Name: 호중구 격리 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 배우세요 인간 전혈에서 호중구를 분리하는 밀도 구배 분리법을 사용하여 면역학 연구에 활용하는 방법입니다. 이 프로토콜은 염증 반응에서 호중구 기능을 연구하는 데 필수적인 기술을 제공합니다.

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호중구 격리 프로토콜 <ol><li> 상온 모든 시약을 가져와. </li><li> 원심 분리기 튜브의 호중구 격리 미디어 5.0 ML를 수집합니다. 분리 미디어를 통해 혈액 조심스럽게 층 5.0 ML. 천천히 그리고 신중하게, 그리고 혈액과 미디어를 혼합 피하기 위해 미디어의 표면에 가까운 피펫 팁이 단계를 수행합니다. </li><li> 20-25에서 35 분 500 RCF에서 원심 분리기 ° C. 플라즈마, monocytes, 절연 매체, neutrophils, 더 절연 매체, 그리고 적혈구 세포 펠릿 (그림 1) 피는 6 별개의 밴드 밖으로 분리한다. 이 밴드가 명확하지 않은 경우, 분리 과정이 깨끗하지 못한 반복해야합니다. </li><li> 조심스럽게 피펫을 사용하여 세 가지 레이어 (플라즈마, monocytes, 그리고 절연 매체)를 제거하십시오. 이러한 레이어의 배출. </li><li> 조심스럽게 neutrophils과 neutrophils 아래 격리 미디어의 모든 레이어를 피펫. 깨끗한 원심 분리기 튜브에 솔루션을 놓으십시오. </li><li> 칼슘 2 + / MG 2 + 않고 HBSS 10 ML에 호중구 솔루션을 희석. 세포를 일시 중 지할 수있는 튜브를 몇 번 반전. </li><li> 10 분 350 RCF에서 호중구 솔루션을 원심 분리기. 빨간 펠렛은 neutrophils 및 잔여 적혈구 (RBCs)를 포함, 튜브의 하단에 제시해야합니다. 신중하게 그래서 펠렛가 방해되지 않았음을 피펫으로 뜨는을 제거합니다. </li><li> 잔류 RBCs를 lyse하려면, 튜브 2 ML 레드 세포 용해 완충액을 추가합니다. 펠렛, 소용돌이 3-4의 설정에 병을 resuspend한다. 이것은 neutrophils가 활성화가 발생할 수 있으므로, 4 위의 소용돌이 설정을 증가하지 마십시오. 그것은 몇 초 동안 와동해야 할 수도 있습니다, 또는 펠렛을 분해하는 소용돌이를 &quot;펄스&quot;로. </li><li> 5 분 250 RCF에서 튜브를 원심 분리기. 피펫으로 뜨는을 제거합니다. 필요한 경우 lysing 과정을 반복합니다. </li><li> 칼슘 2 + / MG이없이 500 μl HBSS를 추가 + 각 튜브 수 있습니다. 다시 3-4의 설정에서 펠렛을 resuspend하는 소용돌이. 칼슘 2 + / MG 2 + 않고 HBSS 10 ML로 희석. </li><li> 5 분 250 RCF에서 튜브를 원심 분리기. 뜨는을 대기음 및 폐기. </li><li> 250 μl HBSS / HSA 솔루션 (2 % HSA)의 펠렛을 Resuspend. 전지는 다음 계산하고 원하는 농도로 조정할 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+leucocytes+from+blood+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Separation of leucocytes from blood and bone marrow.</a> Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).</li>
<li>England, J. M., Rowan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assignment+of+values+to+fresh+blood+used+for+calibrating+automated+blood+cell+counters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lab.+Haemat%22%5BJournal%5D)">The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters.</a> Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).</li>
<li>Garcia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+leukocyte+extraction+methods+for+cytomegalovirus+antigenemia+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay.</a> J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).</li>
<li>Ferrante, A., Thong, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+simultaneous+purification+of+mononuclear+and+polymorphonuclear+leucocytes+from+human+peripheral+blood+by+the+Ficoll-Hypaque+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method.</a> J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).</li>
</ol>

밀도 기울기 분리 방법은 나트륨 metrizoate와 Dextran 500의 혼합물을 사용하여 전체 혈액에서 인간 neutrophils을 분리하는 데 사용됩니다. 이 방법은 Ferrante과 통 (1980)에 의해 호중구 분리으로 바뀌었습니다 Boyum (1968)에 의해 mononuclear 백혈구 분리 방식에 따라 달라집니다. 기증자로부터 수집 후, 전체 혈액은 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 구연 산염, 또는 헤파린과 anticoagulated 수 있습니다. 그들은 짧은 - 살았되므로, neutrophils는 컬렉션의 2~4시간 이내에 사용해야합니다. 절차는 밀도 기울기 매체, 원심 분리, 호중구 계층의 분리, 그리고 잔류 적혈구의 용해를 통해 겹겹이 전체 혈액으로 구성되어 있습니다. 전지는 다음 씻어 계산하고, 원하는 농도 resuspended 있습니다. 여섯 밴드가 처음 원심 분리 단계 후에 별개하지 않는 경우, 분리 과정이 깨끗하지 못한 반복해야합니다. 깨끗한 분리, 절연 미디어가 만료되었거나 오염되지 않았는지 ...

<table><tbody><tr><td>Lymphocyte Poly(R)</td><td>시약</td><td>Cedarlane Labs</td><td></td><td>PolymorphprepTM을 대체제로 사용할 수 있음</td></tr><tr><td>염화칼슘이 포함되지 않은 Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인성 혈청 알부민(Human Serum Albumin)</td><td>시약</td><td>ZLB Bioplasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 버퍼(Red Cell Lysis Buffer)</td><td>시약</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>도구</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>볼텍스 믹서(Vortexer)</td><td>도구</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 및 벌브</td><td>도구</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolymorphprepTM</td><td>시약</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td>Lymphocyte-Poly (R)의 대체 시약</td></tr><tr><td>시린지 필터</td><td>기타</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td>Millex-GV, 0.22 &amp;#x03BC;m, PVDF, 33 mm, 감마 멸균 가능</td></tr><tr><td>염화칼슘이 포함된 Hank&amp;rsquo;s Balance Salt Solution</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

호중구 격리 프로토콜

Neutrophil Isolation Protocol

호중구 granulocytes polymorphonuclear (PMN)는 인간과 염증성 면역 반응의 사이트에 도착을 가장 먼저 세포 중 가장 풍부한 leukocytes 있습니다. 염증에서 중요한 역할로 인해, 이러한 운동, 시토킨 생산, phagocytosis, 그리고 종양 세포 전투로 호중구 기능이 광범위하게 연구하고 있습니다. neutrophils 짧은 - 살았하고 수집 2-4시간 이내에 사용해야합니다 특히 이후 neutrophils의 특정 기능을 특성화, 다른 혈액 세포에서 그들을 분리 깨끗하고, 빠르고, 안정 방법은, 체외 연구에서 위해 바람직합니다. 여기서 우리는 나트륨 metrizoate 및 Dextran 500의 혼합물이다 상용 분리 미디어를 사용 전체 혈액에서 인간 neutrophils을 분리하기위한 기준 밀도 기울기 분리 방법을 보여줍니다. 절차는 밀도 기울기 매체, 원심 분리, 호중구 계층의 분리, 그리고 잔류 적혈구의 용해를 통해 겹겹이 전체 혈액으로 구성되어 있습니다. 전지는 다음 씻어 계산하고, 원하는 농도 버퍼에 resuspended 있습니다. 제대로 수행되면,이 방법은&gt; 95 % 생존과&gt; 95 % neutrophils의 샘플을 항복을 보여줘왔다.

Neutrophils은 염증성 면역 반응의 사이트에 도착을 가장 먼저 세포 사이에하며, 그들의 기능과 메커니즘은 체외에서 광범위하게 연구되고있다. 우리는 상용 분리 미디어를 사용 전체 혈액에서 인간 neutrophils을 분리하기위한 기준 밀도 기울기 분리 방법을 보여줍니다.

호중구 다형핵 백혈구(PMN)는 인체에서 가장 풍부한 백혈구이며, 염증 부위에 가장 먼저 도달하는 세포 중 하나입니다.

호중구 분리 프로토콜. 이 절차는 원심분리기와 바이알을 사용하여 전혈 샘플에서 백혈구를 추출하는 과정입니다. 볼텍스 믹서, 바늘 및 주사기, 주사기 필터가 필요합니다.Millipore 브랜드 MX gv 0.22 µm 재질을 사용합니다. Hanks 균형염 용액(HBSS)을 이용한 중성구 분리에는 두 종류의 HBSS 용액이 필요합니다. 염화칼슘이 포함된 HBSS는 human serum albumin 용액을 제조하는 데 사용됩니다.염화칼슘이 포함되지 않은 HBSS를 사용하여 호중구를 부유시키고 세척합니다. 이 과정에서 적절한 HBSS 용액을 사용하도록 특별히 주의하십시오. 휴먼 세럼 알부민 또는 HSA는 pH와 삼투압을 유지하는 혈장 내 단백질입니다.bovine serum amalgamate red cell lysis buffer를 사용하지 마십시오. 이 제품은 Roche Diagnostics에서 제조하며, neutrophil Isolation Media NIM Cedar Line Labs Lymph light Poly separation media는 빛으로부터 보호하고 냉장 보관해야 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 모든 시약은 사용 시 실온 상태여야 합니다.실험 시작 1시간 전에 냉장고에서 시약을 꺼내십시오. 호중구 분리를 위한 H-B-S-S-H-S-A 용액을 준비하십시오. 염화칼슘이 포함된 HBSS를 바이알에 피펫으로 분주하십시오.주사기로 HSA를 흡입합니다. 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 주사기 바늘을 제거하고 필터로 교체합니다.필터를 통해 HSA를 HBSS 바이알에 주입하고 볼텍스로 두 번 섞습니다. 다른 재료들이 준비되어 실온 상태가 되면, 전혈 약 15 milliliters를 채취합니다. 이를 통해 10⁸ neutrophils가 포함된 10 to 15 milliliters의 시료를 얻을 수 있습니다. 기증자는 혈액 샘플을 기증하기 전 24시간 동안 알코올이나 일반 의약품을 섭취하지 않아야 합니다.이들은 분리 과정을 방해할 수 있습니다. 전혈은 제조사의 지침에 따라 혈액 9분량에 K₃EDTA sodium citrate 또는 heparin 1분량을 첨가하여 항응고 처리할 수 있습니다. 본 절차에서는 다음 단계들이 설명됩니다.혈장과 단핵구를 분리하여 제거합니다. 적혈구를 용해하여 적혈구가 제거된 호중구 층을 분리 및 획득하여 호중구를 1차 분리합니다. NIM 층에서 호중구를 획득합니다.원심분리관에 분리 배지 5 mL를 수집합니다. 분리 배지를 튜브 하단에 배치하면, 원심분리 시 혈액이 배지를 통과하여 아래로 강제로 이동하므로 필터 역할을 하게 됩니다. 깨끗한 분리를 위해 NIM 위에 혈액 5 mL를 조심스럽게 층을 이루어 쌓습니다.용액이 섞이지 않도록 매우 주의하십시오. 원심분리 시 혼합되는 것을 방지하기 위해, 피펫 팁을 분리 겔(resolving media) 표면에 가깝게 대고 이 단계를 천천히 그리고 조심스럽게 수행하십시오. 용액을 500 RCF에서 35분 동안 원심분리하십시오.20~25°C에서 혈액은 6개의 뚜렷한 층으로 분리되어야 합니다. 이 6개 층은 혈장, 단핵구, 분리 매질, 호중구, 추가 분리 매질, 그리고 바닥 부분의 적혈구 펠렛으로 구성됩니다. 만약 이 6개 층이 명확하고 뚜렷하게 구분되지 않는다면, 분리 과정이 정밀하게 이루어지지 않은 것이므로 다시 수행해야 합니다.분리가 제대로 되지 않는 일반적인 원인으로는 오래된 분리 배지, 공여자가 지난 72시간 이내에 알코올을 섭취했거나 Tylenol 또는 aspirin과 같은 다른 약물을 복용한 경우가 있습니다. 혈장, 단핵구 및 분리 배지를 조심스럽게 제거하여 버립니다. 이 층들을 밀폐 가능한 튜브에 넣고 주의해서 버리십시오. 최대한 많은 호중구를 회수하기 위해, 호중구 층과 호중구 아래의 모든 분리 배지를 깨끗한 원심 분리관으로 조심스럽게 피펫팅하여 옮깁니다.아래 층의 분리 배지를 일부 함께 포함하는 것이 가장 간편할 때가 많습니다. 바닥의 펠릿(pallet)이 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 두 번째 선언, 호중구 층을 정제합니다.칼슘이 포함되지 않은 HBSS를 사용하여 호중구 용액을 10 milliliters로 희석합니다. 튜브를 몇 번 뒤집어 세포를 부유시킨 후, 호중구 용액을 원심 분리합니다.350 RCF에서 10분간 원심분리합니다. 20~25°C에서 호중구와 잔류 적혈구가 포함된 붉은색 펠렛이 튜브 바닥에 형성되어야 합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다.주의하십시오. 적혈구를 용해할 때 바닥의 펠렛이 흐트러지지 않도록 하십시오.이제 시료 내의 적혈구를 용해시켜 제거해야 합니다. 남아 있는 적혈구를 용해하려면, 튜브에 적혈구 용해 버퍼 2 mL를 첨가하여 재부유시킵니다. 펠릿을 부유시킨 후, 바이알을 3~4 설정으로 볼텍싱합니다.중성구(neutrophils)가 활성화될 수 있으므로 볼텍스(vortex) 설정을 4 이상으로 높이지 마십시오. 펠렛(pellet)을 녹이기 위해 수 초 동안 볼텍싱하거나 짧게 반복하여 볼텍싱해야 할 수도 있습니다. 용해액(lysis solution)을 250 RCF에서 5분 동안 원심분리하십시오.시료의 손상을 최소화하기 위해 소프트 스타트(soft start) 옵션을 사용하십시오. 피펫으로 상층액을 제거합니다. 용해 과정을 반복합니다.필요한 경우, 호중구 현탁액을 분산시키기 위해 각 튜브에 calcium이 없는 HBSS 500 microliters를 추가합니다. 펠릿을 3에서 4 설정으로 볼텍싱하고, calcium이 없는 HPSS로 10 milliliters까지 희석한 후 원심분리합니다. 호중구를 250 RCF에서 5분 동안 원심분리한 뒤 상층액을 흡입하여 제거합니다.펠렛을 250 µL의 HSA 포함 HBSS 용액에 다시 현탁합니다. 일반적으로 mL당 2×10⁶개의 호중구를 수집합니다.

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 호중구-생물막 상호 작용을 연구하기 위한 체외 분석을 보여줍니다. 생물막에 내장된 병원성 세균과 분리된 호중구는 형광 표지를 사용하여 태그를 지정하고, 호중구에 의한 면역 반응과 박테리아에 의한 면역 반응 회피를 형광 현미경을 사용하여 평가했습니다.

호중구와 생물막 사이의 상호 작용을 연구하기 위한 체외 분석

이 비디오는 항호중구 세포질 항체가 포함된 환자 혈청을 사용하여 사전 라벨링된 호중구에서 호중구 세포외 트랩 또는 NET의 유도 및 시각화를 보여줍니다. 또한 불침투성 DNA 염료와 형광 현미경을 사용하면 NET을 시각화할 수 있습니다.

Induction and Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Pre-Labeled Neutrophils

다음 프로토콜에서 우리는 쉽게 사용할 시약을 사용하여 인간의 전체 혈액에서 호중구 세포 외 트랩 (그물을) 분리하는 아주 간단한 방법을 설명합니다. 우리는 그 다음 절연 그물 암세포 밀착성 시험 관내 분석에서 사용하는 방법을 보여준다.

단순화 된 인간 호중구 세포 외 트랩 (그물)의 분리 및 처리

호중구는 침입하는 미생물에 대한 숙주 방어뿐만 아니라 종양 세포의 면역 감시에도 중요한 역할을 합니다. 여기에서는 항종양 특성을 가진 호중구의 분리와 관련된 기술과 in vitro 및 in vivo에서 항종양 호중구 기능을 모니터링하는 방법에 대해 설명합니다.

항 종양 특성을 가진 분리 및 호중구의 특성

호중구는 백혈구 중 가장 풍부한 유형입니다. 밀도 구배 분리 방법에 의한 인간 혈액에서 호중구의 분리 및 과립구 경로를 따른 인간 전골수구(HL60) 세포의 분화가 여기에 설명되어 있습니다. 항림프종제에 대한 림프종 세포의 민감도에 대한 역할을 테스트합니다.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

우리는 여기서 획득 및 호중구 유래 거 식세포의 새로운 특징 모집단을 식별하는 방법을 설명합니다. 이 세포는 신선한 인간의 혈액 호중구에서 문화를 개발하고, 식균 작용, 자식 작용, 상당히 큰 크기, 확장 된 수명을 특징으로한다. 이 방법은 또한 독특한 호중구 유래 모집단을 조사하기 위해 필수적이다.

인간 호중구 유래 거 식세포의 소설 모집단의 개발 및 식별 체외

여기에서는 면역형광 이미지에서 NET를 정량화하기 위한 완전 자동 소프트웨어 옵션인 NEUTrophil 세포 외 트랩(NET)을 생성하고 NETQUANT를 운영하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

NETQUANT를 사용한 호중구 세포외 트랩의 자동 이미지 기반 정량화

이 프로토콜은 전혈, 버피 코트 또는 백혈구 막에서 호중구를 분리하여 좋은 수율, 높은 순도 및 최소한의 세포 활성화를 달성하는 방법을 자세히 설명합니다. 그라데이션 정제, 적혈구(RBC) 퇴적물 및 RBC 용액을 활용하여 고품질/순도 호중구 제제를 획득합니다.

전신 혈액과 버피 코트에서 인간의 호중구의 격리

이 정의된 프로토콜은 in vitro에서 인간 호중구 세포외 트랩(NET) 방출을 시각화하고 정량화하기 위한 실시간 고처리량 현미경 접근 방식을 설명합니다. 재현 가능한 방법을 통해 뚜렷한 NETosis 유도 인자를 자극 시 NET 방출의 특성과 동역학을 조사할 수 있으며 NETosis 길항제의 약리학을 평가할 수 있습니다.

Human Neutrophil Extracellular Trap release의 실시간 고처리량 현미경 정량화 및 길항제의 약리학 평가

여기에서는 자기 분리(negative selection) 및 불연속 밀도 구배 매체를 사용하여 전혈에서 저밀도 및 정상 밀도 호중구를 분리하기 위한 신뢰할 수 있는 접근 방식을 제공합니다. 이는 고순도 세포(≥93%)의 손대지 않은 분리를 보장하여 건강과 질병에서 호중구 하위 집단의 역할을 이해하는 데 중요한 호중구 하위 집단의 정확한 다운스트림 분석을 용이하게 합니다.

전혈에서 저밀도 및 정상 밀도 호중구의 분리 및 특성화(The Isolation and Characterization of Low- and Normal- Density Neutrophils from Whole Blood)

저밀도 호중구(LDN)는 여러 질병에서 크게 증가합니다. LDN은 일반적으로 세포 분류를 통해 분리됩니다. 순수하고 실행 가능한 LDN을 얻는 실용적인 방법을 제시합니다. 말초 혈액의 밀도 구배 원심분리 후 세포를 자성 마이크로비드와 함께 배양한 다음 LDN을 자기 컬럼을 통해 분리합니다.

저밀도 호중구의 효율적인 정제를 위한 신속한 자기-마이크로비드 방법

배우세요 인간 전혈에서 호중구를 분리하는 밀도 구배 분리법을 사용하여 면역학 연구에 활용하는 방법입니다. 이 프로토콜은 염증 반응에서 호중구 기능을 연구하는 데 필수적인 기술을 제공합니다.

호중구 격리 프로토콜

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