Name: 중시경에서 현미경 비늘에 이르기까지 신경 세포 이미징을위한 조직 제거 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 학습하세요 ScaleSF 조직 투명화 기법을 이용한 뇌 조각 신경 세포 이미징 방법을. 마우스 뇌 조직에서 EGFP 양성 뉴런의 3D 구조를 고해상도로 시각화하여 신경 회로 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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저자들은 AAV 벡터 제작을 위한 이시다 요코(준텐도 대학)와 기술 지원을 위해 호시노 키사라(준텐도 대학)에게 감사를 표한다. 본 연구는 JSPS KAKENHI (JP20K07231 내지 K.Y.; JP21H03529 내지 T.F.; JP20K07743 내지 M.K.; JP21H02592 내지 H.H.) 혁신 영역 "공명 바이오"에 대한 과학 연구 (JP18H04743 ~ H.H.). 이 연구는 또한 일본 의학 연구 개발청 (AMED) (JP21dm0207112 ~ T.F. 및 H.H.), 일본 과학 기술국 (JST)의 Moonshot R & D (JPMJMS2024 ~ H.H.), JST (JPMJFR204D에서 H.H.까지)의 파괴적인 과학 기술을위한 융합 지향 연구 (FOREST), 중텐도 대학 의과 대학 의과 대학 노년기 질환 연구소 (X2016 ~ K.Y.; X2001 to H.H.), 그리고 사립 학교 브랜딩 프로젝트.

모든 실험은 준텐도 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (승인 번호 2021245, 2021246)의 승인을 받았으며 일본 과학위원회 (2006)의 동물 실험의 적절한 수행을위한 기본 지침에 따라 수행되었습니다. 여기서, 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP) 유전자와 파브알부민(PV)/미리스토일화-EGFP-저밀도 지단백 수용체 C-말단 박테리아 인공염색체(BAC) 형질전환 마우스(PV-FGL 마우스)9 를 담은 AAV 벡터를 주입한 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하였다. PV-FGL 마우스는 C57BL/6J 배경에서 유지되었다. 이 연구와 관련하여 성별에 근거한 차이는 발견되지 않았습니다.
1. 조직 준비
<ol><li>관류 고정 참고: 흄 후드에서 1.1.1~1.1.3단계를 수행하여 파라포름알데히드(PFA)에 대한 노출을 제한하십시오.<ol>
<li>성인 남성 마우스 (8-16 주령)를 펜토바르비탈 나트륨 (200 mg / kg)의 과다 복용으로 복강 내 주사하여 마취하십시오. 발가락 꼬집음 금단과 눈 깜빡임 반사의 부재로 마취의 적절성을 확인하십시오.</li>
		<li>흉강을 열고 수술 가위로 오른쪽 심방 부속기를 자릅니다. 20 mL 주사기에 부착된 23 G 바늘을 사용하여 마우스를 빙냉 인산완충염수 (PBS) 20 mL로 관류시키고, 이어서 또 다른 20 mL 주사기를 사용하여 0.1 M 인산염 완충액 (PB) 중의 빙냉 4% PFA 20 mL를 관류시켰다. 주의: PFA는 독성이 있으며 기형발생성입니다. 흡입이나 피부, 눈 및 점막과의 접촉을 피하십시오.</li>
		<li>핀셋으로 두개골에서 뇌 조직을 제거하십시오. 뇌 조직을 0.1 M PB의 4% PFA가 들어있는 15 mL 튜브로 옮기고, 샘플을 빛으로부터 보호하고, 50-100 rpm의 진탕기에서 4°C에서 밤새 부드럽게 흔들어줍니다.</li>
		<li>참고: 수확된 뇌 조직은 4°C에서 PBS 중의 0.02% 아지드 나트륨(NaN3)에 수 주 동안 저장될 수 있다. 주의:NaN3는 독성이 있습니다. 흡입이나 피부, 눈 및 점막과의 접촉을 피하십시오. 흄 후드 안에서 다루십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>두뇌 조각 준비<ol>
<li>PBS 50 mL에 한천 2 g을 첨가하여 PBS 중의 4% 한천을 제조하였다. 한천이 완전히 용해 될 때까지 혼합물을 전자 레인지. 용액을 40-45°C로 냉각시킨다. 참고 : 한천의 주요 구성 요소 인 agaropectin이 제공하는 점성 특성은 조직 조각의 절단 용이성을 향상시킵니다.</li>
		<li>한천 용액 10 mL를 6-웰 배양 플레이트에 첨가한다. 포셉을 사용하여 한천 용액에 뇌 조직을 잠급니다. 한천이 얼음 위에서 굳어지게하십시오.</li>
		<li>우물에서 내장 된 뇌 조직을 제거하고 면도날로 한천을 다듬습니다. 아가 블록을 수퍼 접착제로 비브라톰 욕조 바닥에 고정하고 버퍼 트레이에 0.1M PB를 붓습니다.</li>
		<li>에탄올에 담근 보풀이 없는 티슈 페이퍼를 사용하여 다른 면도날을 청소하고 진동 조직 슬라이서의 블레이드 홀더에 블레이드를 부착합니다.</li>
		<li>단면화 속도를 진폭이 1.4mm인 0.14mm/s로, 주파수를 75-77Hz로 설정합니다. 뇌 조직을 1mm 두께의 조각으로 자르고 PBS가 포함된 6웰 세포 배양 플레이트에 조각을 수집합니다. 참고: 뇌 절편은 4°C에서 PBS 중의 0.02%NaN3 에 몇 주 동안 저장될 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 조직 정화
참고: 사용된 ScaleS 용액의 조성은 표 1에 열거되어 있다. 샘플은 호일로 덮어서 빛으로부터 보호해야합니다. 지우기 단계는 그림 1A에 나와 있습니다.
<ol><li>8 mL의 Sca l eS0 용액을 6-웰 세포 배양 플레이트의 한 웰에 첨가하고, 8 mL의 ScaleS4 용액을 플레이트의다른 웰에 첨가하고, 인큐베이터에서 37°C로 예열한다.</li>
	<li>뇌 절편을 주걱으로 미리 가온된 ScaleS0 용액으로 옮기고 90 rpm의 진탕 인큐베이터에서 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>투과화된 뇌 조각을 주걱이 있는 6-웰 세포 배양 플레이트에 PBS(–) 8 mL로 옮기고 40-60 rpm의 오비탈 진탕기에 보관하여 15분 동안 세척한다. 이 작업을 두 번 반복하십시오.</li>
	<li>뇌 조각을 미리 가온된 8 mL의 ScaleS4 용액에 주걱으로 옮기고 37°C에서 8-12시간 동안 90rpm의 진탕 인큐베이터에서 배양하여 이를 지웁니다. 지워진 뇌 조각은 그림 1에서 볼 수 있습니다.
</li>
</ol>3. 브레인 슬라이스 장착
참고: 사용자 지정 가능한 이미징 챔버는 클리어된 뇌 조각의 안정적인 장착에 사용됩니다(그림 2)6. 챔버는 챔버 프레임과 하단 커버 슬립으로 구성됩니다. 현미경 스테이지 어댑터는 이미징 챔버를 현미경 스테이지에 직접 장착하도록 설계되었습니다(그림 2A,B). 챔버 프레임 및 현미경 스테이지 어댑터는 사내 또는 아웃소싱 3D 인쇄 서비스를 사용하여 3D 인쇄할 수 있습니다. 이미징 챔버의 3D 컴퓨터 지원 설계(CAD) 데이터는 Furuta et al. 20226에 제공된다.
<ol><li>챔버 준비를 위해, 감압 접착제를 사용하여 챔버 프레임을 커버슬립에 부착하십시오.</li>
	<li>병에 든 용액 100 mL에 아가로오스 1.5 g을 첨가하여 Sca l eS4D25 (0) 용액 (ScaleS4 겔)에 1.5 % 아가로스를 준비하십시오. 아가로스가 완전히 용해 될 때까지 용액을 교반하고 전자 레인지로 용액을 잘 섞는다. 완료되면 용액을 37 °C로 냉각하십시오.</li>
	<li>클리어 된 뇌 조각을 주걱으로 이미징 챔버의 하단 커버 슬립에 장착하십시오. 보풀이 없는 깨끗한 티슈 페이퍼를 사용하여 클리어된 슬라이스에서 과량의 용액을 닦아냅니다.</li>
	<li>ScaleS4 겔을 마이크로피펫을 사용하여 뇌 슬라이스에 첨가하여 이미징 챔버를 채운다. 포셉으로 위에 다른 커버슬립을 놓고 보풀이 없는 티슈 페이퍼와 유리 슬라이드를 커버슬립에 순서대로 놓습니다.</li>
	<li>이미징 챔버를 4°C의 냉장고로 옮긴다. 유리 슬라이드에 금속 무게를 놓고 30 분 동안 그대로 두십시오.</li>
	<li>이미징 챔버에서 금속 중량, 유리 슬라이드, 보풀이 없는 티슈 페이퍼 및 커버슬립을 제거하고 과도한 젤을 닦아냅니다(그림 2A,B).</li>
	<li>이미징 챔버를 60mm 유리 페트리 접시에 넣고 퍼티와 같은 감압 접착제로 이미징 챔버의 테두리를 접시에 부착하십시오. 여러 지점의 챔버를 페트리 접시에 부착하십시오.</li>
	<li>ScaleS4 용액을 접시에 붓고 40-60 rpm의 오비탈 쉐이커 상에서 20-25°C에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 준다. 신선한 용액으로 대체하고 200 μL 피펫 팁을 사용하여 표면을 부드럽게 긁어 젤 표면의 기포를 제거하십시오. 침지된 이미징 챔버를 현미경 스테이지에 장착합니다(그림 2C).</li>
</ol>4. CLSM 이미징
<ol><li>장거리 작동 거리(WD)의 다중 침지 대물 렌즈가 장착된 CLSM을 사용하여 이미지를 획득합니다(16x/0.60 수치 조리개[NA], WD = 2.5mm). 참고: 높은 NA 대물 렌즈는 높은 회절 제한 해상도를 제공할 수 있습니다.</li>
	<li>모든 관련 이미징 장비(워크스테이션, 현미경, 스캐너, 레이저 및 수은 램프)를 켜고 CLSM 이미징 소프트웨어를 시작합니다.</li>
	<li>다중 침지 대물 렌즈의 보정 칼라를 1.47로 설정합니다. ScaleS4 용액은 약 1.47,5,7의 굴절률 (RI)을 갖는다. RI 불일치로 인한 수차는 이미지 형성을 방해할 수 있습니다(그림 3).</li>
	<li>대물 렌즈를 용액에 담그고 슬라이스에 천천히 접근하게하십시오. 대물 렌즈 끝에 갇힌 기포를 제거합니다. epifluorescence를 사용하여 클리어링된 조직에서 관심 영역(ROI)을 찾습니다.</li>
	<li>적절한 설정을 테스트하여 이미지 수집 매개 변수를 설정합니다.<ol>
<li>이미지 수집을 위한 비트 심도를 결정합니다. 이미지의 데이터 크기는 비트 깊이에 따라 증가합니다.</li>
		<li>감지 파장을 설정합니다. 방출 스펙트럼에 따라 검출기에 적합한 게이트를 조정하십시오. 검출 파장이 레이저 라인을 커버하지 않는지 확인하십시오.</li>
		<li>xy 해상도를 설정합니다. 형식이 클수록 더 나은 xy 해상도를 제공하지만 이미지를 수집하는 데 시간이 더 오래 걸립니다.</li>
		<li>스캔 속도를 설정합니다. 느린 스캔 속도는 높은 신호 대 잡음비를 제공합니다. 그러나 픽셀 체류 시간과 광표백의 위험도 증가합니다. 그에 따라 선택하십시오.</li>
		<li>핀홀 크기를 조정합니다. 핀홀 크기는 광학 섹션 두께를 제어합니다. 핀홀 크기가 작을수록 광학 섹션이 더 얇아져 z 분해능이 향상되지만 형광 신호는 감소합니다. 핀홀 크기를 크게 만들면 형광 신호가 더 강한 더 두꺼운 광학 섹션이 제공됩니다.</li>
		<li>레이저 전력, 검출기/증폭기 게인 및 오프셋을 설정합니다. 적절한 이미지가 얻어질 때까지 레이저 전력 및 검출기/증폭기 이득을 점진적으로 증가시킨다. 높은 레이저 파워는 광표백의 위험을 수반합니다. 오프셋(콘트라스트)을 적절하게 조정하여 높은 신호 대 잡음비를 얻습니다.</li>
		<li>ROI 크기에 따라 필요한 경작 영역을 결정합니다. ROI의 전체 길이와 너비가 캡처되었는지 확인하십시오.</li>
		<li>모든 평면에서 지워진 조직을 탐색하고 스택의 시작점과 끝점을 설정합니다. 원하는 z 분해능에 따라 z-스텝 크기를 설정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미지 획득 설정에 만족할 때 이미지를 수집하고 캡처된 이미지를 기록합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution%3A+Toward+organism-level+systems+biology+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li>
<li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li>
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<li>Furuta, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-scale+light+microscopy%2Felectron+microscopy+neuronal+imaging+from+brain+to+synapse+with+a+tissue+clearing+method%2C+ScaleSF%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF.</a> iScience. 25 (1), 103601(2022).</li>
<li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+imaging+of+cleared+brain+by+confocal+laser-scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy.</a> Protocol Exchange. , (2016).</li>
<li>Okamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exclusive+labeling+of+direct+and+indirect+pathway+neurons+in+the+mouse+neostriatum+by+an+adeno-associated+virus+vector+with+Cre%2Flox+system%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100230(2021).</li>
<li>Kameda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-producing+cortical+interneurons+receive+inhibitory+inputs+on+proximal+portions+and+cortical+excitatory+inputs+on+distal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites.</a> The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).</li>
<li>Sohn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+vector+platform+for+high-level+gene+transduction+of+central+neurons%3A+Adeno-associated+virus+vector+equipped+with+the+Tet-off+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system.</a> PLoS One. 12 (1), 0169611(2017).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fractions+of+short-+and+long-range+connections+in+the+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).</li>
<li>Kuramoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+thalamocortical+projections+from+the+motor+thalamic+nuclei+of+the+rat%3A+a+single+neuron-tracing+study+using+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors.</a> Cerebral Cortex. 19 (9), New York, N.Y. 2065-2077 (2009).</li>
<li>Matsuda, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+nigrostriatal+dopaminergic+neurons+form+widely+spread+and+highly+dense+axonal+arborizations+in+the+neostriatum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).</li>
<li>Lin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+and+projection-specific+brain-wide+reconstruction+of+single+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons.</a> Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).</li>
<li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+1%2C000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li>
<li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+tissue+clearing+%28PACT%29%3A+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence%2C+histology%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Scientific Reports. 6, 34331(2016).</li>
</ol>

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프로토콜 내의 중요한 단계 프로토콜에는 의미 있는 결과를 얻기 위해 최대한의 주의를 기울여 수행해야 하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 샘플의 균일 한 고정은 대규모 조직 내에서 3D 이미징을 위해 필수적입니다. 대물 렌즈, 샘플 및 침지 유체는 일치하는 RI를 가져야합니다. 이들 사이의 RI-불일치는 제거된 뇌 절편 내에서 EGFP 발현 세포의 고도로 교란된 영상화로 이어질 것이다(도 3). 대물 렌즈를 침지 유체에 대한 보정 칼라 조정은 깊이 유도 구형 수차를 최소화하여 3D 이미징에서 신호, 콘트라스트 및 공간 분해능을 극대화합니다. 준비된 용액의 RI는 굴절계를 사용하여 측정 할 수 있습니다.
기술 문제 해결 용액의 더 긴 저장은 클리어링 능력과 형광 신호 보존 능력 및 구조적 무결성에 영향을 줄 수 있습니다. 갓 준비된 용액을 사용해야합니다. 이들 용액은 4°C에서 ...

조직 제거 방법은 광 현미경으로 생물학적 및 임상 샘플의 깊이 독립적 인 이미징을 개선하여 손상되지 않은 조직 1,2에 대한 구조 정보를 추출 할 수 있습니다. 광학 클리어링 기술은 잠재적으로 속도를 높이고 조직학적 분석 비용을 절감할 수 있습니다. 현재 세 가지 주요 클리어링 접근법이 있습니다 : 친수성, 소수성 및 하이드로 겔 기반 방법 1,2. 친수성 접근법은 형광 신호 및 조직 완전성을 보존하는 데 있어 능가하며, 다른 두 접근법(3,4)에 비해 독성이 적다.
친수성 클리어링 방법인 ScaleS는 구조적 및 분자 무결성의 보존과 강력한 클리어링 능력(클리어링-보존 스펙트럼)5으로 독특한 위치를 차지하고 있습니다. 이전 연구에서, 우리는 Sca l eS6의 클리어링 절차를 수정하여 조직 슬라이스 (~ 1-mm 두께)에 대한 신속하고 등각 클리어링 프로토콜 인 ScaleSF를 개발했습니다. 이 클리어링 프로토콜은 10.5-14.5 시간 동안 세 가지 솔루션으로 뇌 조각을 순차적으로 배양해야합니다. 이 방법은 전자 현미경 (EM) 분석 (보충 그림 1)과도 호환되는 높은 클리어링 보존 스펙트럼을 특징으로하므로 정확한 신호 재구성6을 갖춘 멀티 스케일 고해상도 3D (3D) 이미징이 가능합니다. 따라서 ScaleSF는 특히 신경 세포가 엄청난 길이의 풍부한 과정을 정교하게하고 정보를 전달하고 수신하기위한 전문화 된 미세한 세포 하부 구조를 배열하는 뇌에서 효과적이어야합니다. 신경 세포의 회로에서 세포 하위 수준까지 비늘로 구조 정보를 추출하는 것은 뇌 기능을 더 잘 이해하는 데 매우 유용합니다.
여기에서는 ScaleSF를 사용하여 중시경 / 회로에서 현미경 / 세포 수준까지의 스케일로 신경 구조를 시각화하기위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에는 조직 준비, 조직 정화, 클리어 된 조직의 취급 및 클리어 된 조직의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 이미징이 포함됩니다. 우리의 프로토콜은 회로에서 아세포 구성 요소 척도에 이르기까지 신경 구조를 심문하는 데 중점을 둡니다. 용액의 제조를 위한 상세한 절차와 마우스 뇌에 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터의 입체택시 주사를 위한 상세한 절차는 각각 Miyawaki et al. 20167 및 Okamoto et al. 20218을 참조한다.

<table><tbody><tr><td>16x 다중 침수 대물 렌즈</td><td>Leica Microsystems</td><td>HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Nacalai Tesque</td><td>01028-85</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>TaKaRa Bio</td><td>L03</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Nacalai Tesque</td><td>13407-45</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06286-55</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;- 사이클로덱스트린</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>037-10643</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Huygens Essential</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td>ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>ver. 9.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X</td><td>Leica Microsystems</td><td>LAS X, ver. 3.5.5.19976</td><td></td></tr><tr><td>메틸-&베타;-사이클로덱스트린</td><td>도쿄 화학 산업</td><td>M1356</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Merck Millipore</td><td>1.04005.1000</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(10x; pH 7.4)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>27575-31</td><td>10x PBS(&ndash;)</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31233-55</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP8</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35940-65</td><td></td></tr><tr><td>진동 조직 슬라이서</td><td>Dosaka EM</td><td>PRO7N</td><td></td></tr></tbody></table>

중시경에서 현미경 비늘에 이르기까지 신경 세포 이미징을위한 조직 제거 방법

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

중강경에서 뇌 조직의 현미경 수준에 이르기까지 신경 구조를 시각화하기 위해 상세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 신경 회로에서 세포 하부 신경 구조에 이르기까지 뉴런 구조는 ScaleSF로 광학적으로 클리어 된 마우스 뇌 조각에서 시각화됩니다. 이 클리어링 방법은 ScaleS의 변형 된 버전이며 강력한 클리어링 기능뿐만 아니라 형광 신호의 높은 수준의 보존 및 구조적 무결성을 달성하는 조직 슬라이스에 대한 친수성 조직 제거 방법입니다. 사용자 정의 가능한 3차원(3D) 인쇄 이미징 챔버는 클리어된 뇌 조직의 안정적인 장착을 위해 설계되었습니다. 강화된 녹색 형광 단백질 유전자를 운반하는 아데노 관련 바이러스 벡터를 주입한 마우스 뇌를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 진동 조직 슬라이서로 1-mm 두께의 조각으로 절단하였다. 뇌 조각은 세 가지 용액, 즉 Sca l eS0 용액, 인산염 완충 식염수 (-) 및 ScaleS4 용액에서 순차적 인 배양을 포함하는 클리어링 프로토콜에 따라 총10.5-14.5 h의 클리어링 프로토콜에 따라 제거되었습니다. 클리어된 뇌 조각을 이미징 챔버에 장착하고 ScaleS4D25(0) 용액에 용해된 1.5% 아가로스 겔에 매립하였다. 슬라이스의 3D 이미지 획득은 긴 작동 거리의 다중 침지 대물 렌즈가 장착 된 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수행되었습니다. 중강경 신경 영상으로 시작하여, 우리는 수지상 척추 및 축삭돌과 같은 미세한 세포 하부 신경 구조를 광학적으로 지워진 뇌 조각에서 시각화하는 데 성공했습니다. 이 프로토콜은 회로에서 아세포 구성 요소 척도에 이르기까지 신경 구조의 이해를 용이하게합니다.

1-mm 두께의 마우스 뇌 슬라이스의 광학 클리어링은 이 프로토콜을 사용하여 달성되었다. 도 1B 는 클리어링 처리 전후의 마우스 뇌 슬라이스의 전송 이미지를 나타낸다. 조직 제거 방법은 1mm 두께의 마우스 뇌 조각을 투명하게 렌더링했습니다. 뇌 조각의 최종 크기에서 약간의 확장은 12 h 동안 클리어링 용액에서 인큐베이션 한 후에 발견되었다 (선형 팽창 : 102.5 % ± 1.3 %). 조직의 형광 및 구조적 완전성의 보존을 PV-FGL 마우스에서 원형질막에서의 표적화된 EGFP 발현으로 평가하였다(도 1C). 이들 마우스에서, 소마토덴드린성 막-표적화된 EGFP는 PV 양성 뉴런9에서 발현된다. 소마토덴드리아 영역에서 원형질막을 표적으로 하는 EGFP 발현은 처리 후에 유지되었다(도 1C). 또한, 이전의 EM 연구는 Scale...

이 프로토콜은 조직 제거 방법인 ScaleSF를 사용하여 뇌 절편에서 신경 세포 영상의 상세한 방법을 제공한다. 이 프로토콜에는 뇌 조직 준비, 조직 정화, 클리어 슬라이스 처리 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미징이 포함됩니다.

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

우리의 프로토콜은 뇌 기능을 더 잘 이해하는 데 필수적인 회로에서 구성 요소 척도에 이르기까지 신경 구조에 대한 조사를 용이하게합니다. 당사의 클리어링 기술인 ScaleSF는 강력한 클리어링 기능뿐만 아니라 크고 작은 규모의 구조물을 동시에 시각화하는 데 필요한 높은 수준의 조직 보존을 발휘합니다. 우리의 프로토콜은 신경 세포가 정교한 과정, 엄청난 링크를 나타내며 전문화 된 미세한 세포 하부 구조를 배열하는 뇌에서 특히 효과적입니다.실험을 시작하기 전에 이 표와 같이 Sca/eS 솔루션을 준비하고 샘플을 호일로 덮습니다. 여섯 웰 세포 배양 플레이트의 두 개의 분리된 웰에 각각 8밀리리터의 ScaleS0 및 ScaleS4 용액을 8밀리리터씩 첨가하여 절차를 시작하고 인큐베이터에서 플레이트를 섭씨 37도까지 미리 데온합니다. 뇌 조각을 주걱으로 미리 가온된 ScaleS0 용액으로 옮기고 90RPM의 진탕 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 두 시간 동안 슬라이스를 인큐베이션합니다.다음에, 투과된 뇌 절편을 6개의 웰 세포 배양 플레이트에서 마이너스 PBS 8밀리리터로 옮기고, 40 내지 60 RPM의 오비탈 진탕기에서 유지함으로써 15분 동안 세척한다. 이 단계를 두 번 반복합니다. 그런 다음 뇌 조각을 미리 예열 된 ScaleS4 용액 8 밀리리터로 옮기고 섭씨 37도에서 90RPM에서 8 ~ 12 시간 동안 배양하십시오.챔버 준비를 위해 챔버 프레임과 현미경 스테이지 어댑터를 3D 프린팅합니다. 감압 접착제를 사용하여 챔버 프레임을 커버슬립에 부착합니다. ScaleS4D25(0) 용액에서 1.5% 아가로스를 준비합니다.용액을 혼합하고 아가로스가 완전히 용해 될 때까지 전자 레인지를 돌립니다. 그런 다음 용액을 섭씨 37도까지 식히십시오. 클리어 된 뇌 조각을 주걱으로 이미징 챔버의 하단 커버 슬립에 장착하십시오.깨끗한 조직을 사용하여 클리어 슬라이스에서 과량의 용액을 제거하십시오. ScaleS4 젤을 마이크로 피펫을 사용하여 뇌 조각에 추가하여 이미징 챔버를 채 웁니다. 포셉으로 위에 다른 커버 슬립을 놓고 티슈 페이퍼와 유리 슬라이드를 놓습니다.이미징 챔버를 섭씨 네 도의 냉장고로 옮깁니다. 유리 슬라이드에 금속 무게를 놓고 30 분 동안 그대로 두십시오. 인큐베이션 후, 이미징 챔버로부터 물질을 제거하고 과량의 겔을 닦아낸다.이미징 챔버를 60mm 유리 페트리 접시에 넣고 이미징 챔버의 테두리를 여러 지점에 감압 접착제로 접시에 부착하십시오. ScaleS4 용액을 접시에 붓고 섭씨 20 ~ 25도에서 40 ~ 60 RPM으로 한 시간 동안 부드럽게 흔들어줍니다. 신선한 용액으로 대체하고 피펫 팁을 사용하여 표면을 부드럽게 긁어 젤 표면의 기포를 제거하십시오.이미징 챔버를 현미경 스테이지에 장착하십시오. 2.5 밀리미터 작동 거리, 16x 배율 및 0.60 수치 조리개의 다중 침지 대물 렌즈가 장착 된 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 준비하십시오. 워크 스테이션, 현미경, 스캐너, 레이저, 수은 램프와 같은 모든 관련 이미징 장비를 켜고 이미징 소프트웨어를 시작하십시오.다중 침지 대물 렌즈의 보정 칼라를 1.47로 설정합니다. 대물 렌즈를 용액에 담그고 슬라이스에 천천히 접근하게하십시오. 대물 렌즈 끝에 갇힌 모든 기포를 제거하십시오.epifluorescence를 사용하여 클리어 된 조직에서 관심있는 영역을 찾으십시오. 이미지 획득 파라미터를 설정하려면, 먼저, 비트에 따라 이미지의 크기가 증가함에 따라 이미지 획득을 위한 비트 깊이를 결정한다. 그런 다음 방출 스펙트럼에 따라 검출 파장을 설정하십시오.XY 해상도, 스캔 속도 및 핀홀 크기를 설정합니다. 또한 레이저 전력, 검출기 증폭기 이득 및 적절한 이미지가 얻어질 때까지 오프셋을 조정한다. ROI의 크기에 따라 타일링 크기를 결정하여 ROI의 전체 길이와 너비가 캡처되도록 합니다.모든 평면에서 조직을 탐색하고 스택의 시작과 끝점을 설정합니다. 원하는 Z 해상도에 따라 Z 단계 크기를 설정합니다. 이미지를 수집하고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 처리합니다.이 프로토콜을 사용하여, 한 밀리미터 두께의 마우스 뇌 슬라이스의 광학 클리어링이 달성되었다. PV-FGL 마우스의 대뇌 피질에서의 EGFP 발현은 조직의 형광 및 구조적 완전성이 보존되었음을 보여주었다. 굴절률 불일치 유도 수차는 EGFP 양성 뉴런의 이미지 밝기 및 해상도의 현저한 손실을 야기하였다.이 뉴런은 보정 칼라가이 ScaleS4 솔루션과 일치하도록 조정되었을 때 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 명확하게 시각화되었습니다. 마우스 일차 체감각 피질에서 EGFP 표지된 뉴런의 3D 재구성은 한 밀리미터 두께의 뇌 절편에서 이루어졌다. 수지상 척추로 장식 된 개별 수지상 arbors는 더 높은 배율로 보였다.축삭 말단 수목화 및 축삭 부톤도 슬라이스에서 관찰되었다. 이미징 유체와 오브젝트 렌즈 사이의 반사 지수 정합은 클리어링된 조직에서 3D 이미징에 매우 중요합니다. 우리의 기술은 회로에서 구성 요소 스케일에 이르기까지 뉴런 구조를 통합하는 것을 촉진하여 뉴런 메커니즘에 대한 통찰력, 뇌에서의 처리 정보를 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기 세미 두께 뇌 조각의 이미지 찬란 표시된 셀에 신속하고 간단한 방법을 설명합니다. , 고정 깔끔히 및 광학 뇌 조직을 취소하여 우리는 표준 epifluorescent 또는 공촛점 이미지가 손상 신경 조직 내의 개별 세포의 연결 네트워크를 시각화하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

출처: Pekarek, B. T., et. al., CLARITY 조직 투명화를 통한 온전한 신경 수상돌기의 이미징 및 정량화. J. Vis. Exp. (2021)이 비디오에서는 컨포칼 현미경 및 3D 재구성 기술을 사용하여 수지상 가지, 척추 형태 및 신경 분포를 조사하기 위해 제거된 마우스 뇌의 준비, 이미징 및 분석을 보여줍니다.

Confocal Microscopy Imaging of intact dendritic arbors and spine morphology in a cleared mouse brain(투명화된 쥐 뇌에서 온전한 수지상 가지와 척추 형태에 대한 컨포칼 현미경 이미징)

큰 조직 내에서 형광 표지된 세포의 고해상도 이미지를 얻으려면 이상적으로는 생물학적 샘플을 절편 없이 이미지화해야 합니다. 3DISCO는 유기 용매를 사용한 순차적 배양을 기반으로 하는 간단한 조직 세척 절차입니다. 투명화되면 장기가 투명해져 표본의 종단 간 레이저 스캔이 가능합니다.

영상은 3DISCO에 의해 세포 수준에서 본래대로 생물학적 시스템을 해제

ACT-PRESTO (장기에 거대 분자의 활성 명확하게 기술 압력과 관련된 효율적이고 안정적인 전송) 수동 확산 또는 압력 보조 배달에 의해 삭제 조직으로, 신속하게 효율적으로하지만, 저렴한 조직 청소 및 신속한 항체 침투 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여, 조직의 넓은 범위는 다중 항체 클리어하여 immunolabeled 및 볼륨 - 이미징 될 수있다.

ACT-PRESTO : 생물 조직 지우기 및 볼륨 이미징을위한 Immunolabeling 방법

이 프로토콜은 수정 된 광견병 바이러스가 형광 마커를 표현, 독립, 편견 클러스터가 서로 다른 신경 세포의 서브 클래스 간의 형태 학적 통계의 종합적인 특성을 사용하는 것이 분석과 역 행성 감염 다음 레이블이 선택적 신경 인구의 대규모 복원에 대해 설명합니다.

형태 학적 지표를 바탕으로 대규모 재건과 독립, 편견 클러스터링은 선택적 인구에서 뉴런을 분류하기

우리는 하나의 조직 샘플에 포함 된 긴 수지상 나무와 뉴런을 시각화하기 위해, 두께 뇌 부분에 골지 - 콕스 염색 방법을 사용하기위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 두 가지 변종은 크레 실 바이올렛으로 대조, 장기 저장을위한 처리되지 않은 뇌의 동결을 포함 그되게됩니다.

골지 - 콕스 방법을 사용하여 두꺼운 뇌 섹션 내에서 이미징 뉴런

여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

신경 수지상 형태는 종종 기능의 근간을 이수합니다. 실제로, 뉴런의 발달에 영향을 미치는 많은 질병 프로세스는 형태학적 표현형으로 나타납니다. 이 프로토콜은 그대로 수지상 식소및 연관된 척추를 분석하는 간단하고 강력한 방법을 설명합니다.

선명도 조직 클리어링을 통한 손상되지 않은 뉴런 덴라이트의 이미징 및 정량화

이 프로토콜은 iDISCO+를 사용하여 온전한 마우스 뇌의 자기 공명 영상, 제거 및 면역 표지를 수행하는 방법을 설명한 다음, 라이트 시트 현미경을 사용한 이미징 및 NuMorph를 사용한 다운스트림 분석에 대한 자세한 설명을 설명합니다.

MRI, 조직 투명화 및 라이트 시트 현미경을 사용한 온전한 신생아 마우스 뇌의 전뇌 단일 세포 이미징 및 분석

본 프로토콜은 (SWITCH - H 2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT 조직 형질 전환 기법과 광시트 형광 현미경 이미징을 일상적으로 높은 처리량 프로토콜로 결합하여 수십 개의 사후 인간 뇌 절편의 신속하고 동시적인 광학 투명화, 다중 라운드 라벨링 및 3D 체적 재구성을 위한 단계별 절차를 제공합니다.

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging(대규모 인간 뇌 영상에서 광시트 형광 현미경을 위한 광학 투명화 및 라벨링)

이 연구는 형광 신호가 보존된 상태에서 세척된 전뇌 및 척수 샘플을 추출 및 준비하여 실험 효율성과 데이터 무결성을 향상시켜 신경 과학 연구를 발전시키는 프로토콜을 제시합니다.

Extraction and Tissue Cleaning Preparation of Mouse Brain-Spinal Cord Samples(쥐의 뇌-척수 샘플의 추출 및 조직 세척 준비)

학습하세요 ScaleSF 조직 투명화 기법을 이용한 뇌 조각 신경 세포 이미징 방법을. 마우스 뇌 조직에서 EGFP 양성 뉴런의 3D 구조를 고해상도로 시각화하여 신경 회로 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

중시경에서 현미경 비늘에 이르기까지 신경 세포 이미징을위한 조직 제거 방법

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