Name: 수동 CLARITY를 사용하여 마우스 중추 신경계의 광학 지우기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 배우세요 마우스 중추 신경계의 광학 투명화를 위한 수동 CLARITY 프로토콜 수정 방법을. 이 기법은 3D 형태학 및 신경 연결성 연구에 일관성 있고 비용 효율적인 결과를 제공합니다.

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이 작품은 넉넉한 신경 질환 및 뇌졸중 (NIH / NINDS) 부여 1R01NS086981과 콘래드 N. 힐튼 재단의 보건 / 국립 연구소의 국립 연구소에 의해 지원되었다. 우리는 공 초점 현미경과의 귀중한 도움 박사 로랑 Bentolila 박사 마태 복음 Schibler 감사합니다. 우리는 CLARITY 포럼 (http://forum.claritytechniques.org)에 기여한 것들 감사합니다. 우리는 특히이 매혹적인 기술을 가르치는 그의 연구실을 개방 박사 칼 Deisseroth 감사합니다. 저자는 뇌 매핑 의료 연구 조직, 뇌 매핑 지원 재단, 피어슨 - 난봉꾼 재단, Ahmanson 재단, 캐피탈 그룹 회사 자선 재단, 윌리엄 M. 린다 R. Dietel 자선 기금, 그리고 노스 스타 펀드의 관대 한 지원에 감사 . 이 책에서보고 된 연구는 부분적으로 연구 자원을위한 국립 센터와 국가의 이사의 사무실에 의해 지원되었다보너스 번호 C06RR012169, C06RR015431 및 S10OD011939에서 건강의 알 연구소. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

모든 실험은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 지침에 따라 수행되었다. THY1-YFP, PLP-EGFP와 PV-TdTomato 마우스를 실험에 이용했지만, 형광 단백질을 발현하는 마우스를 성공적으로 삭제되고 묘화 될 수있다. 1. 조직 준비 주의 : 파라 포름 알데히드 (PFA) 및 아크릴 아미드는 독성 및 자극한다. 흄 후드와 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 장갑, 눈 보호) 이러한 시약을 이용하여 실험을 수행합니다. <ol><li> (- 3 분 ~ 2) 호흡이 중단 될 때까지 이소 플루 란의 ~ 1 ml의 안락사 챔버에서 동물을 희생. </li><li> (- 10 분 5) 혈액이 조직에서 제거 될 때까지 ~ ​​5ml를 설정 연동 펌프를 사용하여 / 분 intracardially 4 ° C에서 관류 액 (표 1)와 마우스를 관류한다. </li><li> 정착액 솔루션에 관류 변경 (표 1)(- 10 분 5) 4 ° C에서 목과 꼬리는 크게 보강 할 때까지. </li><li> 관류를 종료하고 동물 목을 벨. 조심스럽게 제 두개골 주변 결합 조직을 제거한 후, 두개골의 복부 표면으로부터 뼈를 분리 및 20에 기재된 바와 같이, (도 1a)에 뇌를 올려 두개골로부터 뇌를 절개. 참고 : 소뇌의 flocculonodular 로브와 후각 전구를 둘러싼 뼈의 제거에 특별한주의를주십시오. <ol><li> 조심스럽게 척추 및 척추 사이에 미세, 예리한 가위의 선단을 삽입 (21)에 기술 된 바와 같이, 거리 개별 척주 세그먼트를 절단함으로써 척추의 척추 해부. </li></ol></li><li> 플라스틱 마우스 뇌 매트릭스에 배치하고 매트릭스 블레이드와 중간 선을 따라 절단하여 뇌 Hemisect. </li><li> 원심 분리 욕조 50 ㎖를 분리하는 각각의 반구와 척수 추가함께 ES ~ 겔 용액 (표 1) 40ml를. 이 시점 앞으로 커버에서 알루미늄 호일로 튜브는 이후의 모든 단계 동안 형광을 보호 할 수 있습니다. </li><li> 부드러운 7 일 (~ 30 회전)을 진탕 4 ° C에서 하이드로 겔의 샘플이 들어있는 튜브를 품어. </li></ol> 2. 중합 <ol><li> 원심 분리 튜브 하이드로 ~ 25 mL의 시료를 보존하고, ~ 25 ㎖의 하이드로 겔을 버린다. </li><li> 뚜껑을 제거하고 건조기 항아리 원심 튜브를 배치하고, 진공 용기에 접속하여 샘플을 탈산 소화. 솔루션 및 양식 거품 나오는 용해 가스를 허용하기 위해 적어도 10 분 동안 진공을 적용합니다. 부드럽게 거품을 제거 흔들어. </li><li> 3 분 - 2 이상 100 % 질소 가스로 데시 케이 터 항아리에 진공을 교체합니다. 압력 (데시 케이 병의 상부가 개방 될 수있을 경우에) 등화 후 신속 산소의 재 도입을 방지하기위한 튜브 캡. </li><li> 중합체중합이 완료 될 때까지 3 시간 동안 37 ° C의 물 배스에서 샘플 튜브를 배치하여 하이드로 겔이지는. 중합 하이드로 겔은 겔 일관성 (그림 1b)에 걸립니다. 주 : 상단 미 중합 겔 소량 좋다. </li><li> 다음, 원심 분리기 튜브에서 중합 된 샘플을 제거 샘플에서 과량의 하이드로 겔을 절단하기 위해 주걱을 사용합니다. </li><li> 무료 닦아 보풀에 샘플을 배치하고 부드럽게 샘플에 중합 된 하이드로 겔의 얇은 층 뒤에 남겨두고, 마찰과의 조직을 압연하여 나머지 하이드로 겔을 제거합니다. </li></ol> 3. 지질 제거 참고 : 지질 삭제 조직이 취약, 취급에주의. 튜브를 배출 할 때 샘플 손실을 방지하기 위해 셀 스트레이너를 사용합니다. 또한, 샘플은 굴절률 매칭 프로세스 동안 반전 될 수 팽윤성 그러나, 소거 과정을 통해 팽창한다. 주의 : 소디음 도데 실 설페이트 (SDS)와 붕산을 자극한다. 흄 후드와 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 장갑과 눈 보호)로를 이용하여 실험을 수행합니다. <ol><li> 깨끗한 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 중합 샘플을 전송하고 버퍼 (표 1) 삭제의 45 ml에 추가 할 수 있습니다. 부드러운 흔들림 45 ° C (~ 30 RPM)에 품어. 화학 폐기물에 사용 청산 버퍼를 붓는 신선한 청산 버퍼 ~ 45 ml에 추가하여 초기 7 일간 매일 버퍼를 변경합니다. 형광 물질을 보호하기 위해 알루미늄 호일로 덮여 샘플을 함유하는 원심 분리기 튜브를 유지한다. </li><li> 삼일 - 초기 7 일 후, 매 2 ~ 40 ° C 및 교환 청산 버퍼에서 샘플을 품어. 모든 지질을 용해하고 조직 투명성 (그림 1C)에 도달 할 때까지 청소를 계속합니다. 마우스 뇌 반구 6 주에서 2 - - 척수에 대한 사주이 4됩니다. </li><li> 조직이 삭제되면, 전송새로운 50 ML의 원심 분리 관에 시료 잔류 SDS를 제거하기 위해 24 시간 동안 부드러운 진동 (~ 30 RPM)와 40 ° C에서 PBST (표 1)에서 4 번 씻는다. </li></ol> 4. 분자 염색 주의 : 4 &#39;, 6-Diamidino -2- 페닐 인돌 다이 하이드로 클로라이드 (DAPI)의 자극과는 흄 후드와 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 장갑, 눈 보호)을 수행해야합니다 사용하는 실험이다. <ol><li> 깨끗한 15 ML의 원심 분리기 튜브에 샘플을 전송하고 1X PBST 1 μg의 / ㎖ DAPI, pH를 7.5로 입력합니다. 24 시간 동안 실온 (RT)에서 인큐베이션. 형광 물질을 보호하기 위해 알루미늄 호일로 덮여 샘플을 함유하는 원심 분리기 튜브를 유지한다. </li><li> 적어도 6 시간 / 세탁 동안 실온에서 PBST 3 회 반복한다. </li></ol> 5. 굴절률 매칭 주의 : 쉬 2,2&#39;- 티 오디 에탄올 (TDE)는 자극이고 어떤 실험을 이용하여흄 후드와 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 장갑, 눈 보호)을 수행 할 수 울드. <ol><li> 깨끗한 15 ML의 원심 분리기 튜브에 샘플을 전송하고 30 % 1X PBS에서 (v / v)의 TDE, pH를 7.5로 입력합니다. 24 시간 동안 부드러운 흔들림 40 ° C (~ 30 RPM)에 품어. </li><li> 1X PBS, pH가 7.5에서 63 % (v / v)의 TDE와 교환 30 % TDE. 부드러운 24 시간 동안 진탕 40 ° C에서 품어. 참고 :이 샘플은 약 원래 크기로 다시 축소됩니다. </li><li> 편평하고 청결한 표면에 시료의 두께보다 단지 약간 큰 균일 한 직경을 갖는 실린더에 재사용 가능한 접착제의 일부를 롤. </li><li> 개방형 원으로 재사용 접착제 실린더를 마련 (~ 상단에 작은 구멍에 25mm 내경)는 40mm의 유리 바닥 접시에. 교정이 이루어질 필요하면 유리 실린더를 제거하고 면도날로 절단. </li><li> 하여 재사용 가능한 접착제와 유리 사이의 밀봉을 생성하기 위해 P1000 피펫 팁을 사용하여실린더의 외주 주위 압연. </li><li> 장소 ~ 100 ㎕의 63 % 유리 접시 상 TDE 재사용 가능한 접착제의 원 내에있는 유리 표면을 덮도록 주위에 전파. </li><li> 주걱을 사용하여 조심스럽게 기포를 형성하지 않도록주의하면서, 원의 중간 샘플을 놓는다. </li><li> 즉시 재사용 접착제를 통해 40mm 원형 커버 유리를 배치, 직접 샘플에 63 % TDE의 또 다른 100 μl를 피펫. </li><li> 커버 유리 샘플과 연락을 할 때까지 인덱스, 중간, 양손의 약지를 사용하여 조심스럽게 원의 둘레를 누릅니다. </li><li> 천천히, 표면에 휴식 수직 위치로 유리 바닥 접시를 가져 오는 솔루션은 상단에있는 작은 구멍에 도달 할 때까지 다음 피펫 63 % TDE를 추가합니다. 무료 솔루션이 유리에 떨어지지 않도록 피펫 팁을 건조 닦아 보풀을 사용합니다. 챔버에서 거품을 방지하기 위해, 피펫을 완전히 비울 수 없습니다. </li><li> 에작은 구멍은 원형을 넣고 밀폐 된 챔버를 만들기 위해 실리콘 엘라스토머를 추가합니다. 이 영상 전에 건조를 위해 5 분을 기다립니다. </li></ol> 6. 현미경 주의 : 공 초점, 단일 평면 조명과 빛 시트 현미경에 사용되는 레이저는 매우 강력하고 실명의 원인이 될 수 있습니다. 레이저를 이용한 모든 실험은 광범위한 훈련 후 큰주의와 적절한 눈 보호를 수행해야합니다. <ol><li> 레이저 스캐닝 공 초점 현미경의 무대에 내부의 샘플 이미징 챔버를 놓습니다. </li><li> 이미징 소프트웨어를 엽니 다 (재료의 표 참조). 아르곤 여기 레이저를 켜려면, 다음 프로그램 레이저 아이콘의 상단에있는 설정 탭을 클릭합니다. 레이저에 전력을 30 %로 슬라이드 규모를 이동 아르곤 옆의 확인란을 선택합니다. 포인터가 천천히 선택한 위치로 워밍업 관찰한다. <ol><li> 상단의 획득 탭​​으로 돌아갑니다. 큰 상자에서 &quot;빔 경로 설정 및# 34; / 부하로 이동 상자를 설정 저장 및 이미지 YFP (527 ㎚)에 대한 적절한 파장 채널을 선택 드롭 다운 메뉴를 선택합니다. </li></ol></li><li> 채널 설정 상자에서 &quot;현재 객체 목표&quot;라고 표시된 빨간색 하이퍼 링크를 배치함으로써 이미징을위한 적절한 목표를 선택합니다. 탭을 클릭하면 사용 가능한 모든 목표를 열고 선택은 터렛을 자동으로 회전합니다. <ol><li> 사용 목적 (예., 10X)이 큰 작동 거리 (조직의 두께보다 더는 묘화 될 예를 들면, 11mm)과 큰 개구 수 (예. 0.3)을 평면 이미지 해상도를 극대화하고 최소화 할 광학 부 두께. </li></ol></li><li> 1,024 X 1,024에 &quot;형식&quot;이라고 인수 행렬을 설정하는 창 또는 목표의 측면​​ 분해능 한계에 적절한 값 : &quot;해결 XY&quot;를 열고 메뉴를 드롭 다운의 왼쪽 열에서. (가능한 한 낮게 줌 배율을 예. 10.7). </li><li> 같은 창에서 따라 개별적으로 표시된 메뉴를 드롭하여 8 라인 평균 1 프레임 평균 매개 변수를 설정합니다. 신속한 취득이 높은 신호 대 잡음비와 작은 값의 큰 값을 사용한다. 주 : 8 라인 평균 1 프레임의 평균은 약 4 시간에서 마우스 뇌 반구의 고품질 이미지를 획득한다. </li><li> 무대 컨트롤을 사용하여 샘​​플을 찾습니다. 대표적인 필드가 표시되면, 이득 및 오프셋을 설정합니다. 이득 및 조직 유형, 형광에 따라 크게 변화 오프셋 (offset), 및 / 또는 해부학 적 기능을 이미지화되는 참고. YFP를 들어, 이득 780-760로부터 -1.0에서 오프셋을위한 -1.5 값을 설정합니다. </li><li> &quot;타일 스캔&quot;을 선택하고 관심 영역의 경계를 선택합니다. 는 z 스택의 설정 상한과 하한 취득합니다. 목적의 광학 부재의 분해능 한계에 기초하여 상기 광학 부재의 두께를 설정한다. 참고 : 목적의광학 부재의 분해능 한계는 주로 그 개구에 의해 규정된다. 자동 목표 값을 적절한 계산할 대부분 현미경 제어 소프트웨어가 사용된다. 0.3의 개구 수와 10X 대물 렌즈의 경우 즉, 약 11 μm의 것이다. </li><li> 인수를 시작합니다. 참고 :이 여러 시간이 걸릴 수 있습니다. </li><li> 관심의 특정 지역에서 높은 배율 목표를 사용하여 높은 해상도의 이미지를 수집합니다. </li></ol>

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하이드로 겔 포함 된 조직 (수동 CLARITY)의 수동 청소 조직의 큰 조각을 삭제하기위한 간단하고 저렴한 방법이다. 이러한 접근 방식은 전용 설비를 필요로하지 않고, 용이하게 온도 제어 진탕 기에서 수행 될 수있다. 몇 주의 기간 동안, 같은 전체 뇌 또는 척수로도 큰, 매우 유수 조직, 투명하고 현미경에 적합하게 될 것이다. 이 보고서는 CNS 조직의 청산에 초점을 맞추고있다하더라도, 수동 CLARITY 모든 조직에 적용 할 수 있습니다. 광학 정화 기술의 상대적 강점과 약점이 문헌 13,17,22에서 이전에 논의 된,하지만 가장 명확하게 (23)에 배치됩니다. 샘플 다수가 동시에 삭제 및 재현성이 매우 중요하다되고있는 경우 수동 CLARITY 실험에 적합합니다. 티슈는 m을 용이하게하기 위해, 하이드로 겔의 사용은 부가적인 지원을 제공 할ultiple는 조직의 프로빙. 이 보고서에서, 분자량이 작은 염료 DAP...

완전한 신경 해부학적 구조를 이미지화하는 능력은 건강과 질병에서 뇌를 이해하는 데 매우 중요합니다. 전통적으로 3D 이미징은 축 해상도를 제공하고 깊은 해부학적 구조를 시각화하기 위해 조직 절편이 필요했습니다. 이 접근 방식은 고해상도 데이터 세트를 생성할 수 있지만 정교한 이미지 재구성 기술이 필요하고 노동 집약적입니다. 그 결과, 소량의 조직1-3을 이미징하는 것으로 제한되었습니다. 반면에 광학 절편은 형광 표지된 조직의 고해상도 3D 이미지를 만드는 데 매우 적합합니다. 광학 절편은 본질적으로 3차원이기 때문에 3D 이미지 볼륨을 생성하기 위해 광범위한 계산이 필요하지 않습니다. 그러나 빛의 산란과 조직 불투명도는 조직을 광학적으로 절단할 수 있는 깊이를 제한합니다. 이미징 깊이는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에서 약 150μm로 제한되며 이광자 여기 현미경4-8을 사용할 경우 800μm 미만으로 제한됩니다.
이러한 한계를 극복하기 위해 최근 몇 가지 광학 투명화 기술이 개발되었으며 온전한 조직의 깊은 현미경 이미징을 허용하기 위해 더욱 개선되었습니다. 벤질 알코올과 벤질 벤조에이트(BABB)를 사용하여 고정된 조직을 투명하게 만드는 것은 가장 초기의 접근법 중 하나였다9. 그러나 이 접근법은 샘플에서 형광을 소멸시키고 고도로 수초화된 구조를 불완전하게 제거함으로써 제한되었습니다10. 3DISCO(3D Imaging of Solvent Cleared Organs)와 같은 이 기술의 개선으로 매우 빠르고 완전한 조직 투명화가 이루어졌지만 여전히 형광 신호, 특히 황색 형광 단백질(YFP)의 급격한 손실로 어려움을 겪고 있습니다10. Sca/e11 및 SeeDB12와 같은 수성 투명화 용액은 형광 신호를 보존하지만 고도로 수초화된 조직을 완전히 투명화하지는 않습니다. CUBIC(Clear, Unobstructed Brain Imaging Cocktails and Computational analysis)은 이전에 개발된 수성 세정 솔루션의 한계를 극복하는 것으로 보이는 유망한 새로운 광학 세정 기술입니다13. 다른 광학 투명화 기술과 대조적으로, CLARITY(Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel)14는 단백질, 핵산 및 소분자에 구조적 무결성을 제공하는 동시에 지질은 결합되지 않은 상태로 유지하는 다공성 매트릭스에 뇌를 내장합니다. 그런 다음 지질은 전기영동으로 제거되어 일반적으로 사용 가능한 기술을 사용하여 쉽게 시각화하고 동등하게 쉽게 조사할 수 있는 광학적으로 깨끗한 뇌에서 절정에 이릅니다.
전기영동 조직 투명화(ETC)는 CLARITY의 하이드로겔 내장 조직에서 지질을 제거하는 데 사용되지만, ETC는 일관되게 구현하기 어려울 수 있으며 전기영동에 노출되는 조직은 조직 왜곡, 갈변, 형광 손실 및 항체 반응성을 나타낼 수 있습니다. 수동 지질 투명화는 이러한 제한을 피하지만 정화 시간을15-17시간 늘려야 합니다. 또한 수동 세척은 사용 가능한 ETC 장치의 수에 의해 제한되지 않기 때문에 많은 수의 샘플을 병렬로 세척할 수 있습니다. 파라포름알데히드의 농도를 낮추고 하이드로겔에서 비스-아크릴아미드를 제외하면 조직 확장이 커지는 대신 투명화 속도가 크게 빨라진다16. 원래의 CLARITY 기법에 사용된 굴절률 매칭 솔루션에 대한 저렴한 대안이 개발되었습니다17-19. 2,2'-티오디에탄올(TDE)은 지질 제거 중에 발생하는 조직 확장의 일부를 역전시키는 저렴하고 빠른 뇌 정화제입니다18. 이 보고서는 하이드로겔 내장 조직의 수동적 투명화와 원래의 CLARITY 기술에 대한 굴절률 매칭 솔루션으로 TDE를 사용하여 마우스 중추 신경계의 광학 투명화를 위한 재현성이 높고 저렴한 프로토콜을 생성합니다.

<table><tbody><tr><td>10x 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Fisher</td><td>BP399-1</td><td>완충액</td></tr><tr><td>32% 파라포름알데히드(PFA)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15714-5</td><td>관류 및 하이드로겔</td></tr><tr><td>2,2'-티오디에탄올(TDE)</td><td>시그마-알드리치</td><td>166782-500G</td><td>굴절률 정합 용액</td></tr><tr><td>40% 아크릴아미드</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td>하이드로겔</td></tr><tr><td>2% 비스-아크릴아미드</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td>하이드로겔</td></tr><tr><td>VA-044 개시제</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>VA044</td><td>하이드로겔</td></tr><tr><td>붕산</td><td>시그마-알드리치</td><td>B7901</td><td>클리어링 버퍼</td></tr><tr><td>, 도데실황산나트륨(SDS),</td> <td>피셔</td><td>BP166-5</td><td>클리어링 버퍼</td></tr><tr><td>, 수산화나트륨</td><td>, 피셔</td><td>55255-1</td><td>버퍼,</td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>52002-100G</td>, <td>방부제</td></tr><tr><td>, 트리톤 X-100</td>, <td>시그마-알드리치</td><td>X100-500G</td><td>완충액</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-50KU</td><td>관류</td></tr><tr><td>질산나트륨</td><td>Fisher</td><td>BP360-500</td><td>관류</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>분자 프로브</td><td>D1306</td><td>핵 염색</td></tr><tr><td>99.9% 이소플루란</td><td>Phoenix</td><td>57319-559-06</td><td>마취제</td></tr><tr><td>Hydrocholoric acid</td><td>Fisher</td><td>A1445-500</td><td>완충액</td></tr><tr><td>유리 바닥 접시</td><td>Willco</td><td>HBSB-5040</td><td>Willco 접시</td></tr><tr><td>재사용 가능한 접착제</td><td>Bostick</td><td>371351</td><td>Blu-Tack</td></tr><tr><td>실리콘 엘라스토머</td><td>세계 정밀 기기</td><td>KWIK-CAST</td><td>Kwik-Cast</td></tr><tr><td>보푸라기 없는 닦음</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>KimWipe</td></tr><tr><td>마우스 뇌 매트릭스</td><td>Roboz</td><td>SA-2175</td><td>절편 조직</td></tr><tr><td>매트릭스 블레이드</td><td>Roboz</td><td>RS-9887</td><td>절편 조직</td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Cole-Parmer</td><td>77122-24</td><td>pefusion</td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td>현미경</td></tr><tr><td>이미징 소프트웨어</td><td>Leica</td><td>LAS AF</td><td>현미경</td></tr></tbody></table>

수동 clarity를 사용하여 마우스 중추 신경계의 광학 지우기

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

전통적으로 조직 시각화는 관심 조직을 연속적으로 절편하고 이미지화하여 각 조직 섹션을 고유한 비선형 변형에 노출시켜 중추신경계(CNS)의 세포 형태, 분포 및 연결성을 평가하는 능력을 크게 저해했습니다. 그러나 광학 투명화 기술은 조직을 시각화하는 방식을 변화시키고 있습니다. 이러한 접근 방식을 통해 온전한 장기 준비를 깊이 조사할 수 있으며, 건강과 질병에서 조직의 구조적 조직에 대한 엄청난 통찰력을 얻을 수 있습니다. CLARITY(Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel)와 같은 기술은 광 산란 지질이 자유롭게 확산될 수 있도록 하는 동시에 중요한 생체 분자에 결합하는 매트릭스를 제공함으로써 이러한 목표를 달성합니다. 지질 제거 후 굴절률 일치를 통해 조직을 투명하게 만들고 3차원(3D)으로 쉽게 이미지화할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 원래 CLARITY 프로토콜에 사용된 전기영동 조직 투명화(ETC)는 성공적으로 구현하기 어려울 수 있으며 독점적인 굴절률 정합 솔루션을 사용하면 이 기술을 일상적으로 사용하는 데 비용이 많이 듭니다. 이 보고서는 조직 무결성 향상을 위한 수동 CLARITY와 이전에 설명된 굴절률 정합 솔루션인 2,2'-티오디에탄올(TDE)을 결합한 간단하고 저렴한 광학 투명화 프로토콜의 구현을 보여줍니다.

뇌의 구조적 조직을 시각화하는 형태와 연결이 건강과 질병에서 뇌 기능에 미치는 영향을 이해하는 데 중요합니다. 광학 청소 기술은 우리가 응집력 형태와 연결을 연구 할 수 있도록, 손상 조직의 3 차원 이미지 세포 인구에 가능합니다. 세포가 뇌의 신경 연결의 복잡한 패턴을 떨어져 애타게 하나를 허용의 하위 집단에 대한 특이 적 프로모터에 의해 구동 형광 단백질을 발현 마우스. 이러한 생쥐 뇌 (도 2a 및 b) 프로젝션 대뇌 피질 및 해마에있는 신경 세포뿐만 아니라 다른 구조의 서브셋에 YFP 표현 때문에 THY1-YFP 트랜스 제닉 마우스는 광 지우기 문헌에 광범위하게 사용되어왔다. 또한, YFP + 대뇌 피질의 계층 V 뉴런은의에서 피질 기관을 통해 프로젝트대뇌 피질의 뉴런 (15)의 척수...

광학 투명화 기술은 조직을 시각화하는 방식에 혁명을 일으키고 있습니다. 이 보고서에서는 보다 일관되고 저렴한 결과를 제공하는 원래의 CLARITY(Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel) 프로토콜의 수정 사항에 대해 설명합니다.

수동 CLARITY를 사용하여 마우스 중추 신경계의 광학 지우기

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 기존 CLARITY 프로토콜을 수정하여 더욱 일관되고 비용 효율적인 결과를 얻는 방법을 제시하는 것입니다. 이 방법은 중추신경계의 3D 형태 및 연결성과 같이 신경과학의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 마우스 중추신경계의 광학 투명화 및 현미경 관찰의 일관성을 향상시킨다는 점입니다.비용 효율적이고 재현 가능한 방식으로 수행합니다. 이미징 챔버의 구조가 복잡하고 서술형 설명만으로는 쉽게 파악되지 않으므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.형광 단백질을 발현하는 마우스의 파라포름알데히드 고정 뇌 및 척수 조직을 준비합니다. 플라스틱 마우스 뇌 매트릭스에 뇌를 배치하고 매트릭스 블레이드로 정중선을 따라 절단하여 뇌를 반구형으로 분리합니다. 각 뇌 반구와 척수를 별도의 50 mL 원심분리 튜브에 넣습니다.각각 40 milliliters의 하이드로겔 용액을 포함합니다. 형광체를 보호하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 그리고 샘플과 하이드로겔이 들어 있는 튜브를 4 °C에서 완만한 흔들림과 함께 7일 동안 배양합니다.배양 기간이 지난 후, 원심분리 튜브에 시료와 약 25 mL의 하이드로젤이 남도록 25 mL의 하이드로젤을 버립니다. 다음으로, 캡을 열고 원심분리 튜브를 데시케이터 병에 넣은 후 병을 진공 펌프에 연결하여 시료 내의 산소를 제거합니다. 최소 10분 동안 진공 상태를 유지합니다.살살 흔들어 배출된 산소 기포를 제거합니다. 10분 후, 2~3분에 걸쳐 데시케이터 병 내부의 진공을 100% 질소 가스로 대체합니다. 압력이 평형을 이루어 데시케이터 병의 덮개를 열 수 있게 되면, 산소가 다시 유입되지 않도록 튜브의 캡을 빠르게 닫습니다.다음으로, 샘플이 들어 있는 튜브를 37 °C 항온수조에 3시간 동안 두어 중합 반응이 완료될 때까지 하이드로겔을 중합시킵니다. 3시간 후 중합된 하이드로겔은 겔과 같은 점성을 띠게 됩니다. 스패튤러를 사용하여 원심분리 튜브에서 중합된 샘플을 꺼낸 후, 샘플 주변의 과잉 하이드로겔을 잘라냅니다.마지막으로, 샘플을 보풀 없는 와이프 위에 놓고 조직을 부드럽게 문지르고 굴려 남은 하이드로젤을 제거하여, 샘플에 중합된 하이드로젤의 얇은 층만 남깁니다. 지질 제거 과정을 시작하려면, 중합된 샘플을 45 mL의 투명화 버퍼가 들어 있는 깨끗한 50 mL 원심분리 튜브로 옮기고, 45 °C에서 부드럽게 흔들어주며 7일 동안 배양합니다. 초기 7일 동안은 매일 사용한 투명화 버퍼를 화학 폐기물 용기에 버리고 버퍼를 교체해 줍니다.그리고 45 mL의 신선한 투명화 버퍼(clearing buffer)를 첨가합니다. 모든 지질이 가용화되어 조직이 투명해지면, 샘플을 45 mL의 PBST가 채워진 새로운 50 mL 원심 분리 튜브로 옮기고, 잔류 SDS를 제거하기 위해 향후 24시간 동안 40 °C에서 완만하게 흔들어 4회 세척합니다. 마지막 PBST 세척 후, 샘플을 1 µg/mL DAPI와 1xPBST가 채워진 깨끗한 15 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다.알루미늄 호일로 감싸고 상온에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날 상온의 PBST로 1회당 최소 6시간씩 세 번 세척합니다. 그런 다음 굴절률 매칭 단계를 진행합니다.이 절차 단계를 시작하려면, pH 7.5의 1xPBS와 2-2 thiodiethanol이 채워진 깨끗한 15 milliliter 원심분리 튜브에 시료를 옮기고 화면에 표시된 대로 배양합니다. 두 번째 배양 종료 시점에 맞춰, 재사용 가능한 접착 테이프를 시료의 두께보다 약간 더 큰 균일한 직경의 원기둥 모양으로 말아 이미징 챔버를 만듭니다. 이 원기둥을 40 millimeter 유리 바닥 디쉬 위에 한쪽 끝이 열린 원형으로 배치합니다.그다음 P1000 피펫 팁을 사용하여 재사용 가능 접착제를 실린더의 바깥쪽 테두리를 따라 굴려 접착제와 유리 사이에 밀봉을 형성합니다. 약 100 µL의 63% TDE를 유리 디쉬 위에 피펫팅하고, 재사용 가능 접착제가 형성한 원 안의 유리 표면을 덮도록 넓게 펴 바릅니다. 그런 다음 스패튤라를 사용하여 기포가 생기지 않도록 주의하며 원의 중앙에 샘플을 조심스럽게 배치합니다.다음으로, 63% TDE 100 µL를 샘플 위에 직접 분주한 후, 즉시 재사용 가능한 접착제 위에 40 mm 원형 커버 글라스를 덮습니다. 양손의 검지, 중지, 약지를 사용하여 커버 글라스가 샘플에 닿을 때까지 원의 가장자리를 조심스럽게 누릅니다. 이제 유리 바닥 디쉬를 천천히 세워 표면에 기대어 놓고, 피펫으로 63% TDE를 추가하여 용액이 상단의 작은 개구부까지 차오르게 합니다.보풀 없는 와이프로 피펫 팁을 닦아 용액이 유리에 떨어지지 않도록 합니다. 마지막으로, 작은 개구부에 실리콘 엘라스토머를 추가하여 원을 밀봉하고 밀폐된 챔버를 만듭니다. 5분 동안 건조시킨 후, 이미징을 진행합니다.샘플이 들어 있는 이미징 챔버를 레이저 주사 공초점 현미경의 스테이지 위에 놓습니다. 이미징 소프트웨어를 실행하고, 아르곤 여기 레이저를 켜기 위해 프로그램 상단의 구성(configuration) 탭을 클릭한 다음 레이저 아이콘을 클릭합니다. 아르곤 옆의 확인란을 선택하여 레이저 전원을 켜고 슬라이드 스케일을 30%로 이동합니다. 상단의 획득(acquire) 탭으로 돌아갑니다.빔 경로 설정 상자에서 로드-저장 설정 상자로 이동한 다음, 드롭다운 메뉴를 선택하여 YFP를 방출하는 데 적합한 파장 채널을 선택하십시오. 채널 설정 상자에서 'objective current object'라고 표시된 빨간색 하이퍼링크를 클릭하여 이미징에 적합한 대물렌즈를 선택하십시오. 조직의 두께보다 작동 거리가 긴 대물렌즈를 사용하십시오.또한, 평면 이미지 해상도를 극대화하고 광학 절편 두께를 최소화하기 위해 큰 수치 개구수를 사용합니다. 드롭다운 메뉴의 왼쪽 열에서 XY 해상도 창을 열어 포맷이라고 불리는 획득 매트릭스를 1024x1024 또는 대물렌즈의 가로 해상도 한계에 적절한 값으로 설정하십시오. 줌 배율은 가능한 한 낮게 설정하십시오.여기에서는 1.7이 사용됩니다. 동일한 창에서 개별적으로 표시된 드롭다운 메뉴를 통해 8라인 평균 및 1프레임 평균 파라미터를 설정하십시오. 스테이지 컨트롤을 사용하여 샘플의 위치를 찾으십시오.대표 시야가 보이면, YFP의 경우 게인(gain)을 760에서 780 사이로, 오프셋(offset)을 1.0에서 1.5 사이로 설정하십시오. 타일 스캔(tile scan)을 선택합니다. 그런 다음 획득할 Z 스택의 상한 및 하한 값을 설정하십시오.대물렌즈의 광학 절편 해상도 한계를 기준으로 광학 절편의 두께를 설정한 후 획득을 시작하십시오. 이 이미지는 5배 배율로 촬영하여 3D로 재구성한 대뇌 피질과 해마의 YFP 양성 뉴런을 보여줍니다. 스케일 바는 1 mm를 나타냅니다.대뇌 피질의 10배율 이미지 스택을 최대 강도 투사(maximum intensity projection)한 이 영상은 피질 5층 피라미드 뉴런의 수지상 돌기 분지를 보여줍니다. 여기서 스케일 바는 100 microns를 나타냅니다. 여기서는 5배율로 촬영하고 3D로 재구성한 손상되지 않은 경수 및 흉수 척수에서의 THY-1YFP 발현을 보여줍니다.스케일 바는 2 mm를 나타냅니다. 마지막으로, 척수를 10배 배율로 촬영한 이미지 스택의 최대 강도 투영(maximum intensity projection) 결과는 개별 축삭을 보여주며, 스케일 바는 100 µm를 나타냅니다. 적절하게 수행된다면, 이 기법은 척수 전체의 경우 2~4주, 뇌 반구 절단(hemisected brains)의 경우 4~6주 만에 완료할 수 있습니다.본 절차 이후, 더 복잡한 생화학적 표현형 분석이 필요한 질문에 답하기 위해 면역조직화학법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 passive CLARITY와 레이저 공초점 현미경을 사용하여 마우스 중추신경계를 광학적으로 투명화하고 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

전체 마우스 기관의 Multiphoton 현미경은 광학 이미징 전에 장기를 삭제하면 가능하지만, 모든 프로토콜은 형광 단백질의 형광 신호를 보존 할 수 있습니다. 에탄올 기반의 탈수 및 벤질 알코올 광학 개간 방법 사용 : 벤질 벤조산의 개간을, 우리는 전체 마우스 두뇌가 YFP을 표현의 고해상도 multiphoton 이미지를 보여줍니다.

YFP를 표현 잡습니다 마우스 뇌의 Multiphoton 현미경

만성 안구 고혈압 쥐의 눈 섬유주 레이저 광응고술을 사용하여 유도된다. 안압 (IOP)는 레이저 치료 후 몇 개월 동안 상승합니다. 시력 실험 동물의 대비 감도의 감소는 optomotor 테스트를 사용하여 모니터링 할 수 있습니다.

비주얼 결함의 특성을 만성 안구 고혈압의 레이저 유도 마우스 모델

이 문서에서 우리는 높은 해상도, 형광 표지 된 마우스의 뇌의 미세 뇌 해부학과, 재구성하는 전체 실험 절차를 설명합니다. 설명 프로토콜은 샘플 준비 및 청소, 영상, 데이터 후 처리 및 다중 스케일의 시각화를 위해 설치 표본이 포함되어 있습니다.

공 초점 빛 시트 현미경 전체 마우스 두뇌의 마이크론 규모의 해상도 광학 단층 촬영

척추 상상돌기는 통증 인식 및 기타 행동에 중요하며, 세로토닌 섬유는 이러한 섬유 시스템 중 하나입니다. 본 연구는 이러한 세로토닌 섬유의 종결을 조사하기 위해 결합된 CLARITY/CUBIC 프로토콜을 마우스 척수에 적용하는 데 중점을 두었습니다.

CLARITY를 사용하여 마우스 척수에서 세로토닌 섬유 이미징 / CUBIC 기술

이 원고는 고해상도 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월)와 마우스 망막의 비보에 이미징에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 그것은 몇 가지 검색 및 측정 방법 설명 peripapillary 지역에서 망막 신경 절 세포 (RGC)에 초점을 맞추고.

광학 일관성 단층 촬영: 마우스 망막 신경 절 세포에서 Vivo에서 화상 진 찰

여기, 선물이 aquaporin-4 (AQP4)의 양도 의해 마비 및 opticospinal 염증 유도 프로토콜-WT 쥐로 AQP4/- 생쥐에서 특정 T 세포. 또한, 우리는 시각 시스템 장애 모니터링을 직렬 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하는 방법을 보여 줍니다.

마비 및 비주얼 시스템 부상 Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4에 대 한 T 세포 관련 하 여 쥐에서의 유도

여기, 선물이 두 소설 방법론, psPACT 및 최대 광학 투명성과 조직 맥 관 구조에 그대로 설치류의 후속 현미경 분석을 달성 하기 위한 mPACT 전체 CNS.

소설 수동 전체 CNS 조직에 광학 투명도의 급속 한 생산을 위한 방법 삭제

여기서 우리는 표준 면역 조직 화학 염색 및 망막 뉴런및 그 하위 세포 구조의 고해상도 화상 진찰의 질을 향상시키기 위하여 전산 망막에 대한 뇌 조직의 CLARITY 방법을 적응하는 프로토콜을 제시합니다.

선명도 조직 클리어링 방법으로 전산 망막의 면역 염색

이 프로토콜은 조직 제거 방법인 ScaleSF를 사용하여 뇌 절편에서 신경 세포 영상의 상세한 방법을 제공한다. 이 프로토콜에는 뇌 조직 준비, 조직 정화, 클리어 슬라이스 처리 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미징이 포함됩니다.

중시경에서 현미경 비늘에 이르기까지 신경 세포 이미징을위한 조직 제거 방법

흡수 분자 용액과 같은 광학 투명화 기술은 광 산란을 일시적으로 줄여 생물학적 이미징을 향상시키고 깊이 박힌 장기에 대한 생체 적합성, 가역적 생체 내 이미징 전략을 제공합니다. 이 프로토콜은 살아있는 동물의 실시간 역학을 위한 고품질의 동적 이미징을 달성하기 위해 상세한 실험 절차와 고급 이미지 처리를 제공합니다.

Ex Vivo 및 In Vivo 이미징을 위한 흡수 분자를 사용한 일시적인 광학 투명화

배우세요 마우스 중추 신경계의 광학 투명화를 위한 수동 CLARITY 프로토콜 수정 방법을. 이 기법은 3D 형태학 및 신경 연결성 연구에 일관성 있고 비용 효율적인 결과를 제공합니다.

수동 CLARITY를 사용하여 마우스 중추 신경계의 광학 지우기

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