안 매일 빛에 노출되어 플레이트를 섭씨 23도로 옮깁니다.뿌리가 매체로 자랄 수 있도록 뚜껑을 위에 두십시오. 8일 동안 자란 후 발아한 씨앗의 비율을 점수화합니다. 발아는 라디칼이 종피 밖으로 돌출되고 두 개의 자엽이 보일 때 계산됩니다.또한 곰팡이의 영향을 받는 씨앗의 수를 세어 살균 조건의 효과를 확인하십시오. 5 가지 다른 노출 시간에서 4 가지 농도의 표백제를 Columbia 야생형 종자에 대해 테스트했습니다. 높은 표백제 농도는 너무 많이 노출되면 발아에 악영향을 미쳤습니다.그러나 모든 노출 시간에서 40% 및 50%의 표백제에서 높은 발아율이 관찰되었습니다. 높은 농도의 표백제로 멸균된 종자는 폐사율이 높았고 종종 성장 결함이 보였지만 일반적으로 곰팡이가 전혀 없었습니다. 50% 표백제를 10분 동안 살균하면 곰팡이 억제와 건강한 발아가 최적의 균형을 이루는 것으로 확인되었습니다.염소 가스 멸균 조건을 최적화하기 위해 세 가지 농도의 염소 가스를 사용하여 두 가지 다른 시간에 걸쳐 Columbia 야생형 종자를 멸균했습니다. 시간과 가스 농도 사이에는 상당한 상호 작용이 있었습니다. 1시간에는 발아에 영향을 미치지 않았지만 가장 높은 가스 농도는 3시간에 해로웠습니다.따라서 1시간의 살균 기간이 선택되었습니다. 곰팡이 성장은 3 시간 가스 노출 또는 6 % 또는 17 % 가스를 사용하여 1 시간 노출에 의해 효과적으로 억제되었습니다. 따라서 1시간 동안 6%의 가스 농도가 발아 및 곰팡이 억제에 최적인 것으로 결정되었습니다.일단 숙달되면, 이 기술은 적절하게 수행된다면 하루에 수백 개의 종자 라인을 성공적으로 멸균하는 데 사용할 수 있습니다. 가스 멸균 된 종자는 건조한 조건에서 장기간 보관할 수도 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 제공된 방정식을 사용하여 필요한 HCl 및 표백제 부피를 계산하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 다양한 유전자형과 관심 표현형을 연결하기 위해 게놈 전체 연관 연구와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 실험에 행운을 빕니다.

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연구

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