Lignification 역학 클릭 화학 식물에서 시각화: 행복은 듀얼 라벨!

블 리스, lignification 역학 공부에 대 한 이중 라벨 프로토콜 개발 되었다. 합성 monolignol를 사용 하 여 기자와 SPAAC 및 CuAAC bioorthogonal의 순차적 결합 반응,이 방법론 포장 lignins에서 planta에의 속 규제 요인의 심층 분석 하는 방법 클릭 합니다.

이 이중 라벨링 방법론의 전반적인 목표는 식물 조직의 활발한 lignifying 영역을 관찰하는 것입니다. 이 워크플로우에서 화학 리포터 전략은 생체 직교 클릭 화학 반응의 순차적 조합에서 두 개의 별개의 화학 리포터를 사용하여 적용됩니다. 이 방법은 식물과 벽 내에서 리그닌의 공간적 또는 시간적 형성을 조절하는 요인을 결정하는 것과 같은 식물 생물학 분야의 핵심 질문을 해독하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 대사 혼입 중에 생성되는 리그닌을 독점적으로 표적으로 한다는 것입니다. 샘플에 이미 존재하는 리그닌과 구별됩니다. 원래는 리그니피케이션 플래그를 연구하기 위해 이 방법을 개발했지만, 애기장대, 포플러 또는 리그닌을 생산하는 다른 식물과 같은 다른 종에도 사용할 수 있습니다.

이 기술을 소개하기 위해 화학과 생물학 사이의 인터페이스를 연구하는 박사 과정 학생인 Clemence Simon이 이 기술을 사용하여 리그화 역학을 연구하고 있습니다. 먼저, 알킨 태그가 붙은 G 리포터 10 마이크로 뮬러를 함유 한 300 마이크로 리터 화학 리포터 용액을 준비합니다. 그리고 아지드 태그가 붙은 H 리포터와 액체 멸균 1/2 MS 배지의 10 마이크로 뮬러.

용액을 소용돌이치고 전사 피펫을 사용하여 48웰 플레이트의 한 웰로 옮깁니다. G의 마이크로뮬러 10개, H의 마이크로뮬러 10개와 액체 멸균 1/2MS 배지를 포함하는 300마이크로리터 네거티브 컨트롤 용액을 준비합니다. 용액을 소용돌이치고 동일한 48웰 플레이트의 두 번째 웰로 옮깁니다.

깨끗한 면도날을 사용하여 2개월 된 아마씨의 줄기를 토양 높이에서 10cm 높이로 자릅니다. 면도날을 사용하여 스템의 자유형 횡단 단면 50개를 부지런히 준비하고 즉시 1/2MS 배지에 넣습니다. 그런 다음 손상되지 않은 전체 단면을 선택하고 조직이 손상되지 않도록 주의하면서 화학 리포터 용액으로 채워진 우물에 10개를 무작위로 분배합니다.

단면은 단단하고 깨끗하게 절단되어야 하며 단면은 직선이어야 합니다. 조직을 온전하게 유지하기 위해 안정된 손과 날카로운 면도날이 필요합니다. 미리 연습하는 것이 좋습니다.

네거티브 컨트롤 용액에 10개의 손상되지 않은 단면을 분배한 후, 20시간 동안 섭씨 20도의 성장 챔버에서 플레이트를 연속적인 빛으로 배양합니다. 다음 날, 마이크로피펫으로 각 웰의 monolignal 용액을 제거합니다. 각 웰에 500마이크로리터의 1/2 MS 배지를 넣고 10분 동안 부드럽게 저어줍니다.

그런 다음 마이크로피펫으로 헹굼 용액을 제거합니다. 1ml의 균주 촉진 아지드-알카인 고리첨가 용액을 준비합니다. 시클로옥텐 태그가 지정된 형광 염료와 액체 멸균 1/2 MS 배지의 5 마이크로 뮬러를 함유합니다.

그런 다음 솔루션을 소용돌이치십시오. 대사 혼입 프로토콜의 최종 세척 단계 후 1/2 MS 배지를 제거하고 마이크로피펫으로 각 웰에 300마이크로리터의 SPAAC 용액을 추가합니다. 48웰 플레이트를 상자에 넣어 빛으로부터 보호합니다.

그런 다음 기계식 셰이커에 플레이트를 올려 상온의 어둠 속에서 1시간 동안 부드럽게 저어줍니다. 그런 다음 앞에서 설명한 대로 1/2 MS 매체로 각 웰을 4번 세척하고 플레이트를 어두운 곳에 유지합니다. 아스코르브산나트륨, 황산구리, 아지드 태그 형광 염료를 함유한 구리 촉매 아지드 알카인 고리첨가 용액 1ml와 액체 멸균 1/2MS 배지를 준비합니다.

그런 다음 솔루션을 소용돌이치십시오. 1/2 MS 매체를 제거한 후 플레이트를 상자에 넣고 마이크로피펫으로 각 웰에 300마이크로리터의 CuAAC 용액을 추가합니다. 기계식 셰이커에 접시를 올려 상온의 어둠 속에서 1시간 동안 부드럽게 저어줍니다.

기계식 셰이커에서 플레이트를 제거하고 마이크로피펫을 사용하여 각 웰에서 CuAAC 용액을 제거합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 1/2MS 매체를 넣고 어두운 곳에서 10분 동안 기계식 셰이커의 플레이트를 저어줍니다. 1/2MS 매체로 두 번 더 세척한 후 각 웰에 500마이크로리터의 7:3 메탄올과 수용액을 추가합니다.

어둠 속에서 한 시간 동안 기계식 셰이커에 접시를 저어줍니다. 그런 다음 우물에서 용액을 제거하십시오. 다음으로, 각 웰에 500마이크로리터의 1/2MS 배지를 넣고 어둠 속에서 10분 동안 저어줍니다.

이 세척을 네 번 반복한 후 단면을 빛으로부터 보호하여 1/2MS 매체에 보관하십시오. 유리 현미경 슬라이드에 장착 매체 5방울을 떨어뜨립니다. 그런 다음 슬라이드에 화학 리포터 태그가 지정된 각 단면을 조심스럽게 놓습니다.

슬라이드의 반대쪽 두 면에 매니큐어를 바릅니다. 슬라이드 커버를 커버 슬립으로 덮고 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 그런 다음 종이 타월을 사용하여 여분의 장착 매체를 제거합니다.

그런 다음 4면 모두에 매니큐어로 샘플을 밀봉합니다. 네일 바니시가 건조된 후 컨포칼 현미경으로 관찰할 때까지 슬라이드를 섭씨 4도의 어둠 속에서 보관하십시오. 식물 부분은 건조되면 바삭해지는 경향이 있습니다.

항상 용액에 보관하고 모든 면에 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하십시오. 장착된 슬라이드의 저장 수명을 늘립니다. 현미경 스테이지에 샘플 슬라이드를 대물 렌즈 아래에 놓습니다.

샘플을 관찰하고 회전시켜 식물 조직의 원하는 영역을 식별합니다. 다음으로, Z축에서 가장 형광등이 많은 평면을 선택합니다. 게인, 오프셋 및 레이저 출력을 조정하여 각 채널의 전체 그레이 레벨 범위를 따라 최적의 신호 분포를 달성합니다.

마지막으로 고품질 컨포칼 이미지를 획득합니다. BLISS는 식물 세포벽 내 리그닌의 세 가지 색상 국소화 맵을 제공하고, 대사 통합 중 novo에서 생성된 리그닌을 독점적으로 표적으로 삼고 샘플의 기존 리그닌과 구별합니다. 그것은 조직의 다른 세포 유형 또는 세포의 다른 벽 층 또는 하부 구조 내의 기관의 다른 조직 내의 활성 리그 화 부위를 강조합니다.

알킨 태그가 붙은 G 및 아지드 태그가 붙은 H 리포터 통합 프로파일은 형성층에서 아마 2차 물관부 내의 속까지 형성층에서 최대 리그니피케이션에 빠르게 도달하는 반면, 경주 세포는 생애의 훨씬 후반 단계에서 리그닌을 계속 통합한다는 것을 나타냅니다. 화학적 리포터 비율을 다양화하는 것은 2차 물관부 조직의 리그닌 조성이 세포벽 내의 단일리그 가용성에 직접적으로 의존한다는 것을 보여줍니다. 리그닌 중합 중 과산화효소 또는 락카제 특이성보다는.

화학 리포터 통합은 일부의 세포 모서리 및 중간 라멜라 1차 세포벽으로 제한되지만 전부는 아닙니다. 아마 뿌리에서, 화학 리포터는 카스패리안 밴드(casparian band)가 없는 내피 세포의 벽에 통합되어 있습니다. 조직 구조를 더 잘 시각화하기 위해 3D Z 스택 재구성도 생성할 수 있습니다.

이 시각적 개체에 따라 포괄적인 데이터 처리도 수행할 수 있습니다. 모든 예방 조치를 취하면 상대 비교를 통해 일정한 결과를 얻을 수 있으며 서로 다른 샘플 간의 샘플을 읽을 수 있습니다. 이는 다양한 영역의 적극적인 선도의 현지화 외에도 수행될 수 있습니다.

이 방법은 세포벽을 연구하는 저와 같은 식물 생물학자에게 훌륭한 도구입니다. 일단 마스터하면 몇 시간 안에 완료할 수 있습니다. 매우 민감하며 다양한 in vitro in vivo 실험 모델 시스템에 적용할 수 있습니다.

Chemical Reporter 전략을 리그닌에 적용하면 화학 생물학자가 리그니피케이션 역학을 탐구하고 여러 측면에서 여전히 미지의 영역을 구성하는 이 중합 과정을 제어하는 것이 무엇인지 알아낼 수 있는 길이 열렸습니다.