수동 CLARITY를 사용하여 마우스 중추 신경계의 광학 지우기

본 프로토콜의 전반적인 목표는 기존 CLARITY 프로토콜을 수정하여 더욱 일관되고 비용 효율적인 결과를 얻는 방법을 제시하는 것입니다. 이 방법은 중추신경계의 3D 형태 및 연결성과 같이 신경과학의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 마우스 중추신경계의 광학 투명화 및 현미경 관찰의 일관성을 향상시킨다는 점입니다.

비용 효율적이고 재현 가능한 방식으로 수행합니다. 이미징 챔버의 구조가 복잡하고 서술형 설명만으로는 쉽게 파악되지 않으므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

형광 단백질을 발현하는 마우스의 파라포름알데히드 고정 뇌 및 척수 조직을 준비합니다. 플라스틱 마우스 뇌 매트릭스에 뇌를 배치하고 매트릭스 블레이드로 정중선을 따라 절단하여 뇌를 반구형으로 분리합니다. 각 뇌 반구와 척수를 별도의 50 mL 원심분리 튜브에 넣습니다.

각각 40 milliliters의 하이드로겔 용액을 포함합니다. 형광체를 보호하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 그리고 샘플과 하이드로겔이 들어 있는 튜브를 4 °C에서 완만한 흔들림과 함께 7일 동안 배양합니다.

배양 기간이 지난 후, 원심분리 튜브에 시료와 약 25 mL의 하이드로젤이 남도록 25 mL의 하이드로젤을 버립니다. 다음으로, 캡을 열고 원심분리 튜브를 데시케이터 병에 넣은 후 병을 진공 펌프에 연결하여 시료 내의 산소를 제거합니다. 최소 10분 동안 진공 상태를 유지합니다.

살살 흔들어 배출된 산소 기포를 제거합니다. 10분 후, 2~3분에 걸쳐 데시케이터 병 내부의 진공을 100% 질소 가스로 대체합니다. 압력이 평형을 이루어 데시케이터 병의 덮개를 열 수 있게 되면, 산소가 다시 유입되지 않도록 튜브의 캡을 빠르게 닫습니다.

다음으로, 샘플이 들어 있는 튜브를 37 °C 항온수조에 3시간 동안 두어 중합 반응이 완료될 때까지 하이드로겔을 중합시킵니다. 3시간 후 중합된 하이드로겔은 겔과 같은 점성을 띠게 됩니다. 스패튤러를 사용하여 원심분리 튜브에서 중합된 샘플을 꺼낸 후, 샘플 주변의 과잉 하이드로겔을 잘라냅니다.

마지막으로, 샘플을 보풀 없는 와이프 위에 놓고 조직을 부드럽게 문지르고 굴려 남은 하이드로젤을 제거하여, 샘플에 중합된 하이드로젤의 얇은 층만 남깁니다. 지질 제거 과정을 시작하려면, 중합된 샘플을 45 mL의 투명화 버퍼가 들어 있는 깨끗한 50 mL 원심분리 튜브로 옮기고, 45 °C에서 부드럽게 흔들어주며 7일 동안 배양합니다. 초기 7일 동안은 매일 사용한 투명화 버퍼를 화학 폐기물 용기에 버리고 버퍼를 교체해 줍니다.

그리고 45 mL의 신선한 투명화 버퍼(clearing buffer)를 첨가합니다. 모든 지질이 가용화되어 조직이 투명해지면, 샘플을 45 mL의 PBST가 채워진 새로운 50 mL 원심 분리 튜브로 옮기고, 잔류 SDS를 제거하기 위해 향후 24시간 동안 40 °C에서 완만하게 흔들어 4회 세척합니다. 마지막 PBST 세척 후, 샘플을 1 µg/mL DAPI와 1xPBST가 채워진 깨끗한 15 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다.

알루미늄 호일로 감싸고 상온에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날 상온의 PBST로 1회당 최소 6시간씩 세 번 세척합니다. 그런 다음 굴절률 매칭 단계를 진행합니다.

이 절차 단계를 시작하려면, pH 7.5의 1xPBS와 2-2 thiodiethanol이 채워진 깨끗한 15 milliliter 원심분리 튜브에 시료를 옮기고 화면에 표시된 대로 배양합니다. 두 번째 배양 종료 시점에 맞춰, 재사용 가능한 접착 테이프를 시료의 두께보다 약간 더 큰 균일한 직경의 원기둥 모양으로 말아 이미징 챔버를 만듭니다. 이 원기둥을 40 millimeter 유리 바닥 디쉬 위에 한쪽 끝이 열린 원형으로 배치합니다.

그다음 P1000 피펫 팁을 사용하여 재사용 가능 접착제를 실린더의 바깥쪽 테두리를 따라 굴려 접착제와 유리 사이에 밀봉을 형성합니다. 약 100 µL의 63% TDE를 유리 디쉬 위에 피펫팅하고, 재사용 가능 접착제가 형성한 원 안의 유리 표면을 덮도록 넓게 펴 바릅니다. 그런 다음 스패튤라를 사용하여 기포가 생기지 않도록 주의하며 원의 중앙에 샘플을 조심스럽게 배치합니다.

다음으로, 63% TDE 100 µL를 샘플 위에 직접 분주한 후, 즉시 재사용 가능한 접착제 위에 40 mm 원형 커버 글라스를 덮습니다. 양손의 검지, 중지, 약지를 사용하여 커버 글라스가 샘플에 닿을 때까지 원의 가장자리를 조심스럽게 누릅니다. 이제 유리 바닥 디쉬를 천천히 세워 표면에 기대어 놓고, 피펫으로 63% TDE를 추가하여 용액이 상단의 작은 개구부까지 차오르게 합니다.

보풀 없는 와이프로 피펫 팁을 닦아 용액이 유리에 떨어지지 않도록 합니다. 마지막으로, 작은 개구부에 실리콘 엘라스토머를 추가하여 원을 밀봉하고 밀폐된 챔버를 만듭니다. 5분 동안 건조시킨 후, 이미징을 진행합니다.

샘플이 들어 있는 이미징 챔버를 레이저 주사 공초점 현미경의 스테이지 위에 놓습니다. 이미징 소프트웨어를 실행하고, 아르곤 여기 레이저를 켜기 위해 프로그램 상단의 구성(configuration) 탭을 클릭한 다음 레이저 아이콘을 클릭합니다. 아르곤 옆의 확인란을 선택하여 레이저 전원을 켜고 슬라이드 스케일을 30%로 이동합니다. 상단의 획득(acquire) 탭으로 돌아갑니다.

빔 경로 설정 상자에서 로드-저장 설정 상자로 이동한 다음, 드롭다운 메뉴를 선택하여 YFP를 방출하는 데 적합한 파장 채널을 선택하십시오. 채널 설정 상자에서 'objective current object'라고 표시된 빨간색 하이퍼링크를 클릭하여 이미징에 적합한 대물렌즈를 선택하십시오. 조직의 두께보다 작동 거리가 긴 대물렌즈를 사용하십시오.

또한, 평면 이미지 해상도를 극대화하고 광학 절편 두께를 최소화하기 위해 큰 수치 개구수를 사용합니다. 드롭다운 메뉴의 왼쪽 열에서 XY 해상도 창을 열어 포맷이라고 불리는 획득 매트릭스를 1024x1024 또는 대물렌즈의 가로 해상도 한계에 적절한 값으로 설정하십시오. 줌 배율은 가능한 한 낮게 설정하십시오.

여기에서는 1.7이 사용됩니다. 동일한 창에서 개별적으로 표시된 드롭다운 메뉴를 통해 8라인 평균 및 1프레임 평균 파라미터를 설정하십시오. 스테이지 컨트롤을 사용하여 샘플의 위치를 찾으십시오.

대표 시야가 보이면, YFP의 경우 게인(gain)을 760에서 780 사이로, 오프셋(offset)을 1.0에서 1.5 사이로 설정하십시오. 타일 스캔(tile scan)을 선택합니다. 그런 다음 획득할 Z 스택의 상한 및 하한 값을 설정하십시오.

대물렌즈의 광학 절편 해상도 한계를 기준으로 광학 절편의 두께를 설정한 후 획득을 시작하십시오. 이 이미지는 5배 배율로 촬영하여 3D로 재구성한 대뇌 피질과 해마의 YFP 양성 뉴런을 보여줍니다. 스케일 바는 1 mm를 나타냅니다.

대뇌 피질의 10배율 이미지 스택을 최대 강도 투사(maximum intensity projection)한 이 영상은 피질 5층 피라미드 뉴런의 수지상 돌기 분지를 보여줍니다. 여기서 스케일 바는 100 microns를 나타냅니다. 여기서는 5배율로 촬영하고 3D로 재구성한 손상되지 않은 경수 및 흉수 척수에서의 THY-1YFP 발현을 보여줍니다.

스케일 바는 2 mm를 나타냅니다. 마지막으로, 척수를 10배 배율로 촬영한 이미지 스택의 최대 강도 투영(maximum intensity projection) 결과는 개별 축삭을 보여주며, 스케일 바는 100 µm를 나타냅니다. 적절하게 수행된다면, 이 기법은 척수 전체의 경우 2~4주, 뇌 반구 절단(hemisected brains)의 경우 4~6주 만에 완료할 수 있습니다.

본 절차 이후, 더 복잡한 생화학적 표현형 분석이 필요한 질문에 답하기 위해 면역조직화학법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 passive CLARITY와 레이저 공초점 현미경을 사용하여 마우스 중추신경계를 광학적으로 투명화하고 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.