호중구 격리 프로토콜

호중구 분리 프로토콜. 이 절차는 전혈 샘플 장비, 원심 분리기 및 바이알에서 백혈구를 추출합니다. Vortex Sir 바늘 및 주사기 주사기 필터.

Milli pour 브랜드 MX gv 0.22 마이크로 미터 재료. 행크 스펠과 염 용액 호중구 분리에는 두 가지 종류의 HBSS 용액이 필요합니다. 염화칼슘이 함유된 HBSS는 인간 혈청 알부민으로 용액을 만드는 데 사용됩니다.

염화칼슘이 없는 HBSS는 호중구를 현탁시키고 세척하는 데 사용됩니다. 이 절차에서 적절한 HBSS 솔루션을 사용하도록 특히 주의하십시오. 인간 혈청 알부민(HSA)은 pH와 SMO 압력을 유지하는 혈장 내 단백질입니다.

소 혈청 융합 적혈구 용해 완충액을 사용하지 마십시오. 이것은 Roche Diagnostics, 호중구 분리 매체, NIM Cedar Line Labs 림프 조명, Poly 분리 매체, 최상의 결과를 위해 빛으로부터 보호되고 냉장고에 보관됩니다. 모든 시약은 사용 시 실온에 있어야 합니다.

실험하기 1시간 전에 냉장고에서 시약을 꺼냅니다. 호중구 분리를 위한 H-B-S-S-H-S-A 용액을 준비합니다. 염화칼슘이 있는 HBSS를 바이알에 피펫으로 넣습니다.

HSA를 주사기에 주입합니다. 기포가 갇히지 않도록 하십시오. 주사기 바늘을 제거하고 필터로 교체하십시오.

다른 재료가 준비되고 실온에서 약 15ml의 전혈을 얻을 때 HBSS 바이알 와류 두 믹스에 HSA 스루 필터를 주입합니다. 이것은 10에서 15 밀리리터의 10 대 8 호중구를 산출합니다. 기증자는 혈액 샘플을 기증하기 전 24시간 동안 알코올이나 처방전 없이 구입할 수 있는 약물을 섭취해서는 안 됩니다.

이로 인해 분리 과정이 중단될 수 있습니다. 전혈은 제조업체의 지침에 따라 K, 3 EDTA, 구연산 나트륨 또는 헤파린에 혈액 9 부를 첨가하여 EDTA 구연산염 또는 헤파린으로 항응고시킬 수 있습니다. 이 절차에서는 다음 단계에 대해 설명합니다.

혈장과 단핵구를 분리하고 제거합니다. 적혈구를 용해하는 호중구층을 분리하고 획득하여 호중구를 먼저 분리합니다. NIM layer에서 호중구를 획득합니다.

원심분리기 튜브에 5ml의 분리 매체를 수집합니다. 분리 매체를 튜브의 아래쪽에 배치하면 원심분리기가 혈액을 조심스럽게 아래로 밀어 넣기 때문에 필터 역할을 할 수 있습니다. 깨끗한 분리를 위해 NIM 위에 5ml의 혈액을 겹겹이 쌓습니다.

용액이 혼합되지 않도록 각별히 주의하십시오. 이 단계를 천천히 조심스럽게 그리고 파이펫 팁을 분해 매체 표면 가까이에 두어 원심분리기가 혼합되지 않도록 하십시오. 500 RCF에서 35분 동안 용액.

섭씨 20도에서 25도에서는 혈액이 여섯 개의 뚜렷한 띠로 분리되어야 합니다. 6개의 밴드는 혈장 단핵구, 분리 배지, 호중구, 더 많은 분리 배지 및 하단의 적혈구 펠릿입니다. 이 6개의 띠가 명확하지 않고 뚜렷하지 않으면 분리 과정이 깨끗하지 않으므로 반복해야 합니다.

잘못된 분리의 일반적인 원인에는 오래된 격리 매체 기증자, 지난 72시간 동안 알코올을 섭취한 기증자 또는 타이레놀 또는 아스피린과 같은 다른 약물을 섭취한 기증자 등이 있습니다. 혈장 단핵구와 분리 배지를 조심스럽게 제거하고 폐기합니다. 이 층을 밀봉 가능한 튜브에 넣고 호중구층과 호중구 아래의 모든 분리 매체를 깨끗한 원심분리기 파일에 조심스럽게 피펫으로 버려 가능한 한 많은 호중구를 회수합니다.

아래 계층의 격리 매체 중 일부를 포함하는 것이 가장 쉬운 경우가 많습니다. 바닥에 있는 팔레트를 방해하지 마십시오. 두 번째 선언, 호중구층 정제.

호중구 용액을 칼슘이 없는 HBSS로 10ml로 희석합니다. 튜브를 몇 번 뒤집어 세포 원심분리기를 현탁시킵니다. 호중구 용액.

350 RCF를 10분 동안 사용합니다. 섭씨 20도에서 25도에서는 호중구와 잔류 적혈구가 들어 있는 튜브 바닥에 빨간색 펠릿이 있어야 합니다. 피펫으로 수프라 나틴을 제거합니다.

조심하세요. 바닥의 펠릿을 방해합니다. 적혈구를 용해시킵니다.

샘플의 적혈구는 이제 용해에 의해 파괴되어야 합니다. 잔여 적혈구를 용해하기 위해 2ml의 적혈구 용해 완충액을 튜브에 추가하여 소생시킵니다. 펠릿 와류를 바이알을 3-4로 설정하여 매달아 놓습니다.

와류 설정을 4 이상으로 높이면 호중구가 활성화될 수 있으므로 피하십시오. 몇 초 동안 소용돌이를 일으키거나 입천장을 녹이기 위해 소용돌이를 펄스해야 할 수도 있습니다. 용해 용액을 250 RCF에서 5분 동안 원심분리합니다.

소프트 스타트 옵션을 사용하여 시료 손상을 최소화합니다. 피펫으로 수프라 나틴을 제거합니다. 용해 과정을 반복합니다.

필요한 경우 호중구의 현탁액을 해제하고 각 튜브에 칼슘이 없는 500마이크로리터 HBSS를 추가합니다. 펠릿을 3-4로 설정하고 칼슘 원심분리기 없이 HPSS로 10밀리리터로 희석합니다. 250 RCF에서 5분 동안 호중구는 스내트를 흡인하고 버립니다.

HSA 용액을 사용하여 250 마이크로 리터의 HBSS에 펠릿을 2 배 10 대 6으로 다시 현탁시킵니다. 밀리리터당 호중구는 일반적으로 수집됩니다.