Name: 절연 및 특성화 Neutrophil 파생 된 미의 기능 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 배우세요 중성구 유래 미세소포를 초원심분리 및 유동세포분석으로 분리하고 특성화하는 방법을. 이 기술은 면역 반응, 조직 손상 및 복구, 암 진행 연구에 활용됩니다.

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우리는 북서부 Feinberg 학교의 의학 교류 Cytometry 코어를 실행 하는 박사 Suchitra Swaminathan의 기술 지원에 대 한 감사입니다. 자금 (NIH) DK101675에 의해 제공 했다.

모든 동물 일 북서부 IACUC에 의해 승인 되었다. 모든 실험은 모든 관련 규제 기관 지침 준수에 따라 완료 되었습니다. 인체 혈액 기부에 대 한 동의 제시 되었고 서명; 또한,이 연구에서 모든 인간의 과목 인간의 복지에 대 한 기관 및 연방 정부 지침에 따라 치료 했다.
참고: 프로토콜 단계는 다음 하위 섹션 아래에 나열 됩니다: (i) 마우스 골 수 세포 격리; (ii) PMN 격리에서 Murine 골; (iii) PMN 별개로 인간 혈액; (iv) MP 별개로 PMN Supernatants (로 Ultracentrifugation); (v) 서 부 럽;에 의해 MPs의 특성 (vi) Cytometry;에 의해 MPs의 특성 (8 세)의 응용 프로그램 격리 된 MPs 연구 상처 치유
1. 마우스 골 수 세포 격리
<ol style="margin-left: 40px;"><li>
대 퇴 골과 경골 마우스 뒷 다리에서의 해 부
	<ol>
<li>흡입 마 취에 대 한 (예를 들어, 빈 1 mL 팁 상자) 안락사 상자를 준비 합니다. 100 %isoflurane 녹화 플라스틱 상자 뚜껑의 안쪽에 메 마른 헝겊에 몇 방울을 추가 합니다. 새로운 IACUC 지침에 의하여 하지 동물 isoflurane와 직접 접촉에와 서, 따라서 마우스와는 isoflurane 포함 된 거 즈 팁 홀더를 배치 한다. 참고: Isoflurane 강력한 inhalational 마 취 이며 증기 두건 안쪽 극단주의 함께 처리 되어야 합니다.</li>
		<li>IACUC 추천에 의하여 쥐 안락사 그것은 호흡을 정지 했다 때까지 1-5 분 1.1.1 단계에서 설명한 안락사 상자 안에 마우스를 놓습니다. 자 궁 경부 전위를 수행 하 여 동물의 죽음을 확인 합니다.</li>
		<li>족집게 0.17 m m X 0.1 m m 스테인리스, 곡선, 12 cm를 사용 하 여 복 부 피부와 위와 더 낮은 사지 사이 절반 방법 피부를 잘라. 여기에서 더 낮은 말단을 포함 하 여 마우스 신체의 가장 말 초 부분에 피부 껍질. 10 cm 긴, 똑바로 해 부가 위, 뒷 다리에서 근육을 제거 하 고 대 퇴 골 머리 그대로 엉덩이 관절 탈 구.</li>
		<li>가 위를 사용 하 여 대 퇴 골 및 경골 근육 해 부 및 대 퇴 골은 경골에서 분리. 뼈의 끝 그대로 그대로 골의 상당한 금액을 포함 하는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>종이 타월 내 뼈를 압 연 하 여 모든 나머지 살을 제거 합니다. 혈 청 무료 매체 (SFM, 즉, 혈 청 또는 항생제 없이 Dulbecco의 수정 독수리의 매체 (DMEM))를 포함 하는 페 트리 접시에 깨끗 한 뼈를 놓습니다.</li>
		<li>70% 에탄올에 그리고 SFM에 뼈를 씻어.</li>
		<li>50 mL 원뿔 튜브에 SFM의 50 mL를 준비 합니다. 10 mL 주사기에 SFM의 10 mL를 로드 하 고 25 및 5/8 인치 계기 바늘에 첨부.</li>
		<li>골 수 (붉은 색) 하 여 표시 될 때까지 위는 뼈의 끝을 잘라.</li>
		<li>새로운 50 mL 튜브로 골 수 세포를 플러시. 10 mL 주사기를 사용 하 여 약 3 mL/뼈 SFM의 26, 5/8 인치 계기 바늘. 끝나면 홍 조 셀 집계를 (사용 일회용 1 mL 플라스틱 팁)를 pipetting으로 튜브에 세포를 resuspend.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PMN 격리 Murine 골 수에서
<ol><li>
붉은 세포 세포의 용 해
	<ol>
<li>Centrifuging 350 x g 4 ° c.에 8 분에 의해 수집 된 골 수를 작은</li>
		<li>0.2%의 20 mL에 셀 펠 릿 resuspend lyse 적혈구 분수를 약 20-30 s NaCl. 30을 초과 하지 않도록이 s PMN 세포 귀 착될 것 이다. 추가 20 mL 1.6%의 NaCl osmolality 복원 하. 참고:이 단계는 매우 작은 PMN 활성화 이어질 수 있습니다.</li>
		<li>씻으십시오 2 mL PBS와 2.1.1 위의 단계 에서처럼 원심 분리기의 셀. 제거는 상쾌한.</li>
		<li>분리 PMNs 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
조밀도 기온 변화도 원심 분리에 의해 호 중구의 격리
	<ol>
<li>따뜻한 polysucrose와 나트륨 diatrizoate 솔루션, 1.119 g/mL 및 1.077 g/mL ( 재료의 표참조), 사용 하기 전에 실내 온도 (RT)의 밀도와.</li>
		<li>Polysucrose와 나트륨 diatrizoate 그라디언트 신선한, 천천히 1.077 g/mL 밀도 솔루션 15 mL 원뿔 튜브에 1.119 g/mL 밀도 솔루션의 이상 3 mL의 3 mL을 레이어 링 하 여 골 수 세포 응용 프로그램 직전 준비 합니다. 참고: 사전에 너무 멀리 그라데이션 솔루션의 준비 레이어 및 가난한 호 중구 순도 복구 발생 합니다.</li>
		<li>얼음 처럼 차가운 PBS의 1 mL에 골 셀 펠 릿을 resuspend와 polysucrose와 나트륨 diatrizoate 위에 결과 세포 현 탁 액을 오버레이 그라데이션 (천천히, 레이어 혼합을 피하기 위해).</li>
		<li>850 x g 브레이크 없이RT에서 25 ° c에서 30 분 동안 원심 분리기. 골 수에 있는 다른 세포는 호 중구의 효과적인 분리에 대 한 RT에는 시 약을 계속. 그라데이션 효율적으로 형성 하 고 원심 분리 단계 후에 유지 될 수 있도록 천천히 감속에 있는 원심 분리기를 설정 합니다.</li>
		<li>시각적으로 단 셀 레이어를 PBS와 1.077 g/mL 밀도 솔루션 (상위 계층)의 인터페이스에서 찾습니다. PMN 밴드를 방해 하지 않고이 레이어와 밀도 솔루션의 나머지 부분을 제거 합니다.</li>
		<li>15 mL 튜브 전송 피 펫을 사용 하 여 전체 PMN 레이어 및 기본 polysucrose와 나트륨 diatrizoate 1.119 g/mL 해결책의 일부를 수집 합니다. 참고: 격리 PMNs의 순도 상위 계층의 완전 한 제거에 따라 달라 집니다.</li>
		<li>필터링 된 PBS (0.1 µ m 기 공 크기 필터를 통해 필터링)와 4 ° c.에서 5 분, 300 x g에서 원심 분리기 튜브 탑</li>
		<li>2.2.7 단계에서 원심 분리 조건을 사용 하 여 PBS의 2 mL와 수송과 PMNs 워시.</li>
		<li>필터링 된 PBS의 1 mL에 resuspend 및 격리 PMNs hemocytometer 여. 참고:이 격리 방법에 대 한 결과 PMN 순도에 도달 ~ 85-90%, cytometry에 의해 평가 되었다. 분수를 오염 하는 나머지 단 세포의 주로 구성 되어 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MP 출시를 유도 하기 위해 PMN 자극 참고: PMNs MPs N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-myristate-13-아세테이트 (PMA), 또는 인터페론 감마 (IFNγ)를 포함 하 여 다양 한 활성화 조건을 사용 하 여 릴리스를 자극 수 있습니다. 중요 한 것은, 시뮬레이션, 이전 PMNs 지켜져야 한다 얼음에 항상.<ol>
<li>펠 릿 PMNs (300 g, 5 분, 4 ° C) 및 0.1 µ m에 resuspend 포함 하는 선택의 자극 에이전트 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 솔루션, 필터링. 최적의 자극에 대 한 15 mL 튜브에 37 ° C에서 20-30 분 동안 10 백만 PMNs 당 100 µ L 자극 솔루션을 사용 합니다. 참고: 다음 활성 제 농도 성공적으로 우리의 이전 작품에 사용 되었다: fMLF (0.5-1 µ M 인간과 마우스 PMNs에 대 한 2-5 µ M에 대 한), PMA (200 nM), 및 IFNγ (100 ng/mL). 사전 분류 MPs의 릴리스를 원하는 경우 unstimulated PMNs 품 어 (1-5 10 배6) N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC와 ( 재료의 표참조) (100 µ L HBSS, 15 분, 37 ° C에서에서 1 µ M). 진행 단계 2.3.1-2.3.3.</li>
		<li>PMNs 제거 하 고 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브 셀 무료 supernatants 전송 하 4 ° C에서 5 분 동안 850 x g에 아래로 회전 합니다.</li>
		<li>셀 무료 supernatants 별개로 MP, 4.2 단계로 계속.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 인간의 혈액에서 PMN 격리
<ol><li>
기관 IRB 지침에 따라 혈액 추출에 대 한 건강 한 자원 봉사자를 모집 합니다.
	<ol>
<li>상용 5 mL 나트륨 시트르산 포함 된 튜브 ( 재료의 표참조)로 건강 한 자원 봉사자의 팔 뚝에서 피를 수집 합니다.</li>
		<li>Dextran 및 나트륨 diatrizoate 솔루션의 5 mL를 플라스틱 (1.113 g/mL의 조밀도 재료의 표참조) 살 균 15 mL 튜브와 천천히 레이어 위에 갓 고립 된 인간 주변 혈액 5 mL로.</li>
		<li>50 분 낮은 가속 RT (25 ° C)에서 g x 400와 아무 브레이크 튜브 원심</li>
		<li>원심 분리의 끝에, 플라스마와 단 세포 (상위 계층) 살 균 플라스틱 흡입 피 펫을 사용 하 여 제거 합니다.</li>
		<li>레이어 (PMNs) 새로운 살 균 50 mL 원뿔 튜브로 전송 합니다.</li>
		<li>0.45%의 동일한 볼륨 추가 NaCl PMNs (믹스 잘 부드럽게 튜브를 회전 하 여)을.</li>
		<li>25 ° c.에 400 x g에서 10 분 원심 분리기</li>
	</ol>
</li>
	<li>
붉은 세포 세포의 용 해
	<ol>
<li>45 수송과 셀에 얼음 처럼 차가운, 살 균 물 10 mL를 추가 s 뒤에 10 mL의 얼음 처럼 차가운 살 균 1.8% NaCl osmolality 복원 하. 참고: PMN 격리에 대 한 모든 다음 단계 PMN 활성화 및 조기 MP 출시 방지 하기 위해 얼음에 수행 되어야 한다. 그러나 자체 세포 단계 결과 사소한 그러나 중요 하지 PMN 활성화에,, 그것은 기능 분석에 대 한 순수한 PMN 인구를 분리 하는 데 필수적입니다.</li>
		<li>부드러운 감속으로 4 ° C에서 250 x g에서 10 분 동안 셀 원심</li>
		<li>3.2.1, 3.2.2 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>얼음 처럼 차가운 HBSS 칼슘 또는 마그네슘의 5 ml에서 PMNs resuspend. 총 라이브 셀 (hemocytometer와 생존 1:2 희석에 얼룩을 사용 하 여 테이블의 자료를 참조 하십시오) 자극 하기 전에. 참고: 격리 PMNs 수 사용 해야 자극 또는 절연의 2 h 이내 다른 실험에 대 한 변경 기능 및 세포와 세포 죽음을 피하기 위해 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. MP 격리 활성화 PMN Supernatants에서
참고: 비슷한 프로토콜 murine 인간과 PMNs에서 MPs의 절연을 위해 사용 됩니다.
<ol><li>펠 릿 PMNs (300 g, 5 분, 4 ° C) 및 0.1 µ m에 resuspend 필터링 HBSS 솔루션을 포함 하는 선택의 자극 에이전트 (예 1 µ M fMLF 참조 참고: 2.3.1). 최적의 자극에 대 한 15 mL 튜브에 37 ° C에서 20-30 분 동안 10 백만 PMNs 당 100 µ L 자극 솔루션을 사용 합니다.</li>
	<li>다음 자극, 활성화 PMNs 600 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 아래로 회전 하 고 새로운 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 무료 supernatants 전송.</li>
	<li>PMN 허가 상쾌한 13000 x g, 10 분, 세포 파편을 제거 하 고 새로운 ultracentrifuge 관으로 지운된 상쾌한 전송 하 4 ° C에서 원심</li>
	<li>4 ° c.에 100000 x g에서 1 시간을 위한 원심 분리기 Supernatants MP 저장 하기 전에 제거 합니다. 필요에 따라 저장소 수송과 MPs 파라핀 실험에서 사용까지-80 ° C에서 ultracentrifuge 관 봉인에.</li>
</ol>5. 서양 Blotting에 의해 PMN MPs의 검사
<ol><li>1 %SDS 버퍼 추가 (50-200 µ L 100 mM Tris ph: 7.4) MPs를 펠 렛 (4.4 단계)에서 전송 새로운 1.5 mL microcentrifuge 관에 고 5 분 동안 lysed MPs를 삶아. 참고: 수 MPs와 세포의 용 해 버퍼 볼륨 조정 고 관심사의 각 단백질에 대 한 최적화 될 해야 합니다.</li>
	<li>
Β-mercapto-에탄올 10%를 포함 하는 버퍼를 로드 레인 당 같은 양의 PMN MPs를 로드 합니다. 참고: 우리의 방법으로 우리 자극된 PMNs의 동일한 수에서 고립 되었다 MPs 로드 합니다.<ol>
<li>10 %polyacrylamide 젤에 SDS 페이지 lysates 분리 (50-100 V을 사용 하 여 1-1.5 h에 대 한) 니트로 막에 총 단백질 설명된9로 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>막 5% 비-지방 우유 0.05% 트윈 20 Tris 버퍼 염 분에서 1 시간에 대 한 차단 하 고 뒤에 보조 HRP 활용 된 항 체 (하룻밤에 4 ° C), 적절 한 기본으로 품 어.</li>
	<li>막 하는 광선이 카세트 (1-24 h) 내부는 x 선 필름에 노출 chemoluminescence 솔루션을 추가 하 여 밴드를 시각화 합니다.</li>
</ol>6. Cytometry에 의해 PMN MPs의 검사
<ol><li>
항 체 얼룩이 지기 위해 FACS 버퍼 (PBS 0.1 m m EDTA, 0.1% 나트륨 아 지 드)에 적절 하 게 항 체 희석. Resuspend 수송과 PMN MPs (10 x 1-3에서 파생 된6 PMNs/조건) 100 µ L 항 체 솔루션에서.
	<ol>
<li>Annexin V에 대 한 얼룩, FITC 활용 Annexin V의 5 µ L를 들어 Annexin V 버퍼에 수송과 PMN MPs를 resuspend. 공동 항 체와 얼룩, Annexin V 솔루션에 직접 원하는 항 체 (대 한 예에서는 참조 테이블의 재료)를 추가 합니다. 추가 지질 형광 염료, N-(2-aminoethyl) maleimide ( 재료의 표참조), 레이블 및 MPs 식별 하 FACS 버퍼의 100 µ L에 1 μ M 농도에서.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 ° c.에 20 분 이상 솔루션 얼룩에 MPs를 품 어</li>
	<li>Ultracentrifugation (4 ° C에서 100000 x g에서 1 h);에 의해 MPs를 씻어 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>FACS 버퍼에 resuspend 및 증가 한 감도 위해 업그레이드 된 전자 장치를 갖춘 지정 된 교류 cytometer에서 샘플을 실행 ( 재료의 표참조).</li>
</ol>7. 상처 치유에 PMN 함수 공부 절연된 PMN MPs에 대 한 응용 프로그램
<ol><li>
Vivo에서 관리 PMN MPs의 저 승 상처
	<ol>
<li>케 타 민 (100mg/kg) 및 xylazine (5 mg/kg)의 혼합물의 복 주사 하 여 쥐를 anesthetize. 페달 반사 (회사 발가락 핀치)에 의해 마 취를 확인 하 고 필요한 조정.</li>
		<li>그것의 위에에 28 cm 생 겸 고해상도 카메라가 장착 된 내 시경을 사용 하 여 마우스를 두고 (작은 동물 사용에 대 한 수의 내 시경 같은 재료의 표참조), 생성의 등 쪽 측에 따라서 3-5 표면 상처는 콜론입니다. 완료 되 면 부상, 반환 쥐 감 금 소에 복구 될 때까지 온도 제어 (37 ° C) 매트에 배치.</li>
		<li>(단계 7.1.1) 에서처럼 마우스 anesthetize 내 시경을 사용 하 여 해 상처 후 24 시간 (1 일) 부상의 이미지. 마우스 단계 7.1.2로 복구 하자.</li>
		<li>(24 시간 후 부상) 동시에 murine PMN MPs에9시경 기반 microinjection 시스템 (29 G 바늘 사용) 사용 하 여 각 상처 사이트에 HBSS + 직접 100 µ L에서 2 x 106 PMNs에서 파생 된 관리. 3 일 (7.1.1 단계)로 마우스를 anesthetize 하 고 내 시경을 사용 하 여 상처 치유의 이미지를 다시 가져오는 나중 (4 일 후 부상). 마우스 단계 7.1.2로 복구 하자.</li>
		<li>선호 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 인수 이미지, 측정 같은 영역 일 1과 4 후 부상, 상처와 상처 폐쇄의 비율을 계산에서 (참조 테이블의 자료), 개요 보이는 상처 영역.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인간 상피 세포 생체 외에서 상처 치유
	<ol>
<li>수 Caco-2 BBe 또는 T84, hemocytometer 씨앗 5 x 105 셀/잘 24-잘 문화 접시에 의해 인간 장 상피 세포. 37 ° C, 5% CO2표준 보육 챔버에 세포를 품 어. Caco-2 BBe 또는 T84 48 h9에서 confluency 도달. 상피 세포 문화, 이전 DMEM과 DMEM-F12 (50: 50) 보조 제와 함께 사용 설명9.</li>
		<li>앞에서 설명한4,9피 펫 팁 및 낮은 흡입을 사용 하 여 단층에 기계적 스크래치 상처를 생성 합니다. 시간으로 사용 되는 반전된 단계 대조 미분 간섭 현미경 (사용 5 배 또는 10 배 목표)를 사용 하 여 긁 직후 상처 영역에의 이미지를 수집 = 0 참조 포인트.</li>
		<li>긁힌 상처 상피 세포 monolayers를 MPs (2-4 X 106 PMNs에서에서 파생 됨)을 추가 하 고 추가 24 h (48 h 후 부상, 5% CO2와 37 ° C에서)에 대 한 품 어. 이 이번에 다시 처음 상처의 이미지를 취득 합니다.</li>
		<li>선호 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) t 상처 영역 측정 하 = 0, t 선택한 시간 지점에서 상처 영역에서 차이 확인 하 여 48 h. 계산 상처 폐쇄의 비율 =.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는이 통신에 관련 된 어떤 종류의 충돌의 관심을가지고

이 통신 프로토콜 격리 및 PMN 파생 된 MPs의 특성화에 대 한 설명 합니다. 몇 가지 중요 한 요점 절차의 성공에 대 한 계정에 촬영 해야 합니다. 첫째, PMNs 신선한 격리 하 고 자발적인 활성화와 degranulation 방지 하기 위해 절연의 2 h 이내 실험에 사용 될 해야 합니다. 격리 하는 동안 및 자극의 지점 PMNs의 모든 처리 활성화와 조기 MP 릴리스12방지 하기 위해 얼음에 수행 되어야 합니다. 둘째, 1 시간 이상 ultracentrifugation 극대화 cytometry 분석에 대 한 MPs. 셋째, 판, 악기는 제대로 악기 지정 형광 구슬 (구슬 종류 조정 됩니다 특정의 혼합으로 보정 해야 합니다. 악기) 올바르게 MP 크기를 정의 합니다. 예를 들어 제조 교류 cytometers는 FSC 구슬 크기 관련 매개 변수로 사용 하 여, 권장 하는 동안 다른 SSC 구슬에 대 한 최적화 되었습니다 했습니다. 또한, MP 분석에 사용할 교류 cytometer ...

최근, "미/microvesicles" 셀 cytosol 또는 원형질 막에서 발생 되 큰 과학적 관심의 신흥 데이터 직경에서 50-1000 nm에서까지 이러한 구조 생물학 정보를 전달 수 있습니다 제안 및 셀룰러 통신의 비 정식 방법으로 제공 합니다. 면역 세포 유래 MPs 및 특히 polymorphonuclear 호 중구 (PMNs)를 제작한 이들은 PMNs 호스트 방어1,2,3선 동적인 응답 및 상처 치유에 중요 한 역할을 주어 큰 관심의 4. 글, 지금까지 수많은 보고 보여주었다 PMN 의원5, 제안 하는 잠재적인 맥락, 질병-, 종 및 MPs의 기관 특정 역할의 프로-염증 성 및 안티-염증 기능.
이 통신에 설명 된 프로토콜 건강과 질병에서 MPs의 기능을 연구, 혁신, 비용 효율적이 고 융통성 있는 방법을 제공 합니다. 그들은 많은 모형 유기 체, 기관, 및 자극 조건에 적용 됩니다. 그들은 MPs의 여러 종류의 식별을 위해 허용 하 고 그들의 프로-염증 성 및 안티-염증 기능을 해결 하기 위해 나중에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 설명 여기에 상피 상처 치유 생체 외에서 vivoPMN MPs의 기능을 공부 하는 방법. 마우스 골 수 파생 PMNs는 앞에서 설명한 방법6에서 일부 수정 적응 했다의 격리에 대 한 제시 프로토콜.
또한,이 연구에서 설명 하는 프로토콜 탐지 및 PMN MPs에 두 개의 상호 보완적인 방법으로 찾을 수 있는 특정 표시의 특성화에 대 한 허용: 서쪽 오 점 그리고 cytometry 흐름. 그러나 우리는 표준 프로토콜5 를 사용 하 여 MPs의 immunoblotting 간단 하 고 신뢰할 수 있는,, 감도 교류 cytometry 악기, 그리고 향상 된 잡음 대 신호 비율의 최근 발전 지금 허용 MPs의 추가 분석을 위해이 방법을 사용 하 여 찾을. 이 연구에서 설명된 프로토콜 통합 최근 발전과 수정 원심 분리 속도 시간, 샘플 필터링 및 동결/스토리지 조건7 의 추가 포함 하 여 원래 연구 기사에서 추천 , 8, 그리고 "배경 잡음"을 줄일, PMN MPs의 검출 한계를 개선 하 고 MPs의 다른 크기를 구분 하는 방법.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-041-CV</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (열 비활성화)</td><td>Atlanta Biologics</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 (10,000 단위 페니실린 / 10,000 mg/ml 연쇄상구균)</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td></td><td>Fisher BP2482</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>멸균 및 0.1 미크론 필터 유닛</td></tr><tr><td>멸균 필터 Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>멸균 필터 Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>밀도 1.119 g/ml.&nbsp; polysucrose의 해결책 and&nbsp; 디아트리조산나트륨. </td></tr><tr><td>칼슘과 마그네슘이 없는 인산염 완충 식염수(PBS)</td>를 실온에 두십시오. <td>Cellgro</td><td>210-40-CV</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올 (200 proof)</td><td>Decon labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>HBBS</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Sigma</td><td>T8154&nbsp; </td><td>세포 생존율 계산을 위한 SIGMA 희석 1:2</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbot</td><td>50033</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD11b-APC conjugated</td><td>Biolegend</td><td>301350</td><td>Clone ICRD44 (최종 cononcetration: 1 &micro; g/mL)</td></tr><tr><td>BODIPY FL</td><td>Invitrogen</td><td>B10250</td><td>N-(2-aminoethyl) maleimide&nbsp;</td></tr><tr><td>Annexin V 결합 버퍼</td><td>Biolegend</td><td>422201</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석용 보정 비드</td><td>BioCytex</td><td>7803</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V</td><td>Biolegend</td><td>640906</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>축 실드 PoC AS</td><td></td><td>디아트리조산나트륨/덱스트런 500, 밀도 1.113 g/ml</td></tr><tr><td>C57BL/6 마우스</td><td>Jackson Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원심분리기 </td><td>튜브 Corning</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원심분리기 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 혈청학적 피펫</td><td>Celltreat</td><td>229225B</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 혈청학적 피펫</td><td>Celltreat</td><td>229210B</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 혈청학적 피펫</td><td>Celltreat</td><td>229205B</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫&nbsp;</td><td>BD 팔콘</td><td>357575</td><td></td></tr><tr><td>25G x 5/8인치 바늘 (정밀 글라이드 바늘)</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m 세포 스트레이너</td><td>Celltreat</td><td>229485</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer 튜브</td><td>BD</td><td>367251</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP)</td><td>BD(</td><td>SORP)</td><td></td></tr><tr><td>스윙 버킷 원심분리기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75007210</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>(L8-80 M)</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; VV-17703-15 (Fresco 17)</td><td></td></tr><tr><td>스윙 버킷 원심분리기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; 75004503 (Megafuge 40R)</td><td></td></tr><tr><td>생검 겸자, 28cm</td><td>Storz</td><td>27071zj</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>National Institute of Health</td><td>오픈 소스&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

절연 및 특성화 neutrophil 파생 된 미의 기능 연구

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polymorphonuclear neutrophil 파생 미 (PMN)-MPs)는 지질 bilayer, 직경에서 50-1000 nm에서 배열 하는 크기와 구형 microvesicles. MPs는 새로 진화, 셀 통신 및 신호 기계의 중요 한 부분 이다. 그들의 크기와 그들의 자료의 성격, 때문에 최근까지 MP 존재 간과 했다. 그러나, 향상 된 기술 및 분석 방법으로 건강과 질병에 그들의 기능 지금 나오고 있다. 여기에 제시 된 프로토콜 겨냥 된다 격리 및 PMN MPs cytometry immunoblotting 여. 또한, 몇 가지 구현 예는 주어진 다. MP 격리에 대 한 이러한 프로토콜 빠르고, 낮은-비용, 고 비싼 키트를 사용 하 여 필요 하지 않습니다. 또한, 그들은 MPs 미리 MP 릴리스 이전 소스 셀 라벨 뿐 아니라 다음 격리, cytometry에 의해 시각화 및 분석을 위한 막 특정 형광 성 염료를 사용 하 여 라벨에 대 한 허용. 그러나 이러한 메서드는, PMNs MPs 및 정교한 분석 계측에 대 한 필요성의 순도 포함 하는 몇 가지 제한이 있다. 고급 흐름 cytometer 안정적으로 MPs를 분석 하 고 잡음 또는 자동 형광 거짓 긍정적인 읽기 최소화 필요 합니다. 설명된 프로토콜 격리 하 고 MP 속 정의 사용할 수 있습니다 그리고 그들의 마커 및 다른 자극 조건 하에서 구성 변화를 특징. 크기가 exosomes 대 막 입자의 내용 인지, 그리고 그들은 조직의 항상성에서 다른 역할을 수행할 여부를 조사 하기 위해 악용 될 수 있습니다. 마지막으로, 다음 격리 및 MPs, 세포질 응답에 있는 그들의 기능 및 다양 한 질병 모델 (등, PMN 관련 된 염증 성 질환, 염증 성 장 질환 등 심각한 폐 상해)의 특성화를 탐험 수 있습니다.

인간 으로부터 격리 되었고 PMNs 마우스 MPs의 대표적인 흐름 cytometric 분석은 그림 1에 표시 됩니다. PMN MPs의 크기가 비교 하 여 그림 1A, B와 같이 알려진된 크기의 구슬에 인간의 MPs. 참고에 대 한 평가 될 수 있다,이 질 크기에에서 상당한 차이가 마우스 및 인간의 MPs 사이 관찰 되었다. 마찬가지로, cytometry 및 형광 라벨을 사용 하 여, 단백질/s 마우스 또는 인간 근원의 고립 된 MPs에 의해 선택의의 식이 확인할 수 있습니다. 예를 들어 Phosphatidyl 떠들고 (PhS)의 표현 시험 될 수 있다 Annexin V 얼룩에 의해. Murine 골 PMN MPs 그림 1C, D에표시 됩니다. 선택의 여...

새로운 프로토콜 분리 하 고 인간에서 파생 된 미의 특성 설명 및 마우스 호 중구. 이러한 프로토콜 활용 ultracentrifugation, cytometry, 기술과 immunoblotting microparticle 콘텐츠를 분석 하 고 세포질 기능에 다양 한 셀 형식에서 파생 된 미의 역할을 연구 하기 사용할 수 있습니다.

절연 및 특성화 Neutrophil 파생 된 미의 기능 연구

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 기능 연구를 위해 호중구 유래 미립자를 분리하고 특성화하는 것입니다. 이 방법은 암, 염증 및 상처 치유를 포함한 다양한 생리학적 과정에서 세포-세포 통신에서 외세포 소포 또는 미립자의 역할에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 빠르고 비용 효율적이며 기능적 자산에서 미립자 또는 미소포의 p'henotypic 구성을 평가할 수 있다는 것입니다.제 연구실의 박사후 연구원인 Ariel Finkielsztein과 제 연구실의 학부생인 Joseph Lee가 절차를 시연할 것입니다. 쥐 골수 폴리모르포누클리어(PMN) 세포의 밀도 구배 분리를 위해 먼저 골수 세포 샘플당 15밀리리터 원추형 튜브 1개에 갓 준비된 실온, 밀리리터당 1.119그램의 밀도 용액 3밀리리터 위에 갓 준비된 실온, 1.077그램의 용액을 천천히 층을 이룹니다. 다음으로, 얼음처럼 차가운 PBS에서 갓 분리한 골수 세포 1ml를 각 튜브의 최고 밀도 구배층에 오버레이하고 밀도 구배 원심분리로 세포를 분리합니다.분리가 끝나면 PMN 밴드를 방해하지 않고 PBS와 각 튜브의 상위 밀도 구배층 사이의 계면에서 단핵 세포층을 조심스럽게 제거합니다. 전사 피펫을 사용하여 PMN 층을 시료당 하나의 새로운 15ml 튜브에 모으고 0.1미크론 주입 크기의 여과된 PBS를 사용하여 각 튜브의 최종 부피를 최대 15ml까지 가져옵니다. 원심분리로 PMN을 펠렛화한 후, 튜브당 2밀리리터의 새로 여과된 PBS에서 두 번째 원심분리를 수행합니다.그런 다음 계수를 위해 새로 여과된 PBS 1밀리리터에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 계수 후, 세포를 다시 원심분리하고, 1,000만 개의 세포당 관심 자극제를 보충한 0.1 미크론 붓기 크기의 여과된 HBSS의 100 마이크로리터에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 섭씨 37도에서 20-30분 동안 배양합니다.자극이 끝나면 원심분리를 통해 세포를 수집하고 cell-free 상등액을 샘플당 하나의 새로운 1.5 milliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 상층액을 원심분리하여 세포 파편을 제거하고, 세척된 상등액을 새로운 초원심분리 튜브로 옮긴 다음, 상등액을 초원심분리하고, 추가 실험 분석이 있을 때까지 섭씨 80도의 파라핀 밀봉 초원심분리기 튜브에 펠릿화된 미립자를 보관합니다. 미세입자를 쥐의 결장에 투여하려면 먼저 완전히 마취된 쥐를 엎드린 자세로 눕히고 생검 겸자와 고해상도 카메라가 장착된 내시경을 사용하여 결장의 등쪽을 따라 3-5개의 표재성 상처를 생성합니다.완전히 회복될 때까지 모니터링하면서 마우스를 케이지로 되돌립니다.24시간 후 내시경을 사용하여 마취 상태에서 입힌 상처의 이미지를 획득합니다. 그런 다음 대장내시경 기반 마이크로 주입 시스템을 사용하여 100마이크로리터의 HBSS에 재현탁된 실험용 PMN 미세입자를 각 상처 부위에 직접 투여합니다.PMN 미세입자의 크기 이질성은 미세입자를 알려진 크기의 유세포 분석 비드와 비교하여 평가할 수 있습니다. 입증된 바와 같이, 미세입자에 의한 관심 단백질의 발현은 유세포 분석으로도 검사할 수 있습니다. 이 실험에서는 활성제 자극 PMN 유래 미세입자에 의한 주요 염증 및 항염증 분자의 발현을 면역블롯으로 평가했습니다.PMN 미세입자가 상피세포 치유에 미치는 영향은 시험관 내에서 미리 결정된 시점과 생체 내에서 겸자 상처 후 생체 검사 후 생체 내에서 긁힌 상처 상피 단층의 이미지 획득을 통해 모니터링할 수 있습니다. 일단 마스터되면, 이 기술이 적절하게 수행된다면 PMN 유래 미립자를 4시간 이내에 분리할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 자극 전에 PMN을 얼음 위에 두어 조기 활성화와 미세 입자 손실을 방지해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 유세포 분석, 면역 블로팅 및 실시간 증식 반응 기술을 사용하여 다양한 자극 조건 하에서 또는 다른 기원 세포에서 마이크로입자 함량을 정의할 수 있습니다. 이 기술은 면역 반응, 장벽 기능, 조직 손상 및 복구, 암 진행의 조절에서 미세입자 기여의 역할을 조사하는 데 유용합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 쥐 미세입자를 분리하고 라벨링하는 방법과 생체 내 상처 치유 기능적 자산에 미세입자를 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.살아있는 동물과 함께 작업하는 것은 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하기 전에 항상 개인 보호 장비를 착용하고 적절한 안전 교육을 이수할 것을 제안하는 예방 조치를 잊지 마십시오.

isolation-characterization-neutrophil-derived-microparticles-for

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Neutrophils은 염증성 면역 반응의 사이트에 도착을 가장 먼저 세포 사이에하며, 그들의 기능과 메커니즘은 체외에서 광범위하게 연구되고있다. 우리는 상용 분리 미디어를 사용 전체 혈액에서 인간 neutrophils을 분리하기위한 기준 밀도 기울기 분리 방법을 보여줍니다.

호중구 격리 프로토콜

이 비디오는 호중구에서 단백질을 분리하여 추가로 처리되어 더 작은 펩타이드로 소화되는 과정을 보여줍니다. 이러한 펩타이드는 향후 분석에 사용할 수 있습니다.

호중구 단백질의 분리 및 소화(Isolation and Digestion of Neutrophil Proteins)

우리는 밀도 기울기 원심 분리하여 및 CellTracker 염료를 사용하여 호중구 라벨링 마우스 골수에서 호중구의 분리 및 정제를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스트림 기능 연구 또는 입양 전송 및 추적 실험 호중구의 큰 숫자를 얻기위한 간단하고 빠른 재생하고 경제적 인 방법을 나타냅니다.

분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

호중구는 침입하는 미생물에 대한 숙주 방어뿐만 아니라 종양 세포의 면역 감시에도 중요한 역할을 합니다. 여기에서는 항종양 특성을 가진 호중구의 분리와 관련된 기술과 in vitro 및 in vivo에서 항종양 호중구 기능을 모니터링하는 방법에 대해 설명합니다.

항 종양 특성을 가진 분리 및 호중구의 특성

호중구는 백혈구 중 가장 풍부한 유형입니다. 밀도 구배 분리 방법에 의한 인간 혈액에서 호중구의 분리 및 과립구 경로를 따른 인간 전골수구(HL60) 세포의 분화가 여기에 설명되어 있습니다. 항림프종제에 대한 림프종 세포의 민감도에 대한 역할을 테스트합니다.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

우리는 여기서 획득 및 호중구 유래 거 식세포의 새로운 특징 모집단을 식별하는 방법을 설명합니다. 이 세포는 신선한 인간의 혈액 호중구에서 문화를 개발하고, 식균 작용, 자식 작용, 상당히 큰 크기, 확장 된 수명을 특징으로한다. 이 방법은 또한 독특한 호중구 유래 모집단을 조사하기 위해 필수적이다.

인간 호중구 유래 거 식세포의 소설 모집단의 개발 및 식별 체외

이 연구에서 임상 기도 분 비 물이 나선형 관성 마이크로의 폐쇄 루프 작업에서 레이블 없는 호 중구 분리 방법을 설명 합니다. 제안된 된 방법 분석 실험 임상 생체 외에서 다양 한 호흡기 질환에 대 한 확장 이라고 합니다.

폐쇄 루프 관성 마이크로 사용 하 여 환자 파생 기도 분 비에서 레이블 없는 호 중구 농축

이 프로토콜은 전혈, 버피 코트 또는 백혈구 막에서 호중구를 분리하여 좋은 수율, 높은 순도 및 최소한의 세포 활성화를 달성하는 방법을 자세히 설명합니다. 그라데이션 정제, 적혈구(RBC) 퇴적물 및 RBC 용액을 활용하여 고품질/순도 호중구 제제를 획득합니다.

전신 혈액과 버피 코트에서 인간의 호중구의 격리

이 프로토콜은 다양한 신호 전달 경로의 기능을 포괄하는 스크리닝 방법으로 사용되는 호중구 기능 분석 세트를 특징으로 합니다. 이 프로토콜에는 세포 생존율, 순도, 활성 산소 종 생산, 실시간 이동, 식세포작용 및 호중구 세포외 트랩에 대한 예비 제안에 대한 초기 및 간단한 평가가 포함됩니다.

호중구 기능에 대한 간략한 개요를 위한 일련의 스크리닝 기법

여기에서는 자기 분리(negative selection) 및 불연속 밀도 구배 매체를 사용하여 전혈에서 저밀도 및 정상 밀도 호중구를 분리하기 위한 신뢰할 수 있는 접근 방식을 제공합니다. 이는 고순도 세포(≥93%)의 손대지 않은 분리를 보장하여 건강과 질병에서 호중구 하위 집단의 역할을 이해하는 데 중요한 호중구 하위 집단의 정확한 다운스트림 분석을 용이하게 합니다.

전혈에서 저밀도 및 정상 밀도 호중구의 분리 및 특성화(The Isolation and Characterization of Low- and Normal- Density Neutrophils from Whole Blood)

저밀도 호중구(LDN)는 여러 질병에서 크게 증가합니다. LDN은 일반적으로 세포 분류를 통해 분리됩니다. 순수하고 실행 가능한 LDN을 얻는 실용적인 방법을 제시합니다. 말초 혈액의 밀도 구배 원심분리 후 세포를 자성 마이크로비드와 함께 배양한 다음 LDN을 자기 컬럼을 통해 분리합니다.

저밀도 호중구의 효율적인 정제를 위한 신속한 자기-마이크로비드 방법

배우세요 중성구 유래 미세소포를 초원심분리 및 유동세포분석으로 분리하고 특성화하는 방법을. 이 기술은 면역 반응, 조직 손상 및 복구, 암 진행 연구에 활용됩니다.

절연 및 특성화 Neutrophil 파생 된 미의 기능 연구

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