큰 볼륨 내에서 특정 세포 목표를 찾아내기를 위한 직렬 섹션의 복합 계층적 이미징

이 워크플로우의 전반적인 목표는 광학 현미경을 사용하여 조직 내에서 초구조적 이미징을 위한 특정 표적을 식별한 다음 매우 높은 해상도의 SEM에서 3D 이미징을 수행하는 것입니다. 여기에 소개된 이미징 워크플로우는 세포 생물학, 발달 생물학, 신경 과학 또는 병리학과 같은 여러 분야에서 세포 또는 조직 미세 구조에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 실제로 어레이 단층 촬영을 기반으로 하는 이 기술의 주요 장점은 조직을 연속 절편의 어레이로 절단하면 처음에 원래 샘플 부피 내에 묻혀 있는 경우에도 표적 구조를 쉽게 식별할 수 있다는 것입니다.

어레이 단층 촬영은 원래 신경 과학의 맥락에서 도입되었지만, 박테리아, 식물, 동물 및 병리학 환경에서 환자 샘플을 포함한 광범위한 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 방법을 처음 사용하는 개인은 많은 연속 섹션을 수집하는 것이 매우 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 추가 지원 없이 작업하면 섹션이 손실되거나 리본이 엉망이 될 수 있습니다.

이쑤시개에 고정된 몇 개의 머리카락으로 만든 작은 브러시를 사용하여 미리 다듬어진 블록의 앞면과 후방을 접착제 혼합물로 조심스럽게 코팅합니다. 이 혼합물의 용매는 몇 초 내에 증발하기 때문에 이 단계를 빠르게 수행하십시오. 샘플이 건조되는 동안 실리콘 웨이퍼 조각을 나이프 보트에 맞는 크기로 자르고 다이아몬드 스크라이버로 표시합니다.

그런 다음 이소프로판올과 보푸라기가 없는 티슈로 실리콘 웨이퍼를 수동으로 청소합니다. 탈착식 접착제를 사용하여 캐리어 플레이트의 한쪽 끝에 기판을 고정합니다. 일단 설정되면 플라즈마는 친수성 표면을 얻기 위해 공기와 함께 글로우 방전을 사용하여 기판을 활성화합니다.

장착된 기판이 나이프 가장자리에 더 가깝게 캐리어를 cl에 삽입합니다.amp 기판 홀더의. 그런 다음 점보 다이아몬드 나이프를 나이프 홀더에 삽입하고 클리어런스 각도를 0도로 설정합니다. 그런 다음 나이프 보트에 증류수를 채웁니다.

칼이 샘플에서 1-2mm 떨어지도록 칼에 접근합니다. 그런 다음 기판 홀더의 나사 1-3을 사용하여 기판을 물 속으로 내립니다. 급수관이 기판의 상단 1/3에 있는지 확인하십시오.

실리콘 웨이퍼를 사용할 때 지상고를 보기 어렵기 때문에 바닥에 닿는 느낌이 들 때까지 기판을 내립니다. 그런 다음 기판을 약간 올립니다. 절단하는 동안 기판이나 캐리어가 나이프 보트에 닿지 않도록 하십시오.

다음으로, 주사기나 피펫을 사용하여 보트의 수위를 조정합니다. 쌍안경을 통해 보면서 물 표면의 전체 영역이 초박 절기의 상단 조명 조명의 균일한 반사를 보일 때까지 물을 추가하거나 제거합니다. 설정이 완료되면 샘플 절편화를 시작합니다.

여러 부분을 자르면 절단 과정을 중지하고 속눈썹이나 매우 부드러운 고양이 털로 칼 끝을 부드럽게 쓰다듬어 칼날에서 리본을 풀어줍니다. 리본을 기판 쪽으로 조작하고 리본의 첫 번째 부분을 부드럽게 밀어 기판의 건조한 부분에 부착합니다. 샘플을 계속 절단하고 리본을 기판에 부착합니다.

기판의 한쪽에서 시작하여 각각의 새로운 리본을 사용하여 다른 쪽으로 점차적으로 이동합니다. 기판이 리본으로 완전히 덮이면 기판 홀더의 미세 조작기 나사를 사용하여 나이프 보트에서 기판을 부드럽게 들어 올립니다. 리본 어레이를 건조시킨 다음 먼지가 없는 환경에 보관하십시오.

건조 후 캐리어에서 가능한 한 빨리 접착제가 장착된 기판을 제거하십시오. 그런 다음 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 광학 현미경을 위해 샘플을 염색하고 이미징을 수행합니다. 다음으로, 전자 현미경을 위해 샘플을 염색하고 끈적한 탄소 패드로 알루미늄 스터브에 장착합니다.

이제 전계 방출 주사 전자 현미경에서 이러한 어레이를 이미지화합니다. 충전을 피하려면 3kV 이하의 1차 전자 에너지와 50에서 800 피코암페어 사이의 빔 전류를 사용하십시오. ITO 코팅된 유리 커버 슬립을 사용하는 경우 구리 테이프와 은색 페인트로 전도면을 현미경 캐리어에 연결합니다.

계층적 이미징 캐스케이드의 첫 번째 단계는 개별 섹션을 인식할 수 있는 방식으로 어레이의 개요를 생성하는 것입니다. 먼저 약 100배의 낮은 배율로 각 모서리의 이미지를 그래프로 표시하여 배열의 네 모서리를 정의한 다음 전체 배열을 둘러싸는 ROI를 만듭니다. 다음 매개 변수를 사용하여 이 ROI에 이미징 프로토콜을 할당합니다.

약 0.2마이크로초의 짧은 체류 시간을 사용하여 고속 이미징을 위해 2차 전자 검출기를 사용합니다. 큰 이미지 픽셀 크기와 2000 x 2000 픽셀의 타일 크기를 선택합니다. 그 결과 매우 노이즈가 많은 이미지가 생성되지만 여기에서도 단면 내의 조직이 보입니다.

그런 다음 관심 영역을 만들어 첫 번째 섹션의 조직만 간략하게 설정하여 단면 세트를 생성합니다. 스탬프 도구를 사용하여 모든 후속 섹션에 복제합니다. 구부러진 리본을 수용하기 위해 필요한 경우 관심 영역을 회전합니다.

조직의 하부 구조를 가장 잘 표시하는 섹션에 프로토콜을 할당합니다. 여기서, 60나노미터의 중간 픽셀 크기, 12000 x 12000 픽셀의 타일 크기, 3.2마이크로초의 체류 시간을 사용하였다. 품질이 좋지 않기 때문에 선택한 몇 개의 셀을 설명하는 두 번째 섹션 세트는 더 작은 픽셀 크기와 더 민감한 검출기를 사용하여 생성되었습니다.

이제 두 개의 대상 셀을 매우 잘 인식할 수 있습니다. 더 높은 해상도의 SEM 이미징을 위한 표적 구조를 포함하는 섹션 세트 내에 사이트 세트를 생성합니다. 준비된 정밀도를 설명할 수 있을 만큼 관심 영역을 크게 만듭니다.

사이트의 위치를 확인하고 조정합니다. 많은 섹션이 이미지화되는 경우 자동 튜닝이 필요합니다. 중심이 구조적 세부 사항(예: 액포)이 없는 빈 재료에 놓이지 않도록 관심 영역을 배치하는 것이 중요합니다.

다음으로, 자동 초점 설정을 정의하고 이미징할 사이트에 가까운 작은 관심 영역에서 리본 길이에 대한 이미징 성능을 확인합니다. 그런 다음 고분해능 SEM 획득을 위한 이미징 프로토콜을 정의합니다. 멤브레인 구획을 보려면 3나노미터에서 5나노미터 사이의 이미지 픽셀 크기를 선택합니다.

영상에 너무 노이즈가 발생하지 않도록 검출기에 따라 체류 시간을 선택합니다. 스테이지는 이 섹션과 이 섹션을 기록하는 사이에 먼 거리를 이동해야 하기 때문에 check protocol 옵션을 사용하여 각 리본의 적어도 첫 번째 섹션에서 초점 값을 정의합니다. 그런 다음 관심 대상 영역의 전체 시리즈에 대해 자동화된 SEM 이미징을 시작합니다.

완료되면 획득한 데이터를 이미지 시리즈로, 가급적이면 TIF 형식으로 내보냅니다. 이미지 시리즈를 피지에 가상 스택으로 가져올 수 있습니다. 다음으로, 관심 있는 구조에 최대한 가깝게 영역을 잘라 추가 처리를 위해 스택을 자릅니다.

또한 밝기와 대비를 조정하고 스택을 저장합니다. 자르고 최적화되면 파일 메뉴에서 새 TrakEM을 엽니다. 이미지 필드를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 스택을 레이어당 하나의 슬라이스로 TrakEM에 가져옵니다.

마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 Align layers를 선택합니다. 최소 제곱을 모드로 선택하고, 첫 번째에서 마지막 범위를 설정하고, 참조로 none을 선택합니다. 그런 다음 기본 설정 값을 선택하고 원하는 변환으로 Rigid를 선택합니다.

등록이 완료되고 만족스러우면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Export를 선택하여 정렬된 데이터 세트를 저장합니다. 평면 이미지를 만들고, 첫 번째 이미지에서 마지막 이미지까지의 범위를 설정하고, 소프트웨어가 결과 스택을 표시하도록 합니다. 완료되면 스택을 TIF 형식으로 저장합니다.

준비 후 섹션 배열은 직렬 섹션의 여러 리본으로 구성된 배열로 나타납니다. 이 섹션에서는 프로피듐 요오드화물로 염색된 애기장대 뿌리 팁의 개요를 보여줍니다. 이 샘플의 순차적 섹션은 프로토콜에 설명된 대로 정렬되고 결합되어 샘플을 3D로 단일 동영상 파일로 표시했습니다.

여기에서 나중에 SEM에서 나노미터 해상도로 이미지화될 두 개의 표적 세포를 볼 수 있습니다. 우라닐 아세테이트와 혈액 구연산염으로 추가 염색한 후 어레이를 전자 현미경에서 이미지화했습니다. 이 정적 이미지는 20나노미터 해상도에서 첫 번째 이미징 및 두 번째 이미징 라운드에서 5나노미터 해상도로 이미징된 샘플 섹션을 보여줍니다.

여기서, 전자 현미경의 210개의 순차적 이미지는 프로토콜에 설명된 대로 정렬되고 잘렸습니다. 이 비디오는 단 두 개의 세포만을 대상으로 하며 세포 내의 액포가 어떻게 배열되고 때로는 3D로 연결되는지를 보여줍니다. 여기에 표시된 SEM에서 어레이의 자동화된 계층적 이미징은 전체 어레이의 개요에서 세포 내 세부 사항에 이르기까지 다양한 해상도 수준에서 원활한 매핑을 제공할 수 있습니다.

가장 높은 배율에서 액포, 미토콘드리아, 핵 및 소포체를 인식할 수 있습니다. 일단 마스터하면 일반적인 기판에 섹션 리본을 나란히 배치하는 것이 제대로 수행되면 몇 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이는 이미징을 위해 하나의 기판에 수백 개의 절편을 제공할 수 있습니다.

이렇게 많은 수의 절편에 대한 이미징 시간은 현미경마다 다를 수 있으며, 즐겨 사용하는 이미징 기기의 자동화 수준이 다른 경우 더욱 그렇습니다. 흥미로운 점은 일반적인 워크플로우를 표준 히스토 염색 또는 칸도루미네센스와 같은 다른 이미징 기술과 쉽게 결합할 수 있거나 단순히 대용량 관절 구조 이미징을 위한 독립형 도구로 사용할 수 있다는 것입니다. 이 워크플로의 또 다른 측면은 쉬운 접근성입니다.

초기 연구는 추가 도구나 자동화 없이 실현 가능하므로 큰 투자가 필요하지 않습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 워크플로우에 대해 잘 알게 될 것이며, 멀티모달 및 계층적 이미징을 사용하여 다양한 해상도 수준에서 큰 3D 볼륨의 흥미로운 구조를 대상으로 하고 이미지화하는 방법에 대해 잘 알게 될 것입니다.