형광 마이크로플레이트 기반 시클로헥시미드 추적 분석: 형광 핵 잘못 접힌 단백질의 분해 역학을 모니터링하는 기술

정의된 3차 구조가 없는 핵 잘못 접힌 단백질은 유비퀴틴-프로테아좀 시스템인 UPS를 포함한 단백질 분해 시스템에 의한 분해를 촉진하는 작은 유비퀴틴 유사 변형자, SUMO 및 유비퀴틴 분자로 태그가 지정됩니다.

여러 신경퇴행성 질환에서 UPS 기능 장애는 핵이 잘못 접힌 단백질의 축적 및 응집을 유발하여 신경 사멸을 초래합니다.

시험관 내에서 핵 잘못 접힌 단백질의 분해 속도를 조사하기 위해, 형광 표지된 잘못 접힌 단백질 암호화 플라스미드 DNA와 형질감염 시약을 포함하는 혼합물로 부착 포유류 세포의 배양물을 처리합니다.

성공적으로 형질감염된 세포는 핵 국소화 신호로 태그된 형광 표지된 짧은 반감기가 잘못 접힌 단백질을 발현합니다. 핵으로 운송되는 이 잘못 접힌 단백질은 SUMO일화 및 유비퀴틴화를 거치고 단백질 분해 및 제거를 위해 UPS로 옮겨집니다.

배양 후, 배지를 사이클로헥시미드를 함유한 저형광 배지로 교체합니다. 세포 투과성 분자인 시클로헥시미드는 큰 리보솜 단위에 결합하여 단백질 번역의 신장 단계와 추가 단백질 합성을 차단하여 형광 표지 번역된 잘못 접힌 단백질의 분해 속도 연구를 용이

프로테아좀 억제제로 웰 세트를 처리하여 프로테아좀 활성을 차단하고 잘못 접힌 단백질이 축적되도록 합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 잘못 접힌 단백질의 형광을 측정합니다.

형광의 시간 의존적 감소는 잘못 접힌 단백질 분해를 나타냅니다. 프로테아좀 억제제로 처리된 세포는 시간이 지남에 따라 유사한 형광 강도를 나타내며, 이는 잘못 접힌 단백질 분해의 억제를 나타냅니다.

텍스트 프로토콜에 따라 96-웰 플레이트에 HeLa 세포를 파종하고 형질선착한 후; 형질감염 후 20 내지 24시간, 세포의 GFP 발현을 검사한다. 각 웰에 약 200마이크로리터의 1x PBS에서 배지를 제거한 다음 흡인하여 잔류 DMEM을 제거합니다.

5% FBS가 포함된 저형광 DMEM 60마이크로리터와 시클로헥시미드 밀리리터당 50마이크로그램을 첨가하고 1세트의 샘플에 10마이크로몰 MG132를 첨가합니다.

형광 플레이트 리더를 사용하여 최대 8-10시간 동안 매시간 플레이트를 판독하는 GFP 신호를 측정합니다. 데이터를 내보내고 텍스트 프로토콜에 따라 통계 분석을 수행합니다.