Name: Lignification 역학 클릭 화학 식물에서 시각화: 행복은 듀얼 라벨! (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 배우세요 생체정교 클릭 화학을 이용한 이중 라벨링 기법으로 식물 조직의 리그니피케이션 역학을 관찰하는 방법을. 이 기술은 대사적 통합 중 생성된 리그닌을 특이적으로 표적화하여 기존 리그닌과 구분하고, 다양한 식물 종에 적용 가능합니다.

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우리는 빚을 연구 연맹 FRABio를 TisBio 이미징 플랫폼 (대학교 릴, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et Fonctionnelle des Assemblages Biomoléculaires) 이것을 달성 하는 데 도움이 되는 기술 환경을 제공 하 작동 합니다.

참고: 액체와 고체 ½ MS 미디어 보충 표 1에 설명 된 대로 미리 준비 되어야 한다.
1. 공장 문화
<ol><li>
2 개월 된 아마 식물의 문화
	<ol>
<li>아마 (눔 usitatissimum L.) potting 퇴 비를 사용 하 여 플라스틱 화분에 씨앗을 뿌린.</li>
		<li>성장 photoperiod의 16 h/8h와 22 ° C에서 성장 챔버에 아마 주/야.</li>
		<li>1 개월 후 수직 지원으로 식물을 장비 하 고 2 개월 될 때까지 성장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2 주 된 아마 묘 문화
	<ol>
<li>치즈 헝겊 조각에서 12 아마 씨앗 포장 하 고 번들을 고무 밴드와 함께 해결. 참고: 다음 단계는 층 류 연기 후드 무 균 조건 하에서 실시 합니다.</li>
		<li>이전 압력가 250 mL 유리병에 종자 번들을 놓습니다.</li>
		<li>추가 70%의 70 mL EtOH 병 고 부드럽게 1 분 저 어.</li>
		<li>조심 스럽게 이동 하면서 병에 번들으로는 EtOH를 제거.</li>
		<li>2% 염소의 100 mL를 추가 하 고 10 분 동안 부드럽게 저 어.</li>
		<li>병에 번들을 떠나 있는 동안 이동에 의해 염소 솔루션을 제거 합니다.</li>
		<li>1.2.5-1.2.6 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>불 임 초순 물 100 mL를 추가 하 고 1 분 동안 저 어.</li>
		<li>반복 단계 1.2.8 헹 구는 시간을 각 린스 (5, 10 및 15 분)에 3 번.</li>
		<li>단단한 ½ MS 매체를 따뜻하게 하 고 2 cm의 높이까지 메 마른 식물 문화 상자에 부 어 응고까지 진정 하자.</li>
		<li>섬세 하 게 살 균 집게를 사용 하 여 단단한 매체에 각 씨앗을 놓습니다.</li>
		<li>무 균 상자를 닫습니다.</li>
		<li>Photoperiod의 16 h/8h와 22 ° C에서 성장 챔버에 상자를 전송 주/야 2 주 동안 아마 묘 종 성장.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 신진 대사 설립 화학 기자
참고: 아래 3 가지 실험 모델 제시: 줄기의 횡단면, ii) 전체 줄기 및 iii) 식물 묘 i) 대사 라벨. 각 프로토콜은 하나의 생물 복제에 대 한 제시 하 고 수량 필요한 생물 복제 수에 적응 시킬 수 있다. Monolignol 솔루션을 실험 하기 전에 표 2 에 설명 된 대로 재고 솔루션에서 준비 된다. 재고 솔루션-20 ° c.에 몇 개월을 저장할 수 있습니다. HAZ: G 또는 H:G 비율 모든 맞춤 실험적인 디자인에 맞게 조정 될 수 있다.
<ol><li>2 개월 된 아마 줄기 횡단면이으로 화학 기자 설립
	<ol>
<li>G가 10 µ M 및 10 µ M HAZ 의 액체 살 균 ½ MS 매체에서 300 µ L 화학 기자 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>소용돌이는 HAZ/G가 솔루션은 micropipette와 48-잘 접시의 한 우물을 전송.</li>
		<li>G 의 10 µ M와 액체 살 균 ½ MS 매체에서 H 의 10 µ M를 포함 하는 300 µ L 부정적인 제어 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>소용돌이는 H/G 솔루션 같은 48-잘 접시의 두 번째 음을 전송.</li>
		<li>새로운 면도날을 사용 하 여 토양 위 10 cm에서 2 개월 아마 식물의 줄기를 잘라.</li>
		<li>섬세 하 게 50 자유 횡단 횡단면 면도날 (약 150-250 µ m 두께)를 사용 하 여 줄기의 준비.</li>
		<li>바로 시계 유리에 액체 살 균 ½ MS 매체에서 횡단면을 놓습니다.</li>
		<li>육안으로 직접 검사 그대로 전체 횡단면을 선택 하 고 임의로 h AZ잘 채워진에 그들의 10를 배포 /G가 솔루션.</li>
		<li>반복 단계 2.1.8 잘 채워진된 h/G 솔루션 (부정적인 제어)로.</li>
		<li>3 잘 ½ MS 매체의 300 µ L (confocal 현미경 이미지의 연속적인 데이터 처리 중 형광 기준선을 조정 배경 제어)으로 가득 2.1.8 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>20 ° c에서 20 h에 대 한 성장 챔버에 연속 빛에서 접시를 품 어.</li>
		<li>각 잘은 micropipette에서 monolignol 솔루션을 제거 합니다.</li>
		<li>각 음을 ½ MS 매체의 500 µ L을 추가 하 고 10 분 동안 부드럽게 저 어는 micropipette 솔루션을 rinsing이 제거. 4 번을 반복 하 고 블 리스 즉시 라벨 (제 3) 진행.</li>
	</ol></li>
	<li>2 개월 된 아마 전체 줄기로 화학 기자 합동
	<ol>
<li>G가 10 µ M 및 10 µ M HAZ 의 액체 살 균 ½ MS 매체에서 포함 된 5 mL 화학 기자 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>소용돌이는 HAZG가 솔루션 및 전송 20 cm 높이 유리 테스트 하는 피 펫 튜브 /.</li>
		<li>G 의 10 µ M 및 10 µ M H 의 액체 살 균 ½ MS 매체에 포함 된 5 mL 부정적인 제어 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>소용돌이는 H/G 솔루션 및 전송 20 cm 높이 유리 테스트에 관.</li>
		<li>½ MS 매체의 5 mL (confocal 현미경 이미지의 연속적인 데이터 처리 중 형광 기준선을 조정 배경 제어)으로 포함 된 세 번째 유리 시험관을 준비 합니다.</li>
		<li>새로운 면도날을 사용 하 여 토양 위 10 cm에서 2 개월 아마 식물의 줄기를 잘라. 루트 시스템 및 줄기의 아래 부분을 버립니다 그리고 식물 줄기의 상단 부분으로 다음 단계를 수행 하십시오.</li>
		<li>HAZ포함 된 튜브에 전체 컷된 줄기의 기지를 담가 /G가 솔루션. 건조에서 그것을 방지 하기 위하여 루트 시스템의 제거 직후의 부 화 솔루션에 줄기를 놓습니다. 참고: 메서드가 적용 되 면 더 오래 된 젊은 식물 및 다른 종, monolignol 솔루션의 볼륨을 조정 해야 크기에 따라 나이 / 식물의 줄기의 직경의.</li>
		<li>그것을 똑 바른 유지 하기 수직 지원에 줄기를 연결 합니다.</li>
		<li>솔루션의 증발을 피하기 위해 parafilm으로 유리관을 봉인.</li>
		<li>H와 부정적인 컨트롤 샘플에 대 한 단계 2.2.6-2.2.9를 반복 /G 솔루션.</li>
		<li>½ MS 매체를 포함 하는 형광 배경 컨트롤 샘플 2.2.6-2.2.9 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>네온 빛을 사용 하 여 지속적인 빛에 20 h에 대 한 각 줄기를 품 어.</li>
		<li>후 대사 관 20 h, HAZ에서 incubated 줄기 제거 /G가 솔루션 ½ MS 매체와 그것을 씻어.</li>
		<li>잘라 1cm 면도날을 사용 하 여 줄기의 아래쪽 삭제 하 고 나머지 줄기의 기지에서 1 cm 높은 실린더 준비.</li>
		<li>신중 하 게 20 자유 가로 횡단면 (약 150-250 µ m 두께)이이 실린더에서 준비 하 고 ½ MS 매체는 시계 유리에 즉시 넣어.</li>
		<li>48-잘 접시의 한 잘에 ½ MS 매체의 500 µ L를 넣어.</li>
		<li>육안으로 직접 검사 고 그대로 전체 횡단면을 선택 하 고 임의로 배포에 ½ MS 솔루션으로 가득 잘 그들의 10.</li>
		<li>2.2.13-2.2.17 H/G 솔루션 incubated 부정적인 제어 줄기에 대 한 단계를 반복.</li>
		<li>½ MS 매체와 형광 배경 제어 줄기에 대 한 단계 2.2.13-2.2.17 incubated 반복.</li>
		<li>조심 스럽게는 micropipette 각 잘에서 솔루션을 제거 합니다.</li>
		<li>각 음을 ½ MS 매체의 500 µ L을 추가 하 고 10 분 동안 부드럽게 저 어는 micropipette 솔루션을 rinsing이 제거. 4 번을 반복 하 고 블 리스 즉시 라벨 (제 3) 진행.</li>
	</ol></li>
	<li>2 주 된 아마 모 종으로 화학 기자 설립 참고: 다음 단계는 모두 수행 무 균 조건 하에서.<ol>
<li>G가 10 µ M 및 10 µ M HAZ 의 액체 살 균 ½ MS 매체에서 포함 된 2 mL 화학 기자 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>소용돌이는 HAZG가 솔루션 및 전송 20 cm 높은 유리 테스트 하는 피 펫 튜브 /.</li>
		<li>G 의 10 µ M 및 액체 살 균 ½ MS 매체에서 H 의 10 µ M 2 mL 부정적인 제어 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>소용돌이는 H/G 솔루션 및 전송 20 cm 높은 유리 테스트에 관.</li>
		<li>½ MS 매체의 2 mL (confocal 현미경 이미지의 연속적인 데이터 처리 중 형광 기준선을 조정 배경 제어)으로 포함 된 세 번째 20 cm 높이 유리 시험관을 준비 합니다.</li>
		<li>긴 핀셋의 쌍을 사용 하 여 고체 ½ MS 매체에서 2 주 된 아마 경종을 섬세 하 게 제거 (섹션 1.2.의 위).</li>
		<li>부드럽게 HAZ포함 된 튜브에는 종묘를 전송 /G가 솔루션, 뿌리가 솔루션에 몰입 하는 보장.</li>
		<li>유리 튜브 증발을 피하기 위해 플라스틱 캡을 닫습니다.</li>
		<li>H와 부정적인 제어 튜브에 대 한 단계 2.3.6-2.3.8를 반복 / G 솔루션.</li>
		<li>½ MS 매체를 포함 하는 형광 배경 제어 튜브에 대 한 2.3.6-2.3.8 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>각 모 종 20 ° c.에 20 h에 대 한 성장 챔버에 지속적인 빛에서을 품 어</li>
		<li>섬세 하 게 HAZ에서 incubated 경종 제거 /G가 솔루션 ½ MS 매체와 그것을 씻어.</li>
		<li>섬세 하 게 20 자유 횡단면 (approximatively 150-250 µ m 두께)는 hypocotyl의 준비.</li>
		<li>48-잘 접시의 한 잘에 ½ MS 매체의 500 µ L를 넣어.</li>
		<li>육안으로 직접 검사 고 그대로 전체 횡단면을 선택 하 고 임의로 배포에 ½ MS 솔루션으로 가득 잘 그들의 10.</li>
		<li>2.3.12-2.3.15 H/G 솔루션 incubated 부정적인 제어 경종에 대 한 단계를 반복.</li>
		<li>½ MS 매체와 형광 배경 제어 경종에 대 한 단계 2.3.12-2.3.15 incubated 반복.</li>
		<li>조심 스럽게는 micropipette 각 잘에서 솔루션을 제거 합니다.</li>
		<li>각 음을 ½ MS 매체의 500 µ L을 추가 하 고 10 분 동안 부드럽게 저 어는 micropipette 솔루션을 rinsing이 제거. 4 번을 반복 하 고 블 리스 즉시 라벨 (제 3) 진행.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 듀얼 형광 라벨 SPAAC와 CuAAC에 의해 식물 횡단면 샘플의
참고: 프로토콜 라벨 블 리스는 모든 3 실험 모델 (제 2) 동일 합니다.
<ol><li>
아 지 드 Alkyne Cycloaddition (SPAAC) 라벨 스트레인 승진
	<ol>
<li>1 mL DBCO 말뚝4-5의 5 µ M를 포함 하는 SPAAC 솔루션의 준비/6-carboxyrhodamine 110 액체 살 균 ½ MS 매체에서. 소용돌이 솔루션 고 어둠 속에서 그것을 유지.</li>
		<li>최종 세척 후 [2.1.13, 2.2.21 또는 선택한 실험적인 디자인에 따라 2.3.19] 변화 법인 프로토콜의 단계 ½ MS 매체를 제거 하 고는 micropipette 잘 당 SPAAC 솔루션의 300 µ L을 추가.</li>
		<li>알루미늄 호 일로 덮 음 또는 상자에 그것을 배치 하 여 빛 으로부터 48-잘 접시를 방패.</li>
		<li>부드럽게 주위 온도에 어둠 속에서 1 시간에 대 한 기계적 통에 접시를 저 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
아 지 드 Alkyne Cycloaddition (CuAAC) 라벨 구리 촉매
	<ol>
<li>어둠 속에서 접시를 유지 하면서도 4 번에 설명 된 대로 단계 2.1.13 각을 씻어.</li>
		<li>CuAAC 솔루션 포함 된 나트륨 하는데 2.5 m m, 0.5 m m CuSO4 및 5-TAMRA-말뚝35 µ M의 1 mL를 준비-액체 살 균 ½ MS 매체에 아 지 드. 소용돌이 솔루션 고 어둠 속에서 그것을 유지. 참고:이 CuAAC 솔루션 갓 사용 하기 전에 준비 되어야 한다 고 4 ° c.에 몇 일을 저장할 수 없습니다.</li>
		<li>각 잘에서 ½ MS 매체를 제거 하 고 잘 사용 하는 micropipette 당 CuAAC 솔루션의 300 µ L를 직접 추가.</li>
		<li>부드럽게 주위 온도에 어둠 속에서 1 시간에 대 한 기계적 통에 접시를 저 어.</li>
		<li>micropipette를 사용 하 여 CuAAC 솔루션을 제거 합니다.</li>
		<li>micropipette를 사용 하 여 ½ MS의 500 µ L을 추가, 10 분 동안 어둠 속에서 저 어 다음이 세척 솔루션을 제거 합니다. 두 번 반복 합니다.</li>
		<li>7:3 MeOH/물 솔루션의 500 µ L을 추가, 1 시간에 대 한 어둠 속에서 저 어 다음 솔루션 제거 주의: 메탄올은 피부 접촉 또는 흡입, 독성 그리고 인간 발암 물질로 지정. 그것의 사용에는 화학 증기 두건 장갑 필요합니다.</li>
		<li>½ MS의 500 µ L을 추가, 10 분 동안 어둠 속에서 저 어 다음 솔루션을 제거 합니다. 4 회 반복 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 장착 현미경에 샘플의 슬라이드
<ol><li>장소 5 방울 유리 현미경 슬라이드에 장착 매체의.</li>
	<li>신중 하 게 각 HAZ입금/G가슬라이드에 횡단면을 태그.</li>
	<li>슬라이드의 2 개의 반대 측에 폴란드어를 적용 합니다.</li>
	<li>커버는 coverslip로 슬라이드. 공기 방울을 피하기 위해 주의 해야 합니다.</li>
	<li>종이 타월을 사용 하 여 초과 설치 매체를 제거 합니다.</li>
	<li>4 면 모두에 매니큐어와 샘플을 봉인. 실내 온도 (대략 30 분)에서 건조 래커 못 하자.</li>
	<li>부정적인 제어 H/G 횡단면 4.1 4.6 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>형광 배경 제어 횡단면 4.1 4.6 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>Confocal 현미경 관찰까지 어둠 속에서 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다. 참고: 준비 슬라이드 준비의 품질에 따라 몇 개월에 몇 주 동안 저장할 수 있습니다. 새로운 관찰 하는 경우 저장 후 만들 수, 샘플 건조 하지가 확인 합니다.</li>
</ol>5. 이미지 수집 형광 Confocal 현미경 검사 법에 의해
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 올바른 순서로 confocal 현미경 시스템의 모든 필요한 단위 설정.</li>
	<li>최대한 숫자 조리개와 함께 원하는 목표를 선택 하 고 여기 및 방출 파장 적응 (예: obj와 같습니다. 60 x, N.A. 1.2. Autofluorescence 채널: λ전 405 nm, λem 450 nm /25; SPAAC HAZ 채널: λ전 488 nm, λem 525 nm /25; CuAAC G가 채널: nm전 561 λ, λem 595 nm /25; 연속 모드)입니다.</li>
	<li>소프트웨어 (12 또는 16-비트, Nyquist 조건에 적응 하는 픽셀 크기)에서 이미지의 생성에 대 한 원하는 매개 변수를 선택 합니다.</li>
	<li>현미경 단계에 HAZ/G가 슬라이드를 놓고 목표 렌즈 아래 샘플 위치 합니다.</li>
	<li>관찰 하 고 식물 조직의 원하는 영역.</li>
	<li>
고품질 이중 레이블이 HAZ/G의 공초점 이미지가 샘플.
	<ol>
<li>Z 축에서 형광 비행기를 선택 합니다.</li>
		<li>조정 하는 이득, 오프셋 및 레이저 전원 각 채널 (autofluorescence, HAZ 와 G가)에 대 한 전체 회색 레벨 범위에 따라 최적의 신호 분배를 달성 하기 위해. 모든 다음 인수에 대 한 동일한 매개 변수를 적용 합니다.</li>
		<li>선택한 이미지의 수집을 시작 하 고 파일을 저장 합니다. 샘플의 각 관련 영역에 대 한 반복 합니다. 참고: 필요한 경우 3D Z 스택 복원 또한 취득 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>동일한 설정을 사용 하 여, 태그 샘플만 autofluorescence 레벨 (2 절에 설명 된 대로 배경 컨트롤 형광)을 ½ MS에서 incubated의 이미지를 취득 합니다.</li>
	<li>동일한 설정을 사용 하 여, 이미지 네이티브 monolignols 일반적인 fluorophore 접착 샘플을 확인 하려면 H/G 와 incubated 부정적인 컨트롤 샘플에 대 한 취득.</li>
	<li>H/G 부정적인 제어 이미지와 HAZ/G가 이미지에 빼기 배경 autofluorescence 신호 획득 이미지 데이터 처리를 적용.</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

앞서 언급 했 듯이,이 문서에 소개 된 듀얼 라벨 블 리스 프로토콜2312, vivo에서SPAAC/CuAAC 결합의 첫 번째 예제 중 하나입니다. 각 단계는 철저 하 게 최적화 및 검증, 그리고 그것은 매우 중요 한 있는 두 클릭 화학 라벨 반응을 순차적으로 수행 하는 순서는 존경 (즉, SPAAC 먼저, 다음에 CuAAC). 모든 크로스-컨트롤 보였다 라벨 각 단계는 특정 때 블 리스 프로토콜 적용된23 : 높은 chemoselective를 처음 리드 SPAAC 단계 수행 HAZ 아 지 드 함수의 라벨은 빠른 속도와 [3 + 2] cycloaddition 반응을 통해 cyclooctyne 기능성된 fluorophore. HAZ 단위 태그는, 일단 아 지 드 fluor 545 프로브 triazole 링크 반응에 의해 생성 하 G가 터미널 alkynes의 copper(I) 촉매 활성화를 필요로 하는 CuAAC 단계 실행 될 수 있습니다. 반면, 역순 (즉, CuAAC 먼저, 다음 SPAAC)가 G HAZ 단위 리드 사용할 수 없습니다 fluorophore 결 찰과 경쟁 하 고 신호의 극적인 손실 유도 크로스 커플링 . 그것은 또한 일반적인 얼룩 피하기 위해 중간 세척 단계의 필요성을 강조 하는 것이 중요입니다.
우리는 우리의 방법은 다양 한 생물학적 실험 디자인을 적용할 수 있습니다 나타났습니다. 블 리스 프로토콜 라벨 먼저 잘라 이전 되었고 클릭 준비 monolignols와 함께 알을 품는 아마 줄기 (약 150-250 µ m 두께)의 자유형 횡단면에 적용 되었습니다. 하지만이 디자인 (외피 볼륨 감소 된다)로 화학 기자의 필요한 수량을 최소화 및 통계 복제의 생산을 촉진의 이점이 있다, 그것은, 엄밀히 말하면, vivo에서 시스템 일부에 경우, 팬 들은 진짜 spatio 시간적 lignification 역학의 모든 측면의 정보를 반영 하지 않을 수 있습니다. 두 번째 실험 설계에서 우리는 따라서 블 리스 프로토콜 이전 소나무와 은행나무27방사선된 monolignols의 연구에 사용 된 방법에 적응. 이 방법에서는, 뿌리와 식물의 줄기는 물리적으로 분리 하 고 전체 줄기의 기지에서 무슨 '꽃병' 접근을 불리 수 있습니다 monolignol 솔루션에 알을 품. 떠난 후 줄기 원하는 (보육) 시간, 횡단면 컷 하 고 수행 하는 블 리스 프로토콜 있습니다. 이 지역화 패턴은 기본적으로 동일 (ii) (i) 수정 된 monolignols 생활 줄기를 통해 수송을 성장 하는 세포 벽 내의 리그 닌 고분자에 통합 표시 허용 접근입니다. 실험의이 유형은 실제 생활 공장에서 수행 되 고의 장점을 / 라이브 셀 더 이상 실험 하 고 더 깊이 있는 연구, 허용 접근 화학 기자의 큰 수량을 요구 한다. 마지막으로, 블 리스 프로토콜도 아마 식물 묘 목, 공장 모델 화학 기자 줄기를 이송 되 고 전에 뿌리를 통해 흡수 되어야 합니다는 살아있는 진짜 대표와 함께 사용 되었다. 이 모델은 실제로, 식물에 수행 되 고의 명확한 이점이 그것 젊은 묘 종에 제한 되며 (긴 보육 시간, 높은 실용적인 이유로 이전 식물 lignification 역학 조사에 정말 적합 하지 않습니다. 화학 기자 양)입니다. 그럼에도 불구 하 고,이 세 가지 실험 디자인은 보완 그리고 모든 실용적인 측면과 답변 생물학 질문의 유형에 따라 생물 학적 의미에 관하여 그들의 장단점 있다.
아마 lignification 역학 연구 개발, 우리의 프로토콜은 높은 적응력, 생물학 실험 디자인의 관점에서 뿐만 아니라 다른 응용 프로그램의 관점에서 식물 종 및 장기/조직. 예를 들어, 블 리스는 애기 또는 다양 한 유전자에 대 한 노크 아웃 또는 노크 다운 뮤턴트와 연구에 더 많은 의무가 있다 Populus 속에 쉽게 전송할 수 있습니다. 원칙적으로, 우리의 접근 방식으로 듀얼 라벨 연구 확장할 수 있습니다 또한 다른 생체에 식물 세포 벽 고분자-모든 세 가지 주요 monolignols 또는 그들의 신진 대사 선구자 뿐만 아니라 다양 한를 포함 하 여 두 가지 수정된 선구자를 사용 하 여 다 당 류 매트릭스를 구성 하는 단 처음 소개 된 이래, bioorthogonal 화학 실제로 주로 개발 되었습니다 통해 대사 처리한후 엔지니어링 (모에)4,5,17,28, glycans/류를 조사 하 하지만 놀랍게도 되었습니다만 거의 응용 생물학 공장 까지는7,8,9,10,,1112. 반응의 호환성 측면에서 리그 닌의 연구 실제로 두 화학 기자는 같은 reticulated 폴리머에 통합으로 해결 하기 위해 복잡 한 사건 이었다. 레이블이 없는 HAZ-의 가능성G가 상호 형성이 했다 G가 와 3D 내 HAZ 단위 공간 근접 때문에 극복 하기 위해 주요 문제 리그 닌23, 않을 수 있습니다 두 명의 화학 기자 포함 되지 않은 경우 동일한 유형의 biopolymer 나 어떤 주어진된 셀의 동일한 공간 영역 제한 구조.
넓은 범위에서 블 리스 방법론 본질적으로 두 가지 화학 기자는 아 지 드와 터미널 alkyne 태그를 각각 베어링을 사용 하 여 세균 이나 동물 모델에서 어떤 두 색 형광 이미징 연구에 적용 될 수 있습니다.

지난 2 년간 화학 기자 전략 역학과 비 유전자 인코딩된 생체의 기능을 조사 하기 위해 강력한 2 단계 방법론으로 떠오르고 있다. 1 , 2 , 3 이 전략에서- 화학 기자 -작은 변조에 대 한 관심의 biomolecule의 합성 아날로그는 먼저 대사 살아있는 유기 체 그리고 화학 조사에 의해 (예., fluorophore 형광에 대 한 confocal 현미경 검사 법 영상) covalently bioorthogonal 클릭 화학을 통해 통합된 기자에 연결 됩니다. 조사 신속 하 고 구체적으로 반응 해야 합니다 생활 시스템에 어떤 생체 불활성 하면서 소개 화학 수정. 많은 방법에서는,이 방법은 그로 인하여 대사 산물 또는 이전 접근 되지 않은 biomacromolecules를 추적 하기 위해 기회를 제공 하는 매우 구체적인 클릭 화학 ligations 사용을 통해 일반적인 bioconjugation 기술의 한계 극복 생활에서 시스템4,,56.
세균 및 동물 세포에이 강력한 방법의 빠른 성장 인기에도 불구 하 고 식물 생물학에 있는 그것의 사용을 설명 하는 보고서는 의외로 몇과7,,89,10, 사이 11,12. 우리는 식물의 리그 닌, 지구상에서 가장 널리 퍼진 biopolymers 중 고 lignocellulosic 바이오 매스의 주요 구성 요소 형성 연구에이 전략을 적용 하는 데 특히 관심이 있었다. 13 , 14 리그 닌 구조와 보호 역할을 하는 개발 및 더 높은 식물의 생활에는 페 놀 폴리머입니다.
그것은 일반적으로 3 4 hydroxyphenylpropanoid moieties 구성 되어있습니다: H (p-hydroxyphenyl), G (guaiacyl)와 S (syringyl) 단위 각각 3에서 파생 된 'monolignols' (p-coumaryl, coniferyl 및 sinapyl 알콜)는 (그림 1) 세포의 세포질에서 phenylpropanoid 통로 통해 합성. 세포 벽에 수출 되 고, 후 monolignols 산화는 peroxidases 또는 laccases 후 그들은 리그 닌 고분자에 유해를 순전히 화학 급진적인 커플링 반응의 받을 래 디 칼, 하는 프로세스 라고 lignification. 15 , 16 비록 lignins 강하게 영향을 많은 식물 유래의 산업용 어 제품, 과학계 아직도 있다 lignification를 규제 하는 복잡 한 메커니즘을 해독 갈 길이.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig1.jpg"> 그림 1: 식물 세포에서 lignification 과정. Monolignols는 cytosol에서 페닐알라닌에서 biosynthesized 있습니다. 세포 벽에 수출 되 고, 후 monolignols 산화는 peroxidases 또는 laccases 후 그들은 리그 닌 고분자에 유해를 순전히 화학 급진적인 커플링 반응의 받을 래 디 칼, 하는 프로세스 라고 lignification. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
Glycan 분석 bioorthogonal 반응의 사용에 대 한 보고서는 수많은,2,,317 생체의 다른 종류를 그들의 응용 프로그램 예제는 적은. 리그 닌 bioimaging 목적 bioorthogonal 화학을 사용 하 여 Tobimatsu 그 외 여러분 에 의해 최근에 개척 했다 8 애기 thaliana 알코올 대리 모 알선 리그 닌 고분자 그것은 G 단위, 따라서 개념의 증거를 보여주는8,9 를 형성 하는 어디에 coniferyl의 설립에 대 한 정보를 제공 하는 화학 기자 전략은 이런이 맥락에서 적용 됩니다. CuAAC의 사용은 또한 그림 사용 하 여 다른 coniferyl 알코올 파생 몇 달 나중 Bukowski 외. 그러나 9 , 리그 닌 또한 포함 H와 S 단위 및 lignification 과정의 깊은 이해는 monolignols의 모든 고분자에 통합 하는 방법에 대 한 더 많은 지식이 필요 하 고 어떤 요인 그것의 구성을 제어할 수 있습니다. 현재이 분야에서 새로운 발전은 생활 시스템에서 동시에 여러 화학 기자를 추적 하기 위해 효율적인 방법론의 개발에 따라 달라 집니다. Glycans에 대 한 몇 가지 기사는 최근 몇 년 동안18,19,에 기초를 마련 하더라도20,,2122, 듀얼 접근 라벨 주요 과제 남아 bioorthogonal 화학입니다. 재현할 수 단일 레이블 클릭 프로토콜 개발 어렵다, 다음 듀얼 라벨 접근 상호 2의 연동에 최적화를 필요로 하는 경우 두 명의 별도 화학 기자에 호환 bioorthogonal 반응을 더욱 있습니다. 이 측면을 개척 하는 몇 가지 예 동물 세포에서 glycans 연구 스트레인 승진 아 지 드 alkyne cycloaddition (SPAAC)과 알 켄-tetrazine 역 전자 수요 Diels 오리 나무 (다inv) 반응의 조합 사용. 그러나, 우리는 DAinv 반응의 bioorthogonality (전자-가난한 반응 수 전자 풍부한 대체 cinnamyl 형 단위체를 이루어져 있는 리그 닌의 구조 기능 때문에이 응용 프로그램에서 보장 되지 않을 수 있습니다 생각 DAinv 반응에 사용 되는 tetrazine 프로브 등 dienes)이 아닌 특정 라벨 생성 될 수 있습니다. 다inv 반응 합성으로 액세스로 부피가 고 질 성 그로 인하여 가능성을 제기 하기 어려운 화학 처리를 요구 하는 또한, 그 법인, 전송 그리고/또한 화학 제품의 지역화의 속도 vivo에서 기자 수 있습니다 영향을 받을. 후자의 측면은 lignification을 공부에 대 한 클릭 화학 접근의 경우 특히 관련 된 것으로 간주, 우리는 다른 방향으로 선택 하 고는 Bioorthogonal 결 찰 이미징 순차적 전략 (행복)을 사용 하 여 개발 된 Strain-Promoted 아 지 드 Alkyne Cycloaddition (SPAAC)와 구리 Catalysed 아 지 드 Alkyne Cycloaddition (CuAAC)의 조합 vivo에서. 23
이 두 반응은 있으며 실제로 두 가지 주요 bioorthogonal 클릭 날짜, 사용 된 반응 특히에서 리그 닌의 몇 가지 예는 이미징 최근에 간행 되었다. 8 , 9 우리의 듀얼 라벨 전략 i) 생물학으로 관련 구조 쪽으로 unreactive, ii) 매우 작은 크기 (그림 2 에 두 개의 화학 처리 한 monolignol 기자에 아 지 드 moiety 및 다른 터미널 alkyne 사용할을 수 있습니다. ). 결과적으로, 이러한 합성 수정 연구 biomolecule의 물리 화학적 특성에 미치는 영향 최소화 호텔측 교통 측면에서 부 자연스럽 고 자연 monolignol 기판 사이 감소 및 metabolization 신진 대사 설립 단계 속도입니다. 비록 SPAAC와 CuAAC의 조합 처음 보면 매우 직관적인 것, 그것은 우리의 지식 구조 glycans 이외에이 전략 및 첫 번째 응용 프로그램을 사용 하 여 이중 표시에만 두 번째 예. 12 , 23
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig2.jpg"> 그림 2: 블 리스 듀얼 전략 라벨. 화학 기자 HAZ 와 G 기본 H와 G monolignols의 태그 아날로그는. 그들은 먼저 세 먹이 (1 단계)에 의해 세포 벽의 성장 리그 닌 고분자에 통합 됩니다. Cyclooctyne-와 아 지 드-기능성 형광 프로브는 다음 순차적으로 출혈 통합된 기자에 의해 bioorthogonal 화학 클릭: SPAAC 반응 (단계 2) HAZ 단위의 매우 구체적이 고 뒤에 CuAAC 반응 ( 3 단계) 그는 G 단위 (3 단계)의 특정 되므로 하지 두 기자 들의 특정 지역화 독립적으로 동일한 견본에서. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
우리는 첫째로 설계 하 고 유효성을 아 지 드 태그 monolignol 기자 HAZ ( p-coumaryl 알코올의 대리) 및 리그 닌 H 단위의 선구자 다음 그것 함께에서 사용 되는 블 리스 듀얼 레이블 전략 고안에 이전 보고 alkyne 태그 G,9 (coniferyl 알코올의 대리) 및 리그 닌 G 단위의 선구자. 이 재현 프로토콜을 개발 하 고 아마에서 테스트, 경제적으로 중요 한 식물 종, 리그 닌으로 HAZ 와 G 듀얼 대사 설립 먼저 순차 SPAAC/CuAAC 전에 달성은 라벨. 여기, 태그 HAZ 단위는 처음 구체적으로 표시 된 통해 태그 G가 두 번째 형광 프로브 CuAAC 중재 결 찰에 의해 따라 cyclooctyne 기능성된 fluorophore의 SPAAC 결 찰 단위. 이 메서드와 식물 세포 벽 내의 lignification 과정의 역학 조사 하는 데 사용 되었습니다 적용 vivo에서 횡단면, 줄기 종의 서로 다른 식물의 모 종 생활 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)페놀 (HAZ)</td><td></td><td></td><td>Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 3, 326-338</td></tr><tr><td>(E)-4-하이드록시-3-프로파르길옥시신나밀 알코올 (GALK)</td><td></td><td></td><td>에서와 같이 합성 Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338</td></tr><tr><td>2% 차아염소산</td><td></td><td></td><td></td>나트륨</tr><tr><td>20cm 높이의 유리관</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250mL Schott 유리병</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>48웰 플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5/6-TAMRA-PEG3-Azide</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-AZ109-1</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 치즈 천</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>퇴비, 점토</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>코니페릴 알코올(<강>G</강>)시</td><td>그마, 알드리치</td><td>MFCD00002922,</td> 구리<td></td></tr><tr><td>(II), 황산염(II), 수화물</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110</td><td>Jena 함유 생명과학</td><td>CLK-A127-1</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 초순수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1,5 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아마씨 (L. usitatissimum L.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플루오로마운트-G&트레이드; 슬라이드 장착 매체</td><td>전자 현미경 과학</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버 슬립</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>성장 챔버</td><td>CLF-식물 기후학</td><td></td><td>2 주 된 식물 배양</td></tr><tr><td>성장 챔버</td><td>Angelantoni 생명 과학</td><td></td><td>2 개월 된 식물 문화</td></tr><tr><td>마젠타 식물 배양 상자</td><td></td><td></td><td>2주 된 묘목 배양의</td></tr><tr><td>경우 메탄올</td><td></td><td></td><td>독성(SGH02, SGH06, SGH08), 후드 아래 장갑 사용</td></tr><tr><td>마이크로피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>매니</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>큐어 니콘 A1R 컨포칼 현미경</td><td>니콘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>오비탈 셰이커</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>p-쿠마릴 알코올 (H)</td><td>Carbosynth</td><td>FC145653</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 캡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 냄비</td><td></td><td></td><td>2개월 된 식물 배양</td></tr><tr><td>면도날</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>고무 밴드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Ascorbate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 클램프</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수직 지원</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>액체 및 고체 &frac12용 시약; MS 매체</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KNO3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NH4NO3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl 2.2H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnSO4. H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H3BO3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4.2H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoCl2.6H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA.2H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FeSO4.7H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiamine.HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxine.HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 글리신</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 니코틴산</td><td></td><td></td><td></td>,</tr><tr><td>Myo-inositol</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>당,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES, 수화물</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>한천</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lignification 역학 클릭 화학 식물에서 시각화: 행복은 듀얼 라벨!

Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

리그 닌은 지구상에서 가장 널리 퍼진 biopolymers 중 lignocellulosic 바이오 매스의 주요 구성 요소. 이 페 놀 폴리머 개발 및 더 높은 식물의 생활에 중요 한 구조 및 보호 역할을 하고있다. Lignification 프로세스에서 vivo에서 강력 하 게 규제 하는 복잡 한 메커니즘에 영향을 많은 식물 유래 제품의 산업 어, 비록 과학계는 여전히 그들을 해독 하기 위해 갈 길이 있다. 간단한 3 단계 워크플로에서 여기에 소개 하는 듀얼 라벨 프로토콜 bioimaging 연구를의 적극적으로 식물 조직의 영역을 lignifying 수 있습니다. 첫 번째 단계는 2 명의 독립적인 화학 기자, lignin H와 G 단위를 두 개의 네이티브 monolignols의 대리 모 알선 대사 관에 구성 되어 있습니다. 리그 닌 고분자 성장으로 설립, 후 각 기자 특별히 bioorthogonal SPAAC/CuAAC 클릭 반응의 순차적 조합을 통해 그것의 자신의 형광 프로브 표시 다음 됩니다. 리그 닌 autofluorescence와 결합,이 방법은 식물 세포 벽 내의 리그 닌의 3 색 지역화 맵 생성 공초점 형광 현미경 검사 법에 의해 고 활성의 유무에 정확한 공간 정보를 제공 합니다. 식물 조직, 세포와 다른 세포 벽 층의 규모에 lignification 기계.

그것은 식물에 lignification 프로세스의 역학을 시각화 수, 합성 monolignol 아날로그 및 bioorthogonal 제시 블 리스 프로토콜을 사용 하 여 화학을 클릭 합니다. 리그 닌에 대 한 설립된 기법과 달리 시각화 (예: 조직화 학적인 얼룩, immunolocalization 또는 autofluorescence),이 ' 더블 클릭 ' 프로토콜 독점적으로 대사 법인 중 생산 하는 리그 닌 드 노 보 대상 공초점 형광 현미경 검사 법 (그림 3)에 의해 트리플 채널 세포 이미징으로 샘플의 기존 리그 닌에서 그것을 분화 하 고. H AZ-단위 DBCO 말뚝4-5의 여기 및 방출 파장을 사용 하 여 검색/6-아 지 드의 기능에 특히 클릭 되는 carboxyrhodamine 110 SPAAC 단계 (λex HAZ 분자를 통합 501 nm /λem 526 nm, 녹색 채널), 반면가 G-단위 유사 하 게 특히 G의 통합된 터미널 alkyne 태그에 클릭 되는 azidefluor 545 프로브 특성 파장에서 감지 CuAAC 단계 (λex 546 nm /λem 565 nm, 빨간 채널); 기존의 리그 닌, 405에서 그것의 본질적인 autofluorescence를 사용 하 여 감지 되는에 해당 하는 세 번째 채널 nm (파랑 채널). 이 이렇게 장기 (그림 3A의 다른 조직 사이 존재에 정확한 공간 정보를 제공 하는 식물 세포 벽 내의 리그 닌의 3 색 지역화 지도 또는 활성 lignification 기계 부재의 세대를 이끌어 ), (그림 3B-C) 동일한 조직 내에서 같은 셀 (그림 3D)의 다른 벽 레이어 내의 다른 세포 유형 사이. 즉,이 방법을 수 있습니다 강조 하 고 특히 지역화 '활성' lignification 사이트 (HAZ 와 G가 채널) 리그 닌 이전에 형성 되었다 영역에서 그들을 차별화 하 여 공장 개발 (autofluorescence 채널)의 무대입니다. 또한, autofluorescence에 비해 기술의 감도 극적으로 향상 된 고 갓 합성된 리그 닌의 훨씬 작은 양의 수 감지 (그림 3B).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig3.jpg"> 그림 3: 아마 줄기에 법인된 monolignol 화학 기자의 이미징. (A) 아마 줄기, 복원된 그림의 손으로 만든 횡단 섹션의 절반. Xylem 분화의 첫 번째 레이어 (B) 클로즈업. 왼쪽 패널: 리그 닌 autofluorescence (블루, 405 nm), 중간 패널: 리그 닌 autofluorescence (파란색)와 HAZ 형광 병합 (녹색, 526 nm) 채널, 오른쪽 패널: 리그 닌 autofluorescence (블루)와 G가 병합 형광 (빨강, 565 nm) 채널. 화살표에서 autofluorescence와 비교 하는 행복의 증가 감도 보여주는 레이어의 첫 번째 레이블이 지정 된 세포 벽을 나타냅니다. 다른 세포 유형의 이차 xylem 및 (D) 같은 세포 벽의 다른 층에서 라벨 변화를 설명 하는 이차 xylem 세포에 가까이에 (C) 표시. 왼쪽 패널: 리그 닌 autofluorescence (파란색)와 HAZ 형광 병합 (녹색, 526 nm) 채널, 중간 패널: 리그 닌 autofluorescence (파란색)와 G 형광을 병합 (빨강, 565 nm) 채널, 오른쪽 패널: 리그 닌 autofluorescence (블루), HAZ (녹색) 및 G (레드) 형광 채널 병합. HAZ 와 G 공동 지역화 노란색으로 그려져 있습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
여기에 제시 하는 블 리스 메서드 또는 Tobimatsu 그 외 여러분 에 의해 출판 이전 단일 레이블 프로시저 등 화학 기자 전략 8 따라서 면역-또는 구현 하기 매우 간단 하면서 조직화 학적인 얼룩 같은 이전 접근 방법 보다 훨씬 세밀 하 게 연구를 수 있습니다. 예를 들어, 그림 4 는 설명 HAZ에 대 한 신호 강도 / 아마 이차 xylem의 섬유 tracheids/선박 (FT)에G가 설립 된 레이어의에서 처음 몇 세포 벽에 매우 높습니다 하지만 이전 셀에 점차적으로 감소합니다. 이 프로 autofluorescence의 반대 이며 그 최대 lignification는 레이어의에서 처음 2 ~ 3 피트 세포 층에 매우 빠르게 도달 나타냅니다. 레이 (R) 셀 HAZ로 그들의 발달의 많은 후기를 lignification를 계속 표시 하는 반면,G가 설립은 훨씬 더는 속에는 레이어의에서 모든 셀의 벽에 일정 /. 이러한 세포 유형 그들의 개발 프로그램에 관련 된 차이와 다른 생물학 역할 이후 피트와 R 세포 유형 대조 lignification 역학를 표시 놀라운 일이 아니다. FTs는 성숙 하 고 급속 하 게 죽을 실제로 길쭉한 튜브, R의 좁은 행 세포 반면 기계적 지원 및 물과 무기물의 수직 전송에 필수적인 역할을 재생 하는 두꺼운 lignified 벽 떠나 죽은 빈 셀은 물 관 부 작성 가오리는 두꺼운 lignified 벽 필요 없이 그들의 성숙 하 고 기능적인 상태에 살아 있습니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig4.jpg"> 그림 4: 아마 xylem에 셀 전용 monolignol 기자 관. 브라이트 필드 confocal 현미경 검사 법 아마 줄기에서 자유형 횡단면의 일부의 보기 (A). 핑크 (레이 실질 세포, R), 노랑 (섬유 tracheid 셀, FT) 화살표는 속으로 cambial 영역에서 걸친 벡터 나타내고 405에서 리그 닌 autofluorescence에 대 한 스캔 nm (B), 526에서 HAZ 형광 nm (C)와 G 가 에서 565 형광 nm (D). 이차 xylem의 (E) 보기. 왼쪽 패널: 리그 닌 (블루) autofluorescence, HAZ (녹색), 및 G (빨간색) 형광 채널 병합. HAZ 와 G 공동 지역화 노란색으로 그려져 있습니다. 오른쪽 패널: 아마 줄기에 이차 xylem 구조의 개략도 그림. V, 선박; FT, 섬유 tracheid; R, 레이 실질 세포입니다. 이 사자 외 에서 수정 되었습니다. 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
또한, 두 가지 화학 기자를 H-및 G-단위 블 리스 프로토콜에서 두 bioorthogonal 반응에 해당를 사용 하 여 더 많은 양적 결과를 얻을 수 있습니다. 다중화와 같은 블 리스 설립 비율 다양 한 조건에서 monolignol의 제어에 추가 통찰력을 제공할 수 해독 하기 어려운 lignification 과정에 기여할 수 있는 전략을 라벨. Lignins에 H, G, S monolignols의 상대적 비율은 실제로 아주 종, 조직, 나이 또는 식물의 환경 조건에 따라 가변,이 작곡을 규제 하는 복잡 한 메커니즘 이해 여전히 완전 하지 않게 된다. 듀얼 라벨 기술 규제 lignin 구성 매개 변수 중 일부를 조사 하는 강력한 방법을 나타냅니다. 예를 들어 HAZ를 다양 한: G가 비율 약 이다 이차 xylem 조직에서 리그 닌 조성은 직접 아닌 세포 벽 내에 monolignol 여부 따라 달라 보여 수 있었습니다 과산화 효소/laccase 특이성 (그림 5)
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig5.jpg"> 그림 5: 효과의 G 그리고 HAZ 의 다른 백분율 비율으로 아마 줄기 섹션 잠복기. HAZ: G% 비율 그림의 각 열 위에 받는다. 위: HAZ 와 G 채널 병합. 아래: 히스토그램 HAZ 와 G 다른 % 비율의 평균 형광 강도 나타내는. 값은 회색 레벨 ± sd. 규모에에서 평균 형광 강도의 의미로 표시 바 = 100 µ m. 이 그림 사자 외 에서 수정 되었습니다 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
아마 섬유, 고급 논문 또는 환경 친화적인 복합 재료를 제조 하는 데 사용 되는 그것의 인 피 섬유 (BF)에 대 한 성장 이다. 그들의 산업 어의 중요 한 측면은 그들은 매우 두꺼운 S2/G 보조 레이어19,24에 의해 특징은 그들의 세포 벽에서 리그 닌의 매우 낮은 수준입니다. 블 리스 같은 세포 벽의 다른 층 사이 lignification 역학 차이 강조할 수 있다. 그림 6A HAZ 와 G 기자 관 셀 모서리 및 일부 인 피 섬유의 중간 얇은 판자/기본 세포 벽을 보여줍니다. Monolignol 화학 기자는 것 경우에 두꺼운 인 피부 섬유 중 셀 벽 레이어에서 lignification의 총 부재 제공 분자 환경 적합의 부재에서 발생 하는 그들의 hypolignified 상태를 계시 한다 산화 효소 중재 및 성장 중합체 사슬에 monolignols의 설립 그리고 그 하지 그냥 monolignol 생 합성 유전자의 transcriptional 규칙 이전25보고. 이 관찰 또한와 상관 한다 잘 사실 유전자는 통제해 위로 통제 lignified 인 피 섬유26을 아마 화학 lbf1 돌연변이의 외부 줄기 조직에는 아마 과산화 효소.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig6.jpg"> 그림 6: 블 리스 세포 벽 구조 또는 계층-차이점 하이라이트. (A) 왼쪽된 패널: 아마 줄기 섹션의 필드 밝은 이미지. 원 섬유 번들을 나타냅니다. 오른쪽 패널: 인 피 섬유에 가까이. (와 밝은 필드 없이) HAZ 와 G 채널 병합 그 lignification은 셀 모서리 표시 (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">)와 일부 인 피 섬유의 중간 얇은 판자/기본 세포 벽. BF, 인 피 섬유; 파, 실질 세포; M, 중간 얇은 판자; P, 1 차 세포 벽; S1, 2 차 세포 벽;의 첫 번째 레이어 2 차 세포 벽의 S2/G, 보조 레이어/젤라틴 층. (B) 2 차원 조각과 confocal z-스택의 3D 개조 아마 루트 endodermis 영역의 확대. Casparian 지구 (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">)만 autofluorescence를 표시 하 고 HAZ 또는 G포함 되지 않습니다. 관련된 fluorogram 보여줍니다 G가/HAZ 안티 상관 관계: 높은 녹색 형광이 낮은 붉은 신호 (피 질)과 반대 (endodermis) 연결. Pericycle (P), Endodermis (E), Cortex (C). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
마지막으로,이 두 색 방법론 제공할 수 있습니다 또한 귀중 한 정보 콘텐츠의 세포 벽의 'lignification 상태'에 다양 한 발달 단계에서 및 줄기 이외의 식물 기관에서. 예를 들어 아마 뿌리의 endodermis 개발의 초기 단계 동안에 방사형 및 가로 셀 벽 Casparian 밴드의 존재에 의해 특징입니다. 소수 biopolymer suberin의 리그 닌, 만든이 밴드 물과 용액은 apoplast를 통해 수 동적으로 입력에서 루트에 의해 촬영을 방지 하 고 그들에 기여 하는 그로 인하여 symplastic 경로 통해 플라즈마 멤브레인을 통과 하는 식물 뿌리의 선택적인 통풍 관 용량입니다. 아마 뿌리에 적용, 우리의 전략 HAZ 와 G Casparian 밴드 (그림 6B) 결 석은 방사형 벽의 부분에서 뿐만 아니라 endodermal 셀의 접선 벽에 통합 했다. 그러나, monolignol 기자 합동 Casparian 밴드 자체에서 총 부재는 그것이 성숙이 발달 단계에서 다른 벽은 여전히 추가 biopolymer 증 착의 사이트 동안 나타냅니다. Z-스택 복원된 3D 보기는 명확 하 게 빛을 Casparian 밴드를 제공합니다. 흥미롭게도, 일부 대뇌 피 질의 세포는 endodermis에 인접 한 벽 또한 입증 HAZ 를 우선적으로 통합의 능력 (그로 인하여 아마 루트 피에서 리그 닌/suberin의 존재를 나타내는) 하지 G하지만. 공동 지역화 분석 HAZ 와 G이 두 개의 인접 한 세포 유형에 서 특정 세포 벽 구조/효소 기계의 존재를 제안 사이 반대로 상관 관계를 보였다.
보충 표 1: 고체 ½ MS 매체의 준비 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/renamed_f17ea.xls">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 2: 화학 기자 재고 솔루션의 준비 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/Table_2_-_Preparation_of_chemical_reporter_stock_solutions.xls">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

블 리스, lignification 역학 공부에 대 한 이중 라벨 프로토콜 개발 되었다. 합성 monolignol를 사용 하 여 기자와 SPAAC 및 CuAAC bioorthogonal의 순차적 결합 반응,이 방법론 포장 lignins에서 planta에의 속 규제 요인의 심층 분석 하는 방법 클릭 합니다.

Lignification 역학 클릭 화학 식물에서 시각화: 행복은 듀얼 라벨!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

이 이중 라벨링 방법론의 전반적인 목표는 식물 조직의 활발한 lignifying 영역을 관찰하는 것입니다. 이 워크플로우에서 화학 리포터 전략은 생체 직교 클릭 화학 반응의 순차적 조합에서 두 개의 별개의 화학 리포터를 사용하여 적용됩니다. 이 방법은 식물과 벽 내에서 리그닌의 공간적 또는 시간적 형성을 조절하는 요인을 결정하는 것과 같은 식물 생물학 분야의 핵심 질문을 해독하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 대사 혼입 중에 생성되는 리그닌을 독점적으로 표적으로 한다는 것입니다. 샘플에 이미 존재하는 리그닌과 구별됩니다. 원래는 리그니피케이션 플래그를 연구하기 위해 이 방법을 개발했지만, 애기장대, 포플러 또는 리그닌을 생산하는 다른 식물과 같은 다른 종에도 사용할 수 있습니다.이 기술을 소개하기 위해 화학과 생물학 사이의 인터페이스를 연구하는 박사 과정 학생인 Clemence Simon이 이 기술을 사용하여 리그화 역학을 연구하고 있습니다. 먼저, 알킨 태그가 붙은 G 리포터 10 마이크로 뮬러를 함유 한 300 마이크로 리터 화학 리포터 용액을 준비합니다. 그리고 아지드 태그가 붙은 H 리포터와 액체 멸균 1/2 MS 배지의 10 마이크로 뮬러.용액을 소용돌이치고 전사 피펫을 사용하여 48웰 플레이트의 한 웰로 옮깁니다. G의 마이크로뮬러 10개, H의 마이크로뮬러 10개와 액체 멸균 1/2MS 배지를 포함하는 300마이크로리터 네거티브 컨트롤 용액을 준비합니다. 용액을 소용돌이치고 동일한 48웰 플레이트의 두 번째 웰로 옮깁니다.깨끗한 면도날을 사용하여 2개월 된 아마씨의 줄기를 토양 높이에서 10cm 높이로 자릅니다. 면도날을 사용하여 스템의 자유형 횡단 단면 50개를 부지런히 준비하고 즉시 1/2MS 배지에 넣습니다. 그런 다음 손상되지 않은 전체 단면을 선택하고 조직이 손상되지 않도록 주의하면서 화학 리포터 용액으로 채워진 우물에 10개를 무작위로 분배합니다.단면은 단단하고 깨끗하게 절단되어야 하며 단면은 직선이어야 합니다. 조직을 온전하게 유지하기 위해 안정된 손과 날카로운 면도날이 필요합니다. 미리 연습하는 것이 좋습니다.네거티브 컨트롤 용액에 10개의 손상되지 않은 단면을 분배한 후, 20시간 동안 섭씨 20도의 성장 챔버에서 플레이트를 연속적인 빛으로 배양합니다. 다음 날, 마이크로피펫으로 각 웰의 monolignal 용액을 제거합니다. 각 웰에 500마이크로리터의 1/2 MS 배지를 넣고 10분 동안 부드럽게 저어줍니다.그런 다음 마이크로피펫으로 헹굼 용액을 제거합니다. 1ml의 균주 촉진 아지드-알카인 고리첨가 용액을 준비합니다. 시클로옥텐 태그가 지정된 형광 염료와 액체 멸균 1/2 MS 배지의 5 마이크로 뮬러를 함유합니다.그런 다음 솔루션을 소용돌이치십시오. 대사 혼입 프로토콜의 최종 세척 단계 후 1/2 MS 배지를 제거하고 마이크로피펫으로 각 웰에 300마이크로리터의 SPAAC 용액을 추가합니다. 48웰 플레이트를 상자에 넣어 빛으로부터 보호합니다.그런 다음 기계식 셰이커에 플레이트를 올려 상온의 어둠 속에서 1시간 동안 부드럽게 저어줍니다. 그런 다음 앞에서 설명한 대로 1/2 MS 매체로 각 웰을 4번 세척하고 플레이트를 어두운 곳에 유지합니다. 아스코르브산나트륨, 황산구리, 아지드 태그 형광 염료를 함유한 구리 촉매 아지드 알카인 고리첨가 용액 1ml와 액체 멸균 1/2MS 배지를 준비합니다.그런 다음 솔루션을 소용돌이치십시오. 1/2 MS 매체를 제거한 후 플레이트를 상자에 넣고 마이크로피펫으로 각 웰에 300마이크로리터의 CuAAC 용액을 추가합니다. 기계식 셰이커에 접시를 올려 상온의 어둠 속에서 1시간 동안 부드럽게 저어줍니다.기계식 셰이커에서 플레이트를 제거하고 마이크로피펫을 사용하여 각 웰에서 CuAAC 용액을 제거합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 1/2MS 매체를 넣고 어두운 곳에서 10분 동안 기계식 셰이커의 플레이트를 저어줍니다. 1/2MS 매체로 두 번 더 세척한 후 각 웰에 500마이크로리터의 7:3 메탄올과 수용액을 추가합니다.어둠 속에서 한 시간 동안 기계식 셰이커에 접시를 저어줍니다. 그런 다음 우물에서 용액을 제거하십시오. 다음으로, 각 웰에 500마이크로리터의 1/2MS 배지를 넣고 어둠 속에서 10분 동안 저어줍니다.이 세척을 네 번 반복한 후 단면을 빛으로부터 보호하여 1/2MS 매체에 보관하십시오. 유리 현미경 슬라이드에 장착 매체 5방울을 떨어뜨립니다. 그런 다음 슬라이드에 화학 리포터 태그가 지정된 각 단면을 조심스럽게 놓습니다.슬라이드의 반대쪽 두 면에 매니큐어를 바릅니다. 슬라이드 커버를 커버 슬립으로 덮고 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 그런 다음 종이 타월을 사용하여 여분의 장착 매체를 제거합니다.그런 다음 4면 모두에 매니큐어로 샘플을 밀봉합니다. 네일 바니시가 건조된 후 컨포칼 현미경으로 관찰할 때까지 슬라이드를 섭씨 4도의 어둠 속에서 보관하십시오. 식물 부분은 건조되면 바삭해지는 경향이 있습니다.항상 용액에 보관하고 모든 면에 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하십시오. 장착된 슬라이드의 저장 수명을 늘립니다. 현미경 스테이지에 샘플 슬라이드를 대물 렌즈 아래에 놓습니다.샘플을 관찰하고 회전시켜 식물 조직의 원하는 영역을 식별합니다. 다음으로, Z축에서 가장 형광등이 많은 평면을 선택합니다. 게인, 오프셋 및 레이저 출력을 조정하여 각 채널의 전체 그레이 레벨 범위를 따라 최적의 신호 분포를 달성합니다.마지막으로 고품질 컨포칼 이미지를 획득합니다. BLISS는 식물 세포벽 내 리그닌의 세 가지 색상 국소화 맵을 제공하고, 대사 통합 중 novo에서 생성된 리그닌을 독점적으로 표적으로 삼고 샘플의 기존 리그닌과 구별합니다. 그것은 조직의 다른 세포 유형 또는 세포의 다른 벽 층 또는 하부 구조 내의 기관의 다른 조직 내의 활성 리그 화 부위를 강조합니다.알킨 태그가 붙은 G 및 아지드 태그가 붙은 H 리포터 통합 프로파일은 형성층에서 아마 2차 물관부 내의 속까지 형성층에서 최대 리그니피케이션에 빠르게 도달하는 반면, 경주 세포는 생애의 훨씬 후반 단계에서 리그닌을 계속 통합한다는 것을 나타냅니다. 화학적 리포터 비율을 다양화하는 것은 2차 물관부 조직의 리그닌 조성이 세포벽 내의 단일리그 가용성에 직접적으로 의존한다는 것을 보여줍니다. 리그닌 중합 중 과산화효소 또는 락카제 특이성보다는.화학 리포터 통합은 일부의 세포 모서리 및 중간 라멜라 1차 세포벽으로 제한되지만 전부는 아닙니다. 아마 뿌리에서, 화학 리포터는 카스패리안 밴드(casparian band)가 없는 내피 세포의 벽에 통합되어 있습니다. 조직 구조를 더 잘 시각화하기 위해 3D Z 스택 재구성도 생성할 수 있습니다.이 시각적 개체에 따라 포괄적인 데이터 처리도 수행할 수 있습니다. 모든 예방 조치를 취하면 상대 비교를 통해 일정한 결과를 얻을 수 있으며 서로 다른 샘플 간의 샘플을 읽을 수 있습니다. 이는 다양한 영역의 적극적인 선도의 현지화 외에도 수행될 수 있습니다.이 방법은 세포벽을 연구하는 저와 같은 식물 생물학자에게 훌륭한 도구입니다. 일단 마스터하면 몇 시간 안에 완료할 수 있습니다. 매우 민감하며 다양한 in vitro in vivo 실험 모델 시스템에 적용할 수 있습니다.Chemical Reporter 전략을 리그닌에 적용하면 화학 생물학자가 리그니피케이션 역학을 탐구하고 여러 측면에서 여전히 미지의 영역을 구성하는 이 중합 과정을 제어하는 것이 무엇인지 알아낼 수 있는 길이 열렸습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

공촛점 래맨 현미경에 따라 방법은 레이블이없는 식물 세포 벽에 리그닌의 시각화 및 다른 조직, 표본 또는 수종의 lignification의 비교를 내실수 것을 제공됩니다.

라벨 - 무료 현장에서</em식물 세포 벽 Lignification의> 이미징

이 비디오에서는 특수 식물 세포에 존재하는 리그닌을 염색하기 위한 Wiesner 염색 기술에 대해 설명합니다. 이 염색 기술은 애기장대 탈리아나 줄기에서 리그화된 세포벽을 시각화하는 데 도움이 되며 다양한 유형의 세포 세포벽에서 리그니화를 정량화하는 데 도움이 됩니다.

리그닌 시각화를 위한 Wiesner 염색: 애기장대 탈리아나의 줄기에 존재하는 리그닌 침전물을 염색하는 기술

식물 세포벽 구성은 조직 유형에 따라 다르며 리그닌, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 펙틴을 포함할 수 있습니다. 세포 유형 수준에서 차이를 시각화하기 위해 다양한 염색 기술이 개발되었습니다. 이 논문은 일반적으로 사용되는 세포벽 염색 기술을 편집한 것입니다.

의 조직 화학 염색<em&gt; 애기 장대</em&gt; 차 전지 벽 요소

이 프로토콜은 라만 이미징 및 다 변수 분석을 사용하여 식물 세포 벽에서 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로오스를 시각화하는 일반적인 방법을 제시합니다.

라만 이미징과 다변량 분석을 결합하여 식물 세포벽에서 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로스를 시각화합니다.

이 프로토콜 라이브 이미지 촬영 정점 meristems 레이저 스캐닝 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다른 식물 종에서 분석 하는 방법을 제공 합니다.

다른 식물 종에서 촬영 정점 Meristems의 confocal 라이브 영상

형태학적 변화는 활성화 다음 면역 반응 섬유 아세포 세포에서 발생하고 세포 모집에 변경을 촉진. 유전자 조작섬유아세포 특이적 단백질 1(FSP1)-cre와 함께 2광자 이미징을 활용; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) 마우스 라인과 녹색 형광 태그 lipopolysaccharide-FITC, 우리는 진피 섬유아세포와 생체 내 형태학적 변화에 있는 lipopolysaccharide의 고도로 특정 한 섭취를 설명할 수 있습니다.

피부에 있는 유전으로 표를 붙인 기자 세포의 Vivo 2 색 2-광자 화상 진찰에서

이 프로토콜은 스펙트럼 및 형광 수명 측정을 결합하여 로다민 기반 형광 프로브와 리그닌 폴리머 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)을 두꺼운 식물 섹션에서 직접 평가하는 원래 의설정에 대해 설명합니다.

네이티브 오토플루임션을 기반으로 sFLIM에 의한 식물 섹션의 형광 프로브와 리그닌 간의 상호 작용 측정

본 프로토콜은 플라스모디오포라 브라시카에 의해 유도된 담즙의 조직학적 관찰을 위한 최적화된 방법을 기술한다. 배축의 Vibratome 섹션은 질병 진행 동안 전사 인자와 식물 호르몬의 관여를 연구하기 위해 형광 이미징 전에 제거됩니다. 이 프로토콜은 수지 임베딩 한계를 극복하여 형광 단백질의 플란타 시각화를 가능하게 합니다.

Plasmodiophora brassicae에 대한 유전자 발현 및 생리적 반응의 변화를 시각화하기 위해 투명화와 형광 현미경을 결합

이 원고는 살아있는 이끼 조직의 3D 세포벽 역학을 이미지화하는 상세한 프로토콜을 제시하여 장기간에 걸쳐 발달하는 동안 ggb 돌연변이에서 세포벽의 분리와 야생형의 세포벽 패턴을 두껍게 시각화할 수 있습니다.

이끼 피스코미트리움 파텐스에서 칼코플루오르를 사용한 세포벽 역학의 3D 타임랩스 이미징

여기에서는 대사 올리고당 엔지니어링, 클릭 화학 및 확장 현미경 검사를 결합한 간단한 프로토콜을 제안하며, 이를 통해 일상적인 현미경 장비를 사용하여 향상된 해상도로 세포 내 시알릴화된 N-당단백질의 바이오이미징을 가능하게 합니다.

Click Chemistry and Expansion Microscopy를 사용한 세포 내 사이알릴화 시각화

배우세요 생체정교 클릭 화학을 이용한 이중 라벨링 기법으로 식물 조직의 리그니피케이션 역학을 관찰하는 방법을. 이 기술은 대사적 통합 중 생성된 리그닌을 특이적으로 표적화하여 기존 리그닌과 구분하고, 다양한 식물 종에 적용 가능합니다.

Lignification 역학 클릭 화학 식물에서 시각화: 행복은 듀얼 라벨!

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