절연 및 특성화 Neutrophil 파생 된 미의 기능 연구

이 프로토콜의 전반적인 목표는 기능 연구를 위해 호중구 유래 미립자를 분리하고 특성화하는 것입니다. 이 방법은 암, 염증 및 상처 치유를 포함한 다양한 생리학적 과정에서 세포-세포 통신에서 외세포 소포 또는 미립자의 역할에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 빠르고 비용 효율적이며 기능적 자산에서 미립자 또는 미소포의 p'henotypic 구성을 평가할 수 있다는 것입니다.

제 연구실의 박사후 연구원인 Ariel Finkielsztein과 제 연구실의 학부생인 Joseph Lee가 절차를 시연할 것입니다. 쥐 골수 폴리모르포누클리어(PMN) 세포의 밀도 구배 분리를 위해 먼저 골수 세포 샘플당 15밀리리터 원추형 튜브 1개에 갓 준비된 실온, 밀리리터당 1.119그램의 밀도 용액 3밀리리터 위에 갓 준비된 실온, 1.077그램의 용액을 천천히 층을 이룹니다. 다음으로, 얼음처럼 차가운 PBS에서 갓 분리한 골수 세포 1ml를 각 튜브의 최고 밀도 구배층에 오버레이하고 밀도 구배 원심분리로 세포를 분리합니다.

분리가 끝나면 PMN 밴드를 방해하지 않고 PBS와 각 튜브의 상위 밀도 구배층 사이의 계면에서 단핵 세포층을 조심스럽게 제거합니다. 전사 피펫을 사용하여 PMN 층을 시료당 하나의 새로운 15ml 튜브에 모으고 0.1미크론 주입 크기의 여과된 PBS를 사용하여 각 튜브의 최종 부피를 최대 15ml까지 가져옵니다. 원심분리로 PMN을 펠렛화한 후, 튜브당 2밀리리터의 새로 여과된 PBS에서 두 번째 원심분리

그런 다음 계수를 위해 새로 여과된 PBS 1밀리리터에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 계수 후, 세포를 다시 원심분리하고, 1,000만 개의 세포당 관심 자극제를 보충한 0.1 미크론 붓기 크기의 여과된 HBSS의 100 마이크로리터에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 섭씨 37도에서 20-30분 동안 배양합니다.

자극이 끝나면 원심분리를 통해 세포를 수집하고 cell-free 상등액을 샘플당 하나의 새로운 1.5 milliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 상층액을 원심분리하여 세포 파편을 제거하고, 세척된 상등액을 새로운 초원심분리 튜브로 옮긴 다음, 상등액을 초원심분리하고, 추가 실험 분석이 있을 때까지 섭씨 80도의 파라핀 밀봉 초원심분리기 튜브에 펠릿화된 미립자를 보관합니다. 미세입자를 쥐의 결장에 투여하려면 먼저 완전히 마취된 쥐를 엎드린 자세로 눕히고 생검 겸자와 고해상도 카메라가 장착된 내시경을 사용하여 결장의 등쪽을 따라 3-5개의 표재성 상처를 생성합니다.

완전히 회복될 때까지 모니터링하면서 마우스를 케이지로 되돌립니다.24시간 후 내시경을 사용하여 마취 상태에서 입힌 상처의 이미지를 획득합니다. 그런 다음 대장내시경 기반 마이크로 주입 시스템을 사용하여 100마이크로리터의 HBSS에 재현탁된 실험용 PMN 미세입자를 각 상처 부위에 직접 투여합니다.

PMN 미세입자의 크기 이질성은 미세입자를 알려진 크기의 유세포 분석 비드와 비교하여 평가할 수 있습니다. 입증된 바와 같이, 미세입자에 의한 관심 단백질의 발현은 유세포 분석으로도 검사할 수 있습니다. 이 실험에서는 활성제 자극 PMN 유래 미세입자에 의한 주요 염증 및 항염증 분자의 발현을 면역블롯으로 평가했습니다.

PMN 미세입자가 상피세포 치유에 미치는 영향은 시험관 내에서 미리 결정된 시점과 생체 내에서 겸자 상처 후 생체 검사 후 생체 내에서 긁힌 상처 상피 단층의 이미지 획득을 통해 모니터링할 수 있습니다. 일단 마스터되면, 이 기술이 적절하게 수행된다면 PMN 유래 미립자를 4시간 이내에 분리할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 자극 전에 PMN을 얼음 위에 두어 조기 활성화와 미세 입자 손실을 방지해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 유세포 분석, 면역 블로팅 및 실시간 증식 반응 기술을 사용하여 다양한 자극 조건 하에서 또는 다른 기원 세포에서 마이크로입자 함량을 정의할 수 있습니다. 이 기술은 면역 반응, 장벽 기능, 조직 손상 및 복구, 암 진행의 조절에서 미세입자 기여의 역할을 조사하는 데 유용합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 쥐 미세입자를 분리하고 라벨링하는 방법과 생체 내 상처 치유 기능적 자산에 미세입자를 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

살아있는 동물과 함께 작업하는 것은 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하기 전에 항상 개인 보호 장비를 착용하고 적절한 안전 교육을 이수할 것을 제안하는 예방 조치를 잊지 마십시오.