향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cPILOT)

이 개선된 다중 분석법의 전반적인 목표는 시료 오차와 분석 시간을 줄이면서 동시에 분석 가능한 단백질 시료의 수를 늘리는 것입니다. 이 방법은 발병 기전, 진행, 진단, 예후 및 치료 표적과 관련된 노화, 신경퇴행성 질환, 기타 연령 관련 질환 및 암 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 조건에 걸친 단백질 변화에 대한 포괄적인 스냅샷을 생성할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 마우스 모델의 알츠하이머병에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 알츠하이머 환자나 기타 다양한 질환자의 조직 샘플에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사람들은 짧은 시간 내에 여러 샘플을 동시에 처리해야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 저희는 아세틸화가 단백질 니트로화의 isobaric tagging과 결합될 수 있다는 점을 인식하면서 이 방법의 아이디어를 처음 얻었으며, 이를 통해 모든 펩타이드에 전역적으로 적용 가능한 기술을 구현하고자 했습니다.

본 연구에서는 알츠하이머병 마우스 모델과 야생형 대조군의 뇌, 심장 및 간 조직을 분석합니다. 각 조직 샘플 60~90 mg을 용해 튜브로 옮기고, 8 M urea가 포함된 PBS 500 µL를 첨가합니다. 기계식 균질기를 사용하여 샘플을 균질화합니다.

용해 튜브에서 조직 균질물을 제거하여 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 8 M urea가 포함된 PBS 100~500 µL로 용해 튜브를 헹구고, 헹굼액을 조직 균질물과 합칩니다. 조직 균질물을 15분 동안 원심분리합니다.

각 샘플에서 상층액을 수집합니다. BCA 분석을 수행하여 단백질 농도를 결정한 후, 각 샘플에서 100 micrograms의 단백질을 개별적으로 라벨링된 마이크로원심분리 튜브에 넣습니다. 각 샘플에 dithiothreitol을 첨가합니다.

그리고 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 각 샘플에 iodoacetamide(IAM)를 첨가하고, 얼음 위 암소에서 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 각 샘플에 L-cysteine을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

30분 후, calcium chloride가 포함된 tris buffer를 첨가하여 urea의 최종 농도가 2 M이 되도록 희석합니다. 각 샘플에 L1 tosilimitotophenylethylcholer methyl ketone으로 처리된 trypsin을 첨가합니다. 그리고 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다.

다음 날, 시료를 액체 질소로 급속 냉동하여 단백질 소화를 정지시키고 추가 처리 시까지 -80 °C에서 보관합니다. 디메틸화 표지 전, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 펩타이드 시료를 탈염하고 진공 원심분리기(vacuum centrifugation)로 건조합니다. 디메틸화 표지 절차를 시작하려면 HPLC 또는 nanopure 등급의 물에 용해된 1% acetic acid로 펩타이드를 재구성합니다.

각 샘플에서 50 µg씩 분취하여 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다. 재구성된 펩타이드의 나머지 양은 향후 실험을 위해 -80 °C에서 보관하십시오. 다음으로 시연할 단계에서는, 화학적 활성화 반응이 모든 샘플에서 동일한 시간 동안 일어날 수 있도록 시약을 신속하게 첨가하는 것이 중요합니다.

가벼운 디메틸화(light dimethylation)로 라벨링할 시료에 60 millimolar 포름알데히드 용액 8 µL를 첨가합니다. 무거운 디메틸화(heavy dimethylation)로 라벨링할 시료에는 60 millimolar carbon 13 deuterium 라벨링 포름알데히드 용액 8 µL를 첨가합니다. 가벼운 디메틸화로 라벨링된 시료에 24 millimolar 소듐 사이아노보로하이드라이드 8 µL를 첨가합니다.

중수소화 디메틸화(heavy dimethylation)로 표시된 샘플에 24 mM sodium cyanoborohydride 8 µL를 첨가합니다. 샘플을 볼텍싱한 후, 튜브 셰이커를 이용하여 실온에서 약 10분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 1% ammonia 16 µL를 첨가하여 5분 동안 반응을 정지시킵니다.

5% formic acid 8 µL를 첨가하여 반응 혼합물을 다시 산성화합니다. 가벼운(light) 및 무거운(heavy) 디메틸화 펩타이드를 결합하여 총 6개의 샘플을 생성합니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 샘플 탈염을 수행합니다.

그리고 진공 원심분리기를 사용하여 샘플을 건조합니다. 디메틸화된 샘플의 등중량 태깅(isobaric tagging)을 시작하려면, 먼저 100 µg의 디메틸화된 펩타이드와 triethylammonium bicarbonate(TEAB 완충액)를 이용해 재구성합니다. 다음으로, 등중량 태깅 키트 제조사의 프로토콜에 따라 등중량 시약을 준비합니다.

각 펩타이드 샘플에 적절한 부피(이 경우 용해된 isobaric 태깅 시약 41 µL)를 첨가하고 약 10초 동안 볼텍싱합니다. 상온의 마이크로원심분리기 튜브 쉐이커에서 샘플을 약 1시간 동안 흔들어 줍니다. 반응을 정지시키기 위해 각 샘플에 8 µL의 하이드록실아민을 첨가합니다.

그런 다음 샘플을 실온에서 15분 동안 배양합니다. 라벨이 지정된 6개의 샘플을 하나의 혼합물로 모아 탈염합니다. 0.1% formic acid가 포함된 질량 분석기용 등급의 증류수에 펩타이드를 재구성하여 액체 크로마토그래피를 위한 펩타이드를 준비합니다.

0.65 µm 필터가 들어 있는 마이크로원심분리 튜브에 재구성된 펩타이드를 추가합니다. 그리고 12,000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 필터를 제거하여 폐기합니다.

여과된 펩타이드를 자동 시료 주입기 바이알로 옮깁니다. 각 강 양이온 교환 분획 시료 6 µL를 트랩 컬럼에 주입합니다. Carbon 18 물질로 2 cm까지 충전합니다.

분석 분리 및 데이터 수집 질량 분석법을 실행합니다. 알츠하이머병 마우스 모델과 야생형 대조군의 뇌, 심장 및 간 조직을 대상으로 12-plex cPilot 분석을 수행하였습니다. 전구체 데이터에서는 m/z 643.854 및 647.875 피크로 나타나는 가벼운 dimethylated 펩타이드와 무거운 dimethylated 펩타이드가 확인되었습니다.

이 펩타이드들은 선택 및 독립적으로 분리되었으며, 충돌 유도 해리(collision induced dissociation)를 통해 단편화되어 이러한 스펙트럼을 생성하였습니다. 검색 결과, 해당 피크들은 phosphoglycerate kinase one 단백질의 펩타이드에 속하는 것으로 나타났습니다. 이러한 피크들은 고에너지 충돌 해리 탠덤 질량 분석법을 위해 추가로 분리되었으며, 리포터 이온이 표시된 바와 같이 관찰됩니다.

12개 샘플에 대한 정보를 얻기 위해서는 두 세트의 3단계 질량 분석 스펙트럼이 모두 필요합니다. 이 예시에서, 뇌, 간 및 심장 조직의 두 생물학적 반복 시료 간 알츠하이머병 대 야생형 대조군의 이온 비율은 서로 유사하게 나타납니다. 각 비교의 fold change 값은 뇌와 심장의 phosphoglycerate kinase one 수치가 알츠하이머병 마우스에서 더 높지만, 간에서는 더 낮음을 시사합니다.

이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 약 5시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플 취급에 주의하는 것이 중요합니다. 일일 분석 깊이와 커버리지를 높이기 위해 강 양이온 교환 또는 고 pH 분획과 같은 분리 방법을 이 절차에 포함하여 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청하신 후에는 C-Pilot을 사용하여 샘플 멀티플렉싱을 향상시키는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.