높은 콘텐츠, 오픈 소스 소프트웨어에 의해 지원되는 범용 현미경 데이터에서 형광 마커, 개별 셀 정량화를위한​​ 워크 플로우

이 절차의 전반적인 목표는 현미경 이미지에서 특정 형광 마커 강도를 정량화하여 개별 세포의 반응을 객관적으로 측정하는 것입니다. 이는 먼저 부착 조직 배양 세포에 irna 매개 유전자 녹다운을 적용함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 세포를 형광으로 염색한 다음 여러 관심 마커에 대해 이미지화합니다.

마지막 단계에서, 특정 세포 내 영역 내의 마커 발현은 알고리즘적으로 정의되며, 이는 개별 세포입니다. 궁극적으로, 유전자 녹다운(gene knockdown)의 생물학적 단서에 대한 세포 반응은 관심 마커의 형광 발현 수준과 세포 내 전좌(subcellular Translocation)를 측정하여 분석할 수 있습니다. 이 절차는 siRNA에 대한 반응으로 G one cell cycle transit의 조절에 대한 통찰력을 제공합니다.

또한 형광 세포 이미지를 생성하고 핵 수송 및 단백질 항상성을 연구하는 연구에 적용할 수 있습니다. 제 연구실의 박사후 연구원인 Daniel Wek과 Car K HO가 절차를 시연할 것입니다.먼저 70마이크로리터의 200나노몰 irna를 분주하고 irna 완충액을 멸균 조직 배양 후드의 멸균 96웰 플레이트의 적절한 웰에 희석하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 40 부피의 무혈청 DMEM 배지에 희석된 105 마이크로리터의 형질주입 지질을 실온의 부드러운 진동으로 플레이트를 혼합한 Sir a의 각 웰에 첨가한 다음 10분 후에 생성된 175 마이크로리터를 투명한 염기를 가진 불투명 조직 배양 처리된 96 웰 플레이트로 타겟당 3개의 50 마이크로리터 복제로 세분화합니다.

다음으로, 섞기 없이 50 마이크로리터 지질 irna 복합물에 10%serum를 가진 DMEM의 150 마이크로리터에 있는 웰 당 8, 000의 세포를 직접 분배하십시오. 그런 다음 멸균 접착제, 통기성 멤브레인으로 플레이트를 밀봉하고 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 가습 인큐베이터에 넣습니다. 48시간 후 플레이트에서 매체를 흡입합니다.

그런 다음 실온의 흄 후드에 4% 버퍼 포름알데히드 100마이크로리터에 세포를 고정하고 10분 후 고정제를 흡인하고 마지막 세척 후 PBS로 100마이크로리터 세척을 3회 수행합니다. PBS를 제거하고 흔들지 않고 실온에서 각각 10분씩 100마이크로리터 투과화 용액 배양을 3회 진행하여 세포를 천공합니다. 마지막 배양 후 투과 용액을 제거한 다음 실온에서 30분 동안 웰당 100마이크로리터의 블록 용액을 첨가합니다.

그런 다음 블록 용액을 흡인하고 20 x 대물렌즈로 uc 컨포칼 현미경을 라벨링한 후 2주 이내에 1차 관심 항체 50마이크로리터로 세포를 프로브하여 DNA 염료, GFP 및 면역 염색에 해당하는 3개 채널에서 별도의 16비트 그레이 스케일 TIFF 이미지를 촬영합니다. Flora fours는 웰당 약 1000-2000개의 세포를 이미지화하기 위해 겹치지 않는 많은 이미지 세트 또는 프레임을 캡처합니다. 메타데이터 정보를 사용하여 이미지 파일의 이름을 체계적으로 지정하여 각 파일 이름이 실험 이름, 웰 주소, 프레임 번호 및 채널 식별자의 고유한 조합이 되도록 합니다.

그런 다음 셀 프로파일러 소프트웨어를 열고 파일 및 파이프라인 가져오기를 클릭합니다. 다음으로, 파일에서, 저장된 파일 이름 컨벤션 셀 프로파일러에서 이미지 파일 메타 데이터를 해석하는 데 필요한 지침이 포함 파일 3 채널 파이프 라인 CP 파이프 파일을 선택하면 이미지를 관련시키고, 파일에서 핵 DNA 및 항체 강도를 추출하고, GFP 채널을 사용하여 핵 대 세포질 강도의 비율을 계산할 수 있습니다. 감지된 각 셀에 대해 view output settings(출력 설정 보기) 버튼을 클릭한 다음 default input(기본 입력) 및 default output folders(기본 출력 폴더)를 클릭합니다.

분석할 이미지 파일의 위치와 추출된 데이터의 대상을 각각 선택합니다. 그런 다음 해석 모듈 창에서 해당 눈 아이콘을 클릭하여 해석 중에 1차 객체 및 3차 객체 식별 창을 관찰하고 해석이 완료되면 이미지 분석을 클릭합니다. 메시지 상자에서 확인을 클릭하고 모든 데이터 파일이 쉼표로 구분된 값 파일로 저장되는 기본 출력 폴더 위치로 이동합니다.

데이터 추출을 수행하려면 형광 핵 항체 강도, 핵 DNA 강도 및 GFP CDK 두 리포터 비율 값에 대한 개별 세포 데이터가 포함된 세포 프로파일러의 출력에 포함된 새 핵 CSV 파일을 찾습니다. 제공된 맥박 스크립트 파일을 보행 분류기 PL에 핵 CSV 데이터 파일과 동일한 폴더에 복사합니다. 그런 다음 Pearl Script의 아이콘을 두 번 클릭합니다.

그리고 메시지가 표시되면 데이터 파일의 전체 이름을 입력한 다음 세포를 게이트할 파일의 DOT CSV 파일 이름, 항체 형광 및 G FP CDK 2 리포터 데이터에 대한 게이트 값을 입력합니다. 새로 생성된 파일이 데이터의 원래 세포 프로파일의 원시 개별 세포 분석 값을 각 웰의 각 세포가 두 게이트에 대해 어떻게 수행되는지 보여주는 하위 모집단 레이블과 결합하는지 확인합니다. 이제 R Studio 소프트웨어를 열고 파일 및 파일 열기를 클릭한 다음 제공된 분석 dot r 파일을 선택하여 개별 세포 부분군단 레이블을 사용하여 각 실험 조건에 대한 데이터를 플롯합니다.

드라이브 문자와 파일 자체의 이름을 포함하여 제어된 데이터가 들어 있는 폴더의 컴퓨터 주소를 입력합니다. 그런 다음 스튜디오의 왼쪽 상단 창에서 1행부터 17행까지 강조 표시하고 실행 버튼을 클릭하여 실험 데이터 임계값과 웰 위치 세부 정보를 입력합니다. 마지막으로, 17번 줄 아래에 있는 나머지 코드의 개별 블록을 강조 표시하고 실행 버튼을 클릭하여 해당 플롯을 만듭니다.

스튜디오의 오른쪽 하단 모서리에 있는 창에서 플롯을 관찰한 다음 내보내기 버튼을 클릭하여 다양한 형식으로 저장합니다. 여기에 설명된 워크플로우는 형광 현미경 이미지를 분석하여 식별된 각 세포와 해당 분석 값을 자세히 설명하는 목록 형태의 원시 데이터를 생성합니다. 이러한 데이터를 분석하기 위한 많은 옵션이 있습니다.

예를 들어, 이러한 히스토그램 플롯에서 대조군 RNA로 처리된 세포의 분석 값을 통해 각 분석의 임계값을 설정하기 위한 적절한 게이트를 식별할 수 있습니다. 그런 다음 펄스 스크립트를 사용하여 게이팅 임계값을 적용하여 분석 결과에 따라 원시 데이터의 각 세포에 레이블을 지정합니다. 이 라벨링 접근 방식은 매우 큰 개별 세포 데이터 세트에서도 처리와 하위 집단 분포 간의 관계에 대한 사전 시각적 및 자동 평가를 지원합니다.

예를 들어, 이 대표적인 실험에서 threes irna knockdown 조건은 두 개의 분석법인 게이트에 대한 세포의 대조적인 분포를 초래했습니다. R 플롯은 레이블을 사용하여 각 사분면에 있는 셀의 백분율 분포를 계산합니다. 또한 라벨을 사용하면 추가 형광 측정을 분석 데이터와 상호 참조할 수 있습니다.

이 실험에서는 SI CDK six로 처리된 세포의 하위 집단을 각각의 분석 레이블에 따라 그룹화하고 핵 DNA 염색의 히스토그램으로 표시했습니다. 이러한 세포 데이터 라벨의 사용은 두 세포 분석과 세포 내 DNA 함량 사이의 관계를 나타냅니다. 이 절차를 수행할 때 셀 프로파일러를 사용할 때 이미지 분할 파라미터를 테스트하고 조정해야 한다는 점을 항상 기억하는 것이 중요합니다.

이는 새 이미지 파일이나 테스트되지 않은 이미지 파일을 처음 사용할 때 특히 중요합니다. 그래.