Name: 큰 볼륨 내에서 특정 세포 목표를 찾아내기를 위한 직렬 섹션의 복합 계층적 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 배우세요 조직 내 특정 세포 목표를 광학현미경과 주사전자현미경을 활용한 계층적 이미징으로 식별하는 방법입니다. 이 프로토콜은 세포생물학, 발달생물학, 신경과학 연구에서 고해상도 3D 초미세구조 분석을 가능하게 합니다.

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이 작품은 교육과 연구, 프로젝트 MorphiQuant-3 차원에 대 한 독일 연방 내각에서 그랜트 FKZ 13GW0044에 의해 지원 되었다. 기술 지원에 감사 Carolin Bartels 하 고.

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키트는 기판 홀더의 기능 모델의 공급에 대 한 Boeckeler 계기에 의해 환급 받았다. 마 탈 러 ZEISS 현미경 GmbH,이 문서에 언급 된 현미경 시스템의 제조 업체의 직원입니다. 또한, ZEISS ZEISS 아틀라스 솔루션 패키지 다양 한 현미경과 거짓말-sem의 악기에 대 한 큰 영역, 3D 이미징 응용 프로그램에 대 한 특정 솔루션을 제공합니다. 다른 모든 저자를 사용 없다 공개 수 있습니다.

대상 멀티 모달 계층에 의해 조직 내에서 특정 셀에 대 한 워크플로 시연 했다: 수 지에 포함 된 샘플 사용자 정의 설계 기판 소유자를 사용 하 여 전도성 기판에 배치 되는 직렬 섹션의 배열로 나누기입니다. fluorophore로 후는 FLM에서 이미징, 재건된 볼륨 대상 셀을 선택 하는 데 사용 됩니다. 후 추가 얼룩 대비 소개 중 금속 라운드, 이러한 목표는 SEM는 자동화 된 소프트웨어 플랫폼을 사용 하 여 나노 스케일 해상도에서 몇 백 섹션에 몇 군데는.
생산 몇 가지 긴 리본을 조밀 하 게 포장된 배열, 기판 홀더 여기에 설명 된 것과 비슷한가 필요 합니다. 유능 하 고 환자 사람 연결 하 여러 리본 실리콘 기판, 반 칼 보트에 열 중 하 고 리본 기판에 앉아있을 때까지 점차적으로 수 위를 낮추는 방법으로 배열을 검색할 수 있습니다. 그러나,에 있는 우리의 경험, 기판은 칼 보트 (1.3.2 프로토콜에서에서 참조 참고)의 어떤 부분을 만질 때 형성을 무 너 뜨 리는 경향이 있다. 또한,이 절차는 훨씬 더 어려운 ITO 코팅 기판: (1) 때문에 이토 유리의 투명도, 그것 보고 어렵습니다 물의 가장자리 리본 끝; 첨부 해야 (2) ITO 코팅 표면 고광택된 실리콘 웨이퍼 보다 훨씬 거칠어 있기 때문에, 리본 리프트- 작은 조각 몇 가지 섹션으로 구성 된 플 로트 수 있습니다, 따라서 섹션의 순서를 파괴 하는 동안 휴식 하는 경향이.
전체 워크플로 FLM 데이터에 상관 없이 가능한 이기도합니다. 이 경우에, sem에서 데이터 컬렉션 여러 세션에서 할 수 있습니다. 초기 3D 재구성 또는 적어도 낮은 또는 중간 해상도 데이터의 평가 대상 식별 해야 할 수 있습니다. 또한, 기존의 조직학 얼룩 명시 LM에 대 한 (안 필요한 FLM)을 적용할 수 있습니다. 물론, 다른 옵션6,7,8 은18에 초기 논문에서 이미 시연으로 배열에 라벨 또는 유전자 형광 성 단백질 (XFPs) 인코딩 또는 미리 라벨을 포함 하는 항 체 와 샘플 준비 중 형광의 보전.
설명한 방법의 일반적인 제한은 특정 두께의 섹션 및 3D 볼륨의 결과 개별 샘플링을 사용 하 여: SEM 섹션 표면 (d에서에서 유일한 데이터 수집 이후 Z 해상도 섹션의 두께 만큼 좋은 수 선택 기본 에너지/방문 에너지에 epending). 이 결과 3D 볼륨 이방성 복, 예를 들어있다는 뜻., 100 nm3 경우 100 x 5 x 5 nm 섹션과 이미지 픽셀 크기가 5 nm 사용 됩니다. 1 µ m 아래 크기 범위에서 아주 작은 요소,이 대 한 진정한 ultrastructural 충분 한 않을 수 있습니다. 더 기술적인 한계 이미징 자동 SEM에서 사용 하는 무대의 정확도 이다. 이 때문에, 전체 대상 지역 몇 군데 되도록 무대 정확도의 규격 보다 더 큰 ROI를 선택할 필요가 있다.
블록-얼굴 이미징 방법 SBF SEM과 거짓말-sem의에 비해, 상호에 위에서 설명한 대로 이방성 복의 결정적인 단점이 있다. 거짓말-SEM, 5 nm3 x 5 x 5의 등방성 복 적절 한 드리프트 보정 장소에 있을 때 얻을 수 있습니다.
배열의 준비 하는 동안 섹션의 손실로 인해 재건 볼륨에서 간격 SBF SEM와 거짓말-SEM. 발생 하지 문제가 있을 접착제에 의해 좋은 리본 안정화, 일반적으로 이것이 리본의 마지막 부분에 대 한 문제: 나이프는 속눈썹을 사용 하 여에서 그것을 풀어 놓을 때 손상 될 수 있습니다. 그러나, 우리의 경험의 모든 20-50 단원의 한 부분 손실 않습니다 하지 영향 이미지 등록.
다른 한편으로, 배열 후 얼룩 가능성 좋은 신호 및 SEM 이미징, 여기에 표시 된 루트 팁 냉동 고압 등 약하게 금속된 샘플에도 대비 수 여. 따라서, 수많은 화학 고정 및 금속 단계에 의해 최적의 ultrastructural 보존 타협을 필요는 없습니다. 또한, 중간 정도의 경화와 병 리 실험실에서 일상적인 샘플 우수한 데이터10제공합니다. 일반적으로 이러한 포스트 포함 대비 향상 SBF SEM과 거짓말-sem의 대 한 불가능 하다. 또한, 이러한 메서드는 파괴 하 고, 이후 즉, 이미징, 계층적 다른 해상도 및 사이트에서 이미징 또는 시간에서 나중에 지점에서 반복된 이미징 동안 샘플 사용 불가능 합니다. 원칙적으로, 무제한 볼륨, 큰 FOVs (예를 들어, connectomics에서 전체 마우스 두뇌에 대 한 여러 밀리미터까지)으로 구성 된 모자이크, 바느질에 의해 만들어지고 섹션의 거 대 한 숫자에 거짓말-SEM, 100 µ m x 100 µ m 넘어 FOVs에에서 의해 취득 될 수 있다 일상적인 악기와 함께 달성 하기 어렵다입니다.
SBF SEM과 거짓말-sem의 위에서 언급 한 방법 모두 단면화 및 완전 자동화 된 방식으로 같은 악기 내 이미징 수행 이후 설명에 워크플로 추가 자동화 확실 한 장점 것입니다. 단면 자동화의 한 종류 존재: Kapton 테이프를 사용 하 여 기판 등으로 배열 한 FLM에서 이미지 어렵다 하지만 The ATUMtome12 생성 하 고 수집 섹션의 수천 수 있습니다. 여기에 사용 되는 ITO 코팅 coverslips에 최고 해상도 영상 가능 해야 합니다. 자동화에 대 한 추가, 매우 바람직한 대상 FLM 데이터 스택 기록 될 것 이다. 다른 한편으로, 자동화 비쌀 수 있다 고 기판 홀더를 제외 하면 여기에 제시 된 워크플로 조건 (하드웨어)만 계측 일상적인 EM 실험실 또는 핵심 시설, 낮은 만들기에서 일반적으로 사용할 수 있는 액세스 수준.

조직 ultrastructural 해상도 큰 볼륨을 재구성을 위해 SEM에 따라 다른 이미징 방식의 번호 사용된1되었습니다: 포괄적인 리뷰는 사용할 수 있는 예., SBF SEM2, 거짓말-sem의3및 배열에 대 한 (에서)4의 tomography 후자의 방법 샘플 자료는 다양 한 기판에 직렬 섹션으로 유지 되지만, SBF SEM과 거짓말-sem의 파괴적인 방법이 있습니다, 샘플 블록에 노력 하 고 이미징 동안 그것을 사용. SEM에 수 지의 충전 때문에 그들은 또한 강력 하 게 금속된 샘플 블록5에 따라 다릅니다.
다른 한편으로, 특정 세포 또는 조직 샘플 내 관심의 구조 식별 특히 상호 빛과 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인)6,,78에서 이익 수 있습니다. FLM을 사용 하 여 대상에 대 한 걸이 형광 신호9를 끄다 것 때문에 많은 양의 중 금속의 응용 프로그램을 하겠습니다. 이러한만 약간 금속된 샘플에 대 한에 배열 될 수 있습니다 쉽게 후 무거운 금속으로 얼룩진 LM 이미징 후 이후 선택 방법입니다. 또한, 샘플의 거의 모든 종류에서 사용할 수 있습니다, 그리고 심지어 일상적인 샘플의 병리학에서 보물 가슴10.
또 다른 큰 장점은 계층적11 또는 다중 해상도 이미지12에 대 한 잠재력은: 모든 고해상도 이미지를 필요는 없습니다, 목표는 다른 형식 (예를 들어, FLM) 또는 선택할 수 있습니다 저해상도 SEM 이미지입니다. 만 재미 있는 지역 조직 또는 세포 인구에서 고해상도의 이미징 디지털 데이터 저장 공간을 절약 하 고 쉽게 처리 하는 작은 이미지 데이터 세트를 생성. 여기, AT 워크플로 오히려 약하게 금속된 샘플을 사용 하 여 설명 된다: 식물의 뿌리 (애기 thaliana) 냉동 고압 친수성 수 지에 포함 된.
배열 준비, 스테인드, 그리고 FLM에 SEM, 몇 군데 고 이미지 스택을 등록 하는 방법을 설명 합니다. 또한, FLM 볼륨의 3D 개조를 사용 하 여 나노 해상도 sem 이미징에 대 한 특정 셀을 선택 하는 방법을 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>Instrumentation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>RMC</td><td>PT-PC</td><td>대안: Leica UC7</td></tr><tr><td>기판 홀더</td><td>RMC</td><td>ASH-100</td><td>대안: 가정용</td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Diener</td><td>Zepto 40kHz</td><td>대안 : Ted Pella Pelco 또는 기타 벤치 탑 플라즈마 클리너 40kHz 발생기 (0-100W)가있는 Diener Zepto의 예제 매개 변수; 0.5mbar, 5sccm(공기), 10% 성능&nbsp;</td></tr><tr><td>광시야 형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer.Z1</td><td>대안: Leica, Nikon, Olympus</td></tr><tr><td>형광 필터 세트</td><td>Zeiss</td><td>43 HE (Cy3/DsRed)</td><td></td></tr><tr><td>대물 렌즈</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Neofluar 40x</td><td>&nbsp; 0.75 NA</td></tr><tr><td>GB 크기의 이미지 데이터를</td><td></td><td></td><td></td>처리할 수 있는 괜찮은 워크스테이션</tr><tr><td>FESEM</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 55</td><td>대안: FEI, JEOL, Hitachi, TESCAN</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Sectioning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Plano</td><td>T585-V</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 나이프 트리밍용 45도;</td><td>Diatome</td><td>DTB45</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 나이프 트리밍 90도;</td><td>Diatome</td><td>DTB90</td><td></td></tr><tr><td>점보 다이아몬드 나이프 절편</td>용 <td>Diatome</td><td>DUJ3530</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼 (개)</td><td>Si-Mat</td><td>맞춤형</td><td>도핑: P/Bor, 방향: < 100>, 두께: 525 & 25 &마이크로; m, 저항률 : 1-30 > 오메가; -cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td></tr><tr><td>ITO 코팅 커버 슬립</td><td>Balzers</td><td>유형 Z</td><td>22 &times; 22 &times; 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td></tr><tr><td>알루미늄 캐리어</td><td>맞춤 제작</td><td></td><td>76 &times; 26mm</td></tr><tr><td>웨이퍼 집게</td><td>Ideal-tek</td><td>34A.SA</td><td></td></tr><tr><td>스텁 집게</td><td>Dumont</td><td>0103-2E1/2-PO-1</td><td>Dumoxel-H 2E 1/2</td></tr><tr><td>다이아몬드 스크라이버</td><td>Plano</td><td>T5448</td><td></td></tr><tr><td>속눈썹/매우 부드러운 고양이 털</td><td>Selfmade</td><td></td><td>대안: Plano</td></tr><tr><td>Brush</td><td>Selfmade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pattex 접촉 접착제</td><td>Pattex</td><td>PCL3C</td><td>Kraftkleber Classic (황색)</td></tr><tr><td>Fixogum</td>캐리어에 <td>기판을 고정하기 위한</td> <td>Marabu</td><td>290110001</td></tr><tr><td>접착 테이프</td><td>3M</td><td>851</td><td>캐리어에 기판 고정용</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Bernd Kraft</td><td>07029.4000</td><td></td></tr><tr><td>크실렌</td><td>Carl Roth</td><td>4436</td><td>접착제 혼합물용 희석제</td></tr><tr><td>Rotihistol</td><td>Carl Roth</td><td>6640</td><td>대안, 리모넨 기반 희석제</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image processing</td><td>Open source</td><td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td><td></td></tr><tr><td>Image acquisition</td><td>Zeiss</td><td>Atlas 5 AT (Zeiss SEM용 모듈)</td><td>자동 이미지 획득을 위한 대안: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>원액: 0.1% 아지드화나트륨</td></tr><tr><td>우라닐아세테이트</td> 중 1.5mM <td>Science Services</td><td>E22400</td><td></td></tr><tr><td>리드(II) 질산</td><td>염 머크</td><td>107398</td><td></td></tr><tr><td>트라이 구연산나트륨 이수화물</td><td>머크</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 펠릿</td><td>머크</td><td>106469</td><td></td></tr><tr><td>1M NaOH 용액</td><td>Bernd Kraft</td><td>01030.3000</td><td></td></tr><tr><td>유리 페트리 접시</td><td>Duran</td><td>23 755 56</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Mounting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stubs</td><td>Plano</td><td>G301F</td><td></td></tr><tr><td>카본 패드</td><td>Plano</td><td>G3347</td><td></td></tr><tr><td>구리 테이프</td><td>Plano</td><td>G3397</td><td>양면 접착제, 전도성</td></tr><tr><td>실버 페인트</td><td>Plano</td><td>G3692</td><td>Acheson Elektrodag 1415M</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solutions/mixtures</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>코팅</td><td></td><td></td>용 접착제 혼합물 <td>Pattex 접촉 접착제/크실렌을 더 얇게 만들고 비율 1:3. (크실렌 대체품: Rotihistol)</td></tr><tr><td>Reynolds Lead citrate</td><td></td><td></td><td>50 mL: 1.33 g의 질산납(II)을 dH2O. 10 ml에 3sodium citrate dihydrate 1.76 g을 용해 dH2O. mix 용액이 투명해질 때까지 1M 수산화나트륨을 추가합니다. dH2O를 50mL에 채웁니다.</td></tr><tr><td>Propidium iodide 염색 용액</td><td></td><td></td><td>적절한 혼합을 위해 dH2O. Vortex의 재고에서 1:1500 희석을 준비합니다.</td></tr><tr><td>수성 우라닐 아세테이트</td><td></td><td></td><td>3 % 우라닐 아세테이트를 dH2O에 용해시킵니다(완전히 혼합).</td></tr></tbody></table>

큰 볼륨 내에서 특정 세포 목표를 찾아내기를 위한 직렬 섹션의 복합 계층적 이미징

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

혼합된 셀 인구 또는 조직 내에서 ultrastructural 해상도에서 특정 셀을 대상으로 하는 것은 계층적 이미징 빛과 전자 현미경의 조합을 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 수 지에 포함 된 샘플 배열 ultrathin 섹션의 수백의 리본 메뉴의 구성으로 구분 되며, 실리콘 웨이퍼 또는 導 코팅된 coverslips의 조각에. 어레이 낮은 해상도 fluorophores 후 스마트폰 카메라 또는 급속 한 큰 지역 개요에 대 한 가벼운 현미경 (LM) 또는 넓은 분야 형광 현미경 (형광 가벼운 현미경 검사 법 (FLM)) 같은 디지털 소비자를 사용 하 여 몇 군데. 중 금속으로 얼룩 후, 후 배열 스캐닝 전자 현미경 (SEM)에 몇 군데는. 대상 선택 FLM에 의해 생성 된 3 차원 복원 또는 아무 형광 마커를 사용할 수 있는 경우 중간 해상도 SEM 이미지 스택에서 만든 3D 개조에서 가능 하다. Ultrastructural 분석에 대 한 선택된 대상 마지막으로 고해상도에서 SEM에 기록 됩니다 (몇 나노미터 이미지 픽셀). 리본 처리 도구 어떤 ultramicrotome에 개조 될 수 있는 시연입니다. 그것은 배열 생산 및 단면 칼 보트에서 기판 제거와 함께 도움이 됩니다. Sem에서의 배열 자동된 이미징 허용 하는 소프트웨어 플랫폼을 설명 합니다. 직렬 블록-얼굴 SEM (SBF-SEM) 집중 된 이온 빔 SEM (거짓말-SEM) 등의 큰 볼륨 그들 데이터를 생성 하는 다른 방법에 비해이 방법은 두 가지 주요 이점이 있다: (1) 수 지에 포함 된 샘플은 보존, 이기는 하지만 썬 업 버전. 그것은 다른 방법으로 얼룩진 고 다른 해상도로 촬영 될 수 있습니다. (2)로 섹션 후 얼룩이 질 수 있다, sem의 이미징에 대 한 대비를 소개 하는 조직 블록 전도성 렌더링 중 금속으로 샘플 강하게 블록 스테인드를 사용 하 여 필요는 없습니다. 이것은 메서드를 사용 하면 다양 한 재료와 생물학 질문에 적용할 수 있습니다. 특히 사용된 자료 예를 들어, 생 은행 및 병 리 실험실에서 수 있습니다 직접 포함 되며 3d에서 재구성.

워크플로 수 지 블록에 포함 된 샘플 (그림 1) 시작을 여기 설명 합니다. 샘플 준비 하는 동안 일부 중 금속은 조직에 도입 되어야 하지만 그것은 오히려 강한 금속에 대 한 최적화 된 프로토콜을 사용 하 여 필요가 없습니다. 그림 1A (유채과 야채) 블록-스테인드 통상 1% OsO4 와 1 %uranyl 아세테이트, 그림 1B 에서 애기 루트는 약하게만 메탈 0.5 %uranyl 아세테이트를 사용 하 여 식물 뿌리를 보여 줍니다. 형광 담금질 하는 경향이 일부 중 금속 후자 샘플 유형 상호 접근에 대 한 가장 적합 하다. 몇 백 섹션의 배열 수 있는 전용된 기판 홀더 (그림 2)와 (그림 1C)을 생산. 형광 라벨 후 같은 배열 표준 넓은 필드 FLM (그림 1D)에 몇 군데 다음 헤비 메탈 솔루션 스테인드 되며 다른 해상도 (그림 1E-G) SEM에 몇 군데.
배열, 재현할 수 세대에 대 한 중요 한 도구는 기판에 톰의 칼 보트에서 여러 리본을 배치 하는 경우에 특히는 기판 홀더 (그림 2A, 저자의 연구실에 맞춤형)와 점보 다이아몬드 현미경 슬라이드 (그림 2B)에 맞게 충분히 큰 보트 칼. 리본의 좋은 관측 수 평면 초승달 모양 필요 하 고 플라즈마 기판의 청소에 의해 달성 될 수 있다: 증류수의 작은 물방울 그림 2C (치료 기판)에서 기판에 렌즈 모양의 구조를 형성 한다 박막 (그림 2D, 플라즈마 활성화 기판) 하지만. 이러한 조건 하에서 ITO 코팅 coverslip의 마른 부분에 부착 된 리본은 쉽게 시각화 (그림 2E)와 관찰 하 고 수 물에서 기판의 리프트 아웃 동안 제어.
예를 들어, 배열 propidium 요오드 화물 식물 세포 벽을 물 들일 표준 넓은 필드 FLM (그림 3A)와 몇 군데 있었다. 이후 섹션은 100 nm 두께, 심지어 과도 같이 얼룩 약간 모호 하 게 소개. 등록 후, 완전히 복원 된 볼륨에 포함 된 두 개의 셀 3d에서 고해상도 이미징 이미지 스택 (그림 3B)에서 선정 되었다 (참고 추가 영화 S1). 추가 uranyl 아세테이트 및 리드 시트르산과 얼룩, 다음 배열 몇 군데는 SEM. 개요, 60 nm 이미지 픽셀; 기록 표시 그림 3 C 이미지의 중앙에 어두운 광장 어디 자동 초점 기능, 실행 하 고 추가 복용량 약간의 오염에 지도 위치를 나타냅니다. ROIs 그 직렬 섹션 (조각 51 248 435 조각의 총에서)에 적합 한 5 nm 이미지 픽셀 크기 다음 기록 된 FLM 스택에서 선택한 두 개의 대상 셀을 포함 하 (그림 3D; 보충 영화 S2참고).
여기에 설명 된 sem에서 배열의 자동화 된 계층적 이미징 소프트웨어/하드웨어 플랫폼 솔루션 ZEISS 아틀라스 5로 이루어졌다. 전체 배열에 대 한 개요와 SE 검출기를 사용 하 여 만들어진 첫째, 매우 큰 (1000 nm) 이미지 픽셀 및 매우 낮은 유지 시간 (그림 4A). ROI만 조직 개요 첫 번째 섹션에 배치 하 고 배열의 다른 모든 섹션에 전파 했다. 이 섹션 세트 60 nm 이미지 픽셀 (그림 4B) 긴 망설임 시간을 사용 하 여 다음 기록 했다. 마지막으로, 두 대상 셀에 1을 더한 단계 부정확, 담당 하는 세포를 둘러싼의 "레이어"를 포함 하는 사이트 집합 다음 매개 변수를 설정 했다: ESB (에너지 선택적 후방 산란) 검출기, 5 nm 이미지 픽셀, 아주 긴 (40 µs) 면만 시간 ( 그림 4C). 이러한 이미지를 확대 subcellular 세부 사항 (그림 4D) 그들 (V), 미토 콘 드리 아 (M), 핵 (N), 및 바인딩과 그물 (화살표) 등을 보여 줍니다. 또한 하나의 목표 셀의 subcellular 세부 사항에 전체 배열에 대 한 개요에서 확대에 대 한 보충 영화 s 3 을 참조 하십시오.
여기 (200 섹션)에 표시 된 배열 플러스 추가 250 섹션 중 약 8 h 생산 했다, LM, 그리고 언젠가 FLM에 (수동으로) 기록에 대 한 얼룩 한 밤. 후 얼룩 개별 배열 수에 따라 총에서 약 1-2 시간 걸립니다. Sem의 녹음에 대 한 몇 시간 아틀라스 실행 설정 및 자동된 녹음은 3-4 h 중간 해상도 (60 nm 픽셀 크기) 섹션 세트 (200 섹션, 450 x 200 µ m2) 및 고해상도 (5 nm 픽셀 크기)에 대 한 약 5 일 투자 수익 (200 섹션, 55 x 30 µ m2) 두 개의 대상 셀을 포함 하. Note는 여기에 표시 된 샘플의 낮은 금속 내용으로 인해 매우 느린 검색 속도 고해상도 투자 수익에 대 한 40 µs의 드웰 타임 (현재 사용할 수 있는 탐지기)에 대 한 암시는 좋은 신호 대 잡음 검출을 도달 하는 데 사용할 했다.
일부의 단계에서 전체 워크플로 경향이 함정: 이상적으로 리본 더 많거나 적은 직선과 (그림 5A) 올바른 순서로 배치 해야. 그러나, 구부러진 (그림 5B), 곡선된 (그림 5D), 또는 심지어 깨진된 리본 종종 생산 됩니다. 이 비대칭 또는 unevenly 침투 샘플에서 뿐만 아니라 잘못 된 트리밍 (선도 및 정확 하 게 병렬), 또는 비-균일 하 게 적용된 접착제, 발생할 수 있습니다. 특히 성가신 샘플은 부드럽고 매우 하드 구성 요소가 포함 된. 후자의 구성 요소 (그림 5C) 여기에 표시 된 식물 뿌리의 세포 벽과 같은 침투 하기 어려울 수 있습니다. 이 경우, 주름 (화살촉) 가변 압축 및 단면 동안 휴식에 의해 쉽게 발생할 수 있습니다. 대 한 sem에서 이미지, 자동 곡선된 리본 되지 않습니다 큰 문제 이후는 ROIs 리본의 곡률에 맞게 회전 될 수 있습니다.
프로토콜에서 다른 중요 한 단계 얼룩: 부적절 한 세척 잔류물 (그림 5E, F), 섹션에서 발생할 수 있고 최악의 경우 ( 그림 5 층에 두 개의 대상 셀 중 하나에 원) 가장 흥미로운 영역을 커버. 또한, 먼지 (그림 5D, 강하게 산란 입자) 더러운 기판 캐리어와 함께 칼 보트, 예를 들면에 소개는 심각한 문제가 발생할 수 있습니다: FLM, 먼지는 높은 형광 수 (cf. 보충 영화에에서 몇 조각 S1) 일부 등록 알고리즘 작동 하지 않습니다에 같은 정도. 그러나, TrakEM17 에 "정렬" 기능 추가 영화 s 1에서 같이 이러한 스택을 처리할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig1.jpg"> 그림 1: 워크플로 상호 계층적 이미징. 수 지 블록 (A, 강력 하 게 증 착된 샘플)에 포함 된 샘플에서 시작, 샘플 첫 손질된 (B, 약하게 금속된 샘플) 이며 다음 배열 직렬 섹션 (C)의 여러 개의 리본으로 구성 된, 여기에 배치 된 ITO 코팅 coverslip ultramicrotome는을 사용 하 여 생산 됩니다. 형광 염료와 염색, 후 이미지의 넓은 필드 FLM (D)에 기록 됩니다. 소금 추가 라운드 중 금속 얼룩 후 스택은 몇 군데 SEM (E-G)에서 다른 해상도 (이미지 픽셀 크기). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig2.jpg"> 그림 2: 배열의 준비 도구. 표준 ultramicrotome (A)에 연결 하는 움직임의 7 축 micromanipulators에서 조립 하는 기판 홀더: 나사, 동그라미, 강조는 (1) 수직 및 수평 운동 (2) 및 (3) 기판 캐리어의 기울이기 . 여기 슬라이드 크기의 알루미늄 캐리어 (B)에 장착 된 플라즈마 활성화 실리콘 웨이퍼의 조각으로 대형 기판 (화살표)를 맞게 특대 보트 점보 다이아몬드 칼. 20 µ L 방울 증류수 치료 실리콘 웨이퍼 기판 (C) 또는 플라즈마 활성화 기판 (D)에 배치. 4 리본 칼 보트에 떠 있는 그들의 낮은 끝에 의해 이토 코팅 coverslip에 연결 된. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig3.jpg"> 그림 3: LM 데이터와 sem의 데이터의 상관 관계. FLM (A, B)와 (A, C) 개요 및 대상 셀 (B, D) 기록 및 SEM (C, D). (B) 소프트웨어 줌 이며 원래 데이터 기록 했다 1,388 x 1040 화소 카메라 칩에 40 X 객관적 렌즈와 60 nm 이미지 픽셀 크기, 및 (D) (C)는 기록 하는 동안 5 nm 이미지 픽셀 크기를 보여주는 진정한 해상도 SEM.에 있는 증가 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig4.jpg"> 그림 4: 계층적 ZEISS 아틀라스 5 제공을 사용 하 여 sem에서 이미지 배열 개요 1000 nm 이미지 픽셀 SE 검출기 (A)를 사용 하 여 기록. 섹션은 모든 섹션에서 조직에 배치 하 고 60 nm 이미지 픽셀 (B) 기록 수익 설정 합니다. 사이트 설정 직렬 수익 대상 셀에 배치 하 고 5 nm 이미지 픽셀 (C)와 함께 기록 합니다. (D) 같은 고해상도 이미지로 확대, 그들 (V), 핵 (N), 미토 콘 드리 아 (M), 및 바인딩과 그물 (화살표) 같은 세포내 막 구획 표시 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig5.jpg"> 그림 5: 전형적인 문제. 1. 단면 과정에서 발생 하는: 구부러진 (B) 또는 곡선된 리본 (D), 또는 심지어 주름 (C) 리본 이토 코팅 coverslips 이상적으로 직선 (A), 하지만 불규칙 압축 단면 중에 발생할 수 있습니다. 2. 단면 및 얼룩 동안 기판 및 물, 예를 들면에 리본 처리로 인 한: 빛 입자를 기판 (D)에 뿌리고, 섹션 e에서(원), 또는 먼지에 물방울의 가장자리 조직 부족 때문에 밖으로 얼룩져 (F) 얼룩 후 세척. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 S1: FLM 이미지 스택. 435 이미지 피지16 TrakEM17 를 사용 하 여 정렬 하 고 동영상 파일 (.avi)로 저장 됩니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS1.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 S2: SEM 이미지 스택. 210 이미지 피지16 TrakEM17를 사용 하 여 정렬. 이 데이터 집합의 원래 스택 (300 이미지) 15 기가바이트 했다. 3.3 GB에서 스택 (정렬 하 고 두 셀을 대상만을 자르기) 후 소형화, 그것은 x에 확장 했다 y 0.2의 요인에 의해 피지를 사용 하 여 및 다음.avi 동영상으로 저장. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS2.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 S3:는 SEM.에서 다른 해상도 수준으로 확대 영화에서 만들어지고.mp4 형식에서 아틀라스 5 소프트웨어에서 내보낸. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS3.mp4">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 프로토콜 이미징 나노 해상도 스캐닝 전자 현미경 (SEM)을 사용 하 여 조직에서 특정 셀을 대상. 가벼운 현미경 목표를 식별 하 고는 SEM.에서 계층적 방식으로 다 수 생물학 물자 수 지 포함에서 직렬 섹션의 처음 몇 군데

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

이 워크플로우의 전반적인 목표는 광학 현미경을 사용하여 조직 내에서 초구조적 이미징을 위한 특정 표적을 식별한 다음 매우 높은 해상도의 SEM에서 3D 이미징을 수행하는 것입니다. 여기에 소개된 이미징 워크플로우는 세포 생물학, 발달 생물학, 신경 과학 또는 병리학과 같은 여러 분야에서 세포 또는 조직 미세 구조에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 실제로 어레이 단층 촬영을 기반으로 하는 이 기술의 주요 장점은 조직을 연속 절편의 어레이로 절단하면 처음에 원래 샘플 부피 내에 묻혀 있는 경우에도 표적 구조를 쉽게 식별할 수 있다는 것입니다.어레이 단층 촬영은 원래 신경 과학의 맥락에서 도입되었지만, 박테리아, 식물, 동물 및 병리학 환경에서 환자 샘플을 포함한 광범위한 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 방법을 처음 사용하는 개인은 많은 연속 섹션을 수집하는 것이 매우 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 추가 지원 없이 작업하면 섹션이 손실되거나 리본이 엉망이 될 수 있습니다.이쑤시개에 고정된 몇 개의 머리카락으로 만든 작은 브러시를 사용하여 미리 다듬어진 블록의 앞면과 후방을 접착제 혼합물로 조심스럽게 코팅합니다. 이 혼합물의 용매는 몇 초 내에 증발하기 때문에 이 단계를 빠르게 수행하십시오. 샘플이 건조되는 동안 실리콘 웨이퍼 조각을 나이프 보트에 맞는 크기로 자르고 다이아몬드 스크라이버로 표시합니다.그런 다음 이소프로판올과 보푸라기가 없는 티슈로 실리콘 웨이퍼를 수동으로 청소합니다. 탈착식 접착제를 사용하여 캐리어 플레이트의 한쪽 끝에 기판을 고정합니다. 일단 설정되면 플라즈마는 친수성 표면을 얻기 위해 공기와 함께 글로우 방전을 사용하여 기판을 활성화합니다.장착된 기판이 나이프 가장자리에 더 가깝게 캐리어를 cl에 삽입합니다.amp 기판 홀더의. 그런 다음 점보 다이아몬드 나이프를 나이프 홀더에 삽입하고 클리어런스 각도를 0도로 설정합니다. 그런 다음 나이프 보트에 증류수를 채웁니다.칼이 샘플에서 1-2mm 떨어지도록 칼에 접근합니다. 그런 다음 기판 홀더의 나사 1-3을 사용하여 기판을 물 속으로 내립니다. 급수관이 기판의 상단 1/3에 있는지 확인하십시오.실리콘 웨이퍼를 사용할 때 지상고를 보기 어렵기 때문에 바닥에 닿는 느낌이 들 때까지 기판을 내립니다. 그런 다음 기판을 약간 올립니다. 절단하는 동안 기판이나 캐리어가 나이프 보트에 닿지 않도록 하십시오.다음으로, 주사기나 피펫을 사용하여 보트의 수위를 조정합니다. 쌍안경을 통해 보면서 물 표면의 전체 영역이 초박 절기의 상단 조명 조명의 균일한 반사를 보일 때까지 물을 추가하거나 제거합니다. 설정이 완료되면 샘플 절편화를 시작합니다.여러 부분을 자르면 절단 과정을 중지하고 속눈썹이나 매우 부드러운 고양이 털로 칼 끝을 부드럽게 쓰다듬어 칼날에서 리본을 풀어줍니다. 리본을 기판 쪽으로 조작하고 리본의 첫 번째 부분을 부드럽게 밀어 기판의 건조한 부분에 부착합니다. 샘플을 계속 절단하고 리본을 기판에 부착합니다.기판의 한쪽에서 시작하여 각각의 새로운 리본을 사용하여 다른 쪽으로 점차적으로 이동합니다. 기판이 리본으로 완전히 덮이면 기판 홀더의 미세 조작기 나사를 사용하여 나이프 보트에서 기판을 부드럽게 들어 올립니다. 리본 어레이를 건조시킨 다음 먼지가 없는 환경에 보관하십시오.건조 후 캐리어에서 가능한 한 빨리 접착제가 장착된 기판을 제거하십시오. 그런 다음 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 광학 현미경을 위해 샘플을 염색하고 이미징을 수행합니다. 다음으로, 전자 현미경을 위해 샘플을 염색하고 끈적한 탄소 패드로 알루미늄 스터브에 장착합니다.이제 전계 방출 주사 전자 현미경에서 이러한 어레이를 이미지화합니다. 충전을 피하려면 3kV 이하의 1차 전자 에너지와 50에서 800 피코암페어 사이의 빔 전류를 사용하십시오. ITO 코팅된 유리 커버 슬립을 사용하는 경우 구리 테이프와 은색 페인트로 전도면을 현미경 캐리어에 연결합니다.계층적 이미징 캐스케이드의 첫 번째 단계는 개별 섹션을 인식할 수 있는 방식으로 어레이의 개요를 생성하는 것입니다. 먼저 약 100배의 낮은 배율로 각 모서리의 이미지를 그래프로 표시하여 배열의 네 모서리를 정의한 다음 전체 배열을 둘러싸는 ROI를 만듭니다. 다음 매개 변수를 사용하여 이 ROI에 이미징 프로토콜을 할당합니다.약 0.2마이크로초의 짧은 체류 시간을 사용하여 고속 이미징을 위해 2차 전자 검출기를 사용합니다. 큰 이미지 픽셀 크기와 2000 x 2000 픽셀의 타일 크기를 선택합니다. 그 결과 매우 노이즈가 많은 이미지가 생성되지만 여기에서도 단면 내의 조직이 보입니다.그런 다음 관심 영역을 만들어 첫 번째 섹션의 조직만 간략하게 설정하여 단면 세트를 생성합니다. 스탬프 도구를 사용하여 모든 후속 섹션에 복제합니다. 구부러진 리본을 수용하기 위해 필요한 경우 관심 영역을 회전합니다.조직의 하부 구조를 가장 잘 표시하는 섹션에 프로토콜을 할당합니다. 여기서, 60나노미터의 중간 픽셀 크기, 12000 x 12000 픽셀의 타일 크기, 3.2마이크로초의 체류 시간을 사용하였다. 품질이 좋지 않기 때문에 선택한 몇 개의 셀을 설명하는 두 번째 섹션 세트는 더 작은 픽셀 크기와 더 민감한 검출기를 사용하여 생성되었습니다.이제 두 개의 대상 셀을 매우 잘 인식할 수 있습니다. 더 높은 해상도의 SEM 이미징을 위한 표적 구조를 포함하는 섹션 세트 내에 사이트 세트를 생성합니다. 준비된 정밀도를 설명할 수 있을 만큼 관심 영역을 크게 만듭니다.사이트의 위치를 확인하고 조정합니다. 많은 섹션이 이미지화되는 경우 자동 튜닝이 필요합니다. 중심이 구조적 세부 사항(예: 액포)이 없는 빈 재료에 놓이지 않도록 관심 영역을 배치하는 것이 중요합니다.다음으로, 자동 초점 설정을 정의하고 이미징할 사이트에 가까운 작은 관심 영역에서 리본 길이에 대한 이미징 성능을 확인합니다. 그런 다음 고분해능 SEM 획득을 위한 이미징 프로토콜을 정의합니다. 멤브레인 구획을 보려면 3나노미터에서 5나노미터 사이의 이미지 픽셀 크기를 선택합니다.영상에 너무 노이즈가 발생하지 않도록 검출기에 따라 체류 시간을 선택합니다. 스테이지는 이 섹션과 이 섹션을 기록하는 사이에 먼 거리를 이동해야 하기 때문에 check protocol 옵션을 사용하여 각 리본의 적어도 첫 번째 섹션에서 초점 값을 정의합니다. 그런 다음 관심 대상 영역의 전체 시리즈에 대해 자동화된 SEM 이미징을 시작합니다.완료되면 획득한 데이터를 이미지 시리즈로, 가급적이면 TIF 형식으로 내보냅니다. 이미지 시리즈를 피지에 가상 스택으로 가져올 수 있습니다. 다음으로, 관심 있는 구조에 최대한 가깝게 영역을 잘라 추가 처리를 위해 스택을 자릅니다.또한 밝기와 대비를 조정하고 스택을 저장합니다. 자르고 최적화되면 파일 메뉴에서 새 TrakEM을 엽니다. 이미지 필드를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 스택을 레이어당 하나의 슬라이스로 TrakEM에 가져옵니다.마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 Align layers를 선택합니다. 최소 제곱을 모드로 선택하고, 첫 번째에서 마지막 범위를 설정하고, 참조로 none을 선택합니다. 그런 다음 기본 설정 값을 선택하고 원하는 변환으로 Rigid를 선택합니다.등록이 완료되고 만족스러우면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Export를 선택하여 정렬된 데이터 세트를 저장합니다. 평면 이미지를 만들고, 첫 번째 이미지에서 마지막 이미지까지의 범위를 설정하고, 소프트웨어가 결과 스택을 표시하도록 합니다. 완료되면 스택을 TIF 형식으로 저장합니다.준비 후 섹션 배열은 직렬 섹션의 여러 리본으로 구성된 배열로 나타납니다. 이 섹션에서는 프로피듐 요오드화물로 염색된 애기장대 뿌리 팁의 개요를 보여줍니다. 이 샘플의 순차적 섹션은 프로토콜에 설명된 대로 정렬되고 결합되어 샘플을 3D로 단일 동영상 파일로 표시했습니다.여기에서 나중에 SEM에서 나노미터 해상도로 이미지화될 두 개의 표적 세포를 볼 수 있습니다. 우라닐 아세테이트와 혈액 구연산염으로 추가 염색한 후 어레이를 전자 현미경에서 이미지화했습니다. 이 정적 이미지는 20나노미터 해상도에서 첫 번째 이미징 및 두 번째 이미징 라운드에서 5나노미터 해상도로 이미징된 샘플 섹션을 보여줍니다.여기서, 전자 현미경의 210개의 순차적 이미지는 프로토콜에 설명된 대로 정렬되고 잘렸습니다. 이 비디오는 단 두 개의 세포만을 대상으로 하며 세포 내의 액포가 어떻게 배열되고 때로는 3D로 연결되는지를 보여줍니다. 여기에 표시된 SEM에서 어레이의 자동화된 계층적 이미징은 전체 어레이의 개요에서 세포 내 세부 사항에 이르기까지 다양한 해상도 수준에서 원활한 매핑을 제공할 수 있습니다.가장 높은 배율에서 액포, 미토콘드리아, 핵 및 소포체를 인식할 수 있습니다. 일단 마스터하면 일반적인 기판에 섹션 리본을 나란히 배치하는 것이 제대로 수행되면 몇 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이는 이미징을 위해 하나의 기판에 수백 개의 절편을 제공할 수 있습니다.이렇게 많은 수의 절편에 대한 이미징 시간은 현미경마다 다를 수 있으며, 즐겨 사용하는 이미징 기기의 자동화 수준이 다른 경우 더욱 그렇습니다. 흥미로운 점은 일반적인 워크플로우를 표준 히스토 염색 또는 칸도루미네센스와 같은 다른 이미징 기술과 쉽게 결합할 수 있거나 단순히 대용량 관절 구조 이미징을 위한 독립형 도구로 사용할 수 있다는 것입니다. 이 워크플로의 또 다른 측면은 쉬운 접근성입니다.초기 연구는 추가 도구나 자동화 없이 실현 가능하므로 큰 투자가 필요하지 않습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 워크플로우에 대해 잘 알게 될 것이며, 멀티모달 및 계층적 이미징을 사용하여 다양한 해상도 수준에서 큰 3D 볼륨의 흥미로운 구조를 대상으로 하고 이미지화하는 방법에 대해 잘 알게 될 것입니다.

multimodal-hierarchical-imaging-serial-sections-for-finding-specific

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

생체내 bioluminescence과 자기 공명 영상에서 (I), 그리고 (ii) 해부 histological 분석 :이 문서를 사용하여 쥐 두뇌에있는 세포 이식의 multimodal 이미징을위한 이벤트를 최적화된 순서를 설명합니다. 하나의 동물에서 이러한 이미징 modalities를 결합하면 높은 해상도, 민감도와 특이성과 세포 이식 평가를하실 수 있습니다.

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

복잡한 조직 대중은 장기에서 종양, 다양한 세포 요소로 구성되어있다. 우리는 세포의 기원뿐만 아니라 단백질 발현에 따라 세포의 특성을 해독 스펙트럼 unmixing 다음 다중 매개 면역 형광 염색과 함께 멀티 라벨 형광 형질 전환 마우스를 이용한 조직 내에서 세포의 표현형의 기여를 밝혀.

세포의 기원, 종류, 그리고 상호 작용의 시각화를위한 형광 조직 이식에 따라 정량 멀티 스펙트럼 분석

여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

여기에서는, 우리는 포르말린 고정된 파라핀 내장된 종양 조직 단면도에 있는 면역 세포를 구상하고, 정량화하고, 매핑하기 위한 간단하고 접근가능한 전략을 기술합니다. 이 방법론은 기존의 이미징 및 디지털 분석 기법과 이미징 분석의 다중 분석 기능 및 다중 매개 변수 분석을 확장하는 목적으로 결합합니다.

종양 미세 환경에서 면역 세포 집단의 시각화, 정량화 및 매핑

우리는 스캐닝 전자 현미경의 자동화 된 이미징 절차와 함께 배열 단층 촬영 샘플로 사용하기 위해 대형 전송 지원에 직렬 섹션의 리본과 컬렉션의 준비를 설명합니다. 이 프로토콜을 통해 로컬, 희귀 한 이벤트의 스크리닝, 검색 및 표적 이미징및 대량 데이터 볼륨을 수집 할 수 있습니다.

스캐닝 전자 현미경 을 사용하여 대량 정보의 표적 수집을위한 배열 단층 학워크

본 프로토콜은 (SWITCH - H 2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT 조직 형질 전환 기법과 광시트 형광 현미경 이미징을 일상적으로 높은 처리량 프로토콜로 결합하여 수십 개의 사후 인간 뇌 절편의 신속하고 동시적인 광학 투명화, 다중 라운드 라벨링 및 3D 체적 재구성을 위한 단계별 절차를 제공합니다.

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging(대규모 인간 뇌 영상에서 광시트 형광 현미경을 위한 광학 투명화 및 라벨링)

연속 이광자 단층촬영(STPT) 이미징은 이광자 이미징과 자동 스테이지 제어 및 마이크로톰 슬라이싱을 결합하여 조직 덩어리를 3차원 형태로 이미징하는 기술입니다. 여기에서는 마모셋 뇌가 구조적 특징을 더 잘 이해할 수 있도록 이를 구현하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

신경 해부학적 분석을 위한 전체 마모셋 뇌의 연속 이광자 단층촬영(Serial Two-Photon Tomography of the whole Marmoset Brain)

이 논문에서는 복막 전이의 3차원 구조를 특성화하기 위해 최적화된 다중 면역형광 프로토콜에 대해 설명합니다.

Iterative Bleaching Extends Multiplexity 접근법을 사용한 종양 함유 조직의 3차원 이미징

label-free 광학 이미징 방식을 결합한 멀티모달 플랫폼을 활용하여 세포 역학 및 신진대사를 시각화하고 정량화하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 다광자 형광, 2차 고조파 생성 및 유도 라만 산란 현미경을 통한 이미징을 통해 세포 및 분자 환경에 대한 전체적인 개요를 생성할 수 있습니다.

세포 대사 연구를 위한 멀티모달 광학 이미징 플랫폼

우리는 광학 다층 간섭 단층촬영(OMLIT)이라는 새로운 영상 기술을 도입했는데, 이는 뇌 표본의 모든 세포를 중간 규모에서 편향 없이 촬영할 수 있게 하며, 동일한 샘플에 대한 테이프 기반 직렬 주사 전자현미경의 영상 워크플로우에 원활하게 통합할 수 있게 합니다.

중간경적 전세포 뇌 지도화를 위한 주사 전자현미경 호환 광학 영상 방법

배우세요 조직 내 특정 세포 목표를 광학현미경과 주사전자현미경을 활용한 계층적 이미징으로 식별하는 방법입니다. 이 프로토콜은 세포생물학, 발달생물학, 신경과학 연구에서 고해상도 3D 초미세구조 분석을 가능하게 합니다.

큰 볼륨 내에서 특정 세포 목표를 찾아내기를 위한 직렬 섹션의 복합 계층적 이미징

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