Name: 포르말린에서 프로테오믹스 샘플 준비 파라핀 조직에게 고정 및 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 배우세요 포르말린 고정 파라핀 포장 조직에서 프로테오믹스 분석을 위한 샘플 준비 방법을. 레이저 미세절단과 FASP 기법을 활용하여 소량 임상 샘플에서 10,000개 단백질까지 심층 분석이 가능합니다.

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저자 방법을 시연에 대한 지속적인 지원과 부인 카타리나 Zettl은 주셔서 감사합니다 박사 마티아스 맨. 이 작품은 과학의 발전을위한 막스 플랑크 협회에 의해 지원되었다.

1. 계측 필수 <ol><li> 미세 절제 및 샘플 용해를위한 조직 조각의 준비 <ol><li> Thermoblock 99 ° C 또는 끓는 물에 목욕을 설정합니다. </li><li> 레이저 운영 microdissector (예 : PALM, 혈구, 괴팅겐, 독일). </li><li> 온도 조절 벤치 탑 원심 분리기, 온도는 20 ℃로 설정 </li><li> 에펜 도르프 형 처리 튜브 랙 젖은 챔버 (상자). </li><li> 창업 보육 센터는 37 ° C로 설정 </li><li> 마이크로 규모의 석영 큐벳 (0.1 ~ 0.2 ㎖)으로 자외선 근처에 여기 형광의 측정을 가능하게 분광. </li></ol></li></ol> 2. 솔루션 <ol><li> &#39;조직 용해 버퍼&#39;(TLB) : 0.1 M 트리스 - 염산, pH를 8.0, 0.1 M DTT, 0.5 % (w / v)의 폴리에틸렌 글리콜 2 만 4 % SDS의. </li><li> UA 솔루션 : 0.1 M 트리스 - 염산의 pH 8.5에서 8 M 요소. 1 샘플 당 1 ㎖를 준비합니다. UA와 IAA 솔루션 갓 준비하고 하루 내에서 사용되어야한다. </li><li> IAA 솔루션 : 0.05 M 전UA에 odoacetamide. 1 샘플 당 0.1 ML를 준비합니다. </li><li> 엔도리스 - C, 원액. </li><li> 트립신, 원액. </li><li> &#39;소화의 버퍼 (DB) : 0.05 M 트리스-HCl을 pH가 8.5. 1 샘플 당 0.25 ML을 준비합니다. </li><li> &#39;트립토판 표준 용액&#39;1 ㎖ 탈 이온수에 0.1 μg 트립토판. </li><li> &#39;분석 버퍼 B&#39;(ABB) : 10 mM 트리스 - 염산, pH가 7.6. </li><li> 브리튼 &amp; 로빈슨 보편적 인 버퍼 (BRUB)의 원액. 0.1 M CH 3 COOH, 0.1 MH 3 PO 4, 0.1 MH 3 BO 3를 함유하는 용액을 준비하고 필요에 pH를 1 M NaOH로 조정 (2, 4, 5, 6, 11). 사용하기 전에 탈 이온수로 5 배 희석. </li><li> 탈 이온수 1 % (V / V) CH 3 COOH : 버퍼. </li><li> 버퍼 B : 60 % (V / V) CH 3 CN, 1 % 탈 이온수 (V / V) CH3COOH. </li></ol> 3. 피펫 팁 및 &#39;StageTip&#39;열 <ol><li> 콜로라도에있는 Empore - 음이온 막 6 층을 적층하여 SAX 팁 열 준비MMON 0.2 ML 피펫 팁. 샘플 당 두 SAX 팁 열을 확인합니다. </li><li> 0.2 ML 피펫 팁에 Empore-C (18)의 3 층을 적층하여 &#39;StageTip&#39;을 준비합니다. 각 샘플에 대한 6 단계의 팁을 확인합니다. </li></ol> 4. 미세 절제를위한 조직 조각의 준비 및 샘플 용해 <ol><li> 마이크로톰와 섹션 잘라 (슬라이스의 두께가 샘플에 따라 달라. 보통 미세 절제가 7 ~ 10 μm의 조각을 잘 작동합니다). </li><li> 45 분 동안 UV 빛으로 막 슬라이드 (MembraneSlide 1.0 PEN)을 조사. </li><li> 2 시간 동안 37 ° C에서 조사하는 막 슬라이드 및 건조에 섹션을 탑재합니다. </li><li> 2.5 분, 1.5 분 동안 크실렌에서 두 개의 연속 배양하여 장착 섹션을 Deparaffinize. 연속 배양에 무수 에탄올, 70 % 에탄올, 물, 1 분 동안 각각에 의해 섹션 재수. </li><li> 20 초 동안 메이어의 헤 마톡 실린과 섹션을 얼룩 1 분, 공기 건조 물로 헹군다. </li><li> 셀 populati 수집레이저 캡처 미세 절제 시스템을 사용하여 관심에. PALM 악기 (혈구)를 사용하는 경우 접착제 모자의 샘플 (접착 CAP 200)를 수집합니다. </li><li> 모자에 microdissected 자료에 TLB의 나누어지는 피펫. 튜브를 닫고 짧은 원심 분리하여 현탁액을 수집합니다. 를 Lyse 1 시간 동안 교반 (600 RPM)와 가열 블록에서 99 ° C에서 microdissected 조직. microdissected 조직의 10 NL에 대한 버퍼의 3 μl를 사용합니다. </li><li> 10 분 동안 18 ° C에서 16,000 XG에서 원심 분리하여 조 추출물을 명확히. 용해 액은 -20 ℃에서 냉동 저장 될 수있다 </li></ol> 5. 샘플 처리 <ol><li> 솔루션의 10 μL가 필터에 남아 때까지 200 한외 여과 단위 UA의 μL (법의학 30K) 14,000 XG에 원심 분리기로 명확히 용해 액 50 μL까지 섞는다. 보통이 단계는 10 ~ 15 분 원심 분리가 필요합니다. </li><li> 한외 여과 장치에 UA 200 μl를 피펫5.1에서와 같이 원심 분리기. 포집 관을 비 웁니다. </li><li> 피펫 50 IAA 솔루션의 μL와 5.1로 1 분간 원심 분리를위한 열 혼합기에서 600 rpm으로 혼합한다. </li><li> 5.1과 한외 여과 장치와 원심 분리기에 UA 100 μl를 피펫. 두 번이 단계를 반복합니다 </li><li> 5.1에서 한외 여과 장치와 원심 분리기에 대한 DB의 피펫 100 μL. 두 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 새 컬렉션 튜브에 여과 장치를 전송합니다. 피펫 40 μL의 엔도리스-C (1:100의 총 단백질 비율을 단백질 분해 효소)와 DB 및 1 분 동안 열 믹서에서 600 rpm으로 혼합한다. 18 시간 동안 37 ° C에서 젖은 실의 단위를 품어. </li><li> 같은 5.1로 14,000 XG에서 필터 유닛을 원심 분리기. </li><li> 5.1에서와 같이 탈 이온수와 원심 분리기 필터 유닛의 피펫 160 μL. 풀링 흐름을 통해 (5.7 및 5.8 단계) 엔도리스 C. 발표 한 펩티드를 포함 </li><li> 새 컬렉션 튜브에 한외 여과 장치를 전송합니다. 40 μl를 추가합니다트립신 (단백질 비율 1:100 효소)와 DB 및 1 분 동안 열 - 혼합기에서 600 rpm으로 혼합한다. 4 시간 동안 37 ° C에서 젖은 실의 단위를 품어. 반복 트립신 펩티드를 수집하기 위해 5.7 및 5.8 단계를 반복합니다. </li></ol> 6. 펩티드의 정량 <ol><li> 트립토판 잔기는 용매에 잘 접근하기 때문에 단백질 다이제스트의 펩티드 함량의 측정은 희석 완충액에서 수행 될 수있다. </li><li> 석영 큐벳에 ABB의 0.2 ML을 피펫과 &#39;빈&#39;의 발광 스펙트럼을 기록합니다. </li><li> ABB와 큐벳 부드러운 믹스에 TSS의 1 μL 씩 분주을 추가하여 0.1 μg 단계를 사용하여 검량선을 작성. </li><li> 큐벳을 청소합니다. </li><li> 샘플을 피펫 스펙트럼 (샘플)을 기록. </li><li> 단백질과 펩타이드 농도의 계산 0.1 μg 트립토판 B를 수득 단백질 혼합물의 트립토판 함량의 평균 1.1 %에 대하여 약 15 μg 단백질 (에 대응하는시기Y)는 인간의 세포를 용균의 단백질 함량은 다이제스트에서 샘플이나 펩티드 함량 같다 : <img alt="식 (1)" fo:content-width="2.787in" fo:src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1.jpg" /> F (표준 1)은 0.1 μg 트립토판 표준의 형광입니다. 펩티드 함량은 소화 과정의 수율을 계산할 수 있으며 펩티드 분획 및 질량 분광 분석을 위해 다음과 같은 중요한 정보를 제공한다. </li></ol> 7. 리스-C 및 트립 틱 펩티드의 분류 <ol><li> 각각 BRUB의 pH (11)의 pH 5의 0.2 ML로리스 - C와 트립신 digestions에 의해 얻어진 펩타이드 솔루션을 희석. </li><li> 원심 튜브 어댑터 뚜껑 SAX 팁 열을 조립합니다. </li><li> BRUB,리스 - C pepti의 분리 pH를 11 0.1 ㎖의 메탄올 0.1 ㎖로 연속적으로 1 M의 NaOH 0.1 ㎖, 3 번 SAX 팁 열을 씻고 평형데와 BRUB, 트립신 펩티드의 pH 5. 컬럼 재료를 통한 용액의 흐름은 4000 X g에서 원심 분리에 의해 용이하게된다. </li><li> 의리스 - 분리를위한 4; &#39;StageTips&#39;- 세척 및 C 18 평형 - 다음 이후로 &#39;StageTips&#39;, 메탄올 0.05 ㎖, 버퍼 B 0.05 mL를하고 버퍼 A. 0.05 ㎖의 여섯 C (18) 준비와를 C 펩타이드 및 트립신 펩티드의 분리를위한이. </li><li> &#39;StageTip&#39;- C (18)의 SAX 팁 열을 조립합니다. 평형 SAX 팁 - 열에 샘플 솔루션을로드하고 3 분 5,000 XG에서 열을 원심 분리기. </li><li> 0.1 각각 LYC-C에 BRUB ml의 pH를 11 또는 pH를 5 및 트립신 샘플 &#39;피펫 팁&#39;열 평형. 5,000 X g에서 원심 분리하여 흐름을 촉진. </li><li> 다음 C (18)에 SAX 팁 열 이동 - &#39;StageTip&#39;. </li><li> 리스 C 샘플과 BRU와 BRUB pH를 6, 4, 2 펩타이드의 용출 계속트립신 펩티드와 샘플 B의 pH를 2. &#39;StageTip&#39;- 각 용출 단계는 별도의 C (18)을 사용하십시오. </li><li> 버퍼 A. 0.05 ㎖로 &#39;StageTips&#39;- C (18)를 세척 </li><li> 질량 분석기로 조립 LC 시스템에 시료 주입 바이알에 직접 사용할 버퍼 B 0.05 ㎖의 분획을 용출. </li></ol>

<ol><li>Nagaraj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+proteome+and+transcriptome+mapping+of+a+human+cancer+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 548(2011).</li>
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</ol>

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핵산 시퀀싱 및 마이크로 어레이 기술과 비교 깊이 프로테오믹스 기술에 의해 FFPE 물질을 연구 할 수있는 능력은 바이오 마커 및 약물 표적의 발견에 새로운 관점을 엽니 다. 설명 프로토콜은 특성화 및 10,000 단백질의 규모에 microdissected 세포 인구의 프로테옴 정량 할 수 있습니다. microdissected 물질을 덜 사용하는 경우보다 작은 데이터 세트가 생성 될 수 있지만, 아마도, 대부분의 경우 이들 또한 귀중한 임상 데이터를 제공 할 수있다. 따라서, 하나의 샘플은 MED-FASP 절차 후에 직접 분석 할 수있다 이하 분획으로 분리 될 수있다. FASP 절차는 단백질 분해 효소의 유형과 호환되기 때문에, 다른 효소 또는 결합 단백질 digestions 6에서 사용할 수 있습니다. FFPE 소재의 품질은 분석에서 가장 중요한 문제가 될 것으로 보인다. 우리는 수정 같은 기원의 조직 만에서 오는이 다르다는 것을 경험ENT 클리닉 독특한 특성을 가지고 있었다. 다른 병원에서 유사한 물질이 거의 쓸모없는 반면, 우리는 높은 수율에 펩타이드를 생성 할 수 있었던 하나의 소스에서 조직을 사용. 그것은인가 고정 및 매립 절차뿐만 아니라 보관 조건은 임상 물질 (12)의 특성에 영향을 미치는 주요 요인임을 보인다. 따라서 더 큰 프로젝트를 시작하기 전에 몇 가지 샘플의 특성을 테스트하는 것이 좋습니다. 많은 출판물 과거 FFPE 소재의 사용을보고 하였다. 그러나, 이들 연구에서 확인 된 단백질의 개수 이상 1,000-2,000 단백질 4를 초과하지 않았다. 10,000 개 이상의 단백질을 포함하는 인간의 세포 특정 프로테옴의 크기를 고려할 때, 이러한 연구는 거의 하우스 키핑 기능에 관련된 매우 풍부한 단백질에 제한은 매우 피상적​​ 인 그림을 제공 할 만 할 수 있었다. 우리 프로토콜은 임상 또는 생물학적 재료 (F)의 효과적인 분리를 가능하게ROM은 조직을 보존하고 용해 단백질 처리 및 펩티드 예비 분별에 최적화되어있다. 결과적으로 우리의 샘플 준비 워크 플로우는, 하이 엔드 질량 분석에 결합 할 때, 거의 완전한 프로테옴에 대한 통찰력을 할 수 있습니다. 주목할만한,이 분 샘플 양을 요구 가능합니다. 보존 된 조직을 사용하는 주요 장점은 자신의 상대적인 폭 넓은 가용성이다. FFPE 샘플 몇 년 수십 년 동안 보관하고, 때로는 쓸모없는 것으로 간주, 지금, 프로테오믹스 기술 덕분에, 임상 연구 등의 가치가 높은 자료를 나타납니다. 많은 질병이 FFPE 소재의 신선 또는 냉동 자료 조사를하여 연구 할 수있는 반면 것은 드문 질환 (12)을 공부에 특히 중요 할 것 같다, 샘플의 대표 세트는 일반적으로 시간이 오래 걸립니다의 컬렉션이었다.

파라 포름 알데히드로 고정하고 파라핀 (FFPE)에 포함하면 보존 및 임상 조직 재료의 pathomorphologic 조사를 위해 표준 방법입니다. 보존 된 조직의 현미경은 질병과 관련된 형태 학적 변화의 식별 및 질병 관련 항원의 발생 감지 및 채점을 할 수 있습니다. FFPE 시료 전형적 일부만이 이러한 분석에서 사용되기 때문에, 임상 재료의 많은 양이 보관 유지 및 연구의 다른 유형에 이용 될 수있다. 최근 년 동안 생명 과학 분야의 연구는 강력한 프로테오믹스 기술에 의해 강화되었다. 이 기술은 수있는 복잡한 단백질 혼합물에있는 단백질의 수천의 식별 및 정량. 기술의 중요한 특징은 대규모 분석을위한 물질의 미량 만이 필요하다는 것이다. 최근 프로테오믹스 연구 단백질이 거의 샘플의 규모에 연구 될 수 있다는 입증LETE는 1, 2, 프로테옴. 조사의이 유형은 세포의 구성과 질병에 비정상적인 수준에서 발생하는 단백질의 그룹의 식별에 시스템 전체 통찰력을 가능하게한다. 이 연구는 큰 질량 분석 능력을 요구하는 반면, 최근의 작업은 식별 비슷한 정도 측정 3의 하나 일 이내에 달성 할 수 있다는 것을 보여 주었다. 상대적으로 낮은 샘플 양의 요구 사항 및 보존 임상 시료의 폭 넓은 가용성은 FFPE 소재의 프로테오믹스 탐구 (리뷰 4 참조) 활성화 방법을 개발하기 위해 우리와 다른 사람을 유혹. 우리는 고정 된 조직을 5에서 단백질의 정량 추출을 허용하는 프로토콜을 개발 한 열처리에서 포르말린 고정의 가역성을 활용. 우리는 고정 절차는 단백질뿐만 아니라, 적어도 일부의 번역 후 변형뿐만 아니라 유지하는 것으로 나타났습니다. Phosphorylation 및 N-글리코 실화 그러나 FFPE 샘플 5, 그것은 철저하게 통제 조직의 수집, 저장 및 고정 상태입니다을위한 전제 조건을 사용하여 공부하실 수 있습니다. 다음으로, 우리는 고정 된 조직의 레이저 캡처 미세 절제 및 단백체 원자로 기반의 샘플 처리 6, 7에 대한 방법을 최적화했다. 대장 암에 대한 대규모 연구는 임상 자료 8에서 microdissected에서 7,500 단백질의 정량 분석을 허용했다. 마지막으로, 우리는 연속 - 두 단계의 단백질 소화 프로토콜 9를 적용하여 microdissected 재료의 탐구의 방법을 개선했습니다. 하나의 효소를 사용하는 일반적인 소화 전략에 비해,이 절차는 더 시퀀스 고유 펩티드의 생성을 가능하게하고, 그 결과, 단백질 동정 높은 깊이 초래한다. microdissected 사람의 대장 선종의 분석은 샘플 3 당 9,500 단백질의 깊이 단백체 분석을 허용했다. 이 스터드우리는 적어도 2 펩티드와 88-89% 단백질을 식별 할 수 있도록 샘플 당 55,000 펩티드를 매핑 예. 여기에서 우리는 LC-MS/MS 분석을위한 FFPE 재료에서 시료 준비를 위해 최적화 된 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 반응기 형식 (FASP)에 대한 미세 절제 조직 조각의 제조, 절연 세포의 용해 및 시료 처리를 포함 6. 그 다음 우리는 펩타이드 수율의 spectrofluorometric 결정을 설명하는, 최적의 펩티드 식별을 위해 중요도가 높은 작업을 질량 분석기에 의해. 마지막으로, 우리는 강한 음이온 교환 (SAX) 기반의 펩티드 분획에 대한 분리 기술을 보여줍니다. 이 방법에서 펩티드의 분리 및 최종 정리 둘 피펫 팁 마이크로 컬럼 (10), (11)를 이용하여 수행된다. 이 단계는 선택적이지만 더 몇 마이크로 그램 이상의 펩티드가 단일 샘플로부터 획득 될 수있는 연구에 추천된다. SAX-분류는 실질적으로 답하라의 수와 동적 범위를 증가시킬 수있다명시된 내용 및 단백질 서열 범위 3, 10를 확장합니다.

<table><tbody><tr><td>MembraneSlide 1.0 PEN</td><td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td><td>415190-9041-000</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive Cap 200 opaque</td><td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td><td>415190-9181-000</td><td></td></tr><tr><td>Mayer's hematoxylin solution </td><td>Sigma-Aldrich St. Louis, MO</td><td>MHS32</td><td></td></tr><tr><td>Forensic 30k </td><td>Merck Millipore Darmstadt, Germany</td><td>MRCF0R030</td><td>(기존에는 Microcon YM-30으로 판매) </td></tr><tr><td>Empore 음이온</td><td>바이오 분석 기술 3M Company ST. Paul, MN</td><td>2252</td><td></td></tr><tr><td>Empore C18</td><td>바이오 분석 기술 3M Company ST. Paul, MN</td><td>2215</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin </td><td>Promega</td><td>2014-06-27</td><td></td></tr><tr><td>Endoproteinase Lys-C</td><td>Wako</td><td>129-02541</td><td></td></tr></tbody></table>

포르말린에서 프로테오믹스 샘플 준비 파라핀 조직에게 고정 및

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

보존 임상 물질은 인간의 질환의 프로테오믹스 연구를위한 유일한 소스입니다. 여기에서 우리는 포르말린의 대규모 정량 분석​​이 고정 파라핀 (FFPE) 조직 수 있도록 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 절차는 네 가지 단계를 포함한다. 첫번째는 FFPE 재료 및 그 세포의 미세 절제로부터 섹션들의 준비이다. 두 번째 단계에서는 절연 세포 용균 및 &#39;필터 주었 샘플 준비&#39;(FASP) 기법을 사용하여 처리된다. 이 단계에서, 단백질 시료의 용해에 사용되는 시약의 고갈 및 엔도의 lysC 및 트립신을 사용하여 두 단계로 분해된다. 각 소화 후에, 펩티드는 별도의 분획에 수집하고 자신의 콘텐츠는 매우 민감한 형광 측정을 사용하여 결정된다. 마지막으로, 펩타이드 &#39;피펫 팁&#39;마이크로 컬럼에 분획됩니다. 의 lysC-펩티드 반면 4 분획으로 분리하는 트립신 PEptides 2 분획으로 분리된다. 이러한 방식으로 제조 된 샘플은 10000 단백질의 깊이까지 재료의 분 양에서 프로테옴의 분석을 허용한다. 따라서, 설명 워크 플로우는 잠재적 인 바이오 마커 및 약물 표적의 식별뿐만 아니라 시스템 전체의 패션에 질병을 연구하는 강력한 기술이다.

FFPE 재료의 단백체 분석 샘플 준비를위한 강력하고 재현 할 방법이 필요합니다. 이 출판물에서 우리는 효율적인 고정 물질로부터 세포 집단의 단리 직접 LC-MS/MS 분석에 사용할 수있는 고순도의 펩티드 분획 결과 그들의 화학적 처리를 가능하게하는 프로토콜을 보여준다. FFPE 샘플 및 그것의 microdissection, MED FASP 접근 방식을 사용하여 단백질의 샘플 및 처리 (2) 용해하고, (3) 정량 및 (4) 분획의 섹션 (1)의 제조 : 절차는 네 가지 부분으로 구성 펩티드 (그림 1). 절차의 제 1 단계에서 FFPE 시료를 마이크로톰으로 단면 것으로 멤브레인 덮여 슬라이드에 장착. 조직 섹션 및 슬라이드 막의 표면 사이의 밀착성을 증가하는 것은 UV 광으로 슬라이드면을 조사 할 필요가있다. 이러한 목적을 위해 우리는 UV 램프의 광을 사용세포 배양 벤치에 통합. 이 단계 후 슬라이드는 샘플 파라핀과 재수의 제거를 허용 세척을 실시한다. 재수 화 물질을 단시간 hematoxilin 염색 하였다. 이는 샘플의 약한 얼룩을 초래하지만, 미세 절제를위한 샘플 영역의 시각화에 충분하다. 염색 공정은 과량의 물과 함께 슬라이드 린스하여 급속 정지되어야한다. 가난한 펩타이드 수율의 샘플 결과의 연장 염색. 다음 단계에서 건조 된 부분은 미세 절제을 실시한다. 개별 셀의 조직 영역의 선택은 조사의 유형에 따라 항상 조직학 또는 pathomorphology의 특정 지식이 필요합니다. 레이저 방출 된 물질은 시료 채취 관의 접착 표면 상에 수집된다. 접착 재료의 결합능이 한정되어 있기 때문에 그것은 t에 뚜껑으로부터 microdissected 재료를 전송하는 것이 필요하다샘플의 모든 3-5밀리미터 2의 절개 후 그는 관. 이것은 쉽게 뚜껑과 원심 분리기에서 튜브의 짧은 회전 상 조직을 용해 완충액 (LTB)의 몇 ㎕를 피펫 팅에 의해 수행 될 수있다. 샘플 튜브의 저부에 수집 된 후, 뚜껑의 microdissection 및 시료 수집이 계속 될 수있다. 전체 샘플을 수집되면 튜브 추가적으로 1 시간 동안 계속 교반하면서 약 99 ° C에서 파​​라 필름으로 마개를하고 수욕에서 배양해야한다. 배양 물 중 뚜껑에 응축되어 있기 때문에, 매 15 분 튜브는 곧 관 콘에 물을 다시 수집하기 위해 원심 분리해야합니다. 펩티드를 얻기 위해 조직 해물는 MED-FASP 방식을 사용하여 처리됩니다. 이 방법에서는 용해 단백질은 시스 테이 닐 잔기에서 carboamidomethylated 세제 및 다른 저 분자량 물질로부터 고갈 된 후 연속적으로 두 효소로 분해 DIF그들의 분열의 특이성에서 3.3101는 :의 lysC 트립신을 엔도. 각 소화 단계 후 펩티드는 별도의 분수에 수집됩니다. 샘플 준비의이 부분에서 초기에 멤브레인을 통과 여과 유닛에 로딩 용액의 95 % 이상이 될 때까지 원심 분리 각 단계를 계속하는 것이 중요하다. 대장 조직과 암을 분석 우리는 관찰이 절차 수익률 100 NL microdissected 자료 (표 1) (100 μg 조직 또는 10 ㎛ 부분의 10mm 2) 당 펩타이드의 3-6 μg. 조직으로부터 추출 가능한 총 단백질 추출 및 소화 절차 함께 일본어 신선한 조직에 관하여 30-60 % 수율 발생 조직의 중량의 약 10 %이기 때문이다. 이러한 값은 탈수 및 염색, 미세 절제하고, 한외 여과 장치에서 소화되지 않은 샘플의 부분의 보존 중에 단백질의 손실을 반영한다. 기 때문에 추출 및 처리N-microdissected FFPE 조직은 중요한 샘플 손실은 MED-FASP 이전 단계에서 발생할 가능성이 높습니다 75 % 할인, 5 단백질에 펩티드 전환 수율의 결과. 이 절차에 의해 얻어진 펩티드 혼합물의 중요한 특징은 상기 분별 펩티드 분획 공정 및 질량 분석 식별을 용이하게 높은 순도이다. 이것은 최근에 대장 선종 샘플 3의 분석에 의해 밝혀졌다. 그 연구에서 MS / MS 사건의 약 40 %가 FFPE 조직에서 펩티드의 식별을 주도하고 하나의 LC-MS/MS 실행 당 최대 17,000 펩티드의 매핑 결과. 높은 식별 요금은 동결 체외 배양 된 세포 3의 분석에 달성되었다. 전체 절차의 마지막 두 부분으로 고립 된 펩티드 정량화 및 피펫 팁 마이크로 컬럼에 대한 분별. microdissected 조직에서 분리 된 펩티드의 양이 될 수 있기 때문에낮은 10 μg 이들은 일반적으로 사용되는 염료 계 단백질 분석법을 이용하여 정량화 될 수 없다. 이러한 농도에서 280 UV 스펙트럼 측정에 의한 빛의 산란 효과에 유용하지 않다. 대조적으로, 트립토판 잔기의 형광의 측정은 펩티드 함량의 측정을위한 신뢰할 수있는 방법을 제안한다. 최근에 우리는 배양 된 세포에서 최대 5,000 단백질 &#39;단발&#39;4 시간의 LC-MS/MS 분석 7에서 식별 할 수있는 것으로 나타났습니다. 그러나 이러한 유형의 분석은 거의 3,000 개 이상의 천 단백질 식별 할 수없는 기본 조직에 적용됩니다. MED FASP에서 생성 된 펩타이드는 LC-MS/MS 전에 미리 분별해야 분석의 깊이가 증가합니다. SAX 기반 마이크로 컬럼 분리는 간단하고 효율적인 분별 방법 10. 이미 고정 된 조직을 5, 8, 9의 분석을 포함하여 여러 가지 단백체 연구에 적용되어왔다. SAX- &#39;피펫 팁&#39;microcoluMNS 및 C 18 - &#39;StageTip&#39;탈염 열 아홉 준비하기 쉽습니다. 열은, 플러그의 적층하여 조립 SAX에서 절단 또는 C (18) 막, 200 μL 피펫 팁 (11)에 있습니다. SAX-분획 FFPE 시료 분석의 예를 표 1에 나타낸다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50589/50589fig1.jpg" /> 그림 1. 절차 개요. FFPE 샘플 및 그것의 microdissection, MED FASP 접근 방식을 사용하여 단백질의 샘플 및 처리 (2) 용해하고, (3) 정량 및 (4) 분획의 섹션 (1)의 제조 : 절차는 네 가지 부분으로 구성 펩티드. <table border="1" class="jove_content_small" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.4in"> 견본 </td><td fo:width="1in"> 샘플 사전 분별 / 소화 </str사연&gt; </td><td fo:width="1in"> 사용되는 질량 분석기 </td><td fo:width="1.25in"> 펩타이드 수익률 NG / nL이 샘플 (SD ±) </td><td fo:width="1.25in"> 하나의 샘플 당 고유 한 단백질 동정 </td><td fo:width=".75in"> 참고 </td></tr><tr><td> • Adenonocarcinoma • 정상 대장 점막 </td><td> SAX / 하나의 효소 </td><td> Orbitrap-VELOS </td><td> 36 ± 11 (N = 8) 30 ± 8 (N = 8) </td><td> 5,985 ± 54 5,868 ± 110 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> • 대장 선종 </td><td> SAX / 두 효소 </td><td> Q Exactive </td><td> 56 ± 6.1 (N = 3) </td><td> 9,501 ± 28 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> 표 1. FFPE microdissected 조직의 단백체 분석의 대표 결과.

기록 포르말린 고정 및 (FFPE) 포함 된 파라핀은 임상 시료는 질병의 조사를 위해 가치있는 소재입니다. 여기에서 우리는 microdissected FFPE 조직의 깊이있는 단백체 분석을 허용하는 샘플 준비 워크 플로를 보여줍니다.

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

이 절차의 전반적인 목표는 프로테오믹스 분석을 위해 포르말린 고정 파라핀 매립(FFPE) 시료로부터 펩타이드를 생성하고 사전 분획하는 것입니다. 이는 미세절제술을 통해 원하는 조직을 분리한 후 세포 용해를 수행함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 시료 처리를 통해 펩타이드를 생성하는 것입니다.다중 효소 소화 필터 보조 시료 전처리를 사용합니다. 그 다음, 트립토판 형광을 측정하여 펩타이드를 정량합니다. 마지막 단계는 강음이온 교환 기반 분리 기술을 사용하여 펩타이드를 분획하는 것입니다.궁극적으로, 준비된 샘플을 통해 극소량의 물질로부터 최대 10,000개의 단백질 깊이까지 프로테옴 분석이 가능합니다. 겔 내 소화 또는 용액 내 소화와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 레이저 미세 절제 세포와 같은 극소량의 임상 샘플에 적용 가능하다는 점입니다. 이 방법은 완벽하고 순수한 펩타이드를 포함하는 샘플을 제공합니다.인체 조직 및 질병의 단백질체 탐색을 용이하게 하는 것은 무엇일까요? 전체 프로토콜은 과거에 개발되어 발표된 기술들로 구성되어 있습니다. 여기에는 높은 회수율의 fasp, 피펫 팁 기반의 처리, 그리고 tryptophan 형광을 이용한 펩타이드 함량 측정이 포함되며, 이 절차를 통해 분석 결과가 도출될 것입니다.우리 실험실의 기술자인 Catina가 안내합니다. 마이크로디섹션을 위한 조직 절편 준비를 시작하려면, 마이크로톰을 사용하여 섹션을 절단하십시오. 절편의 두께는 샘플에 따라 달라집니다. 일반적으로 마이크로디섹션은 7 to 10 µm 두께의 절편에서 잘 작동합니다.멤브레인 슬라이드를 UV 광선으로 45분 동안 조사한 후, 절편을 부착하고 37°C에서 2시간 동안 건조합니다. 자일렌이 담긴 연속된 병에 각각 2.5분과 1.5분 동안 두 번 연속으로 침전시켜 부착된 절편의 파라핀을 제거합니다. 그 후 연속적으로 절편을 재수화합니다.절편을 절대 에탄올, 70% 에탄올에서 각각 1분간 배양한 후, 마지막으로 증류수에 넣습니다. 그 후 Meyer's Hematin으로 절편을 20초 동안 염색합니다.물로 1분 동안 헹군 후 공기 중에서 건조시킵니다. 레이저 캡처 미세절제(laser capture microdissection) 시스템을 사용하여 분석 대상 세포군을 수집합니다. palm 장비를 사용할 때는 미세절제된 조직 10 nanoliters당 3 microliters의 조직 용해 버퍼를 사용하여 접착 캡에 샘플을 수집하십시오.캡에 담긴 미세 절제 물질에 완충액을 가하고 튜브를 닫습니다. 짧게 원심분리하여 현탁액을 수집합니다. 그런 다음, 교반 기능이 있는 히팅 블록을 사용하여 99 °C에서 한 시간 동안 미세 절제 조직을 용해합니다.16,000 Gs, 18 °C 조건에서 10분간 원심분리하여 조추출물을 정제합니다. 정제된 용해물 최대 50 µL를 초여과 장치 내의 UA 용액 200 µL와 혼합합니다. 그 후 필터에 용액이 10 µL 미만으로 남을 때까지 14,000 Gs에서 원심분리합니다.일반적으로 이 단계에서는 10분에서 15분 동안 원심분리가 필요합니다. 다음으로, UA 용액 200 µL를 초여과 장치에 피펫으로 분주하고 원심분리합니다. 이전과 마찬가지로, 수집 튜브를 비운 후 IAA 용액 50 µL를 초여과 장치에 피펫으로 분주합니다.실온의 thermo mixer에서 600 RPM으로 1분간 혼합한 후 원심분리합니다. 이전과 마찬가지로, 이 비디오에 포함된 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 초여과 및 원심분리 단계를 계속 진행합니다. 그런 다음 여과 장치를 새로운 수집 튜브로 옮깁니다.endo proteinase lic C가 포함된 소화 버퍼 40 µL를 취한 후, thermo mixer에서 600 RPM으로 1분간 혼합합니다. 이를 습윤 챔버 내 37 °C에서 18시간 동안 배양합니다. 이전과 동일하게 필터 유닛을 원심분리한 후, DB 버퍼 160 µL를 취하여 다시 원심분리합니다.풀링된 통과액의 필터 유닛에는 endo protease lic C에 의해 방출된 펩타이드가 포함되어 있습니다. 다음으로 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 트립틱 펩타이드를 수집하십시오. 트립토판 잔기가 용매에 잘 노출되어 있으므로, 단백질 소화물 내 펩타이드 함량 측정은 희석된 버퍼에서 수행할 수 있습니다. 펩타이드를 정량화하려면 먼저 0.2 milliliters의 assay buffer DB를 quartz Q vet에 피펫팅하십시오.그런 다음 Q vet을 기기의 qve 홀더에 장착하고 공시료(blank)의 방출 스펙트럼을 기록합니다. tryptophan 표준 용액 1 µL씩을 Q vet에 첨가하고 버퍼 db와 부드럽게 혼합하여 0.1 µg 단계로 검량선을 작성합니다. Q vet을 세척한 후, 샘플을 피펫으로 분주하여 샘플 스펙트럼을 기록합니다.분획 전, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질 및 펩타이드 농도를 계산하십시오. 일반적인 0.2 milliliter 피펫 팁에 EM.Import 이온 막을 6겹으로 쌓아 SAX 팁 컬럼을 준비하십시오. 샘플당 두 개의 SAX 팁 컬럼을 제작하십시오.다음으로, M 4 C 18을 세 층으로 쌓아 스테이지 팁을 준비합니다. 0.2 mL 피펫 팁을 사용하여 각 샘플당 6개의 스테이지 팁을 제작합니다. 시작하는 방법은 다음과 같습니다.분획 과정에서, ly C 소화로 얻은 펩타이드 용액을 0.2 milliliters의 Britton-Robinson 범용 완충액(pH 11)으로 희석합니다. 마찬가지로, trypsin 소화로 얻은 펩타이드 용액을 0.2 milliliters의 Britton-Robinson 범용 완충액(pH 5)으로 희석합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 SAX 팁 컬럼과 C 18 스테이지 팁을 세척 및 평형화하기 전, 원심분리 튜브 어댑터 덮개에 SAX 팁 컬럼을 장착합니다.다음으로, C 18 스테이지 팁에 SAX 팁 컬럼을 조립합니다. 평형화된 SAX 팁 컬럼에 시료 용액을 로딩하고 5,000 Gs에서 3분 동안 원심분리합니다. 피펫 팁 컬럼을 희석된 시료 0.1 milliliters로 세척합니다.5,000 Gs에서 원심분리를 하여 흐름을 촉진합니다. SAX 팁 컬럼을 다음 C 18 단계 팁으로 옮기고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 펩타이드 용출을 계속합니다. 0.05 milliliters의 buffer a로 C 18 단계 팁을 세척한 후, 0.05 milliliters의 buffer B를 사용하여 분획물을 바이알에 용출하며, 이는 나중에 질량 분석기가 결합된 액체 크로마토그래피 시스템에 샘플을 주입하는 데 사용됩니다. 단백질 추출 및 소화 결과가 여기에 표시되어 있습니다.10 µm 두께의 절편에서 25 mm²의 미세 절제 영역에 해당하는 250 nL의 조직을 용해하면 약 45 µg의 총 단백질을 얻을 수 있으며, endo protease slice C와 trypsin을 이용한 fasts 포맷의 2단계 연속 소화 결과 총 단백질의 50% 이상의 수율을 나타냅니다. 여기에는 펩타이드 함량의 대표적인 형광 측정 결과가 제시되어 있으며, Tryptophan 표준물질과 시료의 스펙트럼은 350 내지 360 nm에서 최대치를 보입니다. 형광 강도는 trytophan 함량에 비례합니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 미세 절단 기술, 시료 처리 및 펩타이드 분획법을 사용하여 프로테오믹스 분석을 위한 조직 시료를 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 단백질 소화에 필요한 시간을 제외하고 3~4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 조직 절편을 준비한 즉시 사용하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이 기술의 개발은 프로테오믹스 분야의 연구자들이 고정 및 파라핀 매립 재료를 사용하여 조직과 세포의 프로테옴 및 인간의 이상 징후를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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