향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cPILOT)

이 향상된 멀티플렉스 방법의 전반적인 목표는 동시에 분석할 수 있는 단백질 샘플의 수를 늘리는 동시에 샘플 오류와 기기 시간을 줄이는 것입니다. 이 방법은 노화, 신경퇴행성 질환, 기타 노화 관련 질환 및 암 분야의 발병기전, 진행, 진단, 예후 및 치료 대상과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 조건에 걸친 단백질 변화에 대한 포괄적인 스냅샷을 생성할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 마우스 모델에서 알츠하이머병에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 알츠하이머 또는 기타 다양한 질환이 있는 환자의 조직 샘플에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 짧은 시간 내에 동시에 처리해야 하는 여러 샘플이 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 우리는 아세틸화가 단백질 질화에 대한 이소베릭 태깅과 결합될 수 있다는 것을 인식했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸고, 이는 모든 펩타이드에 대해 이 기술이 전 세계적으로 작동하도록 동기를 부여했습니다.

이 연구는 알츠하이머병 마우스 모델과 야생형 대조군에서 뇌, 심장 및 간 조직을 분석할 것입니다. 각 조직 샘플 60-90mg을 용해 튜브로 옮기고 8개의 몰 요소와 함께 500마이크로리터의 PBS를 추가합니다. 기계적 균질화기를 사용하여 샘플을 균질화합니다.

용해 튜브에서 조직 균질액을 제거하고 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 100-500마이크로리터의 PBS와 8개의 몰 요소로 용해 튜브를 헹구고 헹굼 용액을 조직 균질액과 결합합니다. 조직 균질화를 15분 동안 원심분리합니다.

각 샘플에서 상등액을 클러치합니다. 단백질 농도를 측정하기 위해 BCA 분석을 수행한 후, 각 샘플에서 100마이크로그램의 단백질을 개별적으로 라벨링된 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 각 샘플에 디티오트레이톨을 첨가합니다.

그리고 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 각 샘플에 요오드아세트아미드(IAM)를 첨가하고 어두운 곳에서 얼음 위에서 2시간 동안 배양합니다. 다음으로 각 샘플에 L-시스테인을 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

30분 후, 트리스 완충액에 염화칼슘을 첨가하여 요소를 최종 농도인 2대구치로 희석합니다. 각 샘플에 L1 토실리밋오토페닐에틸콜러 메틸 케톤 처리된 트립신을 추가합니다. 그리고 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다.

다음 날, 액체 질소에서 샘플을 급속 동결하여 단백질 분해를 끄고 추가 처리까지 섭씨 음의 80도에서 보관하십시오. 디메틸화 라벨링 전에, 펩타이드 샘플은 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 탈염되고 진공 원심분리에 의해 건조됩니다. 디메틸화 라벨링 절차를 시작하려면 HPLC 또는 나노 순수 등급의 물에 용해된 1% 아세트산에 펩타이드를 재구성합니다.

각 샘플의 50마이크로그램 부분을 새 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 제거합니다. 재구성된 펩타이드의 나머지 부분은 향후 실험을 위해 섭씨 -80도에 보관합니다. 다음에 시연될 단계에서는 시약을 신속하게 첨가하여 모든 샘플에 대해 동일한 시간 동안 화학적 활성화 반응이 일어나도록 하는 것이 중요합니다.

광 디메틸화로 표지하기 위해 60 밀리몰 포름알데히드 용액 8 마이크로 리터를 샘플에 첨가합니다. 60 밀리몰 탄소 13 중수소 표지 포름알데히드 용액 8 마이크로 리터를 샘플에 첨가하여 무거운 디메틸화로 표지합니다. 8마이크로리터의 24 millimolar sodium cyanoborohydride를 light dimethylation으로 표지된 샘플에 추가합니다.

24 millimolar sodium cyanoboroduderide의 mircoliter 8개를 heavy dimethylation으로 표지된 샘플에 추가합니다. 샘플을 소용돌이친 다음 실온에서 약 10분 동안 튜브 셰이커로 부드럽게 흔듭니다. 16마이크로리터의 1%암모니아를 5분 동안 첨가하여 반응을 억제합니다.

8 마이크로 리터의 5 % 포름산을 첨가하여 반응 혼합물을 재산성화합니다. 가벼운 펩타이드와 무거운 디메틸화 펩타이드를 결합하여 총 6개의 샘플을 생성합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플 탈염을 수행합니다.

그리고 진공 원심분리로 샘플을 건조시킵니다. 디메틸화 샘플의 등압 태깅을 위해서는 먼저 100마이크로그램의 디메틸화 펩타이드와 트리에틸암모늄 바이카보네이트 또는 TEAB 완충액을 재구성합니다. 다음으로, isobaric tagging kit의 제조업체 프로토콜에 따라 isobaric 시약을 준비합니다.

적절한 부피(이 경우)를 각 펩타이드 샘플에 41마이크로리터의 가용화 등압 태깅 시약을 추가하고 약 10초 동안 와류를 사용합니다. 마이크로 원심분리기 튜브 셰이커에서 샘플을 실온에서 약 1시간 동안 흔듭니다. 반응을 소멸시키려면 각 샘플에 8마이크로리터의 하이드록실아민을 첨가합니다.

그리고 실온에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 라벨이 부착된 6개의 샘플을 단일 혼합물로 풀링하고 탈염합니다. 질량 분석 등급의 물에서 펩타이드를 0.1% 포름산으로 재구성하여 액체 크로마토그로피를 위한 펩타이드를 준비합니다.

0.65 마이크로미터 필터가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 재구성된 펩타이드를 추가합니다. 그리고 12, 1 분 동안 000 번 g로 원심 분리기. 필터를 제거하고 폐기하십시오.

여과된 펩타이드를 자동시료주입기 바이알로 옮깁니다. 6마이크로리터의 각 강력한 양이온 교환 파벌 샘플을 트랩 컬럼에 주입합니다. 탄소 18 소재로 2cm까지 포장합니다.

분석적 분리 및 데이터 수집 질량 분석기 방법을 실행합니다. 알츠하이머병 마우스 모델 및 야생형 대조군에서 뇌, 심장 및 간 조직에 대한 12-plex cPilot 분석을 수행했습니다. 전구체 데이터는 m/z 643.854 및 647.875에서 피크로 표시되는 가볍고 무거운 디메틸화 펩타이드를 보여주었습니다.

이러한 펩타이드를 선택하고, 독립적으로 분리하고, 담합 유도 해리로 단편화하여 이러한 스펙트럼을 생성했습니다. 검색 결과는 피크가 단백질 phosphoglycerate kinase 1의 펩타이드에 속한다는 것을 나타냈습니다. 이러한 피크는 더 높은 에너지, collusional dissociation, tandem mass spectrometry를 위해 더 분리되었으며 리포터 이온이 그림과 같이 관찰되었습니다.

두 세트의 3단 질량 분석기는 12개 샘플에 대한 정보를 얻는 데 필요합니다. 이 예에서 알츠하이머병과 야생형 조절 이온 비율은 뇌, 간 및 심장 조직에 대한 두 가지 생물학적 복제에서 유사합니다. 각 비교에 대한 폴드 변화 값은 뇌와 심장의 포스포글리에레이트 키나아제 1 수치가 알츠하이머병 마우스에서 더 높지만 간에서는 더 낮다는 것을 시사합니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 약 5시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플 취급에 주의해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 통합되면 강력한 양이온 교환 또는 높은 pH 분획과 같은 분리 방법을 수행하여 일일 깊이와 적용 범위를 늘릴 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 C-Pilot을 사용하여 샘플 멀티플렉싱을 향상시키는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.