Name: 소설 수동 전체 CNS 조직에 광학 투명도의 급속 한 생산을 위한 방법 삭제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 배우세요 쥐와 생쥐의 전체 중추신경계 조직을 손상 없이 빠르게 광학 투명화하는 psPACT 및 mPACT 기법을 활용한 신경과학 연구 방법입니다. 이 기술은 알츠하이머병 및 종양 형성 등의 질병 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 두뇌 한국 21 플러스 프로젝트 의료 과학, 연세대에 지원 됩니다. 또한,이 작품은 국립 연구 재단의 한국 (NRF-2017R1D1A1B03030315)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

모든 절차는 연 세 대학 의과대학에서 적절 한 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다. 연 세 대학 대학의과 대학에 실험실 동물 관리 위원회의 지침에 따라 모든 실험 동물을 희생 한다.
1입니다. 시 약의 준비
주의: Paraformaldehyde (PFA), 아크릴 및 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 독성 irritants 이며 따라서 적절 한 개인 보호 장비 (PPE; 실험실 외 투, 장갑, 보호 안경)와 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.
<ol><li>4% 아크릴 (금주 모임) 솔루션 (A4P0): 0.1 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 180 ml 40% 아크릴 솔루션의 20 mL를 추가.</li>
	<li>0.25% 버지니아-044 솔루션: 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane의 0.5 g 추가] dihydrochloride (VA-044) 파우더 200 mL의 0.1 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를. 버지니아-044 분말은 실내 온도에 저장 될 수, 그러나 PBS에 가용 화 시 4 ° C에 저장 되어야 합니다. 최상의 결과 얻으려면 솔루션 실험에 필요한 만큼만 준비 합니다.</li>
	<li>협정 칵테일 솔루션: 4 %paraformaldehyde (PFA) 솔루션의 225 mL에 아크릴의 10 g를 추가 하 고 4%와 200 mL에 양을 맞추십시오 PFA. 사용 전에 40 ml 50 mL 원뿔 튜브에 혼합물의 버지니아-044 분말의 100 mg을 추가 합니다.</li>
	<li>협정 솔루션 버퍼 지우기: 0.1 M PBS의 350 mL에 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)의 40 g을 추가 하 고 0.1 M PBS 가진 500 mL에 양을 맞추십시오. MPACT 삭제 솔루션, 솔루션 버퍼를 삭제 하는 협정에 0.5% α-thioglycerol를 추가 합니다.</li>
	<li>이 연구에 사용 된 마우스 했다 2 주 된 BALB 남성 쥐; 이 연구에 사용 된 쥐 2 주 오래 된 남성 SD-쥐 했다.</li>
</ol>2. 마 취와 관류 수술
주의: PFA와 아크릴 독성 irritants 이며 따라서 적절 한 보호구와 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.
<ol><li>26-게이지 바늘 1 mL 주사기를 사용 하 여 zoletil의 30 mg/kg으로 병원 체 무료 객실에 동물 anesthetize 5 동물 모니터링-10 분.</li>
	<li>동물 마 취의 수술 평면에 도달 했습니다, 일단 마 취의 깊이 결정 하는 발가락 핀치 응답 메서드를 사용 합니다. 응답을 확인 합니다. 주: 마우스와 쥐 수술을 포함 하는 다음 단계 이전 연구11에 사용 되는 유사한 프로토콜을 따릅니다.</li>
	<li>5-6 cm 절 개 외피와 복 벽을 통해 흉 곽 아래를 확인 합니다.</li>
	<li>곡선, 무딘가 위를 사용 하 여 미리 절 개의 사이트를 찾으려고 흉부 지역 palpating 횡 경 막에 절 개를 만들기 위해.</li>
	<li>절 개 흉 흉 막 캐비티를 폭로 전체 길이 걸쳐 확장.</li>
	<li>조심 스럽게 폐 치환. 쇄 골까지 흉 곽을 통해 상처를 확인 합니다. 아이리스가 위를 사용 하 여, 좌 심 실의 후부 끝에 작은 절 개를 확인 합니다. 오름차순 대동맥, 컷된 심 통과에 무뚝뚝한 또는 올리브 밀고 관류 18 게이지 바늘을 삽입 합니다.</li>
	<li>바늘을 장악 하 고는 hemostat로 마음을 클램핑 하 여 누설을 방지. 또는, 수정된 hemostat 사용 하 여 바늘 팁 주위 대동맥을 클램프.</li>
	<li>오른쪽 아 트리 움, 하강 대동맥에 최소한의 피해를 보장 하기 위해 돌에 큰 절 개를 확인 합니다. 쥐 관류에 대 한 준비가 지금 이다.</li>
</ol>3. 전체 관류와 쥐의 해 부
주의: PFA와 아크릴 독성 irritants 이며 따라서 적절 한 보호구와 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.
참고: 다음 전체 관류 단계는 비슷합니다 우 외에 의해 이전 연구에서 사용 되는 프로토콜. (2016) 10 , 11.
<ol><li>심장의 오른쪽 아 트리 움 어떤 기포를 소개 하지를 돌보는 18 게이지 주사 바늘에 연결 합니다.</li>
	<li>50 mL 주사기를 사용 하 여, 신속 하 고 균일 하 게 감기 0.1 M PBS 솔루션 포함 하는 헤 파 린 (10 단위/mL)의 50 mL 펌프.</li>
	<li>연동 펌프 튜브에 18-게이지 바늘을 연결 합니다.</li>
	<li>10 mL/min의 순환 속도에 헤 파 린 (10 단위/mL)에 포함 된 감기 0.1 M PBS 솔루션의 200 mL와 함께 씻으십시오.</li>
	<li>10 mL/min의 순환 속도에 찬 4 %PFA 솔루션의 250 mL와 함께 수정. 쥐가이 단계에서 뻣 뻣 한 되어야 합니다.</li>
	<li>수집 하 고 처리를 위한 나머지 PFA 솔루션을 저장 합니다.</li>
	<li>협정, 4 %PFA, 4% 아크릴, 및 0.25% 버지니아-044 분말의 냉장 협정 칵테일 솔루션 조직 18 게이지 바늘, perfuse 및 머리와 척추를 제거. 코에는 목에서 정중 선 절 개 하 여 두개골을 노출 합니다. 이 추가 관류 단계 psPACT와 mPACT 방법;에 대 한 필요 하지 않습니다. 고정, 후 즉시 머리와 척추를 분리 하 고 두개골을 노출.</li>
	<li>어떤 잔여 목과 척추 근육을 제거 하 여 두개골의 기지를 노출 합니다.</li>
	<li>벗 겨 두개골을 rongeurs와가 위를 사용 합니다. 뇌와 척수를 제거 합니다.</li>
	<li>4%에서 조직 저장 PFA 4 ° c; 조직 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 하이드로 겔 단위체 주입 및 쥐 및 마우스 CNS의 중 합
주의: 아크릴, SDS, α-thioglycerol 및 PFA irritants 있으며 따라서 처리 연기 후드와 적절 한 오 줌.
<ol><li>
협정 (패시브 기술 삭제)
	<ol>
<li>분리 하 고 전체 CNS (뇌와 척수) 고정된 쥐 및 쥐에서 냉장된 협정 칵테일 4 %PFA, 4% 아크릴, 및 0.25% 버지니아-044 분말 및 24 h. 확인 조직 s에 완전히 몰입은 4 ° C에서 스토어의 솔루션을 포함 하는 50 mL 튜브에 문화 olution입니다.</li>
		<li>10 분 휴지를 사용 하 여 젤 질소 탱크에 연결 된 하이브리드 시스템에 대 한 질소 가스에 샘플을 포함: 37 ° c 시스템 설정 신선한 냉 (4 ° C) 협정을 포함 하는 50 mL 튜브에 조직 전송 칵테일 솔루션 관 모자, 연결한 다음 진공에 설정.</li>
		<li>유해는 하이드로 겔, 3 h, 또는 중 합 완료 될 때까지 떨고 인큐베이터 (150 rpm, 37 ° C)에서 샘플을 포함 하는 튜브를 배치 합니다.</li>
		<li>압 지를 사용 하 여 (참조 테이블의 자료), 제거 나머지 polymerized 히드로 조직을 둘러싼.</li>
		<li>50 mL 튜브 청소 솔루션 (0.1 m M PBS, pH 8.0에서에서 8 %SDS)를 포함 하는 조직 전송.</li>
		<li>조직 삭제 되었습니다 때까지 37 ℃, 150 rpm으로 설정 떨고 인큐베이터에서 샘플을 놓습니다. 평균적으로, 그것은 전체 선명도 달성 마우스 CNS 약 20 일 걸립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
psPACT (별도 수동 삭제 기술 처리)
	<ol>
<li>뼈 절단기와 PFA-고정 마우스와 깨끗 한 벤치에 쥐가 위 전체 CNS (뇌와 척수)를 격리 합니다.</li>
		<li>조직 전송 50 mL 튜브 4% 포함 된 PFA, 및 24 h. 4 ° C에서 저장소 확인 조직은 정착 액에 완전히 잠기 다.</li>
		<li>0.1 m M PBS에서 1 시간에 대 한 고정된 조직을 세척 하 고 A4P0 솔루션 (0.1 m M PBS에 4% 아크릴)을 전송. 24 h에 대 한 37 ° C에서 저장소.</li>
		<li>0.1 m M PBS에 씻어 5 분에 대 한 조직.</li>
		<li>0.25%에서 조직 담가 0.1 M PBS에 버지니아-044. 6-24 h, 37 ° C에서 저장 하 고 신선한 0.25% 버지니아-044/PBS 솔루션을 전송.</li>
		<li>10 분 휴지를 사용 하 여 젤 교 잡에 대 한 질소 가스에 샘플을 포함 질소 탱크에 연결 ( 테이블의 자료를 참조) 시스템: 조직 신선한 감기 (4 ° C)를 포함 하는 50 mL 튜브에 전송 0.25% 버지니아-044/PBS 솔루션, 튜브 캡과 연결. 진공을 켭니다.</li>
		<li>전송 하는 조직 솔루션 (0.1 m M PBS, pH 8.0에서에서 8 %SDS) 삭제.</li>
		<li>조직 삭제 되었습니다 때까지 37 ℃, 150 rpm으로 설정 떨고 인큐베이터에서 샘플을 품 어. 평균적으로, 그것은 마우스 전체 선명도 달성 하는 CNS에 대 한 약 17 일 걸립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
mPACT (수정된 수동 삭제 하는 기법)
	<ol>
<li>뼈 절단기와 PFA-고정 마우스와 깨끗 한 벤치에 쥐가 위 전체 CNS (뇌와 척수)를 격리 합니다.</li>
		<li>단계-4.2.2 4.2.8 psPACT 프로토콜의 수행 합니다.</li>
		<li>전송 하는 조직 솔루션을 지우기. 협정 및 psPACT 프로토콜 달리 mPACT 0.5% α-thioglycerol 0.1 M PBS, pH 8.0에서에서 8 %SDS 이외에 구성 된 개간 솔루션이 필요한 note. Α-thioglycerol는 더 신속 하 고 효과적으로 조직을 취소 하는 데 도움이 유엔 브라우닝 에이전트. 조직의 솔루션에 완전히 포장 되어 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>조직 삭제 되었습니다 때까지 37 ℃, 150 rpm으로 설정 떨고 인큐베이터에서 샘플을 놓습니다. 평균적으로, 그것은 마우스 전체 선명도 달성 하는 CNS에 대 한 약 2 주 걸립니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 굴절률 매칭과 허가 CNS의 Immunostaining
참고: n바퀴 (Nycodenz 기반 굴절률 매칭 솔루션) 0.8 g/mL Nycodenz 분말 30 mL 기본 버퍼 (0.01% 나트륨 아 지 드와 0.1 m M PBS, pH 8.0에서에서 트윈-20)에 녹아 있는 이루어져 있다. 솔루션 파우더의 적절 한 solvation 수 있도록 인큐베이터 떨고 37 ° C에 배치 하는 것이 좋습니다.
<ol><li>0.1%에서 조직 품 어 2 h, 0.1 m M PBS에 Triton X-100 다음 2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 0.1 m M h 6에 대 한 PBS에와 차단.</li>
	<li>PBST에 세 번 섹션을 세척 (0.1 %0.1 M PBS에 트윈-20) 2 헤에 대 한 일에 대 한 섹션 주요 항 체 (이 경우, 혈관 얼룩는 반대로 토끼 PECAM CD31 항 체)에 얼룩.</li>
	<li>2 일에 대 한 2 차 항 체 (이 경우는 염소-토끼 IgG Cy3 형광 공액)에 2 %BSA 섹션을 얼룩.</li>
	<li>워시 분류 2 h, PBST에 세 번 조직 및 저장소 15 ml에서 n바퀴 2-10 일.</li>
	<li>이미징, 전에 35 또는 60 m m 조직 문화 접시에 레이블이 조직 n바퀴의 작은 금액을 이동 합니다. 접시의 아래쪽 가장자리 주위 실리콘 수정.</li>
	<li>신선한 n바퀴의 1.5-2 mL를 추가 합니다.</li>
</ol>6. 이미지 처리
<ol><li>타일 confocal 레이저 스캐닝 microscopewith 10 배 확대를 사용 하 여 검색 이미지 삭제 조직의 취득 ( 재료의 표참조). 조직 Cy3 표시의 사용 하 여 550-600 nm의 파장.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

수동, 전기 이동 비 추출 방법에 고용 하는 동안 협정 크게 이전 조직 삭제 선명도2,3,,47 같은 방법으로 달성 일관성 향상 , 8, 기술은 여전히 가장 눌러 최대한 조직 선명도12를 달성 하는 데 필요한 시간의 길이 여러 가지 단점을 맺는 다. 현재 연구에서 선물이 조직 조직 무결성 및 구조6,10유지 하면서 지우기에 필요한 시간을 크게 줄일 수정된 협정 프로토콜. 또한, 처음으로 우리 조직의 전체 CNS 조직 및 더 높은 순서 설치류 모델 쥐10...

과학 및 임상 조회의 근본적인 목적은 관련 기관의 구조와 기능;의 완벽 한 이해를 달성 그러나, 포유류 장기의 상당히 복잡 한 자연 완전히이 목표1을 달성 하는 방 벽으로 수시로 제공 합니다. 명확성 (명확한 지질 교환 아크릴 때 교배 엄밀한 이미징 호환 Tisssue-하이드로 겔)2,3,4, 건물 그대로 조직에서 히드로 아크릴 기반 하이브리드 포함, 달성 다양 한 기관, 뇌, 간, 그리고 비장를 포함 하 여5그들의 구조적 무결성 유지 하면서 광학 정리. 선명도 시각화 뿐만 아니라 복잡 한 셀룰러 네트워크 및 단면 필요 없이 조직 형태학을 정밀 하 게 해 부를 기회에 따라서 사용할 수 있습니다.
조직 허가 달성 하기 위해 선명도 샘플의 지질 콘텐츠 제거 하 전기 이동 방법을 사용 합니다. 물리적으로 안정적인 조직-히드로 하이브리드 생산에 대 한 선명도 지적 하는 동안 연구 전기 이동 조직 개간 (등) 방법의 사용 조직 품질, 브라우닝, epitope 손상을 포함 한 변수 결과 산출 하 고 단백질 손실5,6. 이러한 문제를 해결 하려면 수동, 이온-세제 기반된 delipidation 기술 등 치료를 대체 하는 협정 (수동 선명도 기술) 등 수정된 프로토콜 개발된7,,89되었습니다. 그러나 결과에 더 일관성을 달성에 불구 하 고, 협정 최대한 정리를 얻기 위해 더 많은 시간이 필요 합니다. 또한, 이러한 기술의 아무도 아직 적용 되었을 전체 CNS 양식 또는 쥐 및 기니 피그와 같은 큰 설치류 모델.
현재 연구는 psPACT (프로세스 별도 협정) 및 mPACT (수정 된 협정), 전체 CNS와 마우스와 쥐 모델10에 내부 장기의 빠른 통관을 촉진을 위한 새로운 방법론을 제안 하 여 이러한 한계를 해결 하고자 합니다. 특히, psPACT 처리 조직 4% 아크릴에 0.25% 하이드로 겔 형성; 하는 동안 두 개의 별도 단계에서 버지니아-044 mPACT는 기본적으로 동일한 단계를 수행 하지만 키 시 약으로 서 0.5% α-thioglycerol와 개간 SDS 기반 솔루션을 보완. 두 기술을 마구 크게 광학 클리어런스를 생산 하는 데 필요한 시간을 줄이기 위해 내 생 적인 조직 및 cerebrospinal 순환 시스템. 원리의 증거로, 허가 조직10혈관 패턴 분석에 confocal 현미경 검사 법의 사용을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)</td><td>Affymetrix, Inc.</td><td>75819</td><td>클리어링 솔루션</td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axia-Shield</td><td>1002424</td><td>nRIMS 솔루션</td></tr><tr><td>40% 아크릴아미드 솔루션</td><td>Bio Rad Laboratories, Inc.</td><td>161-0140</td><td>중합 (A4P0)</td></tr> <tr><td>2,2&acute; -Azobis [2- (2- 이미다 졸린 -2- 일) 프로판] 디 하이드로 클로라이드</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>017-19362</td><td>중합 (VA-044)</td></tr><tr><td>1-Thioglycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1753-100ML</td><td>세정 용액 (mPACT)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Georgiachem</td><td>9005-64-5</td><td>nRIMS 용액</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td>면역 염색</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Bovogen</td><td>BSA100</td><td>면역 염색</td></tr><tr><td>헤파린</td><td>Merck, Millipore</td><td>, 375095</td><td>Perfusion (PBS)</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>, Sigma-Aldrich</td>, <td>S2002-25G</td>, <td>nRIMS solution</td></tr>, <tr><td>PECAM-CD31 항체</td>, <td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-28188</td><td>면역 염색</td></tr><tr><td>염소 항 토끼 -IgG Cy3 형광 접합체</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>111-165-003</td><td>면역 염색</td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>Tech & 혁신</td><td>BPP-9004</td><td>관류, 중합</td></tr><tr><td>20X 인산염 완충 식염수(pH 7.4)</td><td>기술 및 혁신</td><td>BPB-9121</td><td>관류, 버퍼</td></tr><tr><td>10mL 스트라이프렛</td><td>Coatar</td><td>4488</td><td>용액 전송</td></tr><tr><td>50mL 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>투명 튜브</td></tr><tr><td>35mm 세포 배양 접시</td><td>SPL</td><td>20035</td><td>이미징</td></tr><tr><td>컨포칼 접시</td><td>SPL</td><td>211350</td><td>이미징</td></tr><tr><td>1mL 주사기</td><td>한국 백신 (주</td>) <td>26G 1/2</td><td>마취&nbsp;</td></tr><tr><td>50mL 주사기</td><td>Korea vaccine Co., Ltd</td><td>21G1 1/4</td><td>관류</td></tr><tr><td>아크릴아미드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>중합(A4P0)</td></tr><tr><td>Whatman 3MM 종이</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td>젤 제거용 블로팅 페이</td></tr>퍼 <tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>이미징</td></tr><tr><td>ZEN lite 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td>ZEN 2012</td><td>이미징</td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Longerpump</td><td>BT100-1F</td><td>Perfusion</td></tr><tr><td>EasyGel Lifecanvas</td><td>Technologies</td><td>EasyGel</td><td>Tissue gel hybridization system</td></tr></tbody></table>

소설 수동 전체 cns 조직에 광학 투명도의 급속 한 생산을 위한 방법 삭제

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

선명도의 개발 이후 기술 삭제 bioelectrochemical 수 있는 3 차원 표현 형 매핑 투명 한 조직 내의 다양 한 큐빅 (명확 하 고 가리지 뇌 이미징 등 새로운 개간 방법론에 대 한 칵테일 및 전산 분석), 스위치 (상호 작용 시간의 시스템 제어) 및 화학 제품의 활동, 지도 (확대는 프로테옴의 분석), 및 협정 (수동 선명도 기술)에 대 한 기존의 툴킷 확대 설립 되었습니다 생물학 직물의 현미경 분석입니다. 현재 향상 하 고 전체 중앙 신경 시스템 (CNS), 신장, 비장, 그리고 전체 마우스 배아를 포함 하 여 그대로 설치류 조직의 배열에 대 한 원래 협정 절차를 최적화 하는 것을 목표로 공부 합니다. PsPACT (프로세스 별도 협정) 및 mPACT (수정 된 협정) 되 나, 이러한 소설 기법 셀 회로 고 그대로 정상 및 병 적인 조직에서 subcellular 구조 시각화의 높은 효능 수단을 제공 합니다. 다음 프로토콜에서 우리는 psPACT 및 mPACT 통해 그들의 구조적 무결성의 최소한의 침공으로 최대한 조직 허가 달성 하는 방법에 세부, 단계별 개요를 제공 합니다.

최적화 된 수동 청소 기술을 사용 하 여 전체 CNS의 투명 한 모델의 생성
마우스와 쥐 전체 CNS 조직의 광 정리 빠른 속도로 다양 한 수동 개간 기법 (그림 1)를 사용 하 여 달성 되었다. 조직 시간이 지남에 비운의 회로도 그림 2A에 표시 됩니다. 원래 협정 메서드와 달리 psPACT (프로세스 별도 협정) 히드로 하이브리드를 형성 하기 위하여 4% 아크릴 아 미드 (A4P0)와 0.25% 버지니아-044 초기자 솔루션 샘플을 두 개의 별도 단계에서 치료 포함 됩니다. mPACT (수정 된 협정) psPACT 8 %SDS 지우기 0.5% α-thioglycerol 솔루션을 보완 하 여 더욱 향상 시켰습니다. 협정, ps...

여기, 선물이 두 소설 방법론, psPACT 및 최대 광학 투명성과 조직 맥 관 구조에 그대로 설치류의 후속 현미경 분석을 달성 하기 위한 mPACT 전체 CNS.

소설 수동 전체 CNS 조직에 광학 투명도의 급속 한 생산을 위한 방법 삭제

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

이러한 psPACT 및 mPACT 방법의 전반적인 목표는 전기영동 조직 투명화 시스템 없이 전체 CNS 조직을 빠르게 투명화하는 것입니다. 이 방법은 알츠하이머병 또는 부상 및 퇴행 및 종양 형성과 같은 인간 질병 연구 모델 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생쥐 CNS 조직이 전기영동 조직 투명화에 의해 손상되지 않고 수정된 수동 투명화에 의해 빠르게 제거된다는 것입니다.우리는 원래 PACT와 과거의 뇌 정화 방법을 사용한 후 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. psPACT 및 mPACT 방법은 여러 단계의 시료 전처리 단계가 있기 때문에 실행하기가 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 먼저 4% PFA 및 4% 아크릴아미드 용액에 VA-044 분말을 최종 농도 0.25%로 첨가하여 PACT 칵테일 용액을 준비한 후 조직에 PACT 용액을 관류한 후 냉각된 PACT 용액이 들어 있는 50ml 튜브에 전체 뇌와 척수를 완전히 담그고 섭씨 4도에서 24시간 동안 보관합니다.24시간 후, 조직을 신선하고 차가운 PACT 용액이 들어 있는 50ml 튜브로 옮기고 튜브 캡을 질소 탱크에 연결하고 섭씨 37도로 설정된 조직 겔 혼성화 시스템에 연결합니다. 그런 다음 진공 청소기와 가스를 10분 동안 켜서 샘플을 질소 가스에 넣습니다. 하이드로겔을 중합하려면 샘플이 들어있는 튜브를 150rpm 및 섭씨 37도로 설정된 진탕 인큐베이터에 3시간 동안 또는 중합이 완료될 때까지 놓습니다.배양 후 압지를 사용하여 조직을 둘러싸고 있는 남아 있는 중합 하이드로겔을 제거합니다. 그런 다음 조직을 투명액이 들어 있는 50ml 튜브로 옮깁니다. 조직이 제거될 때까지 섭씨 37도 및 150rpm으로 설정된 진탕 인큐베이터에 샘플을 놓습니다.평균적으로 마우스 CNS가 완전한 선명도를 달성하는 데 약 20일이 걸립니다. 섭씨 4도에서 24시간 동안 4% PFA에 사후 고정된 4% PFA가 관류된 마우스의 CNS로 psPACT를 시작합니다. 0.1 어금니 PBS에서 고정 조직을 1 시간 동안 세척합니다.세척 후 조직을 A4P0 용액으로 옮기고 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음날, PBS에서 5분 동안 조직을 세척한 후 조직을 PBS의 0.25%VA-044에 담그고 섭씨 37도에서 6-24시간 동안 배양합니다. 아크릴아마이드와 후속 VA-044 단계를 분리하면 조직을 둘러싸고 있는 남아있는 중합되지 않은 하이드로겔 단량체를 제거할 필요가 없으며, 이는 PACT로 투명도를 달성한 후 최종 조직 무결성을 손상시킬 수 있습니다.배양 후 조직을 신선하고 차가운 VA-044 용액으로 옮깁니다. 그런 다음 샘플을 질소 가스에 10분 동안 담습니다. 조직을 투명화 용액으로 옮깁니다.그런 다음 조직이 제거될 때까지 섭씨 37도 및 150rpm으로 설정된 진탕 인큐베이터에서 샘플을 배양합니다. 평균적으로 마우스 CNS가 완전한 선명도를 달성하는 데 약 17일이 걸립니다. mPACT의 경우 청산 솔루션 단계까지 psPACT에 대한 프로토콜을 따릅니다.그런 다음 0.1 몰 PBS에 8 % SDS 외에 0.5 % 알파 - 티오 글리세롤, un-browning 제를 함유 한 조직 세척 용액을 완전히 담그십시오. 조직이 제거될 때까지 섭씨 37도 및 150rpm으로 설정된 진탕 인큐베이터에 샘플을 놓습니다. 평균적으로 마우스 CNS가 mPACT를 사용하여 완전한 선명도를 달성하는 데 2주밖에 걸리지 않습니다.본 연구에서 mPACT 프로토콜을 통해 처리된 마우스 뇌 샘플은 PACT 및 psPACT 프로토콜을 통해 처리된 샘플보다 14일 후에 광학 투명도를 달성했습니다. mPACT에 의해 투명화된 쥐 전체 CNS 샘플은 20일 만에 최대 제거율을 달성했습니다. 전체 CNS가 아닌 성인 쥐의 뇌만 mPACT로 단 5일 만에 제거되었습니다.일단 숙달되면, 이 기술은 제대로 수행된다면 쥐 전체 CNS로 2주 안에 완료할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 신경 과학 및 해부학 분야의 연구자들이 포유류 CNS 모델에서 조직 손상, 발달 기형, 암 및 신경 퇴행성 질환과 같은 병태생리학적 질병을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

novel-passive-clearing-methods-for-rapid-production-optical

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기 세미 두께 뇌 조각의 이미지 찬란 표시된 셀에 신속하고 간단한 방법을 설명합니다. , 고정 깔끔히 및 광학 뇌 조직을 취소하여 우리는 표준 epifluorescent 또는 공촛점 이미지가 손상 신경 조직 내의 개별 세포의 연결 네트워크를 시각화하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

광학 투명화 기술은 조직을 시각화하는 방식에 혁명을 일으키고 있습니다. 이 보고서에서는 보다 일관되고 저렴한 결과를 제공하는 원래의 CLARITY(Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel) 프로토콜의 수정 사항에 대해 설명합니다.

수동 CLARITY를 사용하여 마우스 중추 신경계의 광학 지우기

ACT-PRESTO (장기에 거대 분자의 활성 명확하게 기술 압력과 관련된 효율적이고 안정적인 전송) 수동 확산 또는 압력 보조 배달에 의해 삭제 조직으로, 신속하게 효율적으로하지만, 저렴한 조직 청소 및 신속한 항체 침투 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여, 조직의 넓은 범위는 다중 항체 클리어하여 immunolabeled 및 볼륨 - 이미징 될 수있다.

ACT-PRESTO : 생물 조직 지우기 및 볼륨 이미징을위한 Immunolabeling 방법

항체 라벨링, 광학 클리어링 및 고급 광 현미경의 조합은 완전한 구조 또는 장기의 3차원 분석을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 간단한 방법은 두꺼운 신장 슬라이스의 면역 라벨링, 에틸 시나메이트와 광학 클리어링, 3차원 신장 구조의 시각화 및 정량화를 가능하게 하는 공초점 이미징을 결합하는 간단한 방법입니다.

면역 표지된 신장 조직의 광학 클리어링 및 화상 진찰

신경 수지상 형태는 종종 기능의 근간을 이수합니다. 실제로, 뉴런의 발달에 영향을 미치는 많은 질병 프로세스는 형태학적 표현형으로 나타납니다. 이 프로토콜은 그대로 수지상 식소및 연관된 척추를 분석하는 간단하고 강력한 방법을 설명합니다.

선명도 조직 클리어링을 통한 손상되지 않은 뉴런 덴라이트의 이미징 및 정량화

이 프로토콜은 조직 제거 방법인 ScaleSF를 사용하여 뇌 절편에서 신경 세포 영상의 상세한 방법을 제공한다. 이 프로토콜에는 뇌 조직 준비, 조직 정화, 클리어 슬라이스 처리 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미징이 포함됩니다.

중시경에서 현미경 비늘에 이르기까지 신경 세포 이미징을위한 조직 제거 방법

종양 구상체는 종양 세포-미세환경 상호작용 및 치료 반응을 평가하기 위해 점점 더 활용되고 있다. 본 프로토콜은 신속한 광학 클리어링을 사용하여 3D 종양 구상체의 반고처리량 이미징을 위한 견고하지만 간단한 방법을 기술한다.

종양 구상체의 반 높은 처리량 분석을 위한 신속한 광학 클리어링

본 프로토콜은 (SWITCH - H 2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT 조직 형질 전환 기법과 광시트 형광 현미경 이미징을 일상적으로 높은 처리량 프로토콜로 결합하여 수십 개의 사후 인간 뇌 절편의 신속하고 동시적인 광학 투명화, 다중 라운드 라벨링 및 3D 체적 재구성을 위한 단계별 절차를 제공합니다.

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging(대규모 인간 뇌 영상에서 광시트 형광 현미경을 위한 광학 투명화 및 라벨링)

이 프로토콜은 광학 투명화(optical clearing)와 면역 라벨링(immunolabeling)을 결합하여 전체 마운트 망막 오가노이드의 전체 볼륨 컨포칼 이미징을 제공합니다. 3D 구조를 보존하여 주요 신경 경로를 자세히 시각화할 수 있으며, 망막 성숙, 공간 조직, 질병 모델링 및 개인 맞춤형 의학에서의 잠재적 응용에 대한 연구를 개선합니다.

Whole-mount Retinal Organoid Visualization with Cellular Resolution

흡수 분자 용액과 같은 광학 투명화 기술은 광 산란을 일시적으로 줄여 생물학적 이미징을 향상시키고 깊이 박힌 장기에 대한 생체 적합성, 가역적 생체 내 이미징 전략을 제공합니다. 이 프로토콜은 살아있는 동물의 실시간 역학을 위한 고품질의 동적 이미징을 달성하기 위해 상세한 실험 절차와 고급 이미지 처리를 제공합니다.

Ex Vivo 및 In Vivo 이미징을 위한 흡수 분자를 사용한 일시적인 광학 투명화

배우세요 쥐와 생쥐의 전체 중추신경계 조직을 손상 없이 빠르게 광학 투명화하는 psPACT 및 mPACT 기법을 활용한 신경과학 연구 방법입니다. 이 기술은 알츠하이머병 및 종양 형성 등의 질병 메커니즘 연구에 활용됩니다.

소설 수동 전체 CNS 조직에 광학 투명도의 급속 한 생산을 위한 방법 삭제

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