포르말린에서 프로테오믹스 샘플 준비 파라핀 조직에게 고정 및

이 절차의 전반적인 목표는 단백질체학 분석을 위해 정형 및 고정식 및 파라핀 포매 또는 FFPE 물질에서 펩타이드를 생성하고 사전 분획하는 것입니다. 이것은 미세 해부에 의해 원하는 조직을 분리한 다음 세포 용해를 통해 수행됩니다. 두 번째 단계는 샘플 처리를 통해 펩타이드를 생성하는 것입니다.

다중 효소 분해 필터를 사용하여 시료 준비를 지원했습니다. 그런 다음 펩타이드는 트리토판 형광을 측정하여 정량화합니다. 마지막 단계는 펩타이드 분획을 위한 강력한 음이온 교환기 기반 분리 기술을 사용하여 펩타이드를 분획하는 것입니다.

궁극적으로, 준비된 샘플은 미세한 양의 물질에서 10, 000 단백질의 깊이까지 단백질체를 분석할 수 있습니다. 겔 또는 용액 분해와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 레이저 미세 해부 세포와 같은 미세한 양의 임상 샘플에 적용할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 완벽하고 순수한 펩타이드를 함유한 샘플을 제공합니다.

인체 조직과 질병에 대한 단백질체학 탐색을 촉진하는 것은 무엇입니까? 전체 프로토콜은 과거에 개발 및 발표된 기술로 구성됩니다. 여기에는 트립토판 형광을 기반으로 한 고회수율 fasp, 피펫 팁 및 펩타이드 함량 측정이 포함되며, 절차가

실험실의 기술자인 Mrs.Catina가 마이크로톰으로 미세 해부 절단 절편을 위한 조직 절편을 준비하기 시작할 것임을 보여줍니다. 슬라이스의 두께는 샘플에 따라 다릅니다. 일반적으로 현미해부는 7-10마이크로미터 조각으로 잘 작동합니다.

멤브레인 슬라이드에 자외선을 45분 동안 조사한 후 섭씨 37도에서 2시간 동안 건조하기 전에 섹션을 장착합니다. De 2 분 30 초와 1 분 30 초 동안 연속적인 자일렌 항아리에서 두 번의 연속적인 배양으로 장착 된 섹션을 분리하십시오. 그런 다음 연속적으로 섹션을 재수화합니다.

절대 에탄올, 70% 에탄올에서 1분 배양. 그리고 마지막으로 물입니다. Meyer's Hematin으로 섹션을 20초 동안 염색한 후.

1분 동안 물로 헹구고 자연 건조시킵니다. 레이저 캡처 현미해부 시스템을 사용하여 관심 세포 집단을 수집합니다. 손바닥 기구를 사용할 때 10나노리터의 현세해부 조직에 대해 3마이크로리터의 조직 용해 완충액을 사용하여 접착 캡의 샘플을 수집합니다.

캡의 미세 절개 물질에 완충액을 바르고 튜브를 닫습니다. 짧은 원심분리 후 현탁액을 수집합니다. 그런 다음 섭씨 99도의 가열 블록에서 미생물을 절개한 조직을 1시간 동안 교반하면서 이가 만듭니다.

10 분 동안 16, 000 Gs 및 18 섭씨 온도에 원심 분리에 의하여 조잡한 추출물을 명백하게 하십시오. 최대 50마이크로리터의 정화 용해물을 200마이크로리터의 UA 용액과 한외여과 장치에 혼합합니다. 그런 다음 용액이 10 마이크로 리터 미만이 필터에 남을 때까지 14, 000 GS에서 원심 분리기를 사용하십시오.

일반적으로 이 단계에서는 10-15분의 원심분리가 필요합니다. 다음으로, UA 용액 200마이크로리터를 한외여과 장치와 원심분리기에 피펫팅합니다. 이전과 마찬가지로 50마이크로리터의 I A A 용액을 한외여과 장치에 피펫팅하기 전에 수집 튜브를 비우십시오.

600RPM으로 실온의 온도 혼합기에 1분 동안 혼합하고 원심분리합니다. 이전과 마찬가지로 이 비디오와 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 한외 여과 및 원심분리 단계를 계속합니다. 그런 다음 여과 장치를 새 수집 튜브로 옮깁니다.

40마이크로리터의 소화 완충액을 엔도 단백질분해효소 lic C로 피펫팅한 후 600RPM으로 온도 혼합기에서 1분 동안 혼합합니다. 섭씨 37도의 습식 챔버에서 18시간 동안 장치를 배양합니다. 이전과 같이 필터 장치를 원심분리한 후 160마이크로리터의 DB 버퍼와 원심분리기를 피펫팅합니다.

풀링된 플로우 루(pooled flow through)에는 엔도 프로테아제 lic C.Next에 의해 방출된 펩타이드가 포함되어 있으며, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 삼부작 펩타이드를 수집합니다. 단백질 분해물의 펩타이드 함량 측정은 트립토판 잔기가 용매에 잘 접근할 수 있기 때문에 희석된 완충액에서 수행할 수 있습니다. 펩타이드를 정량화하기 위해 먼저 0.2ml의 분석 버퍼 DB를 quartz Q vet에 피펫팅합니다.

그런 다음 Q vet을 기기 qve 홀더에 넣고 블랭크의 방출 스펙트럼을 기록합니다. 트립토판 표준물질 용액의 1마이크로리터 부분 표본을 Q vet에 추가하고 완충액 db와 부드럽게 혼합하여 0.1마이크로그램 단계를 사용하여 검량선을 준비합니다. Q 수의사를 세척한 후 샘플을 피펫으로 주입하고 샘플 스펙트럼을 기록합니다.

분획 전에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질 및 펩타이드 농도를 계산하십시오. 6개의 EM 층을 쌓아 SAX 팁 컬럼을 준비합니다. 일반적인 0.2 밀리리터 피펫 팁에 이온 멤브레인을 반입하십시오. 샘플당 두 개의 SAX 팁 컬럼을 만듭니다.

다음으로 M 4 C 18을 3 층으로 쌓아 스테이지 팁을 준비합니다. 0.2ml 피펫 팁에서 각 샘플에 대해 6단계 팁을 만듭니다. 시작하자면.

분별은 ly C로 분해하여 얻은 펩타이드 용액을 0.2ml의 BRI 및 Robinson 범용 완충액으로 희석합니다. pH 11은 마찬가지로 트립신으로 분해하여 얻은 펩타이드 용액을 0.2ml의 Britain 및 Robinson Universal 완충액으로 희석합니다. pH 5는 세척하기 전에 원심관 어댑터 뚜껑에 SAX 팁 컬럼을 조립하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 SAX 팁 컬럼과 C 18 스테이지 팁을 평형

다음으로 SAX 팁 컬럼을 C 18 스테이지 팁에 조립합니다. 샘플 용액을 Equilibrated SAX 팁 컬럼에 로드하고 5, 000Gs에서 3분 동안 컬럼을 원심분리합니다. 피펫 팁 컬럼을 0.1ml의 희석된 샘플로 세척합니다.

5, 000 Gs.Transfer에 분리기에 의하여 교류를 다음 C 18 단계 끝에 SAX 끝 란을 촉진하고 원본 의정서에서 기술된 것과 같이 펩티드를 용리하는 것을 계속하십시오. C를 0.05ml의 완충액으로 세척한 후 18단계 팁을 0.05ml의 완충액 A로 분획을 바이알에 용리화한 후 나중에 질량 분석기 대표자와 함께 조립된 액체 크로마토그래피 시스템에 샘플을 주입하는 데 사용합니다. 단백질 추출 및 분해 결과는 다음과 같습니다.

10 마이크로미터 슬라이스에서 25제곱밀리미터의 미세 해부 영역에 해당하는 250 나노리터의 조직을 용해하면 엔도 프로테아제 슬라이스 C 및 트립신을 사용한 단식 형식의 2단계 연속 소화 후 약 45마이크로그램의 총 단백질이 생성되어 총 단백질의 50% 이상을 수율합니다. 여기에 표시된 것은 펩타이드 함량의 대표적인 형광 측정이며, Trytophan 표준물질의 스펙트럼 및 샘플은 350 - 360 나노미터에서 최대값을 보여줍니다. 형광의 강도는 트리토판 함량에 비례합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 현미해부 기법, 시료 처리 및 펩타이드 분획을 사용하여 단백질체 분석을 위해 고조직 시료를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기법을 숙달하면 3-4시간 내에 완료할 수 있으며 단백질 소화 불량에 필요한 시간을 더한 시간을 추가할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 개발 후 새로 준비된 조직 조각을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 단백질체학 분야의 연구자들이 고정 및 파렌 내장 물질에 대한 arval을 사용하여 조직과 세포의 단백질체와 인간의 이상을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.