Name: 향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cPILOT) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-01T10:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 학습하세요 cPILOT 정량 단백질체학 방법으로 알츠하이머병 마우스 모델과 대조군 조직을 동시 분석하는 기법입니다. 이 방법은 다중 샘플링과 단백질 변화 포착을 통해 신경퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

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저자는 RASR에 피츠버그 시동 자금의 대학과 NIH, NIGMS R01 부여 (GM 117191-01)를 인정합니다.

윤리 선언문 : 마우스는 독립적 인 비영리 생명 의학 연구 기관에서 구입 한 피츠버그 대학의 실험 동물 자원의 부문에 보관되었다. 모든 동물 프로토콜은 피츠버그 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 화학 태그 1. 단백질 추출 및 펩타이드 생성 <ol><li> 조직, 세포, 또는 체액에서 단백질을 추출합니다. <ol><li> 기계적 균질기를 사용하여 8 M 우레아 (500 μL)를 인산 완충 식염수 조직 (예 : 뇌, 심장, 간) (1X PBS) 60-90 mg의 균질화. 필요한 경우, 프로테아제 억제제 또는 인산 버퍼에 추가 될 수있다. 이 프로젝트에서, 그들은 사용되지 않았다. 균질 대해 다음 파라미터를 사용하여 행렬 A 비드, 4m / 초, 20 초를 용균. 심장 조직을 균질화의 최대 9 사이클을 필요로 할 수있다. 참고 : 프로테아제 또는 포스 파타 아제 억제제<html> 필요한 경우, S가 버퍼에 추가 될 수있다. 그들은이 연구에 사용되지 않았다. <ol><li> 용균 튜브에서 조직 균질 액을 제거하고 마이크로 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 8 M 우레아의 PBS 100-500 μL와 튜브 용균 헹구고 조직 파쇄 액과 세정액을 결합한다. </li></ol></li><li> 균질 조직을 원심 분리 (9,447 XG, 4 ℃, 15 분)하여 상층 액을 모은다. </li></ol></li><li> 제조자의 지시에 따라 bicinchoninic 산 (BCA) 분석법을 이용하여 단백질 농도를 결정한다. 주 : 단백질 농도가 너무 높으면 버퍼 희석 또한 필요할 수있다. 이들 조직으로부터 얻어진 시료 농도 6-13 ㎍ / μL 사이에 있었다. <ol><li> 선택적 : 1 비율 μg의 표준 내부 품질 관리 표준 (예 : 소 알파 카제인 또는 다른 외래 단백질)을 추가 100 μg의 단백질 샘플. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. 샘플 소화 <ol><li> 각 샘플로부터의 단백질 100 μg의 (100 × 10-6 g)를 첨가 개별적 마이크로 원심 분리기 튜브로 표시한다. 볼륨이 단백질 농도에 의존한다 (단계 1.2 참조). </li><li> 각 샘플 (몰 비율 샘플 1 시약 40) 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 추가한다. 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션. 몰비의 계산은 66.5 × 103 G / 몰이다 소 혈청 알부민 단백질 질량 (BSA) 기반으로한다. </li><li> 각 샘플 (몰 비율 샘플 1 시약 80) 요오도 아세트 아미드 (IAM)를 추가한다. 2 시간 동안 어둠 속에서 얼음에 품어. 이 반응은 부반응을 방지하기 위해 2 시간 동안 얼음상에서 수행된다. </li><li> 각 샘플 (몰 비율 샘플 1 시약 40) -L- 시스테인을 추가한다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션. </li><li> M. 2의 최종 농도로 희석 우레아, 10 mM의 CaCl2를 (PH 8.2)에 20 mM 트리스 완충액 추가 </li><li> 추가 L-1-tosylamido -2- 페닐 클로로 메틸 케톤 (TPCK)을 트립신 처리 한 (501 기판에 각 시료) 몰 비율을 효소 및 24 시간 동안 37 ° C에서 배양. </li><li> 플래시 동결 추가 처리 될 때까지 -80 ℃에서 액체 질소에 저장하여 샘플을 단백질 분해 담금질. </li></ol> 3. 샘플 탈염 <ol><li> 포름산 (FA)를 첨가하여 샘플을 다시 산성화. 0.1 %의 최종 농도를 얻기 위해 충분한 FA를 추가합니다. 시료는 -80 ° C에서 원래 경우 다시 산성화 전에 얼음에 샘플을 해동. </li><li> 탈 염은 이전에 균형으로 C 18의 친수성 친 유성 (HLB) 10 mg의 카트리지를 사용하여 펩티드 16 기재. </li><li> ~ 10 μL의 부피로 진공 원심 분리 (5 토르, 45 ° C, 77 XG)하여 샘플을 건조. </li></ol> 4. 디메틸 화 라벨 (N 말단) <ol><li> 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 또는 나노 - 순수한 등급의 물에 용해 된 1 % 아세트산 펩타이드 (0.25 ㎍ / μL) 재구성한다. 50 μ 제거; g의 새로운 마이크로 원심 분리 튜브 (1.5 ㎖)에 부와 -80 ° C의 나머지를 저장한다. </li><li> (8) 60 mM의 (4 %) CH의 μL 2 O (37 % 중량 / V) 또는 60 mM의 (4 %) 13 CD 2 O (20 % 중량 / V) 또는 많이 디메틸 화와 표지 용 샘플 각각을 추가 . 일반적으로, 시약 4 μL 펩타이드 25 μg의 (단계 4.2, 4.3, 4.6)에 따라 첨가된다. </li><li> 각각 밝거나 무거운 디메틸 화, 표지 샘플에 24 밀리미터의 NaBH 3 CN 24 mM의 3 NaBD CN 8 μL를 추가한다. </li><li> 소용돌이와 실온에서 ~ 10 분 튜브 쉐이커에 흔들. </li><li> 5 분 동안 1 % 암모니아수 (~ 28-30 %의 v / v)의 16 μL를 첨가하여 반응을 켄칭 하였다. 일반적으로, 시약 8 μL 펩타이드 25 μg의 당 추가된다. </li><li> 다시 산성화시키고, 5 % FA 8 μL 첨가하여 반응 혼합물 (98 %의 절 / V). </li><li> 여섯 개 개의 샘플을 생성하는 광 및 무거운 dimethylated 펩티드 (도 1)에 결합한다. 표 1을 참조하십시오 </strong&gt; 본 연구에 사용되는 샘플 태그 및 풀링에 대한 설명. </li><li> 단계 3.2 및 3.3에 따라 샘플 탈염을 수행합니다. </li></ol> 5. 등압 태그 (라이신 잔기) <ol><li> 트리 에틸 암모늄 바이 카보네이트 (TEAB) 완충액 (pH ~ 8.5) 100 mm 단위 dimethylated 펩타이드 100 μg의 (1 개 ㎍ / μL)를 재구성한다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 명시된 바와 같이 동중 시약을 준비합니다 (재료 / 시약의 표 참조). </li><li> ~ 10 초 동안 펩티드 및 와류에 용해 등압 시약 (41 μL)을 추가한다. ~ 1 시간 동안 마이크로 원심 분리기 튜브 통에 샘플을 흔들어. 8 μL 히드 록실 아민과 실온에서 15 분 동안 샘플을 배양 (/ V w 10 %)로 반응을 켄칭 하였다. </li><li> 추가로 사용할 때까지 -80 ℃에서 혼합 한 탈염 (단계 3.1 내지 3.3) 또는 저장소로 여섯 개 표지 샘플 풀. 참고 : 프로테옴 범위와 깊이를 개선하기 위해, 다차원 분리 전략 제안같은 강한 양이온 교환 (SCX). </li></ol> 6. 강한 양이온 교환 <ol><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 SCX을 수행합니다 (재료 표 참조). <ol><li> 포름산 암모늄 용액 ~ 1 ㎖ (20 mm의 40 mm의 60 mm의 80 mm의 100 mm의 150 mm의 250 밀리미터, 500 mM)을 10 % 아세토 니트릴 (ACN), 0.1 % FA 핀 (PH3)을 준비. </li><li> 피펫 팁의 상단에서 빨간 모자를 제거하고 포장 재료는 피펫 팁의 바닥을 향해 있는지 확인하기 위해 슬러리 포장과 피펫 팁을 누릅니다. 참고 : 치명타 : 프로토콜이 끝날 때까지 피펫 팁을 버리지 마십시오. </li><li> 마이크로 원심 분리 튜브 (2 ㎖)의 상부에 원심 어댑터를 놓고 내부 피펫 팁을 고정. </li><li> 피펫 팁 SCX 재구성 버퍼 150 μL를 추가합니다. </li><li> 실온 (4000 XG)에서 6 분간 피펫 팁을 원심 분리기. 이 단계를 두 번 더 반복하고 폐기물을 폐기하십시오. </li><li> 는 P를 녹이고SCX 재구성 완충액 150 μL의 eptides. pH가 3인지 확인합니다. </li><li> 피펫 팁, 원심 분리기 (6.1.5 참조) 펩티드를 추가하고 용리액을 유지한다. </li><li> 새로운 마이크로 원심 분리 튜브 (2 mL) 중 상기 필터와 피펫으로 옮기고하는 20 mM 포름산 암모늄 용액 150 μL를 추가한다. 실온 (4000 XG)에서 6 분 동안 원심 분리하여 용출액을 유지한다. </li><li> 6.1.8 단계를 반복하여 추가의 일곱 번, 암모늄 포르 메이트의 연속적인 농도 (즉, 40 mm의 60 mm의 80 mm의 100 mm의 150 mm의 250 mM 내지 500 mm)를 사용. </li></ol></li><li> 마이크로 원심 분리기 튜브 (1.5 mL)을 8 개의 분획을 SCX 옮기고 원심 증발을 사용하여 그것들을 집중한다 (단계 3.3 참조). </li></ol> 7. 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LC-MS / MS)와 MS (3) <ol><li> 0.1 % FA, 필터 질량 분석 등급 물에 펩티드를 재구성하고, 오토 샘플러 바이알에 배치했다. FOLL 같은 필터 펩티드OWS : <ol><li> 0.65 μm의 필터를 포함하는 미세 원심 분리 관에 추가 재구성 펩티드 (재료 표 참조). </li><li> 1 분 동안 12,000 XG 원심 분리기 펩타이드. 필터를 제거 폐기하고, 자동 샘플러 병에 필터링 된 펩티드를 추가 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 다음 이동상 버퍼 준비 : 3 %, 0.1 %, FA (A)와 (V / V) ACN 100 % ACN 0.1 % FA (B)와. </li><li> C (18) 재료 (는 5㎛, 200 Å 기공 크기)를 2cm로 충전 트랩 컬럼 상 SCX 각 분획 시료 6 μL를 주입한다. 주 : 다음에 트랩 샘플 세정 : 3 분, 0 % B 단계; 2 차원 액체 크로마토 그래피 시스템을 사용하여 3 μL / 분 (재료 표 참조). </li><li> 분석 분리 방법을 실행합니다. C (18) 재료로 충전 된 75 μm의 ID X 13.2 cm 레이저 인출 팁 용융 실리카 모세관 컬럼 (5 ㎛의 100 Å)을 사용한다. 구배는 : 0-5 분, 10 % B; 5-40 분 10-15 % B; 40-90 분 15-25 % B; 90-115 분 25-30 % B; 115-130 분 30-60 % B; 130-135 분 60-80 % B; 135-145 분, 80 % B, 145-150 분, 80-10 %의 B; 150-180 분, 10 % B; 300 거리 nL / 분, 180 분. </li><li> 분석 분리 방법을 실행하는 동안 질량 분석기에 대한 데이터 수집을 실행합니다. 주 : 400-1,600 m / z 60,000 해상도, 자동 이득 제어 (AGC)는 1 × 106 이온, 최대 분사 시간이 500ms 타겟팅 다음과 같이 조사 MS 스캔을위한 파라미터이다. 다음 CID-MS / MS에 대한 파라미터들은 : 상위 1-7 또는 상부 8-14 데이터 종속 수집 (DDA), 3m / z 분리 폭 500 최소 신호 35 % 정상화 충돌 에너지 (NCE), 0.25 활성화 Q 10 밀리 활성화 시간, 3 × 104 AGC, 50 밀리 초, 최대 분사 시간. 다음 HCD-MS (3)에 대한 매개 변수는 200의 최소 신호 4 m / z 분리 폭 60 % NCE 0.1 활성화 시간, 3 × 105 AGC 250 개 단말 IT를 300-1,300 m / z MS / MS 선택 범위 , 유엔 조각 부모 이온을 제외 할 수 있습니다. </li><l난&gt; 상단 1-7과 최고 8-14 실행 모두 중복의 각 분석을 수행합니다. 참고 : 샘플이 orbitrap 또는 tribrid 질량 분석기를 포함하는 악기의 새로운 모델을 실행할 경우, DDA 매개 변수는 다양하고 더 MS / MS 및 MS 3 스캔을 포함하도록 최적화 할 수 있습니다. 또한 tribrid 악기 동기 전구체 선택 (SPS)는 3이 사용되어야 -MS. </li></ol> 8. 데이터 분석 (16) <ol><li> 마우스 Uniprot 같은 적절한 데이터베이스에 대한 단백질 분석 소프트웨어를 사용하여 RAW 파일을 검색 할 수 있습니다. 주 : 빛과 무거운 dimethylated 펩티드를 검색하기 위해 각 RAW 파일에 대한 두 개의 워크 플로우를 작성하는 것이 중요합니다. </li><li> 다음 매개 변수를 사용하여 RAW 파일을 검색이 놓친 분열, 펩타이드의 질량 범위 300-6,000 다, 15 ppm의 부모 중량 허용 오차, 1 개 다 단편화 허용 오차 트립신. 정적 변형 : 광 디메틸 화 (28.031, N 말단 펩티드) 또는 Heavy의 디메틸 화 (36.076 다, N 말단 펩티드) carbamidomethyl (57.021 다, C). 주 : 중쇄 때때로 dimethylated 피크는 7 ~ 다 (35.069 다, N 말단 펩티드)에 광 dimethylated 피크 내지 때문에 무거운 dimethylated 펩타이드의 검색 작업 흐름에 통합되어야한다. 동적 변형 : 산화 (15.995 다, M), 6- 플렉스 등압 태그 (229.163 다, K). 거짓 검색 속도를 얻을 수있는 미끼 데이터베이스 검색 (예 : 1, 5 %)와 동중 태그의 기자 이온 농도를 검색 할 수있는 정량 노드를 포함합니다. </li><li> 통계 <ol><li> 위해서는 전자 스프레드 시트 프로그램에 데이터 내보내기 단백질 리포터 이온 값을 정규화한다. 각 단백질은 각각 내부 표준의 내부 표준 또는 원시 리포터 이온 농도의 중간 비율로 평균 리포터 비 이온 또는 원시 리포터 이온 농도 중 하나를 나눈다. 이러한 전자 스프레드 시트 프로그램, PERS으로 적절한 통계 소프트웨어를 사용하여EUS, 또는 R 샘플 조건 사이에 큰 변화를 확인합니다. </li></ol></li></ol>

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<li>Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS3-based+quantitative+proteomics+using+pulsed-Q+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).</li>
<li>Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Value+of+Using+Multiple+Proteases+for+Large-Scale+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics.</a> J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiNotch+MS3+Enables+Accurate%2C+Sensitive%2C+and+Multiplexed+Detection+of+Differential+Expression+across+Cancer+Cell+Line+Proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes.</a> Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).</li>
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저자는 더 경쟁 관심이 없습니다.

cPILOT는 12 개 이상의 독특한 샘플의 동시 측정을 허용한다. 펩티드의 N 말단 리신 잔기 모두 성공적인 태깅을 보장하기 위해, 반응의 각 세트에 대한 정확한 산도를 갖는 펩티드 및 라벨링 먼저 디메틸 화 반응을 수행하는 데 필수적이다. N- 말단에 선택적 디메틸 화는 (± 0.2) ~ 2.5의 pH를 갖는 의해 수행된다. 이것은 라이신의 아미노기의 PKA의 차이 및 N 말단을 이용함으로써 달성된다. pH가 2.5에서 라이신이 비활성 상태 (PKA ~ 10.5); pH가 약간 (즉, pH를 5-7) 산성 또는 염기성 인 경우, 상기 N 말단 및 리신 잔기 모두 dimethylated한다. 등압 태그는 낮은 pH에서 먼저 수행되는 경우뿐만 아니라, 상기 N 말단은 등압 라벨 리신 잔기 dimethylated 될 것이다. 이것은 B-이온 선택해야하는 것처럼 MS (3)에 대해 선택되는 작은 조각 될 수있다. 디메틸의 상대적 비용ATION 반응은 상업 동중 시약에 비해 저렴합니다. 하나는 1...

단백질 체학은 종종 더 나은 질병 과정을 이해하는 데 많은 샘플, 효소 반응 속도론, 번역 후 수정, 환경 자극에 대한 반응, 치료 치료, 바이오 마커 발견, 약물 메커니즘에 대한 응답의 분석을 포함한다. 정량 방법은 시료 전체 단백질 수준에서의 상대적인 차이를 측정하고 라벨없는 일 수 있거나, 동위 원소 표지 (대사, 화학적, 또는 효소)를 포함하는 이용 될 수있다. 그들은 많은 시료를 동시에 분석 할 수있게하고 다른 세포, 조직, 체액, 또는 유기체 전체 샘플에 적합하기 때문에 안정 동위체 표식 방법은 인기가 증가했다. 동위 원소 표지 방법 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 증가 실험 처리량획득 시간, 비용, 및 실험 오차를 줄일 수있다. 이러한 방법은 펩티드의 단백질 피크의 상대 존재비를 측정하는 전구체 질량 스펙트럼을 사용한다. 대조적으로, 태그 등압 시약 8, 9, 10 중 하나를 MS / MS 또는 MS에서 검출되는 리포터 이온을 발생 3~11 스펙트럼 및 이들 피크는 단백질의 상대적 존재비를보고하는데 사용된다. 프로테오믹스 멀티플렉싱 현재 최첨단은 12 10 12 플렉스 플렉스 등압 태그 분석 중 13이다. 향상된 다중 샘플 (즉&gt; 10 개 샘플) 방법은 세포 (18)의 분석을 위해 다른 사람에 의해 조직을 14, 15, 16, 17에 대해 실험실에서 개발하고있다 </SUP&gt; 19, 20, 21, 또는 표적 펩티드 22 어떤 조직이. 우리는 동중 태그 (cPILOT)와 결합 전구체 동위 원소 표지라는 강화 된 다중화 기술을 개발했다. 글로벌 cPILOT 다른 샘플 조건 (≥12) (14) 전체의 모든 단백질의 상대적 농도에 대한 정보를 얻기에 유용합니다. 도 1은 일반적인 cPILOT 흐름을 나타낸다. 트립신 또는리스-C 펩티드는 선택적으로 낮은 pH (2)를 사용하여 디메틸 화와 N 말단에 및 높은 pH를 사용하여 6 플렉스 시약 리신 잔기로 표지된다. 이 전략은 실험 비용과 추가를 줄이는 데 도움이 동중 시약으로 분석 할 수있는 샘플의 수를 두 배로, 실험 단계 및 시간을 줄일 수 있습니다. 우리는 산화 번역 후 MODI을 연구하기 위해 다른 방법을 개발로 cPILOT는 유연3 nitrotyrosine의 변성 단백질 14, S-nitrosylation (oxcyscPILOT) 23 시스테인 함유 펩티드를 포함 fications. 또한 아미노산 선택적 접근 시스테인 cPILOT (cyscPILOT) (17)을 개발 하였다. 상부 이온 선택성 11 Y-1 - 이온 방법 (15) MS (3) 획득 리포터 이온 간섭을 줄이고 cPILOT의 정량 정확도를 향상시킬 수있다. 저해상도 이온 트랩기구는 24 일 수 있지만, 획득 방법에서 MS (3)의 사용은 orbitrap 질량 분석기 고해상도 장비를 필요로한다. 이전 cPILOT는 알츠하이머 병 마우스 모델에서 간 단백질 (16)을 연구하는 데 사용되었습니다. 여기, 우리는 periphe의 역할을 연구하는 뇌, 심장, 간 균질를 사용하여 글로벌 cPILOT 분석을 수행하는 방법에 대해 설명합니다알츠하이머 병의 스피. 이 실험은 생물학적 복제를 통합합니다. 때문에 cPILOT의 다양성의 관심 사용자는 생물 문제와 시스템의 범위를 다른 조직을 연구하는 기술을 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>물 - MS 등급</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td>4 L 수량이 필요하지 않습니다</td></tr><tr><td>아세토니트릴 - MS 등급</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td>4 L 수량이 필요하지 않습니다</td></tr><tr>아<td>세트산</td><td>J.T. Baker</td><td>9508-01</td><td></td></tr><tr><td>수산화암모늄 용액 (28 - 30%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320145-500ML</td><td></td></tr><tr><td>포름산 암모늄</td><td>Acros 유기물</td><td>208-753-9</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>플루카 분석</td><td>94318-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 키트</td><td>Pierce Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Biorad</td><td>161-0731</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biorad</td><td>161-0716</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreiotol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>요오도아세트아미드 (IAM</td><td>Acros Organics</td><td>144-48-9</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma Aldrich, 화학</td><td>168149-25G</td><td></td></tr><tr><td>소 췌장에서 L-1-토실아미도-2 페닐에틸 콜로메틸 케톤(TPCK) 처리된 트립</td>신 <td>Sigma Aldrich, 생명 과학</td><td>T1426-100MG</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드(CH2O) 용액; H2O에서 36.5 - 38%</td><td>Sigma Aldrich, 생명 과학</td><td>F8775-25ML</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드(13CD2O) 용액; D2O에서 20wt%, 98 원자 % D, 99 원자 % 13C</td><td>Sigma Aldrich, 화학</td><td>596388-1G</td><td></td></tr><tr><td>시아노보로하이드리드나트륨; 시약 등급, 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>156159-10G</td><td></td></tr><tr><td>시아노보로하이드리드나트륨; 96 원자 % D, 98% CP</td><td>Sigma Aldrich, 화학</td><td>190020-1G</td><td></td></tr><tr><td>SCX(Strong Cation Exchange) 스핀 팁 시료 준비 키트</td>, <td>Protea BioSciences</td><td>SP-155-24KIT</td><td></td></tr><tr><td>TEAB(Triethyl ammonium bicarbonate) 완충액</td>, <td>Sigma Aldrich, Life Science</td><td>T7408-100ML</td><td></td></tr><tr><td>등압 태깅 키트(TMT 6 plex) - 6 반응(1 x 0.8 mg)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90061</td><td></td></tr><tr><td>하이드록실아민 하이드로클로라이드</td><td>Sigma Aldrich, 화학</td><td>255580-100G</td><td></td></tr><tr><td>표준 와류 믹서</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td>모든 믹서를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Oasis HLB 1cc(10mg) 추출 카트리지</td><td>Waters</td><td>186000383</td><td>C18 카트리지</td></tr><tr><td>Visiprep SPE 진공 매니폴드, DL(일회용 라이너), 24포트 모델</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57265</td><td>12포트 모델도 충분합니다</td></tr>. <tr><td>Speed-vac</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD1010</td><td>모든 브랜드의 speed vac이면 충분합니다</td></tr>. <tr><td>수조 챔버</td><td>Thermo Scientific</td><td>2825/2826</td><td>모든 브랜드의 &nbsp; 온도가 조절된 수조 챔버로 충분합니다.</td></tr><tr><td>기계적 균질화기(i.e. FastPrep-24 5G)</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler</td><td>Sciex</td><td>-</td><td>이 모델은 더 이상 사용할 수 없습니다. 오토샘플러가 있는 모든 나노 LC로 충분합니다.</td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos 질량분석기</td><td>Thermo Scientific</td><td>-</td><td>이 모델은 더 이상 사용할 수 없습니다. 다른 고분해능 기기(<예: Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion 또는 Orbitrap Fusion Lumos)>em)을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>단백질 소프트웨어 (예: Proteome Discoverer)</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGABSFAKJMAUH&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>Mettler Toledo</td><td>AL54</td><td></td></tr><tr><td>교반 플레이트</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td>모든 브랜드의 교반 플레이트가 충분합니다</td></tr><tr><td>pH 측정기 (Tris 호환 가능)</td><td>Fisher Scientific (Accumet)</td><td>13-620-183</td><td>모든 브랜드의 pH 측정기가 충분합니다</td></tr><tr><td>pH 10 버퍼</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-664-261</td><td>pH 버퍼 10의 모든 브랜드가 충분한</td></tr><tr><td>pH 7입니다. 완충</td>액 <td>Fisher Scientific</td><td>06-664-260</td><td>모든 브랜드의 pH 완충액 7이면 충분합니다</td></tr><tr><td>1.5 mL 에펜도르프 튜브, 500 pk</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>모든 브랜드의 1.5 mL 에펜도르프 튜브는 충분합니다</td></tr><tr><td>0.6 mL 에펜도르프 튜브, 500 pk</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-408-120</td><td>0.6 mL 에펜도르프 튜브의 모든 브랜드는</td></tr><tr><td>충분합니다 0.65 &마이크로; m Ultrafree MC DV 원심 필터 장치</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30DV00</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 마이크로 원심분리기 튜브, 72 장치</td><td>Thermo Scientific</td><td>69720</td><td></td></tr><tr><td>C18 포장재 (5&nbsp; &마이크로; m, 100 &Aring;)</td><td>브루커</td><td>PM5/61100/000</td><td>이 아이템은 더 이상 브루커에서 구매할 수 없습니다. 나열된 사양의 대체 포장재는 충분한</td></tr><tr><td>C18 포장재(5&nbsp; &마이크로; m, 200 &Aring;)</td><td>브루커</td><td>PM5/61200/000</td><td>이 아이템은 더 이상 브루커에서 구매할 수 없습니다. 나열된 사양의 대체 포장재로 충분합니다.</td></tr></tbody></table>

향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cpilot)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

질병의 이해와 바이오 마커의 발견을위한 많은 생물학적 샘플을 분석하는 요구가 증가하고있다. 여러 샘플의 동시 측정이 확산되고 크게 실험 비용과 시간을 단축 한 수 정량 프로테오믹스 (proteomics) 전략. 우리 연구실은 기존의 동위 원소 표지 또는 등압 태그 방식의 샘플 멀티플렉싱을 향상 동위 원소 라벨 및 동중 태그 (cPILOT) 결합 전구체라는 기술을 개발했다. 글로벌 cPILOT은 세포, 조직, 체액, 또는 전체 유기체로부터 유래 된 샘플에 적용하고 다른 샘플 조건에 걸쳐 상대적 단백질 존재비에 대한 정보를 제공 할 수있다. cPILOT는 낮은 pH 완충액 조건을 이용하여) (1)에 의해 작동 선택적 dimethylate 펩티드 N 말단 2)) 재료 / 시약의 표를 참조 (시판 등압 시약 리신 잔기의 차 아민 라벨을 높은 pH 완충액 조건을 사용한다. 의 정도가능한 샘플 다중화 사용 전구체 레이블의 수 및 등압 태그 시약에 의존한다. 여기서는 한 번의 분석 마우스 조직에서 12 개 샘플을 분석하는 여섯 플렉스 등압 시약과 함께 광 무거운 디메틸 화를 사용하여 12 플렉스 분석을 제시한다. 향상된 다중 적은 실험 편견과 오류, 더 중요한 것은 실험 시간과 비용을 줄일 수 많은 샘플 조건 (생물 복제, 병기, 약물 치료, 유전자형, 또는 세로 시간 포인트)에서 비교를 허용하는 도움이됩니다. 본 연구에서는 글로벌 cPILOT 방법은 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤에서 뇌, 심장, 생물 복제에서 간 조직을 분석하는 데 사용됩니다. 글로벌 cPILOT 다른 생물학적 과정을 연구에 적용되고, 20 개 이상의 샘플을 샘플 다중화를 증가하도록 구성 될 수있다.

cPILOT은 N 말단 및 리신 잔기에 라벨 펩티드를 화학적으로하는 아민 계 화학 제를 사용하여 시료 다중화 기능을 향상시킨다. 그림 2는 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤에서 뇌, 심장, 간 조직의 12 플렉스 cPILOT 분석에서 얻어진 대표 MS의 데이터를 보여줍니다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 알츠하이머 병 및 야생형 생쥐 두 생물 복제이 12 플렉스 분석에 포함되어 있습니다. 도 2a는, 펩티드에 도입 된 하나의 다이 메틸 그룹을 나타내는 4 m / z 간격에 의해 분리되는 이중 하전 피크 쌍을 나타낸다. 광이 한 쌍의 무거운 dimethylated 피크 모두 CID 독립적으로 절연 및 파편이다. dimethylated 펩티드의 각각에 대한 MS / MS 데이터를도 2b 및 C에 ...

결합 전구체 동위 원소 라벨 및 동중 태그 (cPILOT)은 동중 태그의 샘플 다중화 기능을 향상 정량 프로테오믹스 전략이다. 이 프로토콜은 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤에서 조직에 cPILOT의 응용 프로그램을 설명합니다.

향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

이 개선된 다중 분석법의 전반적인 목표는 시료 오차와 분석 시간을 줄이면서 동시에 분석 가능한 단백질 시료의 수를 늘리는 것입니다. 이 방법은 발병 기전, 진행, 진단, 예후 및 치료 표적과 관련된 노화, 신경퇴행성 질환, 기타 연령 관련 질환 및 암 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 조건에 걸친 단백질 변화에 대한 포괄적인 스냅샷을 생성할 수 있다는 점입니다.이 방법은 마우스 모델의 알츠하이머병에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 알츠하이머 환자나 기타 다양한 질환자의 조직 샘플에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사람들은 짧은 시간 내에 여러 샘플을 동시에 처리해야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 저희는 아세틸화가 단백질 니트로화의 isobaric tagging과 결합될 수 있다는 점을 인식하면서 이 방법의 아이디어를 처음 얻었으며, 이를 통해 모든 펩타이드에 전역적으로 적용 가능한 기술을 구현하고자 했습니다.본 연구에서는 알츠하이머병 마우스 모델과 야생형 대조군의 뇌, 심장 및 간 조직을 분석합니다. 각 조직 샘플 60~90 mg을 용해 튜브로 옮기고, 8 M urea가 포함된 PBS 500 µL를 첨가합니다. 기계식 균질기를 사용하여 샘플을 균질화합니다.용해 튜브에서 조직 균질물을 제거하여 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 8 M urea가 포함된 PBS 100~500 µL로 용해 튜브를 헹구고, 헹굼액을 조직 균질물과 합칩니다. 조직 균질물을 15분 동안 원심분리합니다.각 샘플에서 상층액을 수집합니다. BCA 분석을 수행하여 단백질 농도를 결정한 후, 각 샘플에서 100 micrograms의 단백질을 개별적으로 라벨링된 마이크로원심분리 튜브에 넣습니다. 각 샘플에 dithiothreitol을 첨가합니다.그리고 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 각 샘플에 iodoacetamide(IAM)를 첨가하고, 얼음 위 암소에서 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 각 샘플에 L-cysteine을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.30분 후, calcium chloride가 포함된 tris buffer를 첨가하여 urea의 최종 농도가 2 M이 되도록 희석합니다. 각 샘플에 L1 tosilimitotophenylethylcholer methyl ketone으로 처리된 trypsin을 첨가합니다. 그리고 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다.다음 날, 시료를 액체 질소로 급속 냉동하여 단백질 소화를 정지시키고 추가 처리 시까지 -80 °C에서 보관합니다. 디메틸화 표지 전, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 펩타이드 시료를 탈염하고 진공 원심분리기(vacuum centrifugation)로 건조합니다. 디메틸화 표지 절차를 시작하려면 HPLC 또는 nanopure 등급의 물에 용해된 1% acetic acid로 펩타이드를 재구성합니다.각 샘플에서 50 µg씩 분취하여 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다. 재구성된 펩타이드의 나머지 양은 향후 실험을 위해 -80 °C에서 보관하십시오. 다음으로 시연할 단계에서는, 화학적 활성화 반응이 모든 샘플에서 동일한 시간 동안 일어날 수 있도록 시약을 신속하게 첨가하는 것이 중요합니다.가벼운 디메틸화(light dimethylation)로 라벨링할 시료에 60 millimolar 포름알데히드 용액 8 µL를 첨가합니다. 무거운 디메틸화(heavy dimethylation)로 라벨링할 시료에는 60 millimolar carbon 13 deuterium 라벨링 포름알데히드 용액 8 µL를 첨가합니다. 가벼운 디메틸화로 라벨링된 시료에 24 millimolar 소듐 사이아노보로하이드라이드 8 µL를 첨가합니다.중수소화 디메틸화(heavy dimethylation)로 표시된 샘플에 24 mM sodium cyanoborohydride 8 µL를 첨가합니다. 샘플을 볼텍싱한 후, 튜브 셰이커를 이용하여 실온에서 약 10분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 1% ammonia 16 µL를 첨가하여 5분 동안 반응을 정지시킵니다.5% formic acid 8 µL를 첨가하여 반응 혼합물을 다시 산성화합니다. 가벼운(light) 및 무거운(heavy) 디메틸화 펩타이드를 결합하여 총 6개의 샘플을 생성합니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 샘플 탈염을 수행합니다.그리고 진공 원심분리기를 사용하여 샘플을 건조합니다. 디메틸화된 샘플의 등중량 태깅(isobaric tagging)을 시작하려면, 먼저 100 µg의 디메틸화된 펩타이드와 triethylammonium bicarbonate(TEAB 완충액)를 이용해 재구성합니다. 다음으로, 등중량 태깅 키트 제조사의 프로토콜에 따라 등중량 시약을 준비합니다.각 펩타이드 샘플에 적절한 부피(이 경우 용해된 isobaric 태깅 시약 41 µL)를 첨가하고 약 10초 동안 볼텍싱합니다. 상온의 마이크로원심분리기 튜브 쉐이커에서 샘플을 약 1시간 동안 흔들어 줍니다. 반응을 정지시키기 위해 각 샘플에 8 µL의 하이드록실아민을 첨가합니다.그런 다음 샘플을 실온에서 15분 동안 배양합니다. 라벨이 지정된 6개의 샘플을 하나의 혼합물로 모아 탈염합니다. 0.1% formic acid가 포함된 질량 분석기용 등급의 증류수에 펩타이드를 재구성하여 액체 크로마토그래피를 위한 펩타이드를 준비합니다.0.65 µm 필터가 들어 있는 마이크로원심분리 튜브에 재구성된 펩타이드를 추가합니다. 그리고 12,000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 필터를 제거하여 폐기합니다.여과된 펩타이드를 자동 시료 주입기 바이알로 옮깁니다. 각 강 양이온 교환 분획 시료 6 µL를 트랩 컬럼에 주입합니다. Carbon 18 물질로 2 cm까지 충전합니다.분석 분리 및 데이터 수집 질량 분석법을 실행합니다. 알츠하이머병 마우스 모델과 야생형 대조군의 뇌, 심장 및 간 조직을 대상으로 12-plex cPilot 분석을 수행하였습니다. 전구체 데이터에서는 m/z 643.854 및 647.875 피크로 나타나는 가벼운 dimethylated 펩타이드와 무거운 dimethylated 펩타이드가 확인되었습니다.이 펩타이드들은 선택 및 독립적으로 분리되었으며, 충돌 유도 해리(collision induced dissociation)를 통해 단편화되어 이러한 스펙트럼을 생성하였습니다. 검색 결과, 해당 피크들은 phosphoglycerate kinase one 단백질의 펩타이드에 속하는 것으로 나타났습니다. 이러한 피크들은 고에너지 충돌 해리 탠덤 질량 분석법을 위해 추가로 분리되었으며, 리포터 이온이 표시된 바와 같이 관찰됩니다.12개 샘플에 대한 정보를 얻기 위해서는 두 세트의 3단계 질량 분석 스펙트럼이 모두 필요합니다. 이 예시에서, 뇌, 간 및 심장 조직의 두 생물학적 반복 시료 간 알츠하이머병 대 야생형 대조군의 이온 비율은 서로 유사하게 나타납니다. 각 비교의 fold change 값은 뇌와 심장의 phosphoglycerate kinase one 수치가 알츠하이머병 마우스에서 더 높지만, 간에서는 더 낮음을 시사합니다.이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 약 5시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플 취급에 주의하는 것이 중요합니다. 일일 분석 깊이와 커버리지를 높이기 위해 강 양이온 교환 또는 고 pH 분획과 같은 분리 방법을 이 절차에 포함하여 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청하신 후에는 C-Pilot을 사용하여 샘플 멀티플렉싱을 향상시키는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

enhanced-sample-multiplexing-tissues-using-combined-precursor

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결합된 전구체 이소토픽 라벨링 및 동서성 태그(cPILOT)를 사용하여 자동화된 샘플 멀티플렉스

다중화 바코드 이미지 분석은 최근 종양 미세 환경의 특성을 개선하여 세포 구성, 기능 상태 및 세포-세포 상호 작용에 대한 포괄적인 연구를 가능하게 했습니다. 본 명세서에서는 올리고뉴클레오티드 접합 항체의 바코딩을 사용하는 염색 및 이미징 프로토콜과 고차원 이미지 분석 기술을 사용할 수 있는 사이클 이미징을 설명합니다.

파라핀 조직 샘플의 단일 세포 분석에서 면역 프로파일링 및 공간 매핑 특성 분석을 위한 멀티플렉스 바코드 이미지 분석

이 프로토콜은 포르말린 고정 파라핀 포매 조직 절편에서 단백질 이미징 질량 세포 분석을 통한 다중 mRNA 검출 방법론을 자세히 설명합니다.

이중 양식 분자 지도 제작: 다중 mRNA 검출과 단백질 이미징 질량 세포 분석의 통합

여기서는 동위원소 2-플렉스 표지 전략과 ArgC 소화를 사용하여 단일 세포 히스톤 번역 후 변형 후 분석을 자동화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 워크플로우는 단일 세포 해상도에서 염색질 이질성과 후생유전학적 반응을 정량적이고 재현 가능하며 고민도로 프로파일링할 수 있게 합니다.

단일 세포 히스톤 번역 변형(sc-hPTM2)의 다중화 분석을 위한 자동 샘플 준비

본 연구는 조직 절편의 직접 공간 바코딩과 단일 세포 다중옴 분석을 결합한 공간적 Trekker–CUT&amp;Tag 멀티옴 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 유전자 발현과 히스톤 H3K27ac 변형의 공간적으로 분리된 단일 세포 프로파일링을 동시에 가능하게 하여, 조직 미세해부학 맥락에서 유전자 조절에 대한 기전적 통찰을 제공합니다.

냉동 조직 절편에서 전사체 및 후생유전체 표적의 공간적으로 분리된 단일 세포 통합 다중체체 프로파일링

학습하세요 cPILOT 정량 단백질체학 방법으로 알츠하이머병 마우스 모델과 대조군 조직을 동시 분석하는 기법입니다. 이 방법은 다중 샘플링과 단백질 변화 포착을 통해 신경퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cPILOT)

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