소설 수동 전체 CNS 조직에 광학 투명도의 급속 한 생산을 위한 방법 삭제
2018년 5월 8일
여기, 선물이 두 소설 방법론, psPACT 및 최대 광학 투명성과 조직 맥 관 구조에 그대로 설치류의 후속 현미경 분석을 달성 하기 위한 mPACT 전체 CNS.
이러한 psPACT 및 mPACT 방법의 전반적인 목표는 전기영동 조직 투명화 시스템 없이 전체 CNS 조직을 빠르게 투명화하는 것입니다. 이 방법은 알츠하이머병 또는 부상 및 퇴행 및 종양 형성과 같은 인간 질병 연구 모델 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생쥐 CNS 조직이 전기영동 조직 투명화에 의해 손상되지 않고 수정된 수동 투명화에 의해 빠르게 제거된다는 것입니다.
우리는 원래 PACT와 과거의 뇌 정화 방법을 사용한 후 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. psPACT 및 mPACT 방법은 여러 단계의 시료 전처리 단계가 있기 때문에 실행하기가 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 먼저 4% PFA 및 4% 아크릴아미드 용액에 VA-044 분말을 최종 농도 0.25%로 첨가하여 PACT 칵테일 용액을 준비한 후 조직에 PACT 용액을 관류한 후 냉각된 PACT 용액이 들어 있는 50ml 튜브에 전체 뇌와 척수를 완전히 담그고 섭씨 4도에서 24시간 동안 보관합니다.
24시간 후, 조직을 신선하고 차가운 PACT 용액이 들어 있는 50ml 튜브로 옮기고 튜브 캡을 질소 탱크에 연결하고 섭씨 37도로 설정된 조직 겔 혼성화 시스템에 연결합니다. 그런 다음 진공 청소기와 가스를 10분 동안 켜서 샘플을 질소 가스에 넣습니다. 하이드로겔을 중합하려면 샘플이 들어있는 튜브를 150rpm 및 섭씨 37도로 설정된 진탕 인큐베이터에 3시간 동안 또는 중합이 완료될 때까지 놓습니다.
배양 후 압지를 사용하여 조직을 둘러싸고 있는 남아 있는 중합 하이드로겔을 제거합니다. 그런 다음 조직을 투명액이 들어 있는 50ml 튜브로 옮깁니다. 조직이 제거될 때까지 섭씨 37도 및 150rpm으로 설정된 진탕 인큐베이터에 샘플을 놓습니다.
평균적으로 마우스 CNS가 완전한 선명도를 달성하는 데 약 20일이 걸립니다. 섭씨 4도에서 24시간 동안 4% PFA에 사후 고정된 4% PFA가 관류된 마우스의 CNS로 psPACT를 시작합니다. 0.1 어금니 PBS에서 고정 조직을 1 시간 동안 세척합니다.
세척 후 조직을 A4P0 용액으로 옮기고 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음날, PBS에서 5분 동안 조직을 세척한 후 조직을 PBS의 0.25%VA-044에 담그고 섭씨 37도에서 6-24시간 동안 배양합니다. 아크릴아마이드와 후속 VA-044 단계를 분리하면 조직을 둘러싸고 있는 남아있는 중합되지 않은 하이드로겔 단량체를 제거할 필요가 없으며, 이는 PACT로 투명도를 달성한 후 최종 조직 무결성을 손상시킬 수 있습니다.
배양 후 조직을 신선하고 차가운 VA-044 용액으로 옮깁니다. 그런 다음 샘플을 질소 가스에 10분 동안 담습니다. 조직을 투명화 용액으로 옮깁니다.
그런 다음 조직이 제거될 때까지 섭씨 37도 및 150rpm으로 설정된 진탕 인큐베이터에서 샘플을 배양합니다. 평균적으로 마우스 CNS가 완전한 선명도를 달성하는 데 약 17일이 걸립니다. mPACT의 경우 청산 솔루션 단계까지 psPACT에 대한 프로토콜을 따릅니다.
그런 다음 0.1 몰 PBS에 8 % SDS 외에 0.5 % 알파 - 티오 글리세롤, un-browning 제를 함유 한 조직 세척 용액을 완전히 담그십시오. 조직이 제거될 때까지 섭씨 37도 및 150rpm으로 설정된 진탕 인큐베이터에 샘플을 놓습니다. 평균적으로 마우스 CNS가 mPACT를 사용하여 완전한 선명도를 달성하는 데 2주밖에 걸리지 않습니다.
본 연구에서 mPACT 프로토콜을 통해 처리된 마우스 뇌 샘플은 PACT 및 psPACT 프로토콜을 통해 처리된 샘플보다 14일 후에 광학 투명도를 달성했습니다. mPACT에 의해 투명화된 쥐 전체 CNS 샘플은 20일 만에 최대 제거율을 달성했습니다. 전체 CNS가 아닌 성인 쥐의 뇌만 mPACT로 단 5일 만에 제거되었습니다.
일단 숙달되면, 이 기술은 제대로 수행된다면 쥐 전체 CNS로 2주 안에 완료할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 신경 과학 및 해부학 분야의 연구자들이 포유류 CNS 모델에서 조직 손상, 발달 기형, 암 및 신경 퇴행성 질환과 같은 병태생리학적 질병을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
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개요
본 연구에서는 설치류의 온전한 중추신경계(CNS) 혈관계의 광투과성을 높이고 미세 분석을 용이하게 하기 위해 psPACT 및 mPACT라는 두 가지 혁신적인 방법론을 소개합니다. 이 기술들은 중추신경계 조직 전체를 손상 없이 빠르게 투명화하는 것을 목표로 하며, 알츠하이머병 및 종양 형성 등 인간 질환 모델과 관련된 핵심 질문들을 해결하고자 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 조직 투명화 기술
- 현미경 이미징
배경
- 본 연구는 이전 방법들을 기반으로 하며, 전기영동 조직 투명화의 한계점을 강조합니다.
- 설치류 CNS 조직을 위한 신속하고 효과적인 투명화 공정의 필요성을 강조합니다.
- 신경과학 분야의 기초 연구 및 임상적 적용 모두에 대한 해결책을 제시합니다.
연구 목적
- psPACT 및 mPACT를 CNS 조직 투명화를 위한 효율적인 프로토콜로 개발하고 검증한다.
- 신경병리학적 상태를 연구하는 연구자들의 역량을 확장한다.
- CNS 내 조직 혈관의 시각화를 개선한다.
사용된 방법
- 해당 방법은 PACT 용액을 사용하여 중추신경계(CNS) 조직을 준비하고 투명화하는 다단계 프로토콜을 포함합니다.
- 주요 생물학적 모델로는 마우스 및 랫드 CNS 샘플이 포함되며, 광학적 투명도 확보에 중점을 둡니다.
- psPACT는 완전한 투명화까지 일반적으로 약 20일이 소요되는 반면, mPACT는 약 14일 만에 이를 달성할 수 있습니다.
- 중합 및 투명화 과정을 위해 특수 용액과 배양 환경이 사용됩니다.
주요 결과
- mPACT는 기존 방법과 비교하여 조직 투명화 시간을 현저히 단축시킵니다.
- mPACT로 처리한 시료는 더 짧은 시간 내에 광학적 투명도를 나타내어, 연구 응용 분야에서 효율성이 향상됨을 시사합니다.
- 이 기술들은 다양한 신경계 질환 연구를 촉진하는 데 효과적임이 입증되었습니다.
결론
- 본 연구는 CNS 조직의 신속하고 효율적인 투명화를 가능하게 하여, 신경과학 분야의 연구 역량을 향상시킵니다.
- 새로운 방법론은 질병 기전 및 조직 손상을 탐구하는 데 귀중한 도구로 활용됩니다.
- 개선된 이미징 기술을 통해 신경퇴행성 질환을 이해하고 병리학적 연구를 강화하는 데 상당한 영향을 미칩니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
psPACT 및 mPACT와 같은 새로운 수동 투명화 방법은 전기영동 손상 없이 중추신경계(CNS) 전체 조직의 신속하고 정밀한 광학적 투명화를 가능하게 함으로써 신경과학 R&D의 결정적인 병목 현상을 해결합니다. 이러한 기능은 세포 내 구조를 보존하는 동시에 이미징 소요 시간을 단축하여, 신경퇴행성 질환 모델에서의 표적 검증 및 기전적 리스크 감소를 지원합니다. 이 기법들은 신경병리학적 표현형의 시각화를 개선함으로써 알츠하이머병, 종양 형성 및 손상 모델의 전임상 연구에서 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 타겟 결합 연구를 위해 세포 내 소기관 구조와 세포 회로를 보존함으로써, 손상되지 않은 중추신경계(CNS) 모델에서 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 전기영동 투명화와 관련된 조직 처리 아티팩트를 줄여, 표현형 스크리닝 결과의 재현성을 향상시킵니다.
- 예측적 가치: 질환 관련 시스템에서 신경퇴행 진행에 대한 더 명확한 판독 결과를 제공함으로써 포트폴리오 우선순위 결정(triage)을 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 세포하 바이오마커 및 경로 조절의 고해상도 이미징에 적합한 표준화되고 투명한 CNS 표본을 생성합니다.
- 운용적 가치: 전문적인 전기영동 장비의 필요성을 제거하여, 발견 연구 팀 전체의 분석법 구현 진입 장벽을 낮춥니다.
- 확장성: mPACT는 약 14일 만에 마우스 CNS 투명화를 달성하여, 화합물 스크리닝 캠페인을 위한 예측 가능한 일정을 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개적 연속성: 종양 형성 및 발달 기형의 종단적 연구를 위해 조직의 무결성을 유지함으로써, 발견 단계에서 전임상 검증 단계로의 원활한 전환을 촉진합니다.
- 기전적 리스크 감소: 병리 조직 내 세포 내 구조의 시각화를 가능하게 하여, 타겟 기전 해석의 모호함을 줄여줍니다.
- 질환 모델 충실도: 설치류 종(생쥐/쥐) 전반에 걸쳐 일관된 CNS 투명화를 지원하여, 안전성 약리학의 연구 간 비교 가능성을 높여줍니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
psPACT와 mPACT는 초기 발견부터 전임상 단계까지의 연속 과정에 적합하며, 특히 정량화가 가능하고 이미징에 적합한 CNS 모델을 제공함으로써 타겟 검증부터 리드 최적화 단계까지를 지원합니다.
- 발견 생물학: 온전한 조직 내 단백질 발현 및 세포 분포의 3D 매핑을 통해 가설 검증을 가능하게 하여, 질환 모델에서 경로 관여도를 명확히 합니다.
- 스크리닝: 중추신경계(CNS) 구조에 미치는 화합물 효과의 표준화된 평가를 지원하는 재현 가능하고 정량적인 조직 표본을 제공합니다.
- 분석: 향상된 신호 대 잡음비로 처리 조건에 따른 구조적 변화를 팀원들이 비교할 수 있는 고해상도 이미징 결과물을 생성합니다.
- 중개 연구: 발견 단계부터 전임상 단계까지 단백질체 및 구조적 연속성을 유지하여, 신경 퇴행 및 손상 모델에서의 바이오마커 정렬을 지원합니다.
- 기업 내 재사용: 신경병리학을 연구하는 여러 프로젝트에 적용 가능한 재사용 가능한 CNS 투명화 플랫폼을 구축하여, 중복적인 방법론 개발을 줄입니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 손상되지 않은 조직 시각화를 통해 기전적 모호성을 줄임으로써 표적 검증의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 가변적인 전기영동 파라미터 및 장비 의존성을 배제하여 표준화와 재현성을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: CNS 표적 후보 물질의 전임상 데이터 생성 속도를 높여 go/no-go 의사결정 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 더 빠르고 명확한 표현형 판독을 통해 신경퇴행성 질환 및 종양학 프로그램의 위험 조정 우선순위 선정이 가능해집니다.
실행 시 고려 사항
- 다단계 시료 준비를 관리하기 위해 조직 조직학, 하이드로젤 화학 및 배양 프로토콜 실행에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 하이드로젤 중합 및 투명화 단계에서 진탕 배양기, 질소 가스 시스템 및 온도 조절 환경이 필요합니다.
- 실험실 간 재현성을 보장하기 위해 용액 준비(예: VA-044, SDS 농도) 및 타이밍 제어에 대한 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 출처 자료에 명시된 바와 같이, 비중추신경계(non-CNS) 조직(예: 신장, 비장)에 적용하려면 투명화 시간과 구조적 보존에 대한 검증이 필요합니다.
- 실질적 제한 사항: 프로토콜의 성공 여부는 여러 준비 단계의 세심한 실행에 달려 있으며, 편차가 발생할 경우 투명화가 불완전하거나 조직이 손상될 위험이 있습니다.
