세포의 잘못 폴딩 된 단백질의 분해에 대한 분석

이 보고서는 웨스턴 블롯 또는 형광 기반 분석법으로 잘못 접힌 단백질의 분해 속도를 측정하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 잘못 접힌 다른 단백질의 분석 및 고처리량 스크리닝에 적용할 수 있습니다.

이 분석의 전반적인 목표는 잘못 접힌 단백질의 세포 분해 속도를 측정하는 것입니다. 잘못 접힌 단백질은 많은 신경퇴행성 질환과 관련이 있습니다. 이 분석은 비정상적인 단백질에 대한 보호제인 세포 단백질 품질 관리 시스템을 조사하는 데 도움이 됩니다.

잘못 접히기 쉬운 단백질은 세포에 다양한 형태로 존재할 수 있습니다. 세포 분획과 시클로헥산 분석법 추적을 결합함으로써 이 기술의 주요 이점은 잘못 접힌 종의 반감기를 구체적으로 측정하는 것입니다. 우리는 두 가지 모델 단백질을 예로 사용합니다.

응집이 잘 되는 폴리글루타메이트 단백질인 Atxn1 82Q와 구조적으로 불안정한 핵 루시페라제 돌연변이. 이 프로토콜은 잘못 접힌 다른 단백질 측정에도 적용할 수 있습니다. Atxn1 82Q GFP에 대한 분해 분석을 수행하려면 DMEM 배지 및 10%FBS로 35mm 플레이트에 약 3x10^5 HeLa 세포를 플레이트합니다.

세포를 하룻밤 동안 배양하여 transfection 시 40-60% confluence에 도달하도록 합니다. Atxn1 82Q GFP PRK5로 세포를 transfection한 후 4-5시간 후에 형광 현미경으로 450-490나노미터의 여기 파장을 사용하여 GFP 신호의 확산 및 작은 반점의 존재를 특징으로 하는 핵 내 GFP 발현을 위해 살아있는 세포를 검사합니다. 시클로헥시미드 처리 직전에 배지를 제거하고 3밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척하여 한 플레이트의 세포를 수확합니다.

그런 다음 드라이 아이스에 접시를 얼립니다. 나머지 세포 플레이트의 경우, 진공 흡인으로 배지를 제거하고 밀리리터당 50마이크로그램의 시클로헥시미드를 함유한 2밀리리터의 신선한 DMEM을 추가합니다. 또한 프로테아솜 억제제인 MG132 10마이크로몰을 한 플레이트에 첨가합니다.

처리된 세포를 드라이아이스에서 얼리기 전에 4시간, 8시간, 12시간 및 16시간 동안 배양합니다. MG132 처리된 세포를 16시간 후에 채취한 후, 모든 플레이트에서 동결된 세포를 150마이크로리터의 얼음 저온 세포 용해 완충액으로 긁어내고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 17, 000x g 및 섭씨 4도에서 15분 동안 탁상용 원심분리기에서 용해물을 원심분리하십시오.

그런 다음 MP40 용해성 단백질을 포함하는 상등액을 다른 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 방해하지 않고 튜브에 약 200마이크로리터의 1x PBS를 부드럽게 첨가하여 펠릿을 헹굽니다. 흡인 또는 피펫으로 PBS를 조심스럽게 제거하고 펠릿을 150마이크로리터의 얼음으로 만든 펠릿 완충액에 재현탁시킨 다음 얼음에서 15-30분 동안 배양합니다.

다음으로, 75마이크로리터의 3x 끓는 완충액을 펠릿에서 재현탁된 MP40 용해성 분획 및 MP40 불용성 분획에 첨가합니다. 그런 다음 열 블록에서 섭씨 95도의 샘플을 5분 동안 가열합니다. 끓인 MP40 용해성 및 불용성 분획의 분취액에 SDS 겔 로딩 완충액을 추가합니다.

모든 시점에서 수집된 동일한 부피의 샘플을 SDS-PAGE 겔에 로드합니다. 안티 GFP 항체 및 향상된 화학발광을 사용하여 웨스턴 블롯으로 MP40 용해성 및 SDS 용해성 Atxn1 82Q GFP를 검출합니다. 필터 지연 분석을 통해 펠릿 분획에서 SDS 내성 Atxn1 82Q를 검사하려면 0.2 미크론 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인을 고정하는 점도표 장치를 설정합니다.

그런 다음 80-120 마이크로 리터의 끓인 MP40 불용성 샘플을 도트 블롯 장치의 각 웰에 로드합니다. 진공으로 멤브레인을 통해 샘플을 여과한 후 Anti GFP immunoblotting에 의해 멤브레인에 붙어있는 Atxn1 82Q GFP 응집체를 검출합니다. 필터 지연 분석을 사용하여 시간 경과에 따른 SDS 내성 형태의 수준을 검사하는 것이 중요합니다.

이는 SDS 용해성 형태가 분해되지 않고 SDS 내성 형태로 변형될 수 있기 때문입니다. 이 예에서 SDS 저항성 형태는 최소이며 추격 실험과 유사한 수준으로 유지됩니다. 분해 분석을 수행하기 위해 NLS-luciferase-GFP로 HeLa 세포를 하룻밤 동안 transfection한 후 450 - 490 나노미터의 여기 파장으로 GFP 발현을 위해 도립 형광 현미경으로 살아있는 세포를 검사합니다.

시클로헥시미드 처리 직전에 배지를 제거하여 세포 한 플레이트를 수확하고 얼음처럼 차가운 PBS 3밀리리터를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 드라이 아이스에 접시를 얼립니다. 나머지 플레이트의 경우, 배지를 제거한 후 밀리리터당 50마이크로그램의 시클로헥시미드를 함유한 2밀리리터의 신선한 DMEM을 추가하고 프로테아좀 억제제 MG132 10마이크로몰을 하나의 플레이트에 추가합니다.

방금 설명한 대로 수확하기 전에 1.5시간, 3시간, 4.5시간 및 6시간 동안 세포를 처리하고 MG132 처리된 세포를 6시간에 수확합니다. 세포의 마지막 시점을 채취한 후 각 플레이트를 150마이크로리터의 얼음 저온 세포 용해 완충액으로 긁어내고 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅을 수행하기 전에 섭씨 95도의 열 블록에서 샘플을 5분 동안 배양합니다.

2%SDS 및 50밀리몰 DTT의 최종 농도를 위해 전체 세포 용해물에 SDS 젤 로딩 버퍼를 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 96개의 웰 플레이트에 HeLa 세포를 파종하고 transfection한 후, transfection 후 20-24시간 후에 세포의 GFP 발현을 검사합니다. 매체를 제거하고 각 웰에 약 200마이크로리터의 1x PBS를 추가한 다음 흡입하여 잔류 DMEM을 제거합니다.

60마이크로리터의 저형광 DMEM에 5%FBS 및 밀리리터당 50마이크로그램의 시클로헥시미드를 첨가하고 10마이크로몰 MG132를 1세트의 샘플에 추가합니다. 형광 플레이트 리더를 사용하여 GFP 신호를 측정하고 최대 8-10시간 동안 매시간 플레이트를 판독합니다. 데이터를 내보내고 텍스트 프로토콜에 따라 통계 분석을 수행합니다.

정상 상태 분석에서 현미경으로 볼 수 있는 Atxn1 82Q GFP 핵 응집체는 transfection 20시간 후 HeLa 세포의 30-50%에서 관찰할 수 있습니다. 웨스턴 블롯에서 볼 수 있듯이 SDS 용해성 분획에서 Atxn1 82Q GFP의 반감기는 약 5시간입니다. 16시간 동안 MP40 용해성 분획에서 Atxn1 82Q GFP가 약간 감소하거나 전혀 감소하지 않은 것과는 대조적입니다.

Atxn1 82Q GFP의 분해는 MG132로 세포를 처리함으로써 부분적으로 억제됩니다. 이러한 이미지는 transfection 후 20시간이 지나면 NLS-luciferase DM 돌연변이 GFP 응집체가 HeLa 세포의 5-15%에서 현미경으로 볼 수 있음을 보여줍니다. 웨스턴 블롯은 SDS 용해성 NLS-루시페라제 DM 돌연변이 GFP의 반감기가 2-3시간임을 밝혔습니다.

또한, 형질주입된 세포의 형광 강도는 시클로헥시미드 처리 시 시간이 지남에 따라 감소합니다. 시클로헥시미드 처리 후 약 6시간이 지나면 용해성 NLS-루시페라제 DM 돌연변이 GFP가 크게 분해되어 나머지 형광이 분해에 저항하는 응집된 종에서 생성됨을 시사합니다. 이러한 형광 이미지는 응집되었지만 확산되지 않은 GFP가 시클로헥시미드 처리 후 9시간 후에 세포에 남아 있음을 확인합니다.

글쎄요, 면역 기반 분석은 완료하는 데 며칠이 걸립니다. 단백질 분해 속도는 형광 기반 분석을 사용하여 cycloheximide chase 직후에 얻을 수 있습니다. 면역 블로팅(immunoblotting)과 형광 기반 분석법(fluorescence based assay)은 모두 잘못 접힌 다른 단백질에 대한 연구에 적용할 수 있습니다.

후자는 또한 잘못 접힌 단백질의 분해를 조절할 수 있는 거대분자 또는 작은 화합물을 식별하기 위한 고처리량 스크리닝에도 적합합니다. Atxn1 82Q와 같이 잘못 접힌 일부 단백질의 경우 반감기는 세포 분획 및 면역 블로팅을 통해서만 측정할 수 있으며, 이는 빠르게 분해되는 잘못 접힌 종은 전체 Atxn1 82Q 발현의 작은 부분에 불과하기 때문이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 단백질 품질 관리의 메커니즘을 밝히기 위해서는 단백질 분해 분석이 응집체의 정상 상태 수준 분석과 결합되어야 할 뿐만 아니라 응집체가 서로 다른 세포 분획의 분할인지 확인해야 합니다.

in vitro protein folding(체외 단백질 접힘) 및 응집 분석(aggregation assay)과 같은 다른 실험도 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 다양한 전략을 사용하여 잘못 접힌 단백질의 분해 속도를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.